Anesthetized विशिष्ट रोगज़नक़ में एक Ligated आंत्र पाश मॉडल नि: शुल्क मुर्गियों का अध्ययन करने के लिए क्लोस्ट्रीडियम Perfringens डाह

Medicine

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Summary

यहाँ हम शल्य चिकित्सा के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान चिकन छोटी आंत में ' आंत्र ligated छोरों ' बनाने के लिए । यह प्रक्रिया एक एकल मेजबान में सीटू में मल्टीपल क्लोस्ट्रीडियम perfringens उपभेदों ' डाह की तुलना के लिए अनुमति देता है । इस विधि के रूप में आम तौर पर vivo प्रयोगों में इसी तरह के लिए आवश्यक मुर्गियों की संख्या कम हो जाती है.

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Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

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Abstract

गल आंत्रशोथ विवो संक्रमण मॉडल में विभिन्न का उपयोग मुर्गियों में अध्ययन किया गया था । इनमें से अधिकांश क्लोस्ट्रीडियम perfringensका उपयोग कर फ़ीड के माध्यम से gavage या प्रशासन के साथ, ऐसे coccidiosis और आहार के रूप में संवेदनशील कारकों का एक संयोजन का उपयोग करें । इन मॉडलों में, डाह अध्ययन के लिए एकाधिक सी perfringens उपभेदों की तुलना मेजबानों की एक बड़ी संख्या में महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने की आवश्यकता है । अध्ययन के दौरान मृत्यु दर प्रयोगात्मक मॉडल के आधार पर उच्च हो सकता है, इसलिए अनुसंधान में पशु कल्याण के संबंध में नैतिक चिंताओं को उठाना । रोगजनन अध्ययन करने के लिए कम जानवरों की आवश्यकता होती है नए संक्रमण मॉडल के विकास, अभी तक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण और मान्य परिणाम प्रदान, अनुसंधान में पशु उपयोग को कम करने में महत्वपूर्ण है. आंतों ligated लूप मॉडल जैसे चूहों, खरगोशों और बछड़ों के रूप में विभिन्न प्रजातियों में clostridial संक्रमण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । ligated पाश क्षेत्रों बनाने के लिए सर्जिकल प्रक्रियाओं के बाद, सी perfringens उपभेदों बैक्टीरिया और आंतों की श्लेष्मा झिल्ली के बीच एक करीबी संपर्क स्थापित करने के लिए छोरों में सीधे इंजेक्शन रहे हैं. छोटी आंत और चमकदार सामग्री के नमूनों को कुछ घंटों के बाद प्रक्रियाओं की समाप्ति पर लिया जाता है । एकाधिक जीवाणु उपभेदों प्रत्येक जानवर में inoculated जा सकता है, इसलिए प्रयोगों में आवश्यक विषयों की संख्या को कम करने. इसके अलावा, प्रक्रियाओं सामान्य संज्ञाहरण के तहत प्रदर्शन करने के लिए पशु दर्द को कम कर रहे हैं । मुर्गियों में, इस मॉडल perfringens तनाव pathogenicity तुलना करने के लिए मौखिक प्रशासन की तुलना में अधिक उपयुक्त होगा क्योंकि कम जानवरों की जरूरत है, कोई अधिक संवेदनशील कारकों रोग पैदा करने के लिए आवश्यक हैं, और दर्द एनाल्जेसिक द्वारा नियंत्रित किया जाता है . आंतों ligated पाश मॉडल खराब मुर्गियों में वर्णित है और मानकीकरण इसके इष्टतम उपयोग के लिए आवश्यक है. इस पांडुलिपि मुर्गियों में कई आंत्र ligated छोरों बनाने के लिए सभी आवश्यक कदम प्रदान करता है और मान्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण बिंदुओं पर जानकारी लाता है ।

Introduction

पशु मॉडलों के प्रयोग से मानव और पशुओं को प्रभावित करने वाले संक्रामक रोगों का अध्ययन करने के लिए एक विशिष्ट स्थिति के रोगजनन विनियमन डाह कारकों का आकलन करने में एक केंद्रीय उपकरण के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोकने या रोगों का इलाज करने के लिए विस्तृत रणनीतियों1. विभिंन रोगों का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडलों का उपयोग करने के कई फायदे के बावजूद, इस अभ्यास के बारे में नैतिक चिंताओं उत्पंन कर रहे हैं । शोधकर्ताओं ने महत्वपूर्ण और वैध परिणाम प्राप्त करते हुए पशु उपयोग को कम करने की जरूरत है । 3 रु सिद्धांतों की अवधारणा (बदलें, कम और परिष्कृत) यह सुनिश्चित करने के लिए कि कल्याण मुद्दों को इस तरह के परीक्षणों में संबोधित किया गया सविस्तार था । चिकन गल आंत्रशोथ अध्ययनों में, vivo चिकन मॉडल में एटियलजि, रोकथाम, और इस हालत2,3,4,5के उपचार की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है । perfringens के रोगजनक उपभेदों NetB विष6के रूप में विशिष्ट डाह कारकों, ले जाने,7मुर्गियों में गल आंत्रशोथ कारण प्रशासित रहे हैं । प्रतिस्थापन सिद्धांत है, इसलिए, इन डाह कारकों के रूप में इस तरह के मामले में प्राप्त करने के लिए मुश्किल अन्य पशु प्रजातियों में के रूप में महत्वपूर्ण नहीं हो सकता है. मुर्गियों में गल आंत्रशोथ के लिए ज्यादातर मॉडल coccidiosis और बदल आहार के रूप में जोखिम कारकों का एक संयोजन का उपयोग करें, आंत्रशोथ पैदा करने शोरबा संस्कृति के gavage द्वारा पीछा किया ग. perfringens2की बड़ी संख्या में शामिलहै । इन मॉडलों मुर्गियों की एक बड़ी संख्या में रोग पैदा होगा, और मृत्यु इस तरह के परीक्षण8में महत्वपूर्ण हो सकता है, इस प्रकार की कमी और पशु अनुसंधान में शोधन सिद्धांतों के बारे में चिंताओं को उठा ।

आंतों ligated छोरों मॉडल सिद्धांत कमी के संबंध में आंत्र रोगजनकों द्वारा प्रेरित रोगों के अध्ययन के लिए एक वांछनीय विकल्प हैं, और शोधन. इन मॉडलों में, आंतों क्षेत्रों ' नामक छोरों ' आंत्र पथ के साथ लिगेचर्स रखकर बनाया जाता है स्वतंत्र और hermetic डिब्बों के रूप में जहां रोगजनकों अकेले इंजेक्शन किया जा सकता9 या अन्य अणुओं के साथ, ऐसे वैक्सीन उंमीदवारों के रूप में 10 , 11. ब्याज के रोगजनकों आंत्र कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क में रखा जाता है और संक्रमण के समय के कुछ ही घंटों के बाद, आंतों के नमूने आगे विश्लेषण के लिए बरामद किया जा सकता है । यह एक ही जानवर में एकाधिक उपचार और नियंत्रण समूहों के उपयोग की अनुमति देता है । सांख्यिकीय विश्लेषण दोहराया उपाय मॉडल है, जो समूहों के बीच भेदभाव की शक्ति बढ़ जाती है और मौखिक gavage परीक्षणों की तुलना में आवश्यक मुर्गियों की संख्या कम कर देता है के साथ किया जा सकता है । इसके अलावा, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और बाद में संक्रमण बार लगातार सामान्य संज्ञाहरण और analgesia के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं, इसलिए जानवरों के दर्द को कम करने. बंद लूप ligations मेजबान संख्या को कम करने और पशु अनुसंधान में एक और अधिक मानवीय प्रणाली बनाने के लिए एक आदर्श टेंपलेट हैं ।

आंतों ligated छोरों मॉडल अच्छी तरह से विभिन्न प्रजातियों में वर्णित हैं, जैसे बछड़ों, खरगोश और चूहों2,9, लेकिन खराब7मुर्गियों में वर्णित. इस शल्य चिकित्सा मॉडल का एक इष्टतम उपयोग के लिए, उचित तकनीक और निष्पादन ligated आंत्र छोरों के निर्माण के लिए आंतों की अखंडता के लिए नुकसान से बचने के लिए आवश्यक हैं । इस पांडुलिपि का लक्ष्य एक चिकन मॉडल में कई आंत्र छोरों के निर्माण में कदम विधि द्वारा एक कदम का वर्णन करने के लिए है । इस तकनीक के सर्जन कौशल और अनुभव द्वारा सीमित है, के रूप में सटीक प्रक्रियाओं परियोजना की सफलता के लिए आवश्यक हैं ।

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Protocol

जीवित पशु उपयोग के साथ सभी प्रक्रियाओं पशु चिकित्सा, विश्विद्यालय डी मॉंट्रियल (CÉUA, ' Comité d'éthique de l'utilisation des Animaux ') के संकाय की नैतिक समिति द्वारा प्राधिकृत किया गया ।

1. सर्जरी से पहले विचार

  1. 10 सप्ताह पुरानी विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (SPF) सर्जरी के लिए भाफ मुर्गियों का चयन करें ।
    नोट: उनका वजन १.० और १.२ किग्रा के बीच होना आवश्यक है ।
  2. आंत्र पथ खाली करने के लिए प्रक्रियाओं से पहले फ़ीड 12 एच वापस ले लो ।
  3. सर्जरी से पहले, एक anesthesiologist द्वारा सत्यापित प्रोटोकॉल के बाद सामान्य संज्ञाहरण के तहत मुर्गियों जगह. पूर्व औषधि प्रत्येक चिकन 15 मिनट एक इंट्रामस्क्युलर (आईएम) मिदाजोलम के इंजेक्शन के साथ सर्जरी से पहले 1 मिलीग्राम/kg और butorphanol 4 मिलीग्राम/ दोहराएँ, हर 4 एच, butorphanol के इंजेक्शन 4 मिलीग्राम/kg IM या जब संज्ञाहरण के दौरान श्वास पैटर्न में परिवर्तन और आवृत्ति बढ़ जाती है. सामान्य संज्ञाहरण के लिए, सभी प्रक्रियाओं के दौरान, एक intratracheal ट्यूब के साथ १.५ और २.५% के बीच एक एकाग्रता पर isoflurane प्रशासन.
    नोट: बेहोश करने की विधि और analgesia के लिए दवा का उपयोग की सिफारिश की है के रूप में वे काफी संज्ञाहरण की गहराई में सुधार होगा, सभी प्रक्रियाओं के दौरान आवश्यक निश्चेतक की मात्रा को कम करने, साथ ही शोधकर्ताओं दर्द स्तर को नियंत्रित करने के लिए सक्षम.
  4. शरीर के तापमान, हृदय की दर और इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी), श्वसन दर और लय, ऑक्सीजन संतृप्ति, समय सीमा समाप्त कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) और neurologic सजगता रिकॉर्डिंग द्वारा संज्ञाहरण की निगरानी ।
    नोट: एक व्यक्ति को सभी प्रक्रियाओं में इन मापदंडों पर नजर रखने के लिए सौंपा जाना चाहिए ।
  5. सर्जिकल प्रक्रियाओं भर में बांझपन सिद्धांतों का पालन करें । सुनिश्चित करें कि सर्जन और सहायक सर्जन बाँझ गाउन, दस्ताने, एक मुखौटा और संस्थागत ऑपरेटिव प्रोटोकॉल के अनुसार सुरक्षात्मक चश्मे के साथ पोशाक । सर्जन एक chlorhexidine gluconate गर्भवती बाँझ नाखूनों और प्रत्येक उंगली सतह पर जोर देने के साथ कोहनी तक ब्रश के साथ हाथ साफ़ कि सुनिश्चित करें.
  6. एक नसबंदी के साथ शल्य चिकित्सा उपकरणों को निष्फल ।

2. सर्जिकल साइट तैयारी

  1. सबसे पहले, मैन्युअल रूप से कोमल कर्षण के साथ पेट से पंख हटा दें ।
  2. एक chlorhexidine gluconate डिटर्जेंट गर्भवती बाँझ ब्रश के साथ सर्जिकल साइट साफ़ । धीरे केंद्र से त्वचा साफ़ 5 मिनट की कुल संपर्क समय के लिए बाहर के लिए वापस आने के बिना सेंटर के लिए ।
  3. एक chlorhexidine gluconate समाधान और बाँझ धुंध का उपयोग isopropyl शराब के साथ शल्य साइट पर 3 वैकल्पिक मार्ग प्रदर्शन ।
    नोट: मार्ग शल्य साइट के बीच से शुरू करना होगा सीमाओं को गैर संक्रमित क्षेत्रों से शल्य साइट पर संक्रमण से बचने के लिए ।
  4. चिकन पर बाँझ सर्जिकल कपड़ा प्लेस ।

3. उदर गुहा से छोटी आंत का निष्कर्षण

  1. Incise सर्जिकल साइट की केवल त्वचा को बेनकाब करने के लिए कैंची के साथ शल्य कपड़ा ।
  2. एक स्केलपेल ब्लेड #3 के साथ एक ' ' एल ' ' आकार कम midline चीरा प्रदर्शन करके त्वचा Incise ।
    1. उरोस्थि करने के लिए पहला चीरा 1 सेमी caudal शुरू और यह क्लोअका के लिए 1 सेमी कपाल पर अंत ।
    2. पहला चीरा करने के लिए सीधा चीरा प्रदर्शन । पहला चीरा के caudal अंत से शुरू और श्रोणि लाइन का पालन करके पेट के बाईं ओर करने के लिए 5 सेमी जारी है ।
      नोट: यह खोलने एक प्रालंब है कि आंतों की एक आसान निष्कर्षण की अनुमति देगा पैदा करेगा ।
  3. सर्जरी कैंची के साथ, एक ही ' ' एल ' ' आकार पैटर्न उदर गुहा को खोलने के लिए के साथ, और पेट की मांसपेशियों को काट ।
    नोट: यह हवा sacs का पर्दाफाश होगा । आंतों इन संरचनाओं के नीचे स्थित हैं । हवा sacs बाँझ खारा ०.८५% के साथ संतृप्त humidified की प्रक्रिया में सुखाना और संभव टूटना से बचने के लिए होना चाहिए ।
  4. पेट की दीवार का पालन करके उदर गुहा में एक स्नूकर spay हुक डालें और उदर वायु sacs के चारों ओर का रास्ता काम करते हैं ।
  5. धीरे आंतों exteriorize और सर्जिकल क्षेत्र पर इन बाहर फैल गया ।
    नोट: प्रक्रिया में अक्सर बाँझ खारा ०.९% छिड़काव द्वारा आंतों humidified रखें. इसके अलावा, बाँझ खारा के साथ धुंध humidified सुखाना से बचने के लिए आंतों पर रखा जा सकता है ।
  6. एक सूखी बाँझ धुंध का उपयोग कर आंतों को पकड़ो और धीरे से jejunum को बेनकाब करने के लिए मैनुअल कर्षण द्वारा छोटी आंत बाहर खींच ।
    नोट: Mesenteric वाहिकाओं नाजुक और अत्यधिक तनाव उंहें टूटना हो सकता है जो आंतों के कोरोनरी घावों के लिए नेतृत्व और बहुत प्रक्रिया के परिणाम समझौता हो सकता है ।

4. आंतों छोरों का निर्माण

  1. लूप नंबर 1 का निर्माण ।
    1. प्रमुख संयुक्ताक्षर वाहिकाओं के mesenteric से परहेज करके समीपस्थ jejunum में एक polyglactin multifilament सिंथेटिक अवशोषित सामग्री के साथ एक साधारण संयुक्ताक्षर रखें ।
    2. समीपस्थ संयुक्ताक्षर से एक बाहर संयुक्ताक्षर 2 सेमी दूर रखें ।
      नोट: multifilament टांका सामग्री के साथ बनाया सरल लिगेचर्स hermetic क्षेत्रों बनाने के लिए आंत्र पथ के साथ रखा जाता है । स्कीमा (आरेख 1) सभी लिगेचर्स के स्थान का वर्णन करता है । छोरों एक समीपस्थ और बाहर 2 सेमी से अलग संयुक्ताक्षर से मिलकर बनता है ।
  2. लूप नंबर 1 का निर्माण ।
    1. पाश नंबर 1 के बाहर संयुक्ताक्षर के लिए एक साधारण संयुक्ताक्षर ०.५ सेमी aborally प्लेस ।
      नोट: लगातार छोरों के बीच, वहाँ छोरों के बीच एक शारीरिक जुदाई कर रही है, यानी 1 सेमी, के छोरों हैं. की संभावना एक पाश से दूसरे पार संक्रमण के संभावित जोखिम को कम करने के लिए, एक साधारण संयुक्ताक्षर (2 आसंन छोरों के बाहर और समीपस्थ संयुक्ताक्षर से ०.५ सेमी) एक पाश के बीच में रखा गया है. यह एक संभव लीक contaminant के जोखिम को कम करता है एक पाश से एक आसंन पाश के संयुक्ताक्षर तक पहुंचने के लिए । ये सेगमेंट अनिवार्य नहीं हैं लेकिन इससे क्रॉस-प्रदूषित होने का खतरा कम होगा ।
  3. बाद के छोरों और छोरों का निर्माण.
    1. इच्छित लूप की संख्या प्राप्त करने के लिए ४.१ और ४.२ चरणों को दोहराएँ ।
      नोट: इस प्रयोग में 9 छोरों और 8 छोरों बनाए गए थे. कुल लंबाई 26 सेमी की राशि । छोरों की संख्या अध्ययन के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.

5. क्लोस्ट्रीडियम perfringens उपभेदों के छोरों में इंजेक्शन

  1. एक बाँझ सिरिंज और सुई 26 जी के साथ इंजेक्षन नंबर 1 पाश में रोगज़नक़. धीरे आंत के antimesenteric पक्ष पर एक ४५ ° कोण पर सुई डालें ।
    नोट: इस प्रयोग में ब्रेन हार्ट इन्फ्यूश़न (BHI) की ०.२ मिलीलीटर 1 x 106 CFU (कॉलोनी बनाने की इकाइयां) के मध्य लॉग विकास चरण में C. perfringens के प्रत्येक लूप में इंजेक्ट किया गया था । 5 अलग उपभेदों 5 अलग छोरों में इंजेक्शन थे और 4 शेष छोरों कोई जीवाणु (बाँझ bhi), बारी रोगजनकों और बाँझ bhi छोरों युक्त एक नकारात्मक नियंत्रण के साथ इंजेक्ट किया गया.
  2. दोहराएँ चरण ५.१ सभी छोरों इंजेक्षन करने के लिए.
  3. धीरे उदर गुहा के पृष्ठीय क्षेत्र में आंत्र पथ की जगह, हवा sacs के नीचे ।

6. उदर गुहा के बंद

  1. योनि और पेट की मांसपेशियों की सीवन ।
    1. एक polyglactin multifilament सिंथेटिक अवशोषित सामग्री का उपयोग कर एक सरल सतत सीवन पैटर्न के साथ (३.३ कदम में बनाया) श्रोणि के साथ योनि और पेट की मांसपेशियों टांका ।
    2. उरोस्थि से क्लोअका करने के लिए (३.३ चरण में किया गया है. एक सरल सतत सीवन पैटर्न एक polyglactin multifilament सिंथेटिक अवशोषित सामग्री का उपयोग कर के साथ ।
  2. त्वचा की सीवन ।
    1. एक polyglactin multifilament सिंथेटिक सामग्री और एक सरल सतत सीवन पैटर्न का उपयोग करना, ३.२ कदम में किए गए श्रोणि के साथ त्वचा का चीरा बंद ।
    2. एक ही multifilament संयुक्ताक्षर सामग्री और एक सरल सतत सीवन पैटर्न का उपयोग करना, उरोस्थि से त्वचा के चीरा बंद ३.२ कदम में किए गए क्लोअका के लिए ।

7. निष्कर्ष

  1. शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के बाद, संक्रमण के समय के दौरान पशुओं के दर्द को कम करने के लिए एनाल्जेसिक के समुचित उपयोग के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत चिकन रखने के लिए । एक पर्याप्त संज्ञाहरण स्तर सुनिश्चित करने के लिए संवेदनाहारी निगरानी जारी रखें ।
  2. वांछित संक्रमण समय के बाद, humanely सामान्य संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा चिकन euthanize ।
    नोट: इन प्रक्रियाओं के लिए, C. perfringens रोगजनक उपभेदों के साथ सूक्ष्म घावों को प्रेरित करने के लिए आवश्यक समय 7 एच था ।
  3. एक स्केलपेल ब्लेड #3 के साथ, 1 सेमी लंबी पाश अनुभाग के लिए एक ०.५ सेमी काट और यह रात भर निर्धारण और आगे histopathological विश्लेषण के लिए 10% formalin में जगह है ।
  4. एक ही स्केलपेल ब्लेड के साथ, शेष पाश अनुभाग में कटौती और यह उनके आनुवंशिक लक्षण वर्णन के लिए प्रत्येक पाश आगे bacteriologic विश्लेषण में सी. perfringens उपभेदों के अलगाव के लिए एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में जगह है ।
  5. हर लूप के बीच स्केलपेल ब्लेड बदलकर सभी छोरों के लिए चरण ७.२ और ७.३ दोहराएँ.

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Representative Results

9 आंत्र छोरों और 8 छोरों का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है. इस मॉडल में, कुल 9 छोरों और 8 छोरों सरल लिगेचर्स के साथ बनाया जाता है । एक पाश समीपस्थ और बाहर लिगेचर्स के होते हैं समीपस्थ संयुक्ताक्षर से मापा 2 सेमी द्वारा स्थान. दो आसंन छोरों 1 सेमी की एक पाश द्वारा अलग कर रहे हैं । एक संयुक्ताक्षर से रिसाव से छोरों के बीच क्रॉस-संदूषण के संभावित जोखिम को कम करने के लिए, एक पाश संयुक्ताक्षर बाहर संयुक्ताक्षर और समीपस्थ संयुक्ताक्षर के 2 आसंन छोरों से मध्य मार्ग रखा गया है. छोरों की संख्या अध्ययन की आवश्यकताओं के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.

Figure 1
चित्रा 1: ligated आंत्र छोरों के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्र 2a (HPS दाग) एक आंत्र पाश एक नियंत्रण बाँझ मध्यम के साथ इंजेक्शन के सूक्ष्म उपस्थिति से पता चलता है. श्लैष्मिक ब्रश सीमा बरकरार है और वहां कोई परिगलन खंड में मौजूद है । हल्के भीड़ के आंत्र परतों में मौजूद हो सकता है (म्यूकोसा, उपम्यूकोसा, muscularis, और serosa) के क्षेत्रों । चित्र b (HPS दाग) श्लैष्मिक परिगलन क्लोस्ट्रीडियम perfringens के एक रोगजनक तनाव के इंजेक्शन के बाद 7 घंटे से पता चलता है एक चिकन खेत पर गल आंत्रशोथ के एक नैदानिक मामले से बरामद किया । विल्ली युक्तियां विल्ली युक्तियों के आसपास enterocytes के साथ घिस रहे हैं । विल्ली आसपास की सामग्री में, बड़ी छड़ के आकार का बैक्टीरिया के समूहों (तीर) मनाया जाता है । इन बैक्टीरिया को एक Twort दाग (नहीं दिखाया गया है) के साथ ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के रूप में आगे की पहचान की गई । इस खोज, क्लोस्ट्रीडियम perfringensकी बड़ी संख्या के वैक्टीरिया द्वारा अलगाव के साथ संयुक्त, इंगित करता है कि घावों इस जीवाणु के कारण थे । चित्र 2c (HPS दाग) एक कोरोनरी पाश के ऊतकवैज्ञानिक घावों से पता चलता है, जहां परिगलन रोगजनक सी perfringens उपभेदों के इंजेक्शन से संबंधित नहीं है, लेकिन खराब निष्पादित प्रक्रियाओं का परिणाम है । यह आवर्धन क्लोस्ट्रीडियम perfringensकी वजह से घावों के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है कि गंभीर जमावट परिगलन से पता चलता है । हालांकि, इस अनुभाग में कोई बैक्टीरिया नहीं मनाया जाता है । साथ ही, मांसपेशियों की परत में रक्त वाहिकाओं को चूकने वाले एरिथ्रोसाइट्स (तीरों) की बड़ी संख्या के संचय से बुरी तरह से फैली हुई हैं. यह संवहनी भीड़ का संकेत है और इस मामले में, भीड़ ligated mesenteric रक्त वाहिकाओं के कारण होता था । कोरोनरी छोरों को शल्य प्रक्रियाओं के दौरान macroscopically आसानी से पहचाना जा सकता है; गंभीर संवहनी भीड़ के बाद, serosa अपने सामान्य गुलाबी-लाल रंगाई के बजाय गहरे नीले रंग की हो जाएगा ।

Figure 2
चित्रा 2: Histopathologic निष्कर्ष 7 एच के बाद संक्रमण । (क) मस्तिष्क हृदय आधान (BHI), एक बाँझ संस्कृति माध्यम के इंजेक्शन निम्नलिखित histopathology पर म्यूकोसा में कोई गल घावों हैं । (ख) क्लोस्ट्रीडियम perfringensके एक रोगजनक तनाव के साथ इंजेक्शन छोरों में, वहाँ कई बड़े चने-सकारात्मक रॉड के आकार का जीवाणु म्यूकोसा को कवर के साथ म्यूकोसा के परिगलन के रूप में चिह्नित किया गया है । (ग) कोरोनरी घावों सी. perfringensके कारण होने वाले घावों के समान हो सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इस अध्ययन में, छोरों या तो एक बाँझ नियंत्रण संस्कृति माध्यम (BHI) या क्लोस्ट्रीडियम perfringens के पांच अलग उपभेदों में से एक के साथ इंजेक्शन थे विभिन्न एंटीबायोटिक मुक्त चिकन झुंड से प्रभावित या नहीं गल आंत्रशोथ 12 के साथ बरामद . इस अध्ययन में दस मुर्गियों का इस्तेमाल किया गया । उपभेदों pathogenicity म्यूकोसा के लिए आंत्रशोथ के साथ संगत घावों का कारण बनने की क्षमता के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है । जबकि उपभेदों के नैदानिक मामलों से बरामद आंत्रशोथ श्लैष्मिक परिगलन 7 एच के बाद संक्रमण, उपभेदों नैदानिक स्वस्थ चिकन खेतों से बरामद किया श्लैष्मिक परिगलन और श्लेष्मा झिल्ली के समान नहीं था पैदा करने की क्षमता दिखाया सामान्य नियंत्रण छोरों से निष्कर्षों BHI12के साथ इंजेक्शन. एक ही जानवर में कई छोरों का उपयोग करके, पांच सी perfringens उपभेदों और चार नियंत्रण छोरों एक ही पक्षी में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Discussion

आंत्र छोरों मॉडल कई प्रजातियों में वर्णित किया गया है के लिए मेजबान रोगज़नक़ बातचीत और विभिंन आंत्र रोगजनकों की वजह से रोगों के रोगजनन अध्ययन, जैसे क्लोस्ट्रीडियम perfringens, क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल और साल्मोनेला enterica7,9,13,14,15. यह भी श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया16का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, एंटीबॉडी की प्रभावकारिता जीवाणु विषाक्त पदार्थों को बेअसर करने के लिए आंत्र रोगजनकों द्वारा उत्सर्जित11 और वैक्सीन उम्मीदवारों का मूल्यांकन करने के लिए आंतों रोगों को रोकने10 . हालांकि, इस मॉडल के एक व्यक्ति जानवर में कई ligated छोरों का उपयोग खराब मुर्गियों में वर्णित है और इस तकनीक के मानकीकरण अपर्याप्त जोड़तोड़ के रूप में वैध परिणाम प्राप्त करने के लिए अनिवार्य है झूठी परिणाम और गलत व्याख्याओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं . यह पांडुलिपि चिकन गैस्ट्रो आंत्र पथ के jejunum और लघ्वान्त्र में स्थित 9 क्रमिक ligated छोरों के निर्माण से पता चलता है । इस अध्ययन में प्रयुक्त विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (SPF) भाफ नर मुर्गियों के बीच वजनी १.० और १.२ किग्रा. इस नस्ल के इस वजन से अनुमति छोरों की अधिकतम संख्या 9 थी, क्योंकि छोटी आंत के 26 सेमी आसानी से coelomic गुहा से बाहरी हो सकता है । यह शामिल नहीं है कि एक और नस्ल और/या एक भारी भाफ पुरुष चिकन का उपयोग करके, बनाया छोरों की कुल संख्या अलग हो सकता है, यहां तक कि अधिक से अधिक 9. आंतों छोरों लंबाई भी संशोधित किया जा सकता है, लेकिन उपलब्ध आंत्र लंबाई की अधिकतम क्षमता का उपयोग करते हुए histopathology और वैक्टीरिया के लिए नमूना संग्रह की अनुमति देने के लिए 2 सेमी लंबाई इष्टतम माना जाता था.

आंतों ligated पाश इस लेख में वर्णित तकनीक क्लोस्ट्रीडियम perfringensके कारण मुर्गियों में गल आंत्रशोथ का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध मौजूदा मॉडलों के लिए एक मूल्यवान विकल्प हो सकता है. एक पिछले अनुच्छेद12में वर्णित परिणामों के अनुसार, 10 मुर्गियों के साथ 5 सी perfringens उपभेदों के मूल्यांकन के अत्यधिक विषमय और सी perfringensके खाना खानेवाला उपभेदों अंतर करने के लिए पर्याप्त था । तुलना में, अंय संक्रमण ओएस टीका प्रति का उपयोग कर मॉडल के लिए सी perfringens के साथ गल आंत्रशोथ पुनरुत्पादन व्यक्तियों की एक बड़ी संख्या में एक ही परिणाम प्राप्त करने की आवश्यकता होगी । साहित्य में, सी. perfringens उपभेदों के डाह का मूल्यांकन करने के लिए पक्षियों की संख्या के लिए आवश्यक 10 से 30 मुर्गियों के समूह के प्रति एक वर्ग17,18,19 एक सौ मेजबान के प्रति समूह20। अनुसंधान में पशु उपयोग के लिए शोधन सिद्धांत के संबंध में, यह महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए मेजबान की सबसे कम संख्या की आवश्यकता तकनीक का उपयोग करने की सलाह दी जाएगी. आंतों ligated पाश मॉडल इस लेख में वर्णित सबसे अधिक संभावना है मुर्गियों की सबसे कम संख्या की आवश्यकता मॉडल सी perfringens उपभेदों की डाह तुलना करने के लिए.

के बाद से एक संयुक्ताक्षर से रिसाव से पार संक्रमण के बाद ही सी perfringens संस्कृति और लक्षण वर्णन स्पंदित फील्ड जेल ट्रो (PFGE) द्वारा कई दिनों के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है प्रक्रियाओं के बाद, यह अत्यंत महत्व का था करने के लिए इस कम 2 आसंन छोरों के बीच एक पाश संयुक्ताक्षर मध्य मार्ग युक्त 1 सेमी छोरों सहित द्वारा जोखिम. इन सावधानियों को लेकर, संभव है कि एक पार से संक्रमण से बचने के लिए । वास्तव में, जबकि रोगजनक उपभेदों के कारण गल आंत्रशोथ के साथ सूक्ष्म रूप से गल घावों बेताल, वहां से सटे छोरों में कोई महत्वपूर्ण सूक्ष्म घावों थे गैर रोगजनक सी perfringens उपभेदों या BHI संस्कृति माध्यम के साथ इंजेक्शन नकारात्मक नियंत्रण । यह संकेत है कि अलग उपभेदों सुरक्षित रूप से एक ही चिकन के आसंन आंत्र छोरों में इंजेक्ट किया जा सकता था ।

इस मॉडल के साथ सबसे चुनौतीपूर्ण मुद्दों में से एक वेंटिलेशन और आंतों vascularization समझौता किए बिना छोटी आंत के exteriorization था । पक्षियों स्तनधारियों की तुलना में एक अलग श्वसन प्रणाली है । डायाफ्राम अनुपस्थित है, और वेंटिलेशन उदर गुहा में airsacs, पतली दीवारों संरचनाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है । मुर्गियों में इनमें से ७ हैं और इन्हें सर्वाइकल (१), पूर्वकालिक वक्ष (२), पीछे वक्ष (२) और उदर (२) वायु sacs में बाँटा गया है. इन गुब्बारों की तरह संरचनाओं सीधे फेफड़ों से जुड़े होते है और श्वसन तंत्र में हवा की आवाजाही के लिए अनुमति देते हैं । उरोस्थि और क्लोअका के बीच उदर गुहा खोलने पर, उदर airsacs प्रमुख हैं और आसानी से टूटना हो जाते हैं, खासकर अगर शुष्क. इस कारण से, बाँझ खारा के साथ नम हो गई धुंध के साथ लगातार humidification प्रक्रियाओं के दौरान उचित वेंटिलेशन और संज्ञाहरण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा उदर गुहा से बाहर आंतों को exteriorizing करते समय उदर airsacs में छोटे पंचरों से बचना भी मुश्किल हो सकता है । यह इस तरह के श्वसन दर और पैटर्न के रूप में संवेदनाहारी मानकों, पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है, palpebral सजगता, दिल की दर और चिकन की गतिविधियों, संज्ञाहरण के एक पर्याप्त विमान के तहत चिकन रहता है सुनिश्चित करने के लिए. छोटे हवा रिसाव कम संज्ञाहरण की गुणवत्ता को प्रभावित करने की संभावना है, लेकिन इस रिसाव को कम किया जाना चाहिए । यह महत्वपूर्ण है के लिए प्रक्रियाओं के बाद बंद hermetically । यह आंतरिक हवा के दबाव को पुनर्स्थापित करेगा और वेंटिलेशन इस कदम के बाद सामांय करने के लिए वापस आ जाएगा । इस स्ट्रक्चर के बंद होने के बाद पेट से कोई एयर लीकेज नहीं होना चाहिए । यह टांके पर बाँझ खारा की एक छोटी राशि का छिड़काव और बुलबुले के गठन के लिए देखो हवा उदर गुहा से आने का संकेत द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । यदि ऐसा होता है, अतिरिक्त सरल त्वचा टांके हवा रिसाव साइट पर रखा जा सकता है ।

एक अन्य तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पहलू छोटी आंत में खराब निष्पादित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के कारण विकसित होने वाले कोरोनरी घावों के जोखिम से संबंधित है । Ischemia होता है जब वहां ऊतकों को रक्त की आपूर्ति के एक प्रतिबंध है, ऑक्सीजन और अंय सेलुलर चयापचय के लिए आवश्यक अणुओं की कमी के कारण । इस मामले में, आंत तेजी से macroscopically गहरे नीले रंग के बजाय गुलाबी-लाल हो जाएगा और आंतों श्लैष्मिक कोशिकाओं जल्दी से पतित हो जाएगा । इस इंजेक्शन रोगज़नक़ के लिए असंबंधित कोरोनरी घावों का कारण होगा और यह histopathological व्याख्या के साथ हस्तक्षेप करेगा । दो समस्याग्रस्त स्थितियों के ischemia के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । सबसे पहले, inadvertence द्वारा mesenteric वाहिकाओं के संयुक्ताक्षर इस हालत का कारण होगा । इस कारण से, यह mesenteric वाहिकाओं सहित से बचने के लिए आंत्र पथ के साथ लिगेचर्स के स्थान पर ध्यान से देखने के लिए महत्वपूर्ण है । दूसरा, ischemia हो सकता है अगर mesenteric जहाजों के खून बह रहा है प्रक्रियाओं के दौरान होते हैं । इन संरचनाओं पतली दीवारों और नाजुक हैं । अत्यधिक तनाव उनके टूटना के लिए नेतृत्व कर सकते है और जब मैंयुअल रूप से आंतों exteriorizing, ध्यान mesenteric जहाजों पर तनाव को दिया जाना चाहिए इस कदम के दौरान अपनी अखंडता सुनिश्चित करने के लिए । इसके अलावा, mesenteric रक्त वाहिकाओं नकसीर हो सकता है अगर ये एक शल्य टांका सुई के साथ पंचर हो रहे हैं । सर्जन सुई के साथ अन्त्रपेशी के माध्यम से छेदा स्थान पर ध्यान से देखना चाहिए. रक्तस्राव दोनों स्थितियों में रोका जा सकता है, लेकिन जमावट प्रक्रिया बंद हो जाएगा या इन आंत्र क्षेत्रों के लिए काफी रक्त के प्रवाह को कम, इसलिए अपरिवर्तनीय घावों के कारण और परिणाम की वैधता समझौता.

इस मॉडल की मेजबानी के अध्ययन के लिए उपयोगी है-रोगज़नक़ बातचीत और आंत्र संक्रामक एजेंटों की वजह से रोगों के रोगजनन । मॉडल का प्रस्ताव बनाया छोरों की संख्या को बदलने के द्वारा या प्रत्येक पाश की लंबाई को संशोधित करके अध्ययन के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है. इस तरह के परिवर्तनों को लागू करने से पहले, यह महत्वपूर्ण परिणाम सुनिश्चित करने के लिए विधि मानकीकरण करने के लिए सिफारिश की है. इस तकनीक की सीमाएं कौशल उंमुख और केवल ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों रहते पशुओं पर इस सर्जरी प्रदर्शन करना चाहिए रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम कुक्कुट अनुसंधान (एम. Boulianne) में चेयर द्वारा विश्विद्यालय डी मॉंट्रियल के पशु चिकित्सा के संकाय से समर्थित था. डीआरएस को लेकर Boulianne और पैरेंट्स ने मॉडल डेवलप किया । डीआरएस. Boulianne और जनक ने सर्जरी का प्रदर्शन किया । डॉ जलता संज्ञाहरण प्रोटोकॉल विकसित करने में सहायता की । डॉ जनक ने वीडियो संपादित किया और पांडुलिपि लिखी । डीआरएस में जले, Desrochers और Boulianne ने पांडुलिपि का संपादन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

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