Clostridium Perfringens virülans çalışmaya imzalat belirli patojen ücretsiz tavuk ve birleştirilmiş bağırsak döngü modelinde

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada cerrahi olarak tavuk küçük bağırsaklarında 'bağırsak ve birleştirilmiş döngüler' oluşturmak için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yordam, birden çok Clostridium perfringens suşları virülans in situ tek bir ana bilgisayar karşılaştırılması için verir. Bu yöntem belirgin tavuk genellikle benzer in vivo deneyler için gerekli sayısını azaltır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nekrotik enterit çeşitli vivo içinde enfeksiyon modelleri kullanarak tavuklarda incelenmiştir. En-in bunlar sonda ile besleme veya Clostridium perfringenskullanarak yem üzerinden yönetim ile coccidiosis ve diyet, gibi yatkinlastirici faktörlerin birleşimi kullanın. Bu modellerinde, birden çok C. perfringens suşları virülans etütler karşılaştırılması çok sayıda önemli sonuçlar elde etmek için ana bilgisayarlar gerektirir. Çalışma süresince ölüm dolayısıyla araştırma hayvan refahı ile ilgili etik kaygıları gündeme getirme deneysel modeline bağlı olarak yüksek olabilir. Patogenez, henüz istatistiksel olarak önemli ve geçerli sonuçlar sağlayan eğitim için daha az sayıda hayvan gerektiren yeni enfeksiyon modelleri araştırma hayvan kullanımda azaltmada önemli bir gelişmedir. Bağırsak ve birleştirilmiş döngü modelleri fare, tavşan ve buzağı gibi çeşitli tür clostridial enfeksiyonları eğitim için kullanılmaktadır. Ve birleştirilmiş döngü segmentleri oluşturmak için cerrahi işlemler C. perfringens suşları doğrudan döngüler bakteri ve bağırsak mukoza arasında yakın bir temas kurmak için içine enjekte edilir. İnce bağırsak ve luminal İçindekiler örnekleri yordamları fesih bir kaç saat sonra alınır. Birden çok bakteri suşları dolayısıyla gerekli deneyler bireylerde sayısını azaltarak her hayvan aşılamak. Ayrıca, yordamlar hayvan ağrı azaltmak için genel anestezi altında gerçekleştirilir. Tavuklarda, bu model çok daha az sayıda hayvan ihtiyaç vardır, hiçbir yatkinlastirici faktörler hastalığın ikna etmek için gerekli olan ve ağrı ağrı kesici tarafından kontrol edilir çünkü C. perfringens zorlanma patojenitesi karşılaştırmak için sözlü yönetim daha uygun olur . Bağırsak ve birleştirilmiş döngü modeli tavuklarda kötü anlatılan ve standardizasyon optimal kullanımı için gereklidir. Bu el yazması çok sayıda bağırsak ve birleştirilmiş döngüler tavuklarda oluşturmak için gerekli tüm adımları sağlar ve geçerli sonuçlar elde etmek için kritik noktaları hakkında bilgi getiriyor.

Introduction

İnsan ve hayvanların etkileyen bulaşıcı hastalıklar çalışmaya hayvan modelleri kullanımını önlemek veya hastalıkları1tedavi stratejileri ayrıntılı olarak belirli bir koşulu de patogenezinde düzenleyen virülans faktörleri değerlendirirken merkezi bir araçtır. Çeşitli hastalıklar çalışmaya hayvan modelleri kullanmanın birçok yararları rağmen bu uygulama ile ilgili Etik kaygılar kaynaklanan. Araştırmacılar önemli ve geçerli sonuçlar elde etmek süre hayvan kullanımı en aza indirmek gerekir. 3 Rs ilkeleri (değiştir, azaltmak ve İyileştir) kavramı refah sorunları bu tür çalışmalarda ele alındı sağlamak için özenli. Tavuk nekrotik enterit çalışmalarda vivo içinde tavuk modelleri etyoloji, önleme ve tedavi bu koşul2,3,4,5araştırmak için kullanılır. C. perfringens NetB toksini6gibi belirli virülans faktörleri taşıyan patojen suşları nekrotik enterit tavuk7' neden için uygulanmaktadır. Yedek ilke, bu nedenle, bu virülans faktörleri-ebilmek değil var olmak içinde hayvan diğer türler gibi kritik olarak böyle durumda elde etmek zordur. Çoğu modeller tavuklarda nekrotik enterit için risk faktörleri, coccidiosis gibi bir arada kullanmak ve nekrotik enterit sonda ile besleme suyu kültür C. perfringens2. çok sayıda içeren tarafından takip ikna etmek için diyet değişmiş Bu modeller çok sayıda tavuk hastalığında teşvik ve mortalite böylece hayvan araştırma azaltma ve arıtma ilkeleri hakkında kaygıları gündeme getirme böyle denemeler8, önemli olabilir.

Bağırsak ve birleştirilmiş döngüler modelleri çalışma prensibi azaltma ve arıtma ile ilgili bağırsak patojenler tarafından indüklenen hastalıklar için arzu edilen bir alternatiftir. Bu modellerin nerede patojenler yalnız9 enjekte edilebilir bağımsız ve hermetik bölmeleri oluşturmak için bağırsak boyunca veya başka moleküllerin, aşı adaylar ile bitişik harfler yerleştirerek 'döngüler' olarak adlandırılan bağırsak kesimlerinde oluşturulur 10 , 11. faiz patojenler bağırsak hücreleri ile yakın temas içinde yerleştirilir ve enfeksiyon zaman birkaç saat sonra daha fazla çözümleme için bağırsak örnekleri elde edilebilir. Bu aynı hayvan birden fazla tedavi ve kontrol grubu kullanımına izin verir. İstatistiksel analiz grupları arasında ayrımcılık gücünü artırdığı ve gerekli tavuk oral gavaj denemeler için karşılaştırıldığında sayısını azaltır tekrarlanan ölçüler modelleri ile gerçekleştirilebilir. Ayrıca, cerrahi işlemler ve sonraki enfeksiyon kez sürekli genel anestezi ve analjezi, dolayısıyla hayvan ağrı en aza indirme altında gerçekleştirilir. Kapalı devre d ana bilgisayar numaraları azaltmak ve hayvan araştırma daha insancıl bir sistem oluşturmak için ideal bir şablonu vardır.

Bağırsak ve birleştirilmiş döngüler modelleri de çeşitli türlerden buzağılar, tavşan ve fareler2,9, açıklanan ama kötü tavuk7' de açıklanan. Cerrahi bu model en iyi bir kullanımı için uygun tekniği ve yürütme bağırsak bütünlüğü zarar önlemek için ve birleştirilmiş bağırsak döngü oluşturulması için gerekli olan. Bu el yazması bir tavuk modeli birden çok bağırsak döngü oluşturulması adım adım yöntemi açıklamak için hedeftir. Doğru yordamları projenin başarısı için gerekli olduğu gibi bu teknik cerrahın beceri ve deneyim, sınırlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Canlı hayvan kullanımı ile tüm yordamları Etik Komitesi, Veteriner Tıp Fakültesi, Université de Montréal tarafından yetkili (CÉUA, 'Comite d' éthique de l'utilisation des Animaux').

1. ameliyat öncesi hakkında önemli noktalar

  1. 10 haftalık özel patojen ücretsiz (SPF) Livorno tavuk ameliyatı için seçin.
    Not: Kendi ağırlığı 1.0 ve 1.2 kg arasında olması gerekir.
  2. Besleme bağırsak boşaltmak için yordamlar önce 12 h geri alıyorum.
  3. Ameliyat öncesi anestezi uzmanı tarafından doğrulanmış bir protokol sonrası genel anestezi altında tavuk yerleştirin. Her tavuk midazolam kas içi (IM) enjeksiyonu ile ameliyat öncesi 15 dk premedicate 1 mg/kg ve butorphanol 4 mg/kg. Tekrar ediyorum, her 4 h butorphanol enjeksiyon 4 mg/kg ım ya da ne zaman nefes desen değişiklikleri ve frekans anestezi sırasında artırır. Genel anestezi için tüm işlemler sırasında isoflurane 1,5 ve %2,5 bir boğaza tüp ile arasında bir konsantrasyon, yönetmek.
    Not: Onlar önemli ölçüde anestezi derinliği geliştirmek, anestezi sırasında tüm yordamları gerekli miktarını azaltmak, aynı zamanda gibi araştırmacılar ağrı düzeyleri kontrol için olanaklı kılmak sedasyon ve analjezi için premedication kullanılması tavsiye edilir.
  4. Anestezi vücut ısısı, kalp hızı ve elektrokardiyogram (EKG), solunum hızı ve ritim, oksijen doygunluğu, süresi dolan karbondioksit (CO2) ve nörolojik refleksleri kaydederek izlemek.
    Not: Bu parametreler boyunca tüm yordamları izlemek için bir kişi atanmış olması gerekir.
  5. Cerrahi işlemler boyunca kısırlık ilkelere uygun. Steril Önlük, eldiven, maske ile elbise cerrah ve asistan cerrah ve kurumsal preoperatif protokolleri göre koruyucu gözlükler emin olun. Cerrah KLORHEKSİDİN GLUKONAT emdirilmiş steril fırça tırnakları ve her parmak yüzey üzerinde durularak dirsek kadar elleriyle scrubs emin olun.
  6. Cerrahi aletler sterilizasyon ile sterilize.

2. cerrahi sitesi hazırlama

  1. İlk olarak, el ile tüyleri nazik bir çekiş ile karın kaldırın.
  2. Cerrahi sitesi bir KLORHEKSİDİN GLUKONAT deterjan emdirilmiş steril fırça ile fırçalayın. Nazikçe dış Merkezi'nden cilde geri merkezine gelmeden 5 dk toplam kişi zaman için fırçalayın.
  3. 3 alternatif pasajlar KLORHEKSİDİN GLUKONAT çözüm ve steril gauzes kullanarak temizlik iÖin izopropil alkol ile cerrahi sitede gerçekleştirin.
    Not: Geçiş cerrahi siteye sigara dezenfekte alanlardan kirlenmesini önlemek için sınırları için cerrahi sitesi ortasından başlatmanız gerekir.
  4. Steril Cerrahi örtüsü tavuk yerleştirin.

3. çıkarma, küçük bağırsak karın boşluğu

  1. Cerrahi örtüsü sadece cilt cerrahi sitesinin açığa makasla deşmek.
  2. Deri bir neşter bıçakla #3 bir '' L'' şekil yüksek-ensizyon uygulayarak deşmek.
    1. Belgili tanımlık ilk kesme 1 cm için sternum kaudal başlatmak ve 1 cm için lağım kafatası biter.
    2. Belgili tanımlık ikinci kesme ilk kesi dik gerçekleştirin. Kaudal ilk kesi sonundan itibaren başlarlar ve karın sol tarafına 5 cm pelvis hattı takip ederek.
      Not: Bu açılış bağırsakların daha kolay bir çıkarımı sağlayacak bir flep oluşturur.
  3. Cerrahi makas ile karın zarını ve aynı '' L'' şekil desenli karın boşluğu açmak için karın kasları kesmiş.
    Not: Bu hava keseleri geçirecek. Bağırsak bu yapıların altında yer alır. Hava kesesi kuruma ve prosedür boyunca mümkün rüptürü önlemek için steril serum fizyolojik %0.85 ile doymuş gauzes ile nemlendirilmelidir gerekir.
  4. INSERT bir Snook spay karın boşluğunda sol karın duvarı takip ederek kanca ve karın hava keseleri bir yol iş.
  5. Yavaşça bağırsak exteriorize ve bunlar cerrahi sahada yayılmış.
    Not: sık steril serum fizyolojik %0,9 prosedürü boyunca püskürtülerek nemlendirilmelidir bağırsak tutun. Ayrıca, steril serum fizyolojik ile nemlendirilmelidir gauzes bağırsaklarında kuruma önlemek için yerleştirilebilir.
  6. Bir kuru steril gazlı bez kullanarak bağırsak al ve yavaşça küçük bağırsaklarını tarafından el ile çekiş değişir ortaya çıkarmak için çekin.
    Not: Mezenterik damarları kırılgan ve aşırı gerilim onları bağırsak iskemik lezyonları için yol ve büyük ölçüde işlem sonucunu uzlaşma rüptürü.

4. bağırsak döngüler imalatı

  1. Döngü No 1 oluşturulması.
    1. Yer polyglactin multifilament sentetik absorbe malzeme ile proksimal Jejunumdaki büyük mezenterik damarların bağ kaçınarak basit bir bağ.
    2. Distal bağ 2 cm uzakta proksimal bağ yerleştirin.
      Not: multifilament suture maddi ile yapılan basit bitişik harfler hermetik segmentleri oluşturmak için bağırsak yerleştirilir. Bir şema (Şekil 1) tüm bitişik harfler konumu açıklanır. Döngüler 2 cm tarafından ayrılmış bir proksimal ve distal bağ oluşur.
  2. Interloop No 1 oluşturulması.
    1. Basit bağ 0.5 cm aborally döngü no.1 distal bağ için bir yer.
      Not: birbirini izleyen döngüler arasında interloops 1 cm, yani döngüler arasında fiziksel bir ayrım yapma kesimleri vardır. Büyük olasılıkla çapraz bulaşma bir döngü üzerinden başka bir olası tehlikesini azaltmak için basit bir bağ Interloop (2 bitişik döngüler distal ve proksimal bağ 0.5 cm) ortasında yer alıyor. Bu bir döngü bitişik bir döngü bağ ulaşmak için olası bir sızdırılmış kirletici riskini azaltır. Bu kesimler zorunlu değildir ancak çapraz bulaşma riski azalacak.
  3. Sonraki döngüler ve interloops oluşturulması.
    1. 4.1 ve 4.2 istenen döngü sayısını elde etmek için adımları yineleyin.
      Not: Bu deneyde, 9 döngüler ve 8 interloops oluşturulmuştur. Toplam uzunluğu için 26 cm olarak gerçekleşti. Döngü sayısını çalışma bağlı olarak ayarlanabilir.

5. enjeksiyon Clostridium perfringens suşları içine döngüler

  1. Steril şırınga ve iğne 26 G döngü no.1 patojen enjekte et. Yavaşça iğneyi bağırsak antimesenteric tarafında bir 45 ° açıyla yerleştirin.
    Not: Bu deneyde, her döngü içinde beyin kalp infüzyon (BHI) 1 x 106 CFU (koloni oluşturan birimler) C. perfringens orta günlük büyüme aşamasında içeren 0.2 mL enjekte ettiler. 5 farklı suşları 5 farklı döngüler enjekte edildi ve döngüler kalan 4 patojenler ve steril BHI döngüler alternatif hiçbir bakteri (steril BHI), içeren bir negatif kontrol ile enjekte edildi.
  2. Tüm döngüler enjekte etmek için 5.1 arasındaki adımları yineleyin.
  3. Yavaşça bağırsak karın boşluğuna hava keseleri altında dorsal alanında değiştirin.

6. karın boşluğu kapatma

  1. Karın zarını ve karın kasları dikiş.
    1. Karın zarını ve karın kasları (3.3 adımda yapılan) leğen kemiği boyunca polyglactin multifilament sentetik absorbe malzeme kullanarak basit sürekli dikiş desen dikiş.
    2. Karın zarını ve göğüs kemiği gelen karın kasları lağım için dikiş (adım 3.3 oldu. polyglactin multifilament sentetik absorbe malzeme kullanarak basit sürekli dikiş desen ile.
  2. Deri dikiş.
    1. Polyglactin multifilament sentetik malzeme ve basit sürekli dikiş deseni kullanarak, 3.2 adımda yapılan leğen kemiği boyunca cilt kesi kapatın.
    2. Aynı multifilament bağ malzeme ve basit sürekli dikiş deseni kullanarak, göğüs kemiğinin cilde 3.2 adımda yapılan lağım kesi kapatın.

7. sonuç

  1. Cerrahi işlemler sonra uygun hayvan ağrı sırasında enfeksiyon süresini en aza indirmek için ağrı kesici kullanımı ile genel anestezi altında tavuk tutmak. Anestezik bir yeterli anestezi düzeyi sağlamak için izleme devam edin.
  2. İstenen enfeksiyon süre sonra tavuk servikal çıkığı genel anestezi altında tarafından insanca ötenazi.
    Not: Bu yordamları için 7 h mikroskobik lezyonlar C. perfringens patojenik suşları ile ikna etmek için gerekli zamanı oldu.
  3. Bir neşter bıçak #3, 0,5 cm 1 cm uzun döngü bölüm için kesmek ve % 10 formalin fiksasyon gece ve daha fazla histopatolojik analizi için yere koyun.
  4. Aynı neşter bıçak ile kalan döngü bölüm kesmek ve onların genetik karakterizasyon için her döngü daha da bacteriologic analizde C. perfringens suşlarının yalıtım için steril microcentrifuge tüp yerleştirebilirsiniz.
  5. Adım 7.2 ve 7.3 neşter bıçak her döngü arasında değiştirerek tüm döngüler için yineleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

9 bağırsak döngüler ve 8 interloops bir şematik resim 1' de gösterilen. Bu modelde, toplam 9 döngüler ve 8 interloops ile basit bağ oluşturulur. Proksimal bağ ölçülür 2 cm aralıklı proksimal ve distal bitişik harfler, bir döngü oluşur. İki bitişik döngü 1 cm bir Interloop tarafından ayrılır. Kaçak bir bağ üzerinden tarafından döngüler arasında çapraz bulaşma olası riski azaltmak için interloop bir bağ orta yolda distal bağ ve proksimal bağ 2 bitişik döngüler yerleştirilir. Döngü sayısını çalışma gereksinimlerine bağlı olarak ayarlanabilir.

Figure 1
Şekil 1: şematik gösterim ve birleştirilmiş bağırsak döngüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2A (HPS leke) ile bir denetim steril ortam enjekte bir bağırsak döngü mikroskobik görünümünü gösterir. Mukozal fırça sınır sağlam ve hiçbir nekroz bölümünde mevcut. Hafif tıkanıklık bağırsak katmanlar segmentlerinin (mukoza, submukoza, muscularis ve serosa) bulunabilir. Şekil 2B (HPS leke) Mukozal nekroz nekrotik enterit bir tavuk çiftliğinde bir klinik vaka kurtarıldı Clostridium perfringens patojenik bir tür enjeksiyon 7 saat gösterir. Villus ipuçları nekrotik enterositler villus ipuçları çevreleyen aşınmış. Villus çevreleyen nekrotik materyalin büyük çubuksu bakteriler kümeleri (oklar) gözlenir. Bu bakterilerin daha da bir Twort'ın leke (gösterilmez) gram-pozitif bakteri tespit edilmiştir. Bu bulgu, kombine ile yalıtım tarafından Clostridium perfringens, çok sayıda Bakteriyolojinin lezyonlar bu bakteri tarafından victimsâ gösterir. Şekil 2C (HPS leke) nerede nekroz patojenik C. perfringens enjeksiyon için ilgili olmayan iskemik bir döngü histolojik lezyonlar gösterir suşları ama kötü sonucu yürütülen yordamlar. Bu büyütme Clostridium perfringenstarafından neden lezyonlar olarak yanlış yorumlanabilir şiddetli koagülasyon nekrozu gösterir. Ancak, hiçbir bakteri bu bölümde gözlenir. Ayrıca, kan damarlarının kas katmanındaki ciddi oluşan bozucu eritrositler (oklar) çok sayıda birikimi büyümüş. Bu damar tıkanıklığı göstergesidir ve bu durumda, tıkanıklık ve birleştirilmiş mezenterik damarların tarafından neden oldu. İskemik döngüler kolayca macroscopically cerrahi işlemler sırasında tespit edilebilir; şiddetli damar tıkanıklığı, serosa yerine onun normal pembe-kırmızı rengi koyu mavi olacak.

Figure 2
Şekil 2: histopatolojik bulgular 7 h sonrası enfeksiyon. (A) orada hiçbir nekrotik lezyonlar içinde mukoza histopatoloji enjeksiyon beyin kalp infüzyon (BHI), steril bir kültür ortamı, aşağıdaki. (B) Clostridium perfringenspatojenik bir gerilme ile enjekte döngüler içinde orada mukoza nekrozu mukoza kapsayan çok sayıda büyük gram-pozitif çubuksu bakteriler ile işaretlenir. (C) iskemik lezyonları nekrotik lezyonlar C. perfringenstarafından neden benzer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu çalışmada, döngüler ile steril kontrol kültür orta (BHI) veya etkilenen çeşitli antibiyotik ücretsiz tavuk sürüler veya nekrotik enterit12 ile değil kurtarıldı Clostridium perfringens beş farklı suşları bir enjekte edildi . 10 tavuk Bu çalışmada kullanılmıştır. Art arda lezyonlar nekrotik enterit mukoza ile uyumlu neden yeteneği dayalı suşları patojen tespit edilemedi. Nekrotik enterit 7 h sonrası enfeksiyon, suşları mukozal nekroz neden yeteneğini gösterdi klinik durumlarda kurtarıldı suşları kurtarıldı ise klinik olarak sağlıklı tavuk çiftlikleri mukozal nekroz neden değil ve mukoza normale benzer BHI12ile enjekte denetim döngüler bulgular. Aynı hayvan çok sayıda döngüleri kullanarak, beş C. perfringens suşları ve dört denetim döngüler içinde aynı kuş kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bağırsak döngüler modelleri ev sahibi-patojen etkileşim ve Clostridium perfringens, Clostridium difficile ve gibi çeşitli bağırsak patojenlerin neden olduğu hastalıkların patogenezinde çalışmaya çok sayıda tür tarif var Salmonella enterica7,9,13,14,15. Mukozal immün yanıt16, antikorlar intestinal patojenleri11 tarafından atılır bakteriyel toksinler etkisiz hale getirmek için ve bağırsak hastalıkları10 önlemek için aşı aday değerlendirmek için etkinliğini analiz etmek için de kullanılmıştır . Ancak, çok sayıda ve birleştirilmiş döngüler içinde tek bir bireysel hayvan kullanarak bu modeli tavuklarda kötü tanımlanır ve bu teknik standardizasyon yetersiz manipülasyonlar yanlış sonuçlar ve yanlış okuma yol açabilir gibi geçerli sonuçlar elde etmek için zorunludur . Bu el yazması 9 ardışık ve birleştirilmiş döngüler değişir ve ileum tavuk mide-bağırsak sistemi içinde yer alan oluşturulmasını gösterir. Bu çalışmada belirli patojen ücretsiz (SPF) Livorno erkek tavuk 1.0 ve 1.2 kg arasında ağırlıklı kullanılır. 26 cm küçük bağırsaklar kolayca coelomic boşluğundan exteriorized döngü bu doğurmak vasıl bu ağırlık tarafından izin verilen en fazla sayısını 9, sonra alınmaya başlanmıştır. Başka bir cins ve/veya ağır Livorno erkek tavuk kullanılarak, oluşturulan döngüler toplam sayısı olabilir ki farklı, 9'dan daha yüksek dışarıda değil. Bağırsak döngü uzunluğu da değiştirilmiş olabilir, ancak 2 cm uzunluğu ise mevcut bağırsak uzunluğu maksimum kapasitesini kullanarak örnek toplama histopatoloji ve Bakteriyolojinin için izin vermek için en iyi olarak kabul edildi.

Bu makalede açıklanan bağırsak ve birleştirilmiş döngü tekniği Clostridium perfringenstarafından neden tavuklarda nekrotik enterit eğitim kullanılabilir mevcut modelleri için değerli bir alternatif olabilir. Bir önceki madde12içinde açıklanan sonuçlara göre 5 C. perfringens suşları 10 tavuk ile değerlendirilmesi C. perfringensson derece öldürücü ve komensal suşları ayırt etmek için yeterli idi. Buna karşılık, C. perfringens ile nekrotik enterit çoğaltmak os aşılama kullanarak diğer enfeksiyon modelleri aynı sonuçları elde etmek için bireylerin çok sayıda gerektirecektir. Literatürde, kuşların sayısı C. perfringens suşları aralığından 10 grup17,18,19 ' a grubu20başına 100 ana bilgisayar başına 30 tavuk virülans değerlendirmek gerekiyordu. Hayvan kullanılmak üzere araştırma iyileştirme ilkesi açısından önemli sonuçlar elde etmek için ana bilgisayar en düşük sayısı gerektiren tekniği kullanmak tavsiye olacaktır. Bu makalede açıklanan bağırsak ve birleştirilmiş döngü modeli büyük olasılıkla C. perfringens suşları virülans karşılaştırmak için tavuk en düşük sayısı gerektiren modelidir.

Sadece C. perfringens kültür ve karakterizasyonu tarafından darbe alan jel elektroforez (PFGE) yordamlar sonra kaç gün sonra çapraz bulaşma kaçak bir bağ üzerinden tarafından değerlendirilecektir bu yana, bu simge durumuna küçültmek için çok önemli olduğunu 1 cm dahil ederek risk içeren bir interloop bağ orta yolda 2 bitişik döngüler arasında interloops. Bu önlem alarak, olası bir çapraz bulaşma kaçınmak mümkün olmuştur. Nitekim, patojenik suşları mikroskobik nekrotik lezyonlar nekrotik enterit ile orada uyumlu hiçbir önemli mikroskobik lezyonlar ile patojenik olmayan enjekte bitişik döngülerinde victimsâ iken C. perfringens suşları veya BHI kültür orta negatif kontrol. Bu farklı suşları güvenle aynı tavuk bitişik bağırsak döngüler enjekte göstergesiydi.

Bu model ile en zor sorunlardan biri havalandırma ve bağırsak vaskülarizasyon ödün vermeden küçük bağırsak exteriorization yapıldı. Kuşların memeliler daha farklı bir solunum sistemi vardır. Diyafram yoktur ve havalandırma airsacs, ince duvarlı yapıları karın boşluğunda tarafından kontrol edilir. 7 Bu tavuklarda ve rahim ağzı (1), anterior torasik (2), posterior torasik (2) ve abdominal (2) hava keseleri ayrılır. Bu balon benzeri yapıların doğrudan akciğerlere bağlı ve hava solunum yolu içinde hareket için izin. Göğüs kemiği ve cloaca arasında karın boşluğu açılması, üzerine karın airsacs belirgindir ve kolayca rüptüre, özellikle kuru izin verirseniz eğilimindedir. Bu nedenle, steril serum fizyolojik ile emdirilmiş gauzes ile sürekli nemlendirme uygun havalandırma ve anestezi işlemler sırasında kolaylaştırmak önemlidir. Ayrıca, bağırsak karın boşluğu dışında exteriorizing ise karın airsacs içinde küçük delikler önlemek zor olabilir. Solunum hızı ve desen, palpebral refleksleri, kalp hızı ve tavuk anestezi yeterli bir uçağın altında kaldığından emin olmak için tavuğun hareketleri gibi anestezik parametreleri izlemek önemlidir. Küçük hava kaçağı daha az anestezi kalitesini etkilemesi muhtemeldir, ama bu sızıntı indirilmelidir. Hermetik Karın zarını yordamlar sonra kapatmak önemlidir. Bu iç hava basıncı yeniden kurmak ve havalandırma normale bu adımdan sonra dönecektir. Bu yapı kapatılması sonra karın üzerinden hiçbir hava kaçağı olmalı. Bu steril serum fizyolojik küçük bir miktar üzerinde dikiş püskürtülerek doğrulanabilir ve kabarcık oluşumu gösteren hava Karın boşluğundan geliyor arayabilirsiniz. Bu durumda, ek basit deri dikiş hava kaçağı sitesinde yerleştirilebilir.

Başka bir teknik olarak zor yönü iskemik lezyonları bağırsağın kötü yürütülen cerrahi işlemler nedeniyle geliştirme riski ile ilgili. Dokulara oksijen ve diğer moleküller hücre metabolizması için ihtiyaç sıkıntısı neden, kan akımı kısıtlanması iskemi olur. Bu durumda, bağırsak hızla macroscopically Lacivert pembe-kırmızı yerine olacak ve bağırsak mukozal hücreleri hızlı bir şekilde dejenere. Bu iskemik lezyonları için enjekte patojen ilişkili olmayan neden olur ve histopatolojik yorumu ile engel olacaktır. İkisi de sorunlu durumlar için iskemi neden olabilir. İlk olarak, bağ mezenterik damarların dikkatsizlik tarafından bu durum neden olur. Bu nedenle, bitişik harfler mezenterik damarları eklememek için bağırsak boyunca yerleşimini dikkatle bakmak çok önemlidir. İkinci olarak, kanama mezenterik damarların işlemler sırasında oluşursa iskemi olabilir. Bu yapıların ince duvarlı ve kırılgan. Aşırı gerilim için onların rüptürü ve el ile bağırsak exteriorizing süre açabilir, dikkat için gerginlik mezenterik damarları bu adımı sırasında kendi bütünlüğünü sağlamak için verilmelidir. Ayrıca, bunlar bir cerrahi dikiş iğne ile delinmiş mezenterik damarları kanama oluşabilir. Cerrah dikkatle bıçaklanmasından iğne ile deldi yeri bakmak gerekir. Her iki durumda da kanama durdurulabilir, ancak koagülasyon işlemi durdurmak veya önemli ölçüde bu nedenle geri dönüşü olmayan lezyonlar neden ve sonuçları geçerliliğini ödün bağırsak bu kesimler için kan akışını azaltmak.

Ana bilgisayar-patojen etkileşimleri, çalışma ve bağırsak hastalıkları bulaşıcı ajanları tarafından neden patogenezinde için kullanışlı bir modeldir. Önerilen model oluşturulan döngü sayısını değiştirerek veya her döngüsünün uzunluğunu değiştirerek bağlı olarak çalışmaya adapte edilebilir. Bu tür değişiklikleri uygulamadan önce bu önemli sonuçlar sağlamak için yöntem standartlaştırmak için tavsiye edilir. Bu teknik sınırlamaları beceri odaklı vardır ve tek düzgün eğitimli personel bu ameliyatı canlı hayvanlar üzerinde gerçekleştirmeniz gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Veteriner Tıp Fakültesi üzerinden Université de Montréal Tavukçuluk araştırma (M. Boulianne) sandalyede tarafından desteklenmiştir. DRS. Boulianne ve üst modelini geliştirmiştir. DRS. Boulianne ve üst ameliyatlar yapılır. Doktor Burns'ü anestezi protokolünü geliştirmede yardımcı oldu. Dr. üst düzenlenmiş video ve el yazması yazdı. DRS Burns, el yazması Desrochers ve Boulianne düzenlenmiş.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2, (1), 1-4 (2015).
  2. Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. (2015).
  3. Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41, (1), 112-116 (1977).
  4. Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21, (2), 230-240 (1977).
  5. Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56, (4), 1229-1231 (1977).
  6. Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4, (2), e26 (2008).
  7. Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32, (6), 503-512 (2009).
  8. Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45, (3), 365-369 (2016).
  9. Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149, (1), 103-112 (2013).
  10. Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47, (1), 52 (2016).
  11. Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12, (1), 101 (2016).
  12. Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46, (2), 138-149 (2017).
  13. Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7, (9), e45608 (2012).
  14. Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68, (12), 7122-7125 (2000).
  15. Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40, (1), 5 (2009).
  16. Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256, (1-2), 19-33 (2001).
  17. Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
  18. Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16, (3), 289-292 (2010).
  19. Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142, (3-4), 323-328 (2010).
  20. Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51, (4), 834-839 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics