麻醉特异性病原体游离鸡结扎肠环模型研究荚梭菌毒力

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Summary

在这里, 我们提出了一个在鸡小肠中手术创建 ' 肠结扎循环 ' 的协议。本程序允许在单个宿主中对多个菌株的毒力进行原位比较。这种方法明显地减少了通常需要的鸡的数量在类似的体内实验。

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Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

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Abstract

采用各种体内感染模型对鸡进行坏死肠炎的研究。大多数这些使用的诱发因素的组合, 如球虫病和饮食, 与灌胃或管理通过饲料使用荚梭菌。在这些模型中, 多菌株对毒力研究的比较需要大量的主机来获得显著的结果。在研究过程中, 死亡率可能会很高, 这取决于实验模型, 因此在研究中提高了对动物福利的伦理关注。新的感染模型的开发需要较少的动物来研究发病机制, 但提供统计学上的显著和有效的结果, 在减少动物在研究中的使用是重要的。肠道结扎环模型已被用于研究梭菌感染的各种物种, 如小鼠, 兔和小牛。在手术过程中创建结扎环段, C. 荚菌株直接注入循环中, 在细菌和肠道粘膜之间建立密切接触。小肠和管腔的样本在程序终止后几个小时后采取。可以在每种动物中接种多个细菌菌株, 从而减少实验中所需的受试者数量。同时, 在全身麻醉下进行手术以减少动物疼痛。在鸡中, 这种模式比口服施用更适合菌株致病性, 因为需要较少的动物, 不需要诱发因素诱发疾病, 疼痛由止痛药控制。.鸡小肠结扎环模型的描述不充分, 标准化是其最佳使用的必要条件。这份手稿提供了所有必要的步骤, 以创建大量的肠道结扎循环在鸡和带来的关键点信息, 以获得有效的结果。

Introduction

使用动物模型来研究影响人类和动物的传染性疾病, 是评估控制特定疾病发病机制的毒力因素以及制定预防或治疗疾病的策略的中心工具1。尽管使用动物模型来研究各种疾病有许多优点, 但对这种做法的伦理关注却是产生的。研究人员需要尽量减少动物的使用, 同时获得显著和有效的结果。制定了3《 Rs 原则 (替换、减少和改进) 的概念, 以确保在这种审判中处理福利问题。在鸡坏死性肠炎研究中,体内鸡模型用于调查这种情况的病因、预防和治疗2345携带特定毒力因子, 如 NetB 毒素6的致病菌株, 被管理导致鸡坏死性肠炎7。因此, 替换原则在这种情况下很难实现, 因为这些毒力因子在其他动物物种中可能不那么重要。大多数鸡坏死性肠炎模型使用的危险因素的组合, 如球虫病和改变的饮食诱导坏死肠炎后, 灌胃的肉汤培养含有大量的C. 荚2.这些模型将导致大量的鸡的疾病, 死亡率可以是重要的在这种试验8, 从而引起关注的减少和细化原则在动物研究。

肠道结扎循环模型是研究肠道病原体引起的疾病的一种可取的替代方法, 以减少其原理和细化。在这些模型中, 被称为 ' 循环 ' 的肠道片段通过在肠道上放置连字来形成独立和密闭的隔间, 在这种情况下, 病原体可以单独注射9或与其他分子, 如疫苗候选10,11. 有兴趣的病原体与肠道细胞密切接触, 经过几个小时的感染时间, 可以恢复肠道样本以作进一步分析。这允许使用在同一动物的多个治疗和控制组。统计分析可以通过重复测量模型进行, 这增加了群体之间的歧视的力量, 减少了必要的鸡的数量相比口服灌胃试验。此外, 手术过程和随后的感染时间在持续全身麻醉和镇痛下进行, 从而尽量减少动物疼痛。闭环结扎是减少主机数量和创建更人性化的动物研究系统的理想模板。

肠道结扎循环模型在不同的物种, 如小牛, 兔子和小鼠2,9, 但在鸡7描述很差的描述。为了最有效地使用这个手术模型, 正确的技术和执行对于建立结扎的肠道循环, 以避免损害肠道完整性是必不可少的。本手稿的目的是描述一步一步的方法在创建在鸡模型的多个肠道循环。这种技术受外科医生的技能和经验的限制, 因为准确的程序对于项目的成功至关重要。

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Protocol

所有使用活体动物的程序均由蒙特利尔大学兽医学院道德委员会 (CÉUA, éthique ' Animaux ') 授权。

1. 手术前的注意事项

  1. 选择10周老特定病原体免费 (SPF) 里窝那鸡进行手术。
    注: 重量必须介于1.0 到1.2 公斤之间。
  2. 取出饲料12小时前的程序清空肠道。
  3. 手术前, 按照麻醉师验证的协议将鸡置于全身麻醉下。Premedicate 每只鸡15分钟手术前与肌内 (IM) 注射咪唑安定1毫克/千克和布托啡诺4毫克/公斤。重复, 每4小时, 注射布托啡诺4毫克/千克 IM 或当呼吸模式改变和频率增加在麻醉期间。对于全身麻醉, 在所有的过程中, 使用气管管在1.5 和2.5% 之间的浓度下管理异氟醚。
    注意: 建议使用术前用药进行镇静和镇痛, 因为它们将显著提高麻醉深度, 减少所有手术过程中必要的麻醉剂数量, 并使研究人员能够控制疼痛水平。
  4. 通过记录体温、心率和心电图 (ECG)、呼吸速率和节律、氧饱和度、过期二氧化碳 (CO2) 和神经系统反射来监测麻醉。
    注意: 必须指派人员在所有过程中监视这些参数。
  5. 在整个手术过程中遵循无菌原则。根据机构术前协议, 确保外科医生和助理外科医生穿着无菌长袍、手套、口罩和防护护目镜。确保外科医生用葡萄糖酸己定浸渍无菌刷到肘部, 重点放在指甲和每个手指表面上擦洗手。
  6. 用灭菌器消毒手术器械。

2. 手术现场准备

  1. 首先, 用轻柔的牵引手动去除腹部的羽毛。
  2. 用葡萄糖酸己定洗涤剂浸渍无菌刷擦洗手术部位。轻轻擦洗皮肤从中心到外面的总接触时间5分钟, 而不返回到中心。
  3. 使用无菌纱布, 用葡萄糖酸盐溶液和异丙醇在手术部位执行3个备选通道。
    注意: 该通道必须从手术部位的中间开始到边界, 以避免未经消毒的区域到手术部位的污染。
  4. 将无菌手术悬垂在鸡肉上。

3. 从腹腔提取小肠

  1. 用剪刀切割手术的悬垂, 只露出手术部位的皮肤。
  2. 通过使用手术刀刀片 #3 执行 "L" 型低中线切口, 切割皮肤。
    1. 开始第一切口1厘米的尾部到胸骨和结束它在1厘米颅骨到泄殖腔。
    2. 执行垂直于第一切口的第二个切口。从第一切口的尾端开始, 然后按照骨盆线继续5厘米到腹部左侧。
      注意: 这个开口将创建一个皮瓣, 将允许更容易提取肠道。
  3. 用手术剪刀, 用相同的 "L" 形模式切割腹膜和腹部肌肉, 打开腹腔。
    注意: 这将暴露气囊。肠道位于这些结构下面。气囊必须加湿纱布饱和与无菌盐水 0.85%, 以避免干燥和可能破裂整个过程。
  4. 在腹腔插入一个绝育钩, 通过跟随左腹壁和工作的方式围绕腹部气囊。
  5. 轻轻取出肠道, 然后在手术场上传播这些。
    注意: 经常喷洒无菌盐水0.9% 在整个过程中保持肠道湿润。此外, 纱布加湿与无菌盐水可以放在肠道, 以避免脱水。
  6. 使用干燥的无菌纱布抓住肠道, 通过手动牵引轻轻拉出小肠, 以暴露空肠。
    注意: 肠系膜血管是脆弱的, 过度紧张可能会导致肠道缺血性病变, 并极大地损害手术的结果。

4. 肠道循环的制备

  1. 创建环路1。
    1. 通过避免主要肠系膜血管的结扎, 在近端空肠放置一个 polyglactin 复丝合成可吸收材料的简单结扎。
    2. 将远端结扎距离近端结扎2厘米。
      注意: 使用复丝缝合材料制成的简单连字沿肠道放置, 以创建密封段。架构 (图 1) 描述了所有连字的位置。循环由近端和远端连字隔开, 由2厘米分隔。
  2. 创建 interloop 号1。
    1. 将一个简单的连字0.5 厘米 aborally 到1号环路的远端结扎。
      注意: 在连续循环之间, 有1厘米的 interloops,在循环之间进行物理分离的线段。为了可能降低交叉污染的可能风险从一个循环到另一个, 一个简单的连字被放置在中间的 interloop (0.5 厘米从远端和近端结扎2相邻的环路)。这样可以减少循环中可能泄漏的污染物的风险, 从而达到相邻环路的连字。这些段不是强制性的, 但会降低交叉污染的风险。
  3. 创建后续循环和 interloops。
    1. 重复步骤4.1 和4.2 以获取所需的循环数。
      注意: 在本实验中, 创建了9循环和 8 interloops。总长度达26厘米。根据研究, 可以调整循环数。

5.荚梭菌注射到循环中

  1. 注射与无菌注射器和针 26 G 的病原体在环路 no. 1。用45°的角度轻轻地将针头插入肠道的 antimesenteric 侧。
    注: 在本实验中, 在每个循环中注射了0.2 毫升脑心脏输液 (BHI), 其中含有 1 x 106在中对数生长阶段的菌落形成单元。5种不同菌株注射在5个不同的循环和4剩余的循环被注射了阴性控制不含细菌 (无菌 BHI), 交替病原体和无菌 BHI 循环。
  2. 重复步骤5.1 以注入所有循环。
  3. 在腹腔的背区, 在气囊下面轻轻地替换肠道。

6. 腹腔闭合

  1. 腹膜和腹部肌肉的缝合。
    1. 缝合腹膜和腹部肌肉沿骨盆 (步骤 3.3) 与一个简单的连续缝合模式使用 polyglactin 复丝合成可吸收材料。
    2. 将腹膜和腹部肌肉从胸骨缝合到泄殖腔 (在步骤3.3 中进行. 使用 polyglactin 复丝合成可吸收材料的简单连续缝合模式。
  2. 皮肤的缝合。
    1. 使用 polyglactin 复丝合成材料和简单的连续缝合图案, 在步骤3.2 中的骨盆上闭合皮肤切口。
    2. 使用相同的复丝结扎材料和简单的连续缝合模式, 关闭皮肤切口从胸骨到在步骤3.2 中所做的泄殖腔。

7. 结论

  1. 手术后, 保持鸡在全身麻醉下适当使用止痛药, 以尽量减少在感染时间的动物疼痛。继续麻醉监测, 以确保足够的麻醉水平。
  2. 在所需的感染时间后, 在全身麻醉下, 人道安乐死鸡颈脱位。
    注意: 对于这些过程, 所需的时间诱导显微病变与C. 荚致病菌株是7小时。
  3. 用手术刀刀片 #3, 切0.5 厘米到1厘米长的循环部分, 并将其放置在10% 福尔马林, 用于固定过夜和进一步的病理组织学分析。
  4. 使用相同的手术刀刀片, 剪切剩余的循环部分并将其放置在无菌微量离心管中, 以便在每个循环中分离菌株, 进一步细菌学分析其基因表征。
  5. 通过在每个循环之间更改手术刀刀片, 对所有循环重复步骤7.2 和7.3。

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Representative Results

图 1显示了9肠道循环和 8 interloops 的示意图。在此模型中, 使用简单连字创建总共9个循环和 8 interloops。一个循环由近端和远端连字间隔2厘米测量从近距离结扎。两个相邻的环路由1厘米的 interloop 隔开。为了减少交叉污染循环之间的可能的风险从一个连字的泄漏, interloop 连字被放置在中间的方式从远端结扎和近端结扎2相邻环路。循环的数量可以根据研究的要求进行调整。

Figure 1
图 1: 结扎肠循环的示意图表示.请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 2A(HPS 染色) 显示了用控制无菌培养基注射的小肠循环的显微外观。粘膜笔刷边框完好无损, 部分无坏死。轻度充血可能存在于肠道层 (粘膜, 黏膜下层, 肌层, 和浆膜) 的部分。图 2B(HPS 染色) 显示在鸡场坏死性肠炎的临床病例中,荚梭菌的致病菌株注射后7小时粘膜坏死。绒毛提示被侵蚀与坏死 enterocytes 周围绒毛提示。在绒毛周围的坏死物质中, 观察到大杆状细菌的聚集 (箭头)。这些细菌进一步被鉴定为革兰阳性菌与特沃特的污点 (未显示)。这一发现与大量荚梭菌的细菌分离相结合, 表明病变是由这种细菌引起的。图 2C(HPS 染色) 显示缺血性循环的组织学病变, 其中坏死与注射致病性C. 荚菌株无关, 但执行不当的程序的结果。这种放大显示严重的凝血坏死, 可能被误解为荚梭菌引起的病变。但是, 本节未观察到细菌。此外, 肌肉层中的血管通过大量退化红细胞 (箭头) 的积累而严重扩张。这表明血管充血, 在这种情况下, 充血是由结扎肠系膜血管引起的。在手术过程中, 可以很容易地发现缺血性循环;严重的血管阻塞后, 浆膜将是深蓝色, 而不是其正常粉红色-红色的颜色。

Figure 2
图 2: 病理学发现 7 h 后感染.(a)在注射脑心脏输液 (BHI) (无菌培养基) 后, 粘膜上没有坏死性病变。(B)荚梭菌致病菌株注射的循环中, 有明显的粘膜坏死, 有许多大革兰阳性的棒状细菌覆盖粘膜。(c)缺血性病变可类似于引起的坏死性病变。请点击这里查看这个数字的更大版本.

在本研究中, 使用无菌控制培养培养基 (BHI) 或五种不同菌株的从不同的无抗生素鸡群中回收, 并对坏死性肠炎进行了循环注射12.本研究使用了十只鸡。菌株的致病性可以根据反复引起病变的能力来确定, 与坏死肠炎相容。从坏死性肠炎临床病例中恢复的菌株显示, 感染后7小时粘膜坏死的能力, 从临床健康鸡场中恢复的菌株并没有引起黏膜坏死, 粘膜与正常BHI12注入的控制回路的结果。在同一动物中使用许多循环, 五C. 荚菌株和四控制回路可用于同一鸟。

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Discussion

肠道循环模型已被描述在许多物种, 以研究寄主病原体相互作用和疾病的发病机制, 如梭菌, 梭杆菌和沙门氏菌起因7,9,13,14,15。它也被用来分析黏膜免疫反应16, 抗体的效果, 以消除肠道病原体排泄的细菌毒素11和评估疫苗候选者预防肠道疾病10.然而, 这个模型使用大量的结扎循环在单个单独的动物是不太描述在鸡和标准化这项技术是强制性的, 以获得有效的结果, 因为不当的操作可能会导致错误的结果和误解.这份手稿显示了9个连续结扎环位于鸡胃肠道的空肠和回肠。本研究使用了特定的病原体免费 (SPF) 里窝那雄性鸡, 体重介于1.0 和1.2 公斤之间。这个品种允许的最大循环数量在这个重量是 9, 因为26厘米小肠可以很容易地从体腔腔形象化。它不排除, 通过使用另一个品种和/或较重的里窝那雄性鸡, 创建的循环总数可能不同, 甚至高于9。肠循环长度也可以修改, 但2厘米长被认为是最佳的, 以允许样本收集病理学和细菌学, 同时使用最大容量的可用肠道长度。

本文所述的肠道结扎环技术可以作为现有模型研究荚梭菌引起的鸡坏死性肠炎的一种有价值的替代方法。根据前一篇文章12所述的结果, 对10只鸡的 5 C. 荚菌株的评价足以区分高毒和共生菌株的C. 荚。相比之下, 其他感染模型使用每操作系统接种繁殖坏死性肠炎与C. 荚将需要大量的个人获得相同的结果。在文献中, 鸟类的数量需要评估C. 荚菌株的毒力范围从10到30鸡每组17,18,19到100主机每组20。关于动物在研究中使用的细化原则, 建议使用需要最低数量主机的技术获得显著的结果。本文描述的肠道结扎环模型最有可能是需要最低数量的鸡的模型比较菌株的毒力。

由于连串泄漏的交叉污染只能在C. 荚培养和脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 表征后的许多天后的程序, 这是最重要的是最小化这风险由包括1厘米 interloops 包含 interloop 结扎中间方式之间2相邻的环路。通过采取这些预防措施, 可以避免可能的交叉污染。事实上, 虽然致病菌株引起的微小坏死病变与坏死性肠炎一致, 但在非致病性C. 荚菌株或 BHI 培养基中没有明显的显微病变。负控制。这表明, 不同菌株可以安全地注射在同一鸡的相邻肠道循环。

这个模型最具挑战性的问题之一是小肠外部, 而不影响通气和肠道血管化。鸟类与哺乳动物有不同的呼吸系统。隔膜不存在, 通风由腹腔内 airsacs、薄壁结构控制。有7这些在鸡和他们被分为在子宫颈 (1), 前胸 (2), 后胸 (2) 和腹部 (2) 气囊。这些气球状结构直接连接到肺部, 并允许在呼吸道的空气移动。在胸骨和泄殖腔之间打开腹腔时, 腹部 airsacs 突出, 容易破裂, 特别是在干燥的时候。因此, 使用无菌盐水纱布阻尼的恒定加湿对于在手术过程中缓解适当的通气和麻醉非常重要。另外, 在腹部 airsacs 时, 避免小的穿刺是很困难的, 而 exteriorizing 腹腔的肠道。重要的是要监测麻醉参数, 如呼吸速率和模式, 眼睑反射率, 心率和鸡的运动, 以确保鸡留在适当的麻醉平面下。小漏气不太可能影响麻醉质量, 但这种泄漏必须最小化。在手术后关闭腹膜是很重要的。这将重建内部气压和通风将恢复正常后, 这一步。这种结构闭合后, 腹部不应漏气。这可以通过喷洒少量的无菌盐水在缝线上进行验证, 并寻找气泡形成指示来自腹腔的空气。如果发生这种情况, 可以在漏气部位放置额外的简单皮肤缝合线。

另一个技术上具有挑战性的方面是与缺血性病变发展的风险在小肠由于执行不当手术程序。缺血发生时, 有对组织的血液供应的限制, 造成缺氧和其他分子细胞新陈代谢所需的。在这种情况下, 肠道将迅速变成宏观的深蓝色而不是粉红色-红色, 肠道粘膜细胞将很快退化。这将导致与注射的病原体无关的缺血性病变, 它会干扰病理学解释。两个问题的情况可能导致缺血。首先, 粗心大意的肠系膜血管结扎将导致这种情况。因此, 必须仔细观察肠道的连字放置, 以避免包括肠系膜血管。第二, 如果在手术过程中发生肠系膜血管出血, 就会发生缺血。这些结构是薄壁和脆弱的。过度的紧张可能导致他们的破裂, 而手动 exteriorizing 肠道, 应注意肠系膜上血管的张力, 以确保他们在这一步的完整性。此外, 肠系膜血管出血可能发生, 如果这些被刺穿与外科缝合针。外科医生必须仔细观察通过肠系膜刺穿针的位置。出血可以在两种情况下停止, 但凝固过程将停止或显著减少血液流向这些肠道, 从而导致不可逆转的病变和损害结果的有效性。

该模型可用于研究感染性药物引起的肠道疾病的寄主病原体相互作用和发病机制。通过更改创建的循环数或修改每个循环的长度, 可以根据研究来调整所建议的模型。在实施此类更改之前, 建议标准化该方法以确保显著的结果。这种技术的局限性是以技能为导向的, 只有经过适当训练的人员才能在活体动物身上进行这种手术。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了蒙特利尔大学兽医学院家禽研究 (m. Boulianne) 主席的支持。Boulianne 和家长开发了模型。Boulianne 和家长进行了手术。伯恩斯博士协助制定了麻醉协议。家长博士编辑了这部影片并写了手稿。Drs 烧伤, Desrochers 和 Boulianne 编辑了手稿。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

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