Ein Modell der aufgespaltenen Dünndarmschlinge in Kostenlose Hühner narkotisierten spezifischen Erreger Clostridium Perfringens Virulenz zu studieren

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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um chirurgisch "Darm aufgespaltenen Loops" Huhn Dünndarm schaffen. Dieses Verfahren ermöglicht den Vergleich von mehreren Clostridium Perfringens Stämmen Virulenz in Situ in einem einzelnen Host. Diese Methode verringert deutlich die Anzahl der Hühner in der Regel für ähnliche in Vivo Experimente notwendig.

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Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

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Abstract

Nekrotische Enteritis wurde bei Hühnern, die mit verschiedenen in Vivo Infektionsmodelle untersucht. Die meisten davon verwenden eine Kombination der prädisponierenden Faktoren wie Kokzidiose und Ernährung, mit Magensonde oder Verabreichung über das Futter mit Clostridium Perfringens. In diesen Modellen erfordert der Vergleich mehrerer C. Perfringens Belastungen für Virulenz Studien eine große Anzahl von Hosts, signifikante Ergebnisse zu erhalten. Sterblichkeit im Verlauf der Studie kann je nach experimentellen Modell, daher ethische Bedenken bezüglich Tierschutz in der Forschung hoch sein. Die Entwicklung der neuen Infektionsmodelle erfordern weniger Tiere, Pathogenese, noch eine statistisch signifikante und gültige Ergebnisse zu studieren ist wichtig bei der Verringerung der Tierversuche in der Forschung. Aufgespaltenen Dünndarmschlinge Modelle wurden verwendet, um eine Infektionen in verschiedenen Arten wie Mäuse, Kaninchen und Kälber zu studieren. Nach chirurgischen Eingriffen, aufgespaltenen Schleife Segmente zu erstellen sind C. Perfringens Stämmen direkt in die Schlaufen herstellen einen engen Kontakt zwischen den Bakterien und die Darmschleimhaut injiziert. Proben der Dünndarm und der luminalen Inhalte sind bei Beendigung der Verfahren nach ein paar Stunden genommen. In jedem Tier, damit die Verringerung der Anzahl der erforderlichen Themen in den Experimenten können mehrere Bakterienstämme inokuliert werden. Auch sind Eingriffe unter Vollnarkose, Tieren Schmerzen zu reduzieren. Bei Hühnern wäre dieses Modell besser geeignet als orale Verabreichung, C. Perfringens Belastungen Pathogenität zu vergleichen, weil weniger Tiere erforderlich sind, keine prädisponierenden Faktoren erforderlich sind, um die Krankheit zu induzieren und Schmerz durch Analgetika gesteuert wird . Die aufgespaltenen Dünndarmschlinge Modell ist schlecht beschrieben bei Hühnern und Standardisierung ist wichtig für die optimale Nutzung. Diese Handschrift enthält die notwendigen Schritte um zahlreiche Darm aufgespaltenen Schleifen bei Hühnern zu erstellen und bringt Informationen über die kritischen Punkte um valide Ergebnisse zu erhalten.

Introduction

Die Verwendung von Tiermodellen, ansteckende Krankheiten, die Auswirkungen auf Mensch und Tier zu studieren ist ein zentrales Instrument bei der Beurteilung der Virulenzfaktoren Regulierung der Pathogenese einer bestimmten Bedingung sowie, erarbeiten Strategien zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten1. Trotz der zahlreichen Vorteile der Verwendung von Tiermodellen um zu verschiedenen Krankheiten zu studieren entstehen ethische Bedenken in Bezug auf diese Praxis. Forscher müssen Verwendung von Tieren bei der Erlangung relevanter und gültige Ergebnisse zu minimieren. Das Konzept der 3 Rs Grundsätze (Replace, Reduce und verfeinern) wurde erarbeitet, um sicherzustellen, dass Tierschutz in solchen Studien behandelt wurden. In Huhn nekrotische Enteritis Studien sind in Vivo Huhn Modelle zur Ätiologie, Verhütung und Behandlung von diesem Zustand2,3,4,5zu untersuchen. Pathogene Stämme von C. Perfringens tragen spezielle Virulenzfaktoren, wie z. B. der NetB Toxin6, werden verabreicht, um nekrotische Enteritis in Hühner7verursachen. Das Ersatz-Prinzip ist daher schwierig, in einem solchen Fall zu erreichen, da diese Virulenzfaktoren möglicherweise nicht so kritisch bei anderen Tierarten. Die meisten Modelle für nekrotische Enteritis bei Hühnern verwenden eine Kombination von Risikofaktoren wie Kokzidiose und veränderte Ernährung zu induzieren nekrotische Enteritis, gefolgt von Magensonde bouillonkultur mit einer großen Anzahl von C. Perfringens2. Diese Modelle werden die Krankheit in eine große Anzahl von Hühnern induzieren und Sterblichkeit kann in solchen Studien8, so Bedenken über die Reduzierung und Raffinesse Prinzipien in Tierversuchen wichtig sein.

Intestinale aufgespaltenen Schleifen Modelle sind eine wünschenswerte Alternative für das Studium der Krankheiten ausgelöst durch Darm Krankheitserreger in Bezug auf die Reduzierung der Grundsatz und Raffinesse. In diesen Modellen entstehen indem man Ligaturen, entlang den Darm-Trakt, unabhängige und hermetische Fächer zu bilden, wo Krankheitserreger allein9 injiziert werden können, oder mit anderen Molekülen, wie z. B. Impfstoffkandidaten Darm Segmente, so genannte "Loops" 10 , 11. die Erreger von Interesse stehen in engem Kontakt mit der Darmzellen und nach ein paar Stunden hinweg Infektion, intestinale Proben zur weiteren Analyse gewonnen werden können. Dies ermöglicht die Verwendung von mehreren Behandlungs- und Kontrollgruppen im selben Tier. Statistische Analyse kann mit Messwiederholungen Modelle, die die Kraft der Unterscheidung zwischen Gruppen erhöht und reduziert die Anzahl der notwendigen Hühner im Vergleich zu oralen Magensonde Studien durchgeführt werden. Darüber hinaus sind chirurgische Eingriffe und anschließende Infekt-Zeiten unter kontinuierlicher allgemeine Anästhesie und Analgesie, damit den Tieren Schmerzen zu minimieren durchgeführt. Closed-Loop-grundsätzlich sind eine ideale Vorlage zur Verringerung der Host-Nummern und eine menschlichere System in Tierversuchen zu schaffen.

Intestinale aufgespaltenen Schleifen Modelle sind gut beschrieben in verschiedenen Arten, wie Kälber, Hasen und Mäuse2,9, aber schlecht in Hühner7beschrieben. Für eine optimale Nutzung dieses chirurgische Modells sind richtige Technik und Ausführung Voraussetzung für die Schaffung der aufgespaltenen Darm Schleifen zur Vermeidung von Schäden für die intestinale Integrität. Das Ziel dieser Handschrift ist eine Schritt-für-Schritt-Methode bei der Schaffung von mehreren Darm Schleifen in einem Huhn-Modell zu beschreiben. Diese Technik ist durch Geschick und Erfahrung des Operateurs begrenzt, da genaue Verfahren essentiell für den Erfolg des Projekts sind.

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Protocol

Alle Verfahren mit live Tiernutzung wurden autorisiert durch die Ethikkommission der Faculty of Veterinary Medicine, Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d' Éthique de Runden des Animaux ").

1. Überlegungen vor der Operation

  1. Wählen Sie 10 Wochen alt spezifischen Erreger freie (SPF) Leghorn Hühnern für die Chirurgie.
    Hinweis: ihr Gewicht muss zwischen 1,0 und 1,2 kg liegen.
  2. Zurückziehen des Feeds 12 h vor dem Verfahren, den Darm zu entleeren.
  3. Legen Sie vor der Operation die Hühner unter Vollnarkose nach einem Protokoll von einem Anästhesisten überprüft. Premedicate jedes Huhn 15 min vor der Operation mit einer intramuskulären Injektion (IM) Midazolam 1 mg/kg und Butorphanol 4 mg/kg. Wiederholen, alle 4 h die Injektion von Butorphanol 4 mg/kg IM oder die Atmung Muster Änderungen und Frequenz steigt, während der Narkose. Für die Vollnarkose während alle Verfahren zu verwalten Isofluran in einer Konzentration zwischen 1,5 und 2,5 % mit einer intratrachealen Rohr.
    Hinweis: Die Verwendung von Prämedikation für Sedierung und Analgesie wird empfohlen, da sie werden erheblich verbessern die Tiefe der Narkose, reduzieren Sie die Menge der Anästhesie notwendig bei allen Eingriffen, sowie erlauben es, Schmerzen zu kontrollieren.
  4. Überwachen Sie die Narkose durch die Erfassung der Körpertemperatur, Herzfrequenz und Elektrokardiogramm (EKG), respiratory Rate und Rhythmus, Sauerstoff-Sättigung, abgelaufene Kohlendioxid (CO2) und neurologische Reflexe.
    Hinweis: Eine Person muss zugewiesen werden, um diese Parameter über alle Verfahren zu überwachen.
  5. Grundsätzen der Sterilität im gesamten chirurgischen Eingriffen. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg und der Chirurg mit sterilen Kittel, Handschuhe, Maske Kleid und Schutzbrille nach institutionellen präoperative Protokolle. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg die Hände mit einer Chlorhexidin Gluconat imprägniert sterile Bürste bis zum Ellenbogen mit Schwerpunkt auf Fingernägel und jeder Finger Oberfläche scheuert.
  6. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente mit einem Sterilisator.

2. chirurgische Baustellenvorbereitung

  1. Erstens, manuell zu entfernen die Federn aus dem Bauch mit einem sanften Traktion.
  2. Schrubben Sie der Operationsstelle mit einer Chlorhexidin Gluconat Waschmittel imprägnierten sterile Bürste. Schrubben Sie vorsichtig die Haut von der Mitte nach außen für eine totale Kontaktzeit von 5 min ohne zurück in die Mitte zu kommen.
  3. Durchführen Sie 3 alternative Passagen an der Operationsstelle Chlorhexidin Gluconat Lösung mit Isopropyl-Alkohol mit sterile Gazen.
    Hinweis: Die Passage muss aus der Mitte der Operationsstelle bis an die Grenzen zur Vermeidung von Kontaminationen aus den Bereichen nicht desinfiziert an der Operationsstelle beginnen.
  4. Legen Sie die sterile op-Tuch, auf das Huhn.

3. Gewinnung des Dünndarms aus der Bauchhöhle

  1. Einschneiden Sie den chirurgischen Faltenwurf mit der Schere, nur die Haut an der Operationsstelle verfügbar zu machen.
  2. Einschneiden der Haut durch ein '' L'' Form Low-Mittellinie Schnitt mit einem Skalpellklinge #3 ausführen.
    1. Den erste Schnitt 1 cm auf dem Brustbein kaudalen und Ankunftsflughäfen Sie es 1 cm kranial an der Kloake.
    2. Den zweite Schnitt senkrecht zur ersten Schnitt ausführen. Ab der kaudalen Ende des ersten Schnittes und 5 cm auf der linken Seite des Bauches durch das Becken Linie weiter.
      Hinweis: Diese Öffnung schafft eine Klappe, die es eine einfachere Extraktion des Darms ermöglichen.
  3. Mit Chirurgie schneiden Schere, Sie das Peritoneum und Bauchmuskeln mit dem gleichen '' L'' Form Muster, die Bauchhöhle zu öffnen.
    Hinweis: Dadurch werden die Lungenbläschen sichtbar. Darm befinden sich unterhalb dieser Strukturen. Luftsäcke muss mit Gazen gesättigt mit steriler Kochsalzlösung 0,85 % zur Vermeidung von Austrocknung und möglichen Bruch während des Verfahrens befeuchtet werden.
  4. Einfügen, die eine lange Nase zu kastrieren Haken in die Bauchhöhle durch Anschluss an der linken Bauchwand und arbeiten rund um den Bauch Luftsäcke.
  5. Sanft exteriorize den Darm und verteilt diese auf das Operationsfeld.
    Hinweis: Bewahren Sie Darm befeuchtet durch sterile Kochsalzlösung 0,9 % während des Verfahrens häufig sprühen. Gazen mit steriler Kochsalzlösung befeuchtet können auch auf den Darm um Austrocknung zu vermeiden platziert werden.
  6. Schnappen Sie sich den Darm mit einem trockenen steriler Gaze und vorsichtig herausziehen den Dünndarm durch manuelle Traktion, das Jejunum verfügbar zu machen.
    Hinweis: Mesenterialen Gefäße sind zerbrechlich und übermäßige Spannung können sie die zu Darm ischämischen Läsionen führen und erheblich beeinträchtigen das Ergebnis des Verfahrens kann platzen.

4. Herstellung von intestinalen Schleifen

  1. Erstellung von Schleife Nr. 1.
    1. Legen Sie eine einfache Ligatur mit einem Polyglactin Multifil synthetische resorbierbare Material in den proximalen Jejunum durch die Vermeidung der Ligatur der großen mesenterialen Gefäße.
    2. Statt einer distalen Ligatur 2 cm weg von der proximalen Ligatur.
      Hinweis: Einfache Ligaturen, die mit Multifil Nahtmaterial befinden sich entlang den Darm-Trakt, hermetische Segmente zu erstellen. Ein Schema (Abbildung 1) beschreibt die Position des alle Ligaturen. Die Loops bestehen aus einem proximalen und distalen Ligatur durch 2 cm getrennt.
  2. Erstellung von Interloop Nr. 1.
    1. Legen Sie eine einfache Ligatur 0,5 cm aborally an der distalen Ligatur der Schleife Nr. 1.
      Hinweis: Zwischen aufeinanderfolgenden Schleifen gibt es Interloops von 1 cm, d.h. Segmente, so dass eine räumliche Trennung zwischen den Schleifen. Um das mögliche Risiko einer Kreuzkontamination von einer Schleife in eine andere Wahrscheinlichkeit zu verringern, ist eine einfache Ligatur in der Mitte der Interloop (0,5 cm von der proximalen und distalen Ligatur von 2 benachbarten Schleifen) platziert. Dies reduziert das Risiko einer möglichen durchgesickerten Kontaminanten aus einer Schleife, die Ligatur einer angrenzenden Schleife zu erreichen. Diese Segmente sind nicht obligatorisch, aber verringert sich das Risiko einer Kreuzkontamination.
  3. Erstellung von nachfolgenden Schleifen und Interloops.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2, die Anzahl der gewünschten Schleifen zu erhalten.
      Hinweis: In diesem Experiment wurden 9 Loops und 8 Interloops erstellt. Gesamtlänge betrug 26 cm. Die Anzahl der Schleifen kann je nach Studie eingestellt werden.

5. Injektion von Clostridium Perfringens Stämmen in the Loops

  1. Spritzen Sie mit eine sterile Spritze und Nadel 26 G des Erregers in Schleife Nr. 1. Sanft legen Sie die Nadel auf der antimesenteric Seite des Darms in einem Winkel von 45°.
    Hinweis: In diesem Experiment wurde 0,2 mL Gehirn Herz Infusion (BHI) mit 1 x 106 KBE (Kolonie bildende Einheiten) von C. Perfringens in der Mitte des Log Wachstumsphase in jedem Schleifendurchlauf injiziert. 5 verschiedene Stämme wurden in 5 verschiedenen Schleifen injiziert und die 4 verbleibenden Loops wurden mit eine Negativkontrolle enthält keine Bakterien (sterile BHI), abwechselnd Krankheitserreger und sterile BHI Schleifen injiziert.
  2. Wiederholen Sie Schritt 5.1 alle Schleifen zu injizieren.
  3. Ersetzen Sie sanft den Darm-Trakt im dorsalen Bereich der Bauchhöhle unterhalb der Luftsäcke.

6. Abschluss der Bauchhöhle

  1. Die Naht des Peritoneums und Bauchmuskeln.
    1. Naht das Peritoneum und Bauchmuskeln entlang des Beckens (hergestellt in Schritt 3.3) mit einem einfachen kontinuierliche Naht Muster mit einem Polyglactin Multifil synthetische resorbierbare Material.
    2. Naht das Peritoneum und Bauchmuskeln aus dem Brustbein, der Kloake (hergestellt in Schritt 3.3. mit einem einfachen kontinuierliche Naht Muster mit einem Polyglactin Multifil synthetische resorbierbare Material.
  2. Die Naht der Haut.
    1. Schließen Sie mit einem Polyglactin Multifil synthetischen Material und eine einfache kontinuierliche Naht Muster, den Schnitt der Haut entlang des Beckens im Schritt 3.2 gemacht.
    2. Mit dem gleichen Multifil Ligatur-Material und eine einfache kontinuierliche Naht Muster, schließen Sie die Inzision der Haut aus dem Brustbein, der Kloake in Schritt 3.2 gemacht.

7. Abschluss

  1. Halten Sie nach chirurgischen Eingriffen das Huhn unter Vollnarkose mit richtigen Gebrauch von Analgetika, Tieren Schmerzen während der Zeit der Infektion zu minimieren. Weiterhin Narkose überwachen um eine ausreichende Anästhesie zu gewährleisten.
  2. Nach dem gewünschten Infektion Mal Human einzuschläfern Sie das Huhn durch zervikale Dislokation unter Vollnarkose.
    Hinweis: Für diese Verfahren wurde die erforderliche Zeit, mikroskopische Läsionen mit C. Perfringens pathogenen Stämmen zu induzieren 7 h.
  3. Geschnitten Sie mit einem Skalpellklinge #3 0,5 cm auf 1 cm langen Loop Sektion und in 10 % Formalin zur Fixierung über Nacht und weitere histopathologische Analyse.
  4. Schneiden Sie mit der gleichen Skalpellklinge die restlichen Loop Sektion und legen Sie sie in einen sterilen Microcentrifuge Schlauch für die Isolierung von C. Perfringens Stämmen in jeder Schleife weiter bakteriologischen Analyse für ihre genetische Charakterisierung.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 und 7.3 für alle Schleifen durch eine Änderung der Skalpellklinge zwischen jeder Schleife.

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Representative Results

Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der 9 Darm Loops und 8 Interloops. In diesem Modell werden insgesamt 9 Schleifen und 8 Interloops mit einfachen Ligaturen erstellt. Eine Schleife besteht aus proximalen und distalen Ligaturen Abstand von 2 cm, gemessen von der proximalen Ligatur. Zwei benachbarte Schleifen werden durch eine Interloop von 1 cm getrennt. Um das mögliche Risiko einer Kreuzkontamination zwischen Schleifen durch Leckage aus einer Ligatur zu verringern, wird eine interloop Ligatur auf halbem Weg von der distalen Ligatur und proximalen Ligatur von 2 benachbarten Schleifen gelegt. Die Anzahl der Schleifen kann je nach den Anforderungen der Studie eingestellt werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der aufgespaltenen Darm Schleifen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2A (HPS Fleck) zeigt die mikroskopische Darstellung der eine Dünndarmschlinge mit einem sterilen Steuermedium injiziert. Die Schleimhaut Pinsel-Grenze ist intakt und es gibt keine Nekrose im Bereich. Milde Staus kann in den Darm Schichten (Schleimhaut, Submukosa, Muscularis und Darmhaut) der Segmente vorhanden sein. Abbildung 2 b (HPS Fleck) zeigt Schleimhaut Nekrose 7 Stunden nach der Injektion eines pathogenen Stamm von Clostridium Perfringens erholte sich von einer klinischen Fall nekrotische Enteritis auf einer Hühnerfarm. Villi Tipps sind mit nekrotischen Enterozyten rund um die Zotten Tipps erodiert. In das nekrotische Material rund um die Zotten werden Cluster von großen stäbchenförmige Bakterien (Pfeile) beobachtet. Diese Bakterien wurden weiter als gram-positiven Bakterien mit einem Twort Fleck (nicht dargestellt) identifiziert. Dieser Befund, kombiniert mit der Isolierung von Bakteriologie einer großen Zahl von Clostridium Perfringens, zeigt die Läsionen durch dieses Bakterium verursacht wurden. Abbildung 2 (HPS Fleck) zeigen histologische Läsionen einer ischämischen Schleife Nekrose bezieht, nicht auf die Injektion von pathogenen C. Perfringens Stämmen, sondern das Ergebnis schlecht ausgeführt Verfahren. Diese Vergrößerung zeigt schwere Koagulation Nekrose, die als Läsionen verursacht durch Clostridium Perfringensfehlinterpretiert werden könnten. Allerdings sind in diesem Abschnitt keine Bakterien beobachtet. Darüber hinaus sind die Blutgefäße in die Muskelschicht stark durch die Ansammlung einer großen Zahl von degenerierenden Erythrozyten (Pfeile) erweitert. Dies ist bezeichnend für vaskuläre Staus und in diesem Fall wurde die Überlastung von aufgespaltenen mesenterialen Blutgefäße verursacht. Ischämische Schleifen können leicht makroskopisch im Verlauf der chirurgischen Verfahren identifiziert werden; nach schweren vaskulären Staus werden die Darmhaut dunkelblau statt seine normale Rosa-rötliche Färbung.

Figure 2
Abbildung 2: histologischen Befunde 7 h nach der Infektion. (A) es gibt keine nekrotischen Läsionen in der Schleimhaut auf Histopathologie nach der Injektion von Brain Heart Infusion (BHI), einem sterilen Nährmedium. (B) In Schleifen mit einem pathogenen Stamm von Clostridium Perfringensinjiziert, ist es Nekrose der Schleimhaut mit zahlreichen großen grampositiven stabförmigen Bakterien über die Schleimhaut gekennzeichnet. (C) ischämische Läsionen können nekrotische Läsionen verursacht durch C. Perfringensähneln. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

In dieser Studie wurden die Schleifen mit einem sterilen Kontrolle Nährmedium (BHI) oder zu einer der fünf verschiedenen Sorten von Clostridium Perfringens erholte sich von verschiedenen Antibiotika freie Huhn Herden betroffen oder nicht mit nekrotische Enteritis12 injiziert. . Zehn Hühner wurden in dieser Studie verwendet. Stämme Pathogenität konnte ermittelt werden, basierend auf der Fähigkeit, immer wieder Läsionen kompatibel mit nekrotische Enteritis auf die Schleimhaut verursachen. Zwar Stämme von klinischen Fällen nekrotische Enteritis zeigte die Fähigkeit, Schleimhaut Nekrose 7 h nach der Infektion, Stämme verursachen erholt aus erholte sich klinisch gesund Hühnerfarmen nicht dazu veranlassen, die Schleimhaut Nekrose und die Schleimhaut war ähnlich wie bei der normalen Erkenntnisse aus der Regelkreise mit BHI12injiziert. Mithilfe von zahlreichen Schleifen im gleichen Tier könnte fünf C. Perfringens Stämmen und vier Regelkreise in der gleiche Vogel verwendet werden.

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Discussion

Intestinale Schleifen Modelle wurden in zahlreichen Arten, Wirt-Pathogen Interaktionen und Pathogenese von Krankheiten, die durch verschiedene Darm Krankheitserreger, wie , Clostridium Perfringensund Clostridium Difficile zu studieren beschrieben Salmonella Enterica7,9,13,14,15. Es wurde auch verwendet, der mukosalen Immunantwort16, die Wirksamkeit von Antikörpern, bakterielle Toxine ausgeschieden durch Darm Krankheitserreger11 neutralisieren und Impfstoffkandidaten gegen Darmerkrankungen10 bewerten zu analysieren . Allerdings ist dieses Modell mit zahlreichen aufgespaltenen Loops in einem einzelnen Tier schlecht beschrieben bei Hühnern und Standardisierung dieser Technik ist zwingend erforderlich, um valide Ergebnisse zu erhalten, da unzureichende Manipulationen zu falschen Ergebnissen und Fehlinterpretationen führen kann . Diese Handschrift zeigt die Entstehung von 9 aufeinanderfolgenden aufgespaltenen Schleifen befindet sich im Jejunum und Ileum von Huhn-Magen-Darm-Trakt. Diese Studie verwendete spezifische Erreger frei (SPF) Livorno männliche Küken wiegen zwischen 1,0 und 1,2 kg. Die maximale Anzahl der Schlaufen durch diese Rasse bei diesem Gewicht erlaubt war 9, da 26 cm des Dünndarms leicht aus dem coelomic Hohlraum verwirklicht werden konnte. Es ist nicht ausgeschlossen, dass durch die Verwendung einer anderen Rasse und/oder ein schwerer Livorno männlicher Huhn, die Gesamtzahl der Schleifen erstellt möglicherweise anders, sogar höher als 9. Intestinale Schleifen Länge konnte auch geändert werden, aber die 2-cm-Länge galt optimale Probenentnahme für Histopathologie und Bakteriologie, wobei die maximale Kapazität der verfügbaren Darm Länge ermöglichen.

In diesem Artikel beschriebene aufgespaltenen Dünndarmschlinge Technik kann eine wertvolle Alternative zu den aktuellen Modellen verfügbar, nekrotische Enteritis bei Hühnern verursacht durch Clostridium Perfringenszu studieren. Nach den Ergebnissen in einem früheren Artikel12beschrieben war die Evaluierung von 5 C. Perfringens Stämmen mit 10 Hühner ausreichend hoch virulenten und Kommensalen Stämme von C. Perfringenszu unterscheiden. Im Vergleich dazu benötigen andere Infektionsmodelle mit pro os Inokulation, nekrotische Enteritis mit C. Perfringens reproduzieren eine große Anzahl von Personen die gleichen Ergebnisse zu erzielen. In der Literatur die Anzahl der Vögel mussten die Virulenz von C. Perfringens Stämmen reicht von 10 bis 30 Hühner pro Gruppe17,18,19 , hundert Hosts pro Gruppe20zu bewerten. In Bezug auf die Verfeinerung Grundsatz für die Verwendung von Tieren in der Forschung wäre es ratsam, die Technik erfordern die niedrigste Anzahl an Hosts verwenden, um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Die aufgespaltenen Dünndarmschlinge Modell in diesem Artikel beschriebenen ist wahrscheinlich das Modell mit der niedrigsten Anzahl von Hühnern, die Virulenz von C. Perfringens Stämmen zu vergleichen.

Da Keimverschleppung durch Leckage aus einer Ligatur ausgewertet werden konnte, erst nach C. Perfringens Kultur und Charakterisierung von Feld Gelelektrophorese (PFGE) viele Tage nach dem Verfahren gepulsten war es äußerst wichtig, dies zu minimieren Risiko von 1 cm einschließlich interloops, enthält einen interloop Ligatur auf halber Strecke zwischen 2 benachbarten Schleifen. Durch diese Vorsichtsmaßnahmen war es möglich, eine mögliche Cross-Kontamination zu vermeiden. In der Tat, während pathogene Stämmen mikroskopische nekrotische Läsionen konkordante mit nekrotische Enteritis, es verursacht keine signifikanten mikroskopische Läsionen im benachbarten Schleifen mit nicht-pathogenen injiziert wurden C. Perfringens Belastungen oder die BHI Kultur medium negativ-Kontrolle. Dies war bezeichnend, dass verschiedene Stämme sicher im benachbarten Darm Schleifen der gleichen Huhn injiziert werden können.

Eines der schwierigsten Probleme mit diesem Modell war die Auslagerung des Dünndarms ohne Lüftung und Darm Vaskularisierung. Vögel haben ein anderes Atemsystem als Säugetiere. Die Membran ist abwesend, und Belüftung erfolgt durch Airsacs, dünnwandige Strukturen in der Bauchhöhle. Es gibt 7 diese in Hühner und sind in der Halswirbelsäule (1), vorderen Thorax (2), hinteren Thorax (2) und Bauch (2) Luftsäcke aufgeteilt. Diese Ballon-ähnlichen Strukturen sind direkt mit der Lunge verbunden und ermöglichen die Bewegung der Luft in den Atemwegen. Bei der Eröffnung der Bauchhöhle zwischen dem Brustbein und Kloake, Abdominal-Airsacs sind prominente und neigen dazu, leicht gebrochen werden, vor allem, wenn es trocken. Aus diesem Grund ist Konstante Befeuchtung mit Gazen gedämpft mit steriler Kochsalzlösung wichtig, ausreichende Belüftung und Anästhesie während der Verfahren zu erleichtern. Darüber hinaus ist es schwierig, kleine Einstiche im Bauch Airsacs während des exteriorizing die Eingeweide aus der Bauchhöhle zu vermeiden kann. Es ist wichtig, Narkose Parameter, wie Muster, palpebrale Reflexe, Herzfrequenz, Atemfrequenz und Huhn die Bewegungen, um sicherzustellen, dass das Huhn unter eine angemessene Ebene der Narkose bleibt zu überwachen. Kleine Luftverlust ist weniger wahrscheinlich, Einfluss auf die Qualität der Anästhesie, aber diese Leckage muss minimiert werden. Es ist wichtig, hermetisch schließen das Peritoneum nach den Prozeduren. Dies wird den internen Luftdruck wiederherzustellen und Lüftung wird wieder normal nach diesem Schritt. Nach der Schließung dieser Struktur sollte kein Luftverlust aus dem Bauch. Dies kann durch Sprühen eine kleine Menge des sterilen Kochsalzlösung auf die Nähte überprüft werden und suchen nach Blase Bildung zeigt Luft aus der Bauchhöhle. In diesem Fall können zusätzliche einfache hautnähte am Luft-Leckage-Standort platziert werden.

Ein weiterer technisch herausfordernden Aspekt bezieht sich auf das Risiko einer ischämischen Läsionen im Dünndarm wegen der schlecht ausgeführten chirurgische Verfahren zu entwickeln. Ischämie geschieht, wenn eine der Blutzufuhr zu den Geweben Einschränkung, wodurch einen Mangel an Sauerstoff und anderen Molekülen, die für den Zellstoffwechsel benötigt. In diesem Fall der Darm werden schnell makroskopisch dunkelblau statt Rosa-rötlich und die intestinalen Schleimhautzellen werden schnell entarten. Dadurch wird ischämische Läsionen, die in keinem Zusammenhang mit der injizierten Erreger und es beeinträchtigt die histopathologische Interpretation. Zwei problematische Situationen führen zur Ischämie. Ligatur der mesenterialen Gefäße durch Unachtsamkeit wird zunächst diese Bedingung verursachen. Aus diesem Grund ist es entscheidend für die Platzierung der Ligaturen entlang den Darm-Trakt zu vermeiden, einschließlich die mesenterialen Gefäße genau anschauen. Zweitens kann Ischämie passieren, wenn Blutungen der mesenterialen Gefäße im Verlauf der Verfahren auftreten. Diese Strukturen sind dünn ummauerten und zerbrechlich. Übermäßige Spannung führen kann, zu deren Bruch und manuell exteriorizing Darm, Aufmerksamkeit geschenkt werden, die Spannung auf die mesenterialen Gefäße ihre Unversehrtheit während dieses Schrittes zu gewährleisten. Mesenterialen Gefäße Blutungen kann auftreten, wenn diese mit einer chirurgischen Naht Nadel punktiert werden. Der Chirurg muss genau hinschauen an der Stelle mit der Nadel durch das Mesenterium durchbohrt. Blutungen kann in beiden Fällen gestoppt werden, aber der Koagulationsprozess stoppt oder reduzieren deutlich die Durchblutung auf diese Darm Segmente, daher irreversible Läsionen verursachen und beeinträchtigen die Gültigkeit der Ergebnisse.

Dieses Modell eignet sich für das Studium der Wirt-Pathogen Interaktionen und Pathogenese von Darmerkrankungen durch Infektionserreger verursacht. Das vorgeschlagene Modell kann durch Ändern der Anzahl von Schleifen erstellt oder durch Ändern der Länge der each-Schleife je nach Studie angepasst werden. Vor der Umsetzung solcher Änderungen, empfiehlt es sich, die Methode, um signifikante Ergebnisse gewährleisten zu standardisieren. Einschränkungen dieser Technik sind Geschicklichkeit-orientiert und nur von geschultem Personal sollte diese Operation an lebenden Tieren durchführen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den Lehrstuhl für Geflügel Forschung (M. Boulianne) von der Veterinär-medizinische Fakultät der Université de Montréal unterstützt. DRS. Boulianne und Eltern entwickelt das Modell. DRS. Boulianne und Eltern durchgeführt die Operationen. Dr. Burns unterstützt bei der Entwicklung der Anästhesie-Protokoll. Dr. Parent das Video bearbeitet und schrieb das Manuskript. DRS-Burns, Desrochers und Boulianne bearbeitet das Manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

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