מודל לולאת המעי מחוברים בעופות חינם ומורדמת פתוגן מסוים ללמוד החיידק Clostridium התקפה אלימה

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת בניתוח 'לולאות מעיים מחוברים' בהמעי הדק עוף. הליך זה מאפשר ההשוואה של מספר זנים של החיידק Clostridium התקפה אלימה בחיי עיר שורה בודדת. שיטה זו פוחתת במידה ניכרת את מספר התרנגולות ההכרחיות בדרך כלל לצורך ניסויים דומים ויוו .

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

דלקת מעיים נמק נחקרה תרנגולות באמצעות ויוו זיהום מודלים שונים. רוב אלה להשתמש בשילוב של גורמים נטייה, כגון כגון ותזונה, עם gavage או באמצעות ההזנה באמצעות החיידק Clostridium. דגמים אלה, השוואת מספר זני החיידק ללימודי התקפה אלימה דורש מספר רב של מחשבים מארחים עד להשגת תוצאות משמעותיות. התמותה במהלך המחקר יכול להיות גבוה בהתאם לדגם ניסיוני, ומכאן העלאת חששות אתיים בנוגע רווחת בעלי חיים במחקר. הפיתוח של הדגמים החדשים של זיהום, הדורשים פחות חיות ללמוד פתוגנזה, טרם מתן תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית וחוקית, חשוב להפחית את השימוש בבעלי חיים במחקר. לולאת המעי מחוברים מודלים שימשו ללמוד זיהומים clostridial מינים שונים כגון עכברים, ארנבים, עגלים. בעקבות ניתוחים ליצירת לולאה מחוברים מקטעי, זני החיידק הם מוזרק ישירות לתוך לולאות להקים במגע ישיר בין החיידק לבין רירית המעי. דוגמאות המעי הדק ותוכנו luminal נלקחים על הפסקת ההליכים אחרי כמה שעות. מספר זני חיידקים יכולים לקבל חיסון בכל בעל חיים, ומכאן הקטנת מספר הנושאים הנדרשים בניסויים. בנוסף, נהלים מבוצעים בהרדמה כללית כדי להפחית כאב בבעלי חיים. בעופות, מודל זה יהיה מתאים יותר מאשר ניהול דרך הפה כדי להשוות בין החיידק זן פתוגניות כי בעלי חיים פחות נחוצים ללא גורמי predisposing נדרשים כדי לגרום למחלה, כאב נשלטת על ידי משככי כאבים . המודל לולאת המעי מחוברים מתואר בצורה גרועה בעופות, תקינה חיונית עבור השימוש האופטימלי. כתב יד זה מספק את כל הצעדים הדרושים כדי ליצור לולאות מחוברים מעיים רבים בעופות ומביא מידע על נקודות קריטי כדי להשיג תוצאות בתוקף.

Introduction

השימוש במודלים לחקר מחלות זיהומיות להשפיע על בני האדם ובעלי החיים הוא כלי מרכזי בהערכת הגורמים התקפה אלימה ויסות בפתוגנזה של תנאי ספציפי כמו גם באשר לפרט אסטרטגיות כדי למנוע או לרפא מחלות1. למרות יתרונות רבים לשימוש בבעלי חיים כדי ללמוד מחלות שונות, חופרים אתית חששות לגבי המנהג. חוקרים צריך למזער את השימוש בבעלי חיים בעת השגת תוצאות משמעותיות וחוקית. הרעיון של ר' 3 העקרונות (החלף, הקטן, מקד) היה פירט כדי להבטיח רווחה סוגיות נדונו בניסויים כאלה. במחקרים דלקת מעיים נמק עוף, ויוו עוף מודלים משמשים כדי לחקור את אטיולוגיה, מניעת וטיפולים זה תנאי2,3,4,5. פתוגניים זנים של החיידק נושאת גורמים התקפה אלימה ספציפיים, כגון הרעלן NetB6, מנוהלים כדי לגרום דלקת מעיים נמק של תרנגולות7. העיקרון החלפת הוא, לכן, קשה לתפיסה ולהשגה במקרה כזה כמו אלה הגורמים התקפה אלימה לא יכול להיות קריטי של מיני בעלי חיים אחרים. רוב הדגמים עבור דלקת מעיים נמק בעופות להשתמש בשילוב של גורמי סיכון, כגון כגון ושינינו דיאטה כדי לגרום דלקת מעיים נמק ואחריו gavage של תרבות מרק המכיל מספר גדול של החיידק2. מודלים אלה יגרום למחלה במספר רב של עופות, תמותה יכול להיות חשוב כזה ניסויים8, וליחסיו חששות לגבי העקרונות הפחתת ועידון מחקר בבעלי חיים.

לולאות מעיים מחוברים הן חלופה רצויה לחקר מחלות הנגרמת על ידי פתוגנים במעיים ביחס עיקרון הפחתת ולאחר עידון. מודלים אלה, מקטעי מעיים שנקרא "לולאות" נוצרים על-ידי הצבת ליגטורות לאורך צינור העיכול כדי ליצור תאים עצמאית, הרמטי איפה פתוגנים יכול להיות מוזרק לבד9 או עם מולקולות אחרות, כגון חיסון מועמדים 10 , 11. פתוגנים עניין ממוקמים קשר הדוק עם תאי המעי, אחרי כמה שעות של זמן זיהום, דגימות מעיים ניתן לשחזר לצורך ניתוח נוסף. זה מאפשר את השימוש במספר קבוצות שליטה וטיפול של אותה חיה. ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי עם דגמים מידות החוזרות ונשנות, אשר מגדילה את כוחו של אפליה בין קבוצות, מקטין את מספר תרנגולות הכרחי בהשוואה gavage אוראלי ניסויים. כמו כן, ניתוחים ושעות זיהום לאחר מכן מבוצעים תחת הרדמה כללית רציפה, שיכוך כאבים, ומכאן הקטנת הכאב בעלי חיים. לולאה סגורה ligations הם תבנית אידיאלית עבור הפחתת מספרים מארח ויצירת מערכת אנושית יותר מחקר בבעלי חיים.

לולאות מעיים מחוברים מודלים היטיב לתאר במינים שונים, כגון עגלים, שפנים, עכברים2,9, אך גרוע שמתואר תרנגולות7. לשימוש מיטבי של מודל ניתוח זה, טכניקה נכונה וביצוע חיוניים ליצירת מחוברים לולאות מעיים כדי למנוע נזקים את השלמות מעיים. המטרה של כתב יד זה היא לתאר את שיטת צעד אחר צעד ליצירת של מספר לולאות מעיים במודל של עוף. טכניקה זו הוא מוגבל על ידי מיומנותו וניסיונו של המנתח, כמו נהלים מדויקים חיוניים להצלחת הפרויקט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים עם שימוש בבעלי חיים חיים היו מורשים על-ידי הוועדה האתית של הפקולטה לרפואה וטרינרית, דה מאוניברסיטת מונטריאול (CÉUA, 'Comité d' éthique de l'utilisation des Animaux ").

1. שיקולים לפני הניתוח

  1. בחר בן 10 שבועות פתוגן מסוים חינם (SPF) לגהורן תרנגולות לניתוח.
    הערה: המשקל שלהם חייב להיות בין 1.0 ו- 1.2 ק ג.
  2. למשוך את ההזנה 12 שעות לפני ההליכים כדי לרוקן את המעיים.
  3. לפני הניתוח, מקם את התרנגולות בהרדמה כללית בעקבות פרוטוקול אומתו מרדים. Premedicate עוף כל 15 דקות לפני הניתוח עם זריקה תוך שרירית (IM) של midazolam 1 מ"ג/ק"ג ו- butorphanol 4 מ"ג/ק"ג. אני חוזר, כל 4 שעות, ההזרקה של butorphanol 4 מ"ג/ק"ג IM או כאשר השינויים דפוס הנשימה ותדירות עולה במהלך הרדמה. בהרדמה, במהלך כל ההליכים, לנהל איזופלוריין-ריכוז של בין 1.5 ל- 2.5% עם שפופרת intratracheal.
    הערה: השימוש premedication הרגעה, שיכוך כאבים מומלץ כפי שהם באופן משמעותי לשפר את העומק של הרדמה, להפחית את כמות חומרי הרדמה במהלך כל ההליכים הדרושים, וכן לאפשר לחוקרים לקבוע רמות כאב.
  4. נטר את ההרדמה בהקלטת טמפרטורת הגוף, קצב הלב, רל (א), הנשימה שיעור וקצב, חמצן, שפג תוקפו פחמן דו-חמצני (CO2) ורפלקסים נוירולוגיים.
    הערה: אדם יש להקצות לעקוב אחר פרמטרים אלה לאורך כל ההליכים.
  5. בצע את עקרונות עקרות לאורך כל הניתוחים. ודא כי המנתח ואת המנתח עוזר השמלה עם שמלות סטריליים, כפפות, מסיכה, משקפי מגן על פי פרוטוקולים ממושכות מוסדיים. ודא כי המנתח scrubs הידיים עם chlorhexidine gluconate ספוג מברשת סטרילי עד המרפק עם דגש על ציפורניים, משטח כל אצבע.
  6. לעקר את מכשירי הניתוח עם מעקר.

2. ניתוח האתר הכנה

  1. ראשית, להסיר באופן ידני את הנוצות מהבטן עם המתיחה עדינה.
  2. להשתתף באתר כירורגית במברשת chlorhexidine gluconate דטרגנט ספוג סטרילי. לשפשף בעדינות את העור מן המרכז החוצה במשך זמן ההתקשרות הכולל של 5 דקות מבלי לחזור למרכז.
  3. מבצע 3 קטעים חלופי באתר כירורגית עם chlorhexidine gluconate פתרון, אלכוהול איזופרופיל בעזרת פדים סטריליים.
    הערה: המעבר חייב להתחיל מהאמצע של האתר כירורגית את גבולות כדי למנוע הדבקות של האזורים שאינם נקיים באתר כירורגית.
  4. מניחים את הכיסוי ותאבטחי כירורגי סטרילי על העוף.

3. מיצוי של המעי הדק של חלל הבטן

  1. תחתכי את הכיסוי ותאבטחי כירורגית עם מספריים לחשוף רק את העור של האתר כירורגית.
  2. פצעים וחתכים בעור על ידי ביצוע חתך נמוך-קו האמצע של הצורה ' L ' עם להב סכין #3.
    1. להתחיל את החתך הראשון 1 ס מ סימטרית לעצם החזה, וזהו-גולגולתי כדי קלואקה 1 ס מ
    2. לבצע את החתך השני בניצב החתך הראשון. להתחיל מהסוף סימטרית של החתך הראשוני ולהמשיך 5 ס מ בצד שמאל של הבטן על ידי ביצוע קו האגן.
      הערה: פתיחה זו תיצור דש שתאפשר הוצאה קלה יותר של המעיים.
  3. עם ניתוח מספריים לחתוך את צפק ואת שרירי הבטן עם דפוס זהה לצורה "L" כדי לפתוח את חלל הבטן.
    הערה: זו תחשוף את שקי האוויר. המעיים ממוקמים מתחת מבנים אלה. שקי האוויר חייב להיות humidified עם פדים רווי סטרילי מלוחים 0.85% כדי למנוע לייבוש קרע אפשרי לכל אורך ההליך.
  4. הוספה סנוק לסירוס וו בחלל הבטן על ידי ביצוע לקיר הבטן השמאלית ולעבוד בדרך שקי האוויר בטן.
  5. בעדינות exteriorize המעיים, פרושים אלו על המגרש כירורגי.
    הערה: לשמור על המעיים humidified ע י ריסוס לעתים קרובות סטרילי-saline 0.9% לאורך כל ההליך. כמו כן, פדים humidified עם סליין סטרילי יכול להיות ממוקם על המעיים כדי להימנע לייבוש.
  6. . תפוס את המעיים בעזרת גזה סטרילי יבש ומשוך בעדינות את המעי הדק על ידי גרירה ידנית כדי לחשוף מעי צם.
    הערה: כלי מצע המעי העליון הם שבירים, המתח מופרז יכול לקרוע אותם אשר עשויים להוביל פצעים איסכמיים מעיים, לסכן באופן משמעותי את תוצאת ההליך.

4. ייצור של לולאות מעיים

  1. יצירת לולאה מס ' 1.
    1. מקום חבל פשוט בחומר polyglactin multifilament סינתטי שנספג מעי צם הפרוקסימלית על ידי הימנעות של הקשירה של כלי מצע המעי העליון הגדולות.
    2. מקום חבל דיסטלי 2 ס מ בלבד הקשירה הפרוקסימלית.
      הערה: ליגטורות פשוט עשה עם חומר תפרים multifilament ממוקמים לאורך צינור העיכול כדי ליצור מקטעי הרמטי. סכימה (איור 1) מתאר את המיקום של כל ליגטורות. הלולאות מורכב קשירה לקרע, מופרדים על-ידי 2 ס מ.
  2. יצירה של interloop מס ' 1.
    1. המקום פשוט קשירה 0.5 ס מ aborally ל הקשירה דיסטלי של לולאה מס ' 1.
      הערה: בין לולאות רצופים, יש interloops של 1 ס מ, כלומר קטעים עושה הפרדה פיזית בין הלולאות. סביר להקטין את הסיכון האפשרי של זיהום צולב של לולאה אחת לאחרת, חבל פשוט תמוקם במרכז interloop (0.5 ס מ קשירה הדיסטלי, מקורב של 2 לולאות סמוכים). זו מפחיתה את הסיכון של מזהם דלף אפשרי של לולאה כדי להגיע את הקשירה ללולאה סמוכים. מקטעים אלה אינם חובה אך יקטין את הסיכון של זיהום צולב.
  3. יצירה של לולאות עוקבות, interloops.
    1. חזור על שלבים 4.1 ו- 4.2 כדי להשיג את המספר של לולאות הרצוי.
      הערה: בניסוי זה, לולאות 9, 8 interloops נוצרו. האורך הכולל הסתכם 26 ס מ. ניתן להתאים את מספר לולאות בהתאם המחקר.

5. הזרקה של החיידק Clostridium זנים לתוך לולאות

  1. מזריקים מזרק סטרילי ואת המחט 26 גרם את הפתוגן מספר1 לולאה. הכנס בעדינות את המחט על הצד antimesenteric של המעי בזווית של 45°.
    הערה: בניסוי זה, 0.2 מ של המוח הלב אינפוזיה (BHI) המכיל 1 x 106 CFU (יחידות ויוצרים מושבה) של החיידק בשלב הצמיחה יומן אמצע הוזרק בלולאה כל. 5 זנים שונים הוזרקו בלולאות שונים 5, ה-4 הנותרים לולאות הוזרקו פקד שלילי המכיל אין חיידקים (BHI סטרילי), מתחלפים פתוגנים ולולאות BHI סטרילי.
  2. חזור על שלב 5.1 להזריק כל לולאות.
  3. בעדינות להחליף את מערכת העיכול באזור הגבי של חלל הבטן, מתחת שקי האוויר.

6. סגירת חלל הבטן

  1. התפר של צפק ואת שרירי הבטן.
    1. תפר את צפק ואת שרירי הבטן לאורך האגן (שנעשתה בשלב 3.3) עם דפוס פשוטה בתפר רצוף באמצעות polyglactin multifilament סינתטי שנספג חומר.
    2. תפר של צפק של שרירי הבטן של עצם החזה קלואקה (שנעשתה בשלב 3.3. עם דפוס פשוטה בתפר רצוף באמצעות polyglactin multifilament סינתטי שנספג חומר.
  2. התפר של העור.
    1. שימוש בחומר סינתטי multifilament polyglactin, דפוס פשוטה בתפר רצוף, סגור את החתך של העור לאורך האגן שבוצעו בשלב 3.2.
    2. שימוש באותו חומר קשירה multifilament תבנית פשוטה בתפר רצוף, סגור את החתך של העור של עצם החזה קלואקה שבוצעו בשלב 3.2.

7. לסיכום

  1. לאחר הניתוחים, לשמור את העוף בהרדמה כללית עם שימוש נכון משככי כאבים כדי למזער את חיה בכאב בזמן זיהום. המשך ניטור הרדמה כדי להבטיח רמה נאותה הרדמה.
  2. אחרי הפעם זיהום הרצוי, בצורה הומאנית המתת חסד את העוף על ידי נקע בצוואר הרחם בהרדמה כללית.
    הערה: להליכי אלו, הזמן הנדרש כדי לגרום מיקרוסקופיים נגעים עם זנים פתוגניים החיידק היה 7 שעות.
  3. עם להב סכין #3, חתך של 0.5 ס מ לחלק לולאה ארוכה 1 ס מ ומניחים אותו בפורמלין 10% עבור קיבוע לילה וניתוח נוסף histopathological.
  4. עם הלהב ומהדקים אותו, לחתוך המקטע לולאה הנותר ומניחים אותו בצינור microcentrifuge סטרילי עבור הבידוד של זנים החיידק בניתוח נוסף bacteriologic כל לולאה על אפיון גנטי שלהם.
  5. חזור על שלבים 7.2 ו- 7.3 עבור כל לולאות על-ידי שינוי הלהב האזמל בין כל לולאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תיאור סכמטי של לולאות מעיים 9, 8 interloops מוצג באיור1. במודל זה, סך של לולאות 9, 8 interloops נוצרים עם ליגטורות פשוטה. הלולאה מורכבת ליגטורות לקרע, במרווחים קבועים על ידי 2 ס מ נמדד מאמצע הקשירה הפרוקסימלית. שתי לולאות הסמוכים מופרדות interloop של 1 ס מ. כדי להקטין את הסכנה של זיהום צולב בין לולאות על ידי זליגות קשירה, קשירה interloop ממוקם באמצע הדרך מן דיסטלי קשירה קשירה הפרוקסימלית של 2 לולאות סמוכים. ניתן להתאים את מספר לולאות בהתאם לדרישות המחקר.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של לולאות מעיים מחוברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2A (HPS כתם) מציג את המראה מיקרוסקופיים ללולאה מעיים מוזרק עם מדיום סטרילי שליטה. הגבול מברשת הרירית לא נפגע ויש אין נמק נוכח במקטע. גודש קל עשוי להיות נוכח שכבות המעי (רירית, submucosa, muscularis ו serosa) של המקטעים. איור 2B (HPS כתם) מראה נמק הרירית 7 שעות לאחר ההזרקה של זן פתוגניים של החיידק Clostridium התאוששה מקרה קליני של דלקת מעיים נמק בחווה עוף. טיפים villi נשחק עם נמק enterocytes המקיפים את הטיפים villi. בחומר נמק המקיפים את villi, אשכולות של חיידקים מוט בצורת גדולים שנצפו (חיצים). חיידקים אלה זוהו נוספות כמו חיידקים גראם חיוביים עם הכתם של Twort (לא מוצג). ממצא זה, בשילוב עם הבידוד על ידי אלקטרודות מספר גדול של החיידק Clostridium, מציין הפצעים שנגרמו על ידי חיידק זה. איור 2C (HPS כתם) מראה נגעים היסטולוגית ללולאה איסכמי, איפה נמק אינו קשור ההזרקה של פתוגניים החיידק זנים אבל התוצאה של גרוע להורג הליכים. ההגדלה זה מראה נמק קרישת דם חמור זה עלול להיפרש כצעד נגעים הנגרמת על ידי החיידק Clostridium. עם זאת, אין חיידקים הם נצפו בסעיף זה. בנוסף, כלי הדם בשכבה שרירים קשות מורחבים על ידי ההצטברות של מספר גדול של אריתרוציטים המתנוונת (חיצים). זה מעיד על גודש כלי דם, במקרה זה, הגודש נגרם על ידי כלי הדם מצע המעי העליון מחוברים. לולאות איסכמי ניתן בקלות לזהות בעין בלתי מזוינת במהלך הניתוחים; בעקבות גודש כלי דם חמור, serosa יהיה כחול כהה במקום צבע ורוד-אדמדם הרגיל שלה.

Figure 2
איור 2: ממצאים Histopathologic 7 שעות לאחר הפגיעה. (א) קיימות אין נגעים עם נמק של רירית histopathology בעקבות הזריקה של המוח הלב אינפוזיה (BHI), מדיום תרבות סטרילי. (B) בלולאות הזריקו את זן פתוגניים החיידק Clostridium, שם מסומן נמק של רירית עם רבים גדולים חיידקים גראם חיוביים מוט בצורת כיסוי רירית. (ג) פצעים איסכמיים יכול להיות דומה נגעים עם נמק הנגרמת על ידי החיידק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

במחקר זה, לולאות הוזרקו מדיום תרבות שליטה סטרילי (BHI) או אחד של חמישה זנים שונים של החיידק Clostridium התאושש מן הצאן עוף ללא אנטיביוטיקה שונים מושפעים או לא עם נמק דלקת מעיים12 . עשר תרנגולות השתמשו במחקר זה. זנים פתוגניות יכול להיקבע בהתבסס על היכולת שוב ושוב לגרום נגעים תואם עם נמק דלקת מעיים כדי רירית. בעוד זנים התאוששה מקרים קליניים של נמק דלקת מעיים הראה את היכולת לגרום נמק הרירית 7 שעות לאחר הפגיעה, זנים התאוששה עוף בריא קלינית החוות לא זירוז נמק הרירית ו רירית היה דומה לרגיל ממצאים לולאות שליטה הזריק BHI12. באמצעות לולאות רבות אותה חיה, חמישה זני החיידק ולולאות שליטה ארבעה יכול לשמש הציפור אותו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לולאות מעיים מודלים תוארו במינים רבים ללמוד פתוגן-פונדקאי אינטראקציה, בפתוגנזה של מחלות הנגרמות על ידי פתוגנים מעיים שונות, כגון החיידק Clostridium, Clostridium difficile , סלמונלה enterica7,9,13,14,15. הוא גם שימש כדי לנתח את התגובה החיסונית הרירית16, היעילות של נוגדנים לנטרל רעלים חיידקי מופרש על ידי פתוגנים במעיים11 וכן להעריך מועמדים חיסון למניעת מחלות מעיים10 . עם זאת, מודל זה באמצעות לולאות מחוברים רבים חיים בודדים יחיד מתואר בצורה גרועה בעופות, סטנדרטיזציה של טכניקה זו היא הכרחית כדי להשיג תוצאות חוקית כפי מניפולציות לקוי עלול להוביל תוצאות שגויות ו- misinterpretations . כתב יד זה מראה על הקמת 9 לולאות מחוברים רצופים ממוקם על מעי ו של מערכת העיכול עוף. במחקר זה נעשה שימוש ספציפי פתוגן חינם (SPF) לגהורן עופות זכר במשקל בין 1.0 ו- 1.2 ק ג. המספר המרבי של לולאות מורשה על-ידי גזע זה על המשקל הזה היה 9, מאז 26 ס מ של המעי הדק יכול להיות אוזני בקלות מן החלל coelomic. זה לא נשלל כי באמצעות גזע אחר ו/או עוף גברית ליבורנו כבד, המספר הכולל של לולאות שנוצר עשוי להיות שונה, אפילו גבוה יותר 9. גם יכול להיות שונה אורך לולאות מעיים, אך אורך 2 ס מ נחשב אופטימלית כדי לאפשר אוסף מדגם histopathology, בקטריולוגיה תוך שימוש הקיבולת המרבית של אורך המעי זמינים.

הטכניקה לולאת המעי מחוברים המתוארות במאמר זה יכול להיות אלטרנטיבה המודלים הנוכחיים זמינים ללמוד עם נמק דלקת מעיים בעופות נגרמת על ידי החיידק Clostridiumיקרי ערך. על פי הממצאים המתוארים בסעיף הקודם12, הערכת 5 זנים של החיידק עם תרנגולות 10 היה מספיק כדי להבדיל בין מידבק מאוד, commensal זנים של החיידק. לשם השוואה, דגמים אחרים של זיהום באמצעות חיסון לכל מערכת הפעלה להתרבות עם נמק דלקת מעיים עם החיידק ידרוש מספר גדול של אנשים כדי להשיג את אותן תוצאות. בספרות, מספר ציפורים הדרושים להעריך את התקפה אלימה של זני החיידק נע בין 10 ל 30 עופות לכל קבוצה17,18,19 למארחים 100 לכל קבוצה20. לגבי העיקרון עידון לשימוש בבעלי חיים במחקר, זה להיות מומלץ להשתמש בטכניקה הדורשים את המספר הנמוך של המארחים עד להשגת תוצאות משמעותיות. המודל לולאת המעי מחוברים המתוארות במאמר זה הוא ככל הנראה המודל הדורשים את המספר הנמוך של תרנגולות כדי להשוות את התקפה אלימה של זנים של החיידק .

מאז זיהום על ידי זליגות קשירה יוכל להעריך רק לאחר התרבות החיידק ואפיון מאת פעמו שדה בג'ל (PFGE) ימים רבים לאחר ההליכים, זה היה בעל חשיבות עליונה כדי למזער את זה הסיכון על-ידי הכללת 1 ס מ interloops המכיל של קשירה interloop באמצע הדרך בין 2 לולאות סמוכים. על-ידי נקיטת אמצעי זהירות אלה, ניתן היה למנוע זיהום אפשרי. ואכן, בעוד זנים פתוגניים גרם מיקרוסקופיים נמק נגעים concordant עם דלקת מעיים נמק, שם היו אין נגעים מיקרוסקופיים משמעותי בלולאות הסמוכות הזריק פתוגניים שאינם זני החיידק או BHI את תרבות בינוני בקרה שלילית. זה היה מעיד כי זנים שונים יכול להיות בבטחה מוזרק בלולאות המעי הסמוך של העוף אותו.

אחד הנושאים המאתגרים ביותר עם מודל זה היה כיציאה מתוך הגוף של המעי הדק מבלי להתפשר על איוורור ו vascularization מעיים. . לציפורים יש מערכת הנשימה שונה מאשר יונקים. הסרעפת נעדר, אוורור נשלטת על-ידי airsacs, דק עם קירות מבנים בחלל הבטן. ישנם 7 אלו בעופות, הם מחולקים את צוואר הרחם (1), בית החזה הקדמי (2), בית החזה אחורי (2), בטן שקי האוויר (2). המבנים האלה, כמו בלון מחובר ישירות אל הריאות ולאפשר תנועת האוויר במערכת הנשימה. בעת פתיחת חלל הבטן בין החזה קלואקה, airsacs בטן בולטות, נוטים להיות נקרע בקלות, במיוחד אם היא יבשה. מסיבה זו, לחות מתמדת עם פדים damped עם מלח סטרילית חשוב להקל על אוורור נאות והרדמה במהלך הליכי. בנוסף, זה יכול להיות קשה להימנע דקירות קטנות ב airsacs הבטן תוך כדי exteriorizing את המעיים מתוך חלל הבטן. חשוב לעקוב אחר פרמטרים הרדמה, כגון קצב נשימה, דפוס, רפלקסים palpebral, קצב הלב, התנועות של עוף, כדי לוודא שהעוף נשאר תחת מטוס נאותה של הרדמה. דליפת אוויר קטן הוא פחות סביר להניח משפיעים על האיכות של הרדמה, אך יש למזער את הדימום הזה. חשוב לסגור הרמטית של הצפק לאחר ההליכים. זה מחדש את לחץ האוויר הפנימי, אוורור נחזור לשגרה לאחר שלב זה. לאחר הסגר של המבנה הזה, צריך להיות דליפת אוויר לא מהבטן. זה יכול להיות מאומת על ידי התזת כמות קטנה של מלח סטרילית על התפרים וחפש בועה היווצרות אנלוגיים האוויר מגיע חלל הבטן. במקרה כזה, ניתן להניח התפרים עור פשוטה נוספים באתר בריחת אוויר.

היבט נוסף טכנית מאתגר קשורה הסיכון של פצעים איסכמיים פיתוח במעי הדק עקב ניתוחים שבוצעו בצורה גרועה. איסכמיה קורה כאשר יש מגבלה של אספקת הדם לרקמות, גורם מחסור חמצן ומולקולות אחרות לצורך חילוף החומרים הסלולר. במקרה זה, המעי יהפוך במהירות כחול כהה בעין בלתי מזוינת במקום ורוד-אדמדם, תאי הרירית מעיים יתנוון במהירות. זה יגרום פצעים איסכמיים שאינן קשורות לגורם המחלה מוזרק, שהדבר יפריע הפרשנות histopathological. בשני מצבים בעייתיים יכול להוביל איסכמיה. ראשית, קשירה של כלי מצע המעי העליון על ידי בהיסח יגרום מצב זה. מסיבה זו, חשוב להסתכל בזהירות על הצבת ליגטורות לאורך צינור העיכול כדי להימנע כולל כלי מצע המעי העליון. שנית, איסכמיה יכול לקרות אם שטפי דם של כלי מצע המעי העליון להתרחש במהלך ההליכים. מבנים אלה הם חומה דק ושברירי. המתח מופרז יכול להוביל קרע שלהם, בעוד באופן ידני exteriorizing המעיים, תשומת הלב צריך להינתן המתח על כלי מצע המעי העליון כדי להבטיח את שלמות שלהם במהלך שלב זה. כלי מצע המעי העליון דימום יכול להתרחש גם אם אלה הם ניקבו עם מחט תפירה. המנתח חייב להסתכל בזהירות על המיקום חדרה מבעד מצע המעי עם המחט. ניתן לעצור דימום בשני המצבים, אך תהליך קרישת הדם להפסיק או להפחית באופן משמעותי את זרימת הדם במעיים מקטעים אלה, ומכאן גרימת פצעים בלתי הפיך ולחשוף את תוקפו של התוצאות.

מודל זה הינו שימושי עבור חקר אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, בפתוגנזה של מחלות מעיים הנגרמות ע"י מדבקים. המודל המוצע ניתן להתאים בהתאם המחקר על-ידי שינוי מספר לולאות שנוצרו או על-ידי שינוי האורך של כל לולאה. לפני יישום שינויים כאלה, מומלץ לתקנן את השיטה כדי להבטיח תוצאות משמעותיות. מגבלות של טכניקה זו מונחה מיומנות, רק צוות מיומן כראוי, יש לבצע ניתוח זה בבעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הכיסא במחקר עופות (Boulianne מ') מן הפקולטה לרפואה וטרינרית של דה מאוניברסיטת מונטריאול. ד"ר Boulianne, האב פיתח את המודל. ד"ר Boulianne, האב לבצע את הניתוחים. ד ר ברנס סייע בפיתוח פרוטוקול הרדמה. ד ר הורה לערוך הוידאו וכתב את כתב היד. Drs ברנס, Desrochers ו- Boulianne לערוך את כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2, (1), 1-4 (2015).
  2. Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. (2015).
  3. Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41, (1), 112-116 (1977).
  4. Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21, (2), 230-240 (1977).
  5. Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56, (4), 1229-1231 (1977).
  6. Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4, (2), e26 (2008).
  7. Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32, (6), 503-512 (2009).
  8. Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45, (3), 365-369 (2016).
  9. Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149, (1), 103-112 (2013).
  10. Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47, (1), 52 (2016).
  11. Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12, (1), 101 (2016).
  12. Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46, (2), 138-149 (2017).
  13. Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7, (9), e45608 (2012).
  14. Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68, (12), 7122-7125 (2000).
  15. Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40, (1), 5 (2009).
  16. Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256, (1-2), 19-33 (2001).
  17. Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
  18. Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16, (3), 289-292 (2010).
  19. Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142, (3-4), 323-328 (2010).
  20. Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51, (4), 834-839 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics