Un modelo del cerrado-pecho para inducir constricción aórtica transversal en ratones

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Summary

Aquí, presentamos un protocolo de constricción aórtica transversal (TAC) a través de una toracotomía lateral. Esta técnica es un procedimiento quirúrgico mínimamente invasivo, cerrado pecho con el objetivo de simular la sobrecarga de presión y la insuficiencia cardíaca en ratones utilizando la configuración estándar de laboratorio de TAC.

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Eichhorn, L., Weisheit, C. K., Gestrich, C., Peukert, K., Duerr, G. D., Ayub, M. A., Erdfelder, F., Stöckigt, F. A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice. J. Vis. Exp. (134), e57397, doi:10.3791/57397 (2018).

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Abstract

Investigación en hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardíaca con frecuencia se basa en modelos de ratón de sobrecarga de presión inducidos por la TAC. El procedimiento estándar consiste en realizar una toracotomía parcial para visualizar el arco aórtico transversal. Sin embargo, el trauma quirúrgico causado por la toracotomía en pecho abierto modelos cambia la fisiología respiratoria como las costillas están disecadas y salió sueltas tras cierre de pecho. Para evitar esto, hemos establecido un acercamiento como mínimo invasor, cerrado pecho vía toracotomía lateral. Aquí nos acercamos a arco aórtico mediante el espacio intercostal 2nd sin entrar en las cavidades del pecho, dejando el ratón con una lesión menos traumática para recuperarse. Realizamos esta operación usando configuración de laboratorio estándar para procedimientos de pecho abierto TAC con tasas de supervivencia igual. Aparte de mantener patrones de respiración fisiológica debido a lo cerrado del pecho, los ratones parecen beneficiarse, mostrando una recuperación rápida, como la técnica menos invasiva para facilitar un proceso curativo rápido y para reducir la respuesta inmune después de un traumatismo.

Introduction

Modelos de ratón se utilizan a menudo para mímico enfermedades humanas1. Constricción aórtica transversal (TAC) se utiliza para inducir sobrecarga de presión y ventricular izquierdo hipertrofia2. El modelo de TAC de tórax abierto en ratones fue validado por Rockman et al. 3 y el procedimiento quirúrgico es descrito en detalle por DeAlmeida et al. 4. anillamiento de la aorta transversa es más favorable en comparación con constricción aórtica abdominal debido a una porción más grande de la circulación puede compensar los efectos negativos de este último procedimiento2.

Las bandas de la aorta transversa conduce a un aumento de la presión arterial en la aorta ascendente y la arteria braquiocéfala pero deja suficiente perfusión de los órganos a través de los vasos distales (es decir, la arteria carótida común izquierda, subclavia izquierda arteria y aorta descendente). Esto conduce a una mayor poscarga cardiaca y una tensión de la pared cardiaca elevada. La tensión de la pared disminuye posteriormente debido al engrosamiento de la fibra5. El cambio crónico en la hemodinámica cardiaca produce dilatación del ventrículo izquierdo y la adaptación. De esta manera la TAC crea un modelo reproducible de la hipertrofia cardiaca, llevando eventualmente a insuficiencia cardíaca.

El procedimiento estándar para TAC según lo descrito por DeAlmeide et al. 4 acerca del arco aórtico mediante una toracotomía superior parcial mediante disección de las costillas o el esternón y entrar en el mediastino y la cavidad pleural. Esto permite una buena visión de arco aórtico y sus ramas laterales. Por desgracia, no pueden ser reatadas las costillas disecadas, que deja flotar libremente y alterando la dinámica de la respiración.

Por lo tanto, establecimos un acercamiento como mínimo invasor del cerrado-pecho al arco aórtico mediante un abordaje lateral a través del espacio intercostal 2nd . La mayor ventaja de este modelo es la capacidad de realizar TAC sin cortar incluso a través de las costillas. El trauma quirúrgico se limita a la incisión de la piel y la disección de los músculos intercostales. Este procedimiento minimiza el trauma en sí mismo y ayuda a mantener la estabilidad adecuada del pecho.

Aquí describimos un procedimiento paso a paso detallado para realizar la cirugía de la TAC en ratones sin realizar el total o la toracotomía superior. Doppler de alta frecuencia fue utilizado para asegurar el éxito de TAC como describió anteriormente 6,7.

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Protocol

Este protocolo fue aprobado por el Comité de ética de animales experimentación LANUV Recklinghausen (#84-02.04.2016.A374). Generalmente, este procedimiento se realiza en ratones adultos > 10 semanas de edad. Sin embargo, es posible realizar esta cirugía en animales más jóvenes así. Herramientas quirúrgicas deben ser esterilizados antes de su uso y todas las medidas deben realizarse bajo condiciones asépticas.

1. inducción de la anestesia y la intubación

  1. Inyectar la buprenorfina 0.1 μg/g de peso corporal por vía intraperitoneal para aliviar el dolor. Repetir las inyecciones intraperitoneales de 0.1 mg/kg de buprenorfina cada 8 h para los próximos tres días después de la cirugía.
  2. Para la inducción, coloque el ratón en una caja de inducción de la anestesia que está conectada con el vaporizador a 3,0% de Vol de isoflurano con un flujo de oxígeno de 1 L/min.
  3. Asegúrese de narcosis profunda induciendo un estímulo táctil.
    Nota: Aumento de Vol % de isoflurano hasta un 5%, si no de la inducción de la anestesia o narcosis no es lo suficientemente profundo.
  4. Pellizcar la cola del ratón para asegurar la ausencia de reflejo. En caso de ausencia total de reflejos, pesan el ratón para la configuración óptima del ventilador (ver 1.12).
  5. Mueva el ratón a una mesa de operaciones de control de temperatura para mantener una temperatura corporal de 37 ° C durante todo el procedimiento.
  6. Coloque la punta del ratón en un cono de plástico que está conectado a la caja de inducción de la anestesia para mantener narcosis.
  7. Fijar los incisivos superiores del ratón con una sutura de nylon. Para fijar las extremidades con una cinta adhesiva.
  8. Aplique presión en la pata trasera con la punta de las pinzas para asegurar una narcosis adecuada otra vez. En la ausencia de un reflejo de retirada continúe con los pasos siguientes.
    Nota: Aumentar volumen % de isoflurano si falla de la inducción de la anestesia o narcosis no es lo suficientemente profundo y esperar a que la ausencia del reflejo de retirada.
  9. Coloque lubricante oftálmico estéril sobre la córnea para evitar la desecación bajo anestesia.
  10. Lubrique la sonda rectal para evitar trauma rectal. Inserte una sonda de temperatura rectal para asegurar una temperatura de 37 ° C.
  11. Depilarse la garganta y el pecho superior con crema depilatoria según las instrucciones del fabricante. Limpie la crema después de 1 minuto. Si es necesario, repita este paso hasta el éxito.
    Nota: Utilice torundas con punta de algodón en caso de sangrado.
  12. Limpiar la zona depilada con etanol al 70%. Luego aplique povidona-yodo para la desinfección de la piel 3 veces y al menos 3 minutos.
  13. Ajuste el ventilador a parámetros fisiológicos. Establecer la frecuencia respiratoria a 150/min y volúmenes de marea a 8-10 μl/g de peso corporal (BW).
  14. Poner en un nuevo par de guantes estériles. Coloque el ratón debajo de un microscopio quirúrgico y colocar un paño estéril fenestrado sobre el ratón.
  15. Haga una incisión en la piel en la línea media unos 3 mm debajo de la mandíbula hasta la costilla 2nd . Identificar la línea media y los tejidos conectivos de la glándula submaxilar. Luego use fórceps intracapsular ángulo suavemente dividen la glándula en la línea media sin rodeos con dos pinzas y explorar el músculo traqueal.
  16. Preparar la tráquea suavemente tirando de los músculos para traqueal aparte sin rodeos con fórceps intracapsular.
  17. Tire de la lengua con unas pinzas para alisar la garganta para las condiciones de intubación fácil y suavemente inserte una cánula de intubación (1.2mm OD) dentro de la tráquea. Confirmar la intubación por la visualización directa del tubo dentro de la tráquea y comprobando el movimiento adecuado del pecho.
  18. Ajustar la concentración de isoflurano tras la intubación para isoflurano 2% con un flujo de 1.0 L/min y 100% O2.
    Nota: Si no deje de movimientos respiratorios o ratones de inicio móviles, primero aumenta la frecuencia respiratoria hasta 180/min. Si es necesario, aumentar la concentración de isoflurano hasta 3,5% secundario hasta que el ratón deja de respirar por cuenta propia. Evaluar pérdidas o inadecuado llenado del vaporizador como los problemas más comunes.
  19. Como alternativa, realizar intubación como se sugiere en los siguientes pasos de la sub.
    1. Coloque el ratón sobre una mesa en un ángulo de 60°.
    2. Para fijar las extremidades del ratón con cinta adhesiva y reclinar la cabeza.
    3. Coloque una fuente de luz fría directamente sobre la piel por encima de la laringe.
    4. Tire suavemente la lengua con unas pinzas para visualizar las cuerdas vocales.
    5. Inserte un tubo de plástico de una cánula IV (24 G) a través de las cuerdas vocales y conecte el tubo de plástico a los ajustes del ventilador.
    6. Conecte el ventilador a la cánula para confirmar la intubación por movimientos de pecho synchrone.
      Nota: Si no deje de movimientos respiratorios o ratones de inicio móviles, primero aumenta la frecuencia respiratoria hasta 180 por minuto. Si es necesario, incrementar secundariamente la concentración de isoflurano hasta un 3,5% hasta que el ratón deja de respirar por cuenta propia. Evaluar fugas ó inadecuado llenado del vaporizador como los problemas más probables.

2. medición Doppler preoperatorio

  1. Preparar ambas arterias carótidas que endecha adjunto a la tráquea tirando suavemente el tejido fino conectivo aparte con el fórceps.
  2. Coloque la punta de la sonda MHz Doppler 20 con algún gel de ultrasonido estéril a la derecha y la arteria carótida izquierda en un ángulo inferior a 45°.
  3. Gire lentamente la sonda se mueve lateral y medial para encontrar una señal Doppler e inclinar la punta de prueba para optimizar la señal.
  4. Utiliza un software de Doppler para visualizar y almacenar velocidades de flujo en las arterias carótidas comunes derecha e izquierdas en un ordenador.

3. toracotomía

  1. Utilizar un conjunto de guantes estériles para cada ratón individual para prevenir infecciones del sitio quirúrgico.
  2. Ampliar la incisión de piel hasta el espacio intercostal 2nd con una tijera.
  3. Identificar visualmente el espacio intercostal 2nd contando las costillas y luego penetrar sin rodeos este espacio con el fórceps intracapsular.
    Nota: La 1 costillast se encuentra debajo de la clavícula y por lo tanto no es visible porque el espacio intercostal 2nd se encuentra entre la primera costilla visible (es decir, 2nd costilla) y la costilla 3rd .
  4. Abra el espacio intercostal 2nd con la ayuda de puntas de pinzas y coloque los retractores.
  5. Ajustar los retractores con una banda de goma atada a la mesa de operaciones para tener una visión clara del timo.
  6. En caso de sangrado una punta de algodón y presiona sobre los vasos superficiales por 2 min.

4. las bandas de la Aorta transversa

  1. Ajuste la ampliación a 200% para identificar la línea media y los tejidos conectivos. Luego uso acodada pinzas para dividir suavemente el timo. Eliminar tejido graso hasta el arco aórtico se puede ver claramente.
  2. Preparar un túnel con ángulo atar fórceps bajo la aorta transversal entre la arteria braquiocéfala y de la arteria carótida común izquierda (ver figura 1). Sujete el extremo de una sutura 6.0 con la ayuda de Pinzas finas y pase el hilo debajo del arco aórtico.
  3. Tomar el hilo con la segunda pinza desde el otro lado del arco.
  4. Corte un pedazo largo de 3 mm el largo de una 27 G para utilizar la aguja como un el espaciador para ligadura de TAC para los ratones un peso comprendido entre 19-25 g peso y una aguja de 26 G como un espaciador para los ratones > 25 g BW.
  5. Con cuidado coloque al separador paralelo a la aorta transversa.
  6. Preparar un nudo doble suelto en el espaciador y garantizar la óptima colocación del espaciador en paralelo a la aorta. Entonces el primer tiro de lazo y realizar rápidamente un segundo tiro contrario. Retire al espaciador con prontitud.
  7. Para realizar simulacro ratones de control, seguir el mismo protocolo omitiendo la ligadura de la aorta.
  8. Cerrar el espacio intercostal 2nd con una sutura de polipropileno 6.0. Preste especial atención a los vasos subclavios cuando la ligadura.
  9. Sutura de la piel mediante una sutura de polipropileno 6.0 en un patrón de sutura continua.

5. confirmación de ligadura acertada de la Aorta transversa

  1. Colocar una sonda de MHz Doppler 20 en ambos lados del cuello en un ángulo de 45° en la sección 2.
  2. Las velocidades de flujo en cada lado del documento.
    Nota: Un TAC exitoso puede ser validado por la velocidad de flujo Doppler como se muestra en la figura 2. Un cociente de la velocidad de flujo de 4-10 entre la arteria carótida derecha e izquierda generalmente garantiza adecuada TAC (ver figura 2).

6. cosecha de corazón

  1. Inducen narcosis según pasos 1.2. y 1.3.
  2. Coloque el ratón en una cámara de eutanasia y ajustar el flujo de dióxido de carbono para desplazar 10-30% del volumen/minuto.
  3. Para fijar el ratón sobre una mesa de cirugía. Abrir el abdomen con tijeras y cosecha de sangre de la vena cava inferior con una cánula para su posterior análisis.
  4. Cortar el diafragma y el hueso esternal con tijeras fuertes y quitar el corazón.
  5. Remueva todo arterial y tejido conectivo antes de pesar el corazón.
  6. Separa el ventrículo derecho y el septo del ventrículo izquierdo y pesan ambas muestras.
  7. Congelación de ambas muestras de tejido en nitrógeno líquido.

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Representative Results

Un TAC éxito garantiza la inducción de sobrecarga de presión y la hipertrofia ventricular izquierda. Una validación especial de sobrecarga de presión se logra mediante la medición de la velocidad de flujo Doppler como se muestra en la figura 2. Mientras que la velocidad de flujo arterial preoperatoria es igual en ambas arterias carótidas, TAC provoca una velocidad aumentada de sangre en la arteria carótida derecha debido a la presión elevada en el ventrículo izquierdo y la aorta mientras que la velocidad del flujo post estenótico arterial atenuada en la arteria carótida izquierda.

La eficacia de la TAC y su hipertrofia resultante fue validada por el cálculo de corazón peso corporal peso cocientes (HW/BW; mg/g) de ratones machos C57BL/6J en 3, 6 y 21 días post cirugía. Los cocientes de HW/BW aumentaron significativamente en los ratones de la TAC en comparación con ratones no bandas 6 días después de la cirugía (4.78 ± 0,18 vs7.66±1,43 mg/g, p < 0.0001). Esta proporción fue casi constante después de 21 días (4,8 ± 0.11 vs7.81 ± 0,65 mg/g, p < 0.0001) (ver figura 3). La tasa de supervivencia es principalmente dependiente en la hemorragia intraoperatoria: puede reducirse a menos de 5% a través de la práctica regular. La tasa de supervivencia después de 21 días depende principalmente del genotipo. Para los ratones no sufren enfermedades cardíacas funcionales los importes de la tasa de supervivencia a > 85%. La tasa de supervivencia en los ratones C57BL/6J presentados después de 21 días ascendió a 88%.

Presión arterial sistólica y la función cardíaca se midió en anestesia intubación y realizado con un 1.4 presión francesa conductancia catéter8 según lo descrito por otros. 9 frecuencia cardiaca (FC) tiene un efecto significativo en la contractilidad ventricular izquierda de (LV). No hubo diferencias en la frecuencia cardíaca (HR) de los ratones bandas bandas y no aórtica aórticas (p = 0.1456) después de 21 días (ver Figura 4A). Una constante de bandas de la aorta (p = < 0.0001) fue probada por una mayor presión sistólica medida después de 21 días (ver Figura 4B).

Como se ha discutido en la literatura, ratones C57BL/6J son comúnmente conocidos para desarrollar hipertrofia excéntrica con disfunción sistólica10 después de la TAC. Se encontró un aumento del diámetro ventricular izquierdo, que también aparece significativa en mediciones de volumen la presión. Volumen telesistólico aumentado de 16,25 μl (μL ± 1.935) 23.31 μl (± 1.617µL). Este cambio fue significativo (p = 0.0131) (ver figura 4). Volumen telediastólico aumentado de 25.81 μl (μL ± 1.852) a 31.24 μl ± (1.093 μL). Este cambio fue significativo (p = 0.0268) (ver figura 4).

ANOVA unidireccional seguida Bonferroni pruebas posthoc fue realizado para comparar TAC y farsa de grupos. En el caso de mediciones de volumen de presión, los grupos se compararon mediante una prueba de t no pareada con corrección de Welch. Todos los datos se ha presentado como la media ± SEM (barras de error).

Figure 1
Figura 1: el acercamiento quirúrgico a través del espacio intercostal 2nd 200% de aumento. Esta fotografía fue tomada con el microscopio quirúrgico y muestra el arco aórtico con un hilo entre la arteria braquiocéfala y de la arteria carótida común izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: representante de proyección de imagen Doppler de onda pulsada de ambas arterias carótidas (farsa contra ratones de TAC). A) la imagen de Doppler de onda pulsada de la arteria carótida izquierda antes TAC. B) la imagen de Doppler de onda pulsada de la arteria carótida derecha antes TAC. C) imagen ofPulsed de la onda Doppler de la arteria carótida izquierda después de la TAC. La velocidad de flujo de sangre se reduce en comparación con figura 2A. D) Doppler de onda pulsada de la arteria carótida derecha después de la TAC. La velocidad del flujo sanguíneo se incrementa en comparación con la figura 2B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: peso del corazón / cociente del peso del cuerpo. Hipertrofia cardiaca es inducida por TAC. Esto se demuestra por un aumento significativo en proporción peso/cuerpo de corazón. Ratones sin banding aórtico (ej. ratones sham; barras blancas) se compararon con ratones TAC operado (barras negras) después de 3, 6 y 21 días. 6 días después de la TAC el cociente del peso corazón peso /body aumentó significativamente en los ratones de la TAC. Este efecto es pronunciado solamente levemente después de 21 días. Significación se estableció en p = < 0.05. NS = no significativo; p < 0.0001. Los datos se presentan como media ± SEM (barras de error). n = 6-9 por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: parámetros hemodinámicos medición a través de catéter de presión – volumen en ratones (C57BL/6J) con y sin TAC 21 días después de la cirugía: A) la frecuencia cardiaca (FC) en latidos por minuto (bpm). No hubo diferencias en recursos humanos en ambos grupos lo que indica una narcosis similar durante las mediciones invasivas. B) la presión arterial sistólica en la arteria carótida común derecha (sBP). El aumento significativo de la PAS después de 21 días indica una constricción constante del arco aórtico. C) los volúmenes telesistólico (ESV) se incrementan significativamente (p = 0.0131) después de 21 días y mostrar una mayor poscarga debido a la TAC inducida por dilatación del ventrículo. D) aumentar volumen End-diastolic (ESV) (p = 0.0268. Significación se estableció en p = < 0.05. NS = no significativo; * p < 0.05; p < 0.0001. Los datos se presentan como media ± SEM (barras de error); n = 8-13 por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El inicio rápido de la hipertensión arterial debido a la TAC diferencia de hipertrofia clínicamente relevante causada por estenosis aórtica o hipertensión. Sin embargo, el uso de modelos animales pequeños para inducir insuficiencia cardíaca tiene muchas ventajas y es, por tanto, elegido por muchos investigadores11. Este modelo de pecho cerrado mejora los modelos ya existentes de la técnica quirúrgica para inducir constricción aórtica transversal en ratones4.

El paso más crítico es el paso bajo el arco aórtico. Una sutura muy apretada alrededor de la aorta puede causar una reducción grave del flujo sanguíneo a órganos importantes como los riñones. Según la ley de Hagen-Poiseuille, el flujo es principalmente dependiente en el radio. Por lo tanto, se utilizaron algunos espaciadores de adaptadas de peso en nuestro protocolo. Este procedimiento hace que este modelo más universalmente aplicable, particularmente con respecto a ratones muy jóvenes o viejos, dependiendo de la configuración experimental individual.

Trauma quirúrgico sí mismo induce una respuesta inmune y debería reducirse al mínimo para evitar efectos distorsionadores. Rápida recuperación y las tasas de supervivencia altas son obligatorias, especialmente en modelos de animales complejos. Históricamente, a diferencia de la toracotomía en pacientes humanos, la caja torácica en ratones no se restablece después de la cirugía de la TAC. Por lo tanto, restitución a los movimientos de respiración fisiológica es limitada debido a las costillas flotantes gratis, que no se reconectan en el esternón.

Técnicas mínimamente invasivas para TAC son también utilizados por otros12,13. En ambos modelos, el arco aórtico se alcanza a través de una incisión de línea media y una esternotomía parcial superior. Aunque ambos modelos son menos invasivos que los modelos de pecho abierto, cirujanos tienen que extirpar costillas o partes del esternón para llegar a la aorta. Creemos que mantener la fisiología de la caja torácica entera SIDA una recuperación más rápida. Por lo tanto, este protocolo mejora los protocolos ya existentes y ayuda a minimizar el trauma quirúrgico mismo.

El acceso quirúrgico más apical, una hiperinflación post quirúrgica de los pulmones para la prevención de atelectasia o de neumotórax, como ha sido a veces descrita4,14, no es necesaria. Este acceso previene un barotrauma de los pulmones, que puede ser inducida por la sujeción del tubo espiratorio abrir atelectasia en modelos existentes. Este protocolo también incluye una estrategia de ventilación fisiológica individual. Es tentador especular que una ventilación adaptada individualmente ayuda a reducir las complicaciones asociada a la ventilación como barotrauma. Se utilizó una estrategia de ventilación de peso adaptado para evitar efectos en la producción de citoquinas sistémicas por la ventilación sí mismo15.

En conclusión, estas técnicas representan un modelo alternativo y mejor para inducir la hipertrofia cardiaca en ratones.

Aunque el trauma se minimiza evitando la toracotomía, el mayor efecto sobre la reducción de la inflamación no se muestra en esta publicación. Lamentablemente, limitaciones establecidas por las leyes de protección animal no nos permiten realizar TAC de tórax abierto en paralelo con mínima invasiva TAC para la comparación porque este modelo mínimamente invasiva se ha establecido desde hace ya años. Por lo tanto, estas declaraciones se basan en las experiencias anteriores de nuestro grupo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Stilla Frede y Susanne Schulz por su asistencia técnica. Este estudio no recibió financiación de ninguna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pressure-volume catheter Millar Instruments, USA SPR-839
Mouse ventilator Harvard Apparatus GmbH, Germany Minivent - TYPE 845
Mouse ventilator Harvard Apparatus GmbH, Germany Y-connection with intubation cannula OD 1.2mm 73-2844
Vaporizer Dräger Medical AG&CO.KG, Germany 19.3 Isofluran-Vaporizer (a newer version is available under catalog number  D-877-2010)
Microscope  Leica Microsystems, Germany MZ 7.5
Light source  Schott AG, Germany KL 1500 LCD
6-0 Prolene Ethicon, USA Polypropylene suture BV-1 9.3 mm 3/8c suture for surgery
Seraflex Serag Wiessner, Germany USP 5/0 schwarz;  IC108000  suture for constriction
Homoeothermic Controlled Operating Tables Harvard Apparatus GmbH, Germany Typ 872/3 HT with tripod stand and homoeothermic controller Type 874; 73-4233
Flexible Rectal Probe Harvard Apparatus GmbH, Germany 1.6 mm OD; 55-7021
Doppler Signal Visualisation Instrument Indus Instruments, USA Doppler Signal Processing Workstation (DSWP) with 20MHz Pulsed Doppler Module
Arruga Intracapsular Forceps Altomed, UK A5400
Doppler Probe Indus Instruments, USA 20MHz Tubing-mounted Probe
Jaffe Lid Retractor Altomed, UK A3513

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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