En sammanskrivna tarm Loop modell hos sövda specifik patogen fri kycklingar att studera Clostridium Perfringens virulens

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att kirurgiskt skapa 'intestinal sammanskrivna loopar' i kyckling tunntarmen. Detta förfarande möjliggör för jämförelse av flera Clostridium perfringens stammar virulens i situ i en enda värd. Denna metod minskar markant antalet kycklingar oftast nödvändigt för liknande i vivo experiment.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Parent, E., Burns, P., Desrochers, A., Boulianne, M. A Ligated Intestinal Loop Model in Anesthetized Specific Pathogen Free Chickens to Study Clostridium Perfringens Virulence. J. Vis. Exp. (140), e57523, doi:10.3791/57523 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nekrotiserande enterit studerades hos kycklingar som använder olika i vivo infektion modeller. De flesta av dessa använder en kombination av predisponerande faktorer, såsom koccidios och kost, med sondmatning eller administration via fodret med Clostridium perfringens. I dessa modeller kräver jämförelse av flera C. perfringens stammar för virulens studier ett stort antal värdar att uppnå betydande resultat. Dödlighet under loppet av studien kan vara hög beroende på experimentell modell, därmed höja etiska betänkligheter angående djurskydd i forskning. Utvecklingen av nya infektion modeller som kräver färre djur att studera patogenes, som ännu ger statistiskt signifikant och giltiga resultat, är viktigt att minska användning av djur i forskning. Intestinal sammanskrivna loop modeller har använts för att studera clostridier infektioner hos olika arter såsom möss, kaniner och kalvar. Efter kirurgiska ingrepp för att skapa sammanskrivna loop segment, C. perfringens stammar injiceras direkt i slingorna att etablera en nära kontakt mellan bakterierna och tarmslemhinnan. Prover av tunntarmen och luminala innehållet tas vid avslutande av förfarandena efter några timmar. Flera bakteriestammar kan ympas i varje djur, därmed minska antalet nödvändiga försökspersoner i experimenten. Dessutom utförs procedurer under narkos att minska djurens smärta. Hos kycklingar, skulle denna modell vara mer lämpligt än oral tillförsel att jämföra C. perfringens stam patogenicitet eftersom färre djur behövs, ingen predisponerande faktorer krävs för att framkalla sjukdomen och smärta styrs av analgetika . Intestinal sammanskrivna loop modellen är dåligt beskrivna i kycklingar och standardisering är nödvändig för dess optimal användning. Detta manuskript innehåller alla nödvändiga steg för att skapa många intestinal ligated slingor i kycklingar och ger information om de kritiska punkterna att erhålla giltiga resultat.

Introduction

Användning av djurmodeller studera smittsamma sjukdomar som drabbar människor och djur är ett centralt verktyg vid bedömningen av virulensfaktorer som reglerar patogenesen av ett visst villkor samt att utarbeta strategier för att förebygga eller bota sjukdomar1. Trots många fördelar att använda djurmodeller för att studera olika sjukdomar uppstår etiska betänkligheter angående denna praxis. Forskare behöver minimera användning av djur när du erhåller betydande och giltiga resultat. Begreppet 3 Rs principerna (Ersätt, minska och förfina) utarbetades för att säkerställa att välfärd frågor behandlades i sådana prövningar. I kyckling nekrotiserande enterit studier används i vivo kyckling modeller för att undersöka etiologi, förebyggande och behandling av detta tillstånd2,3,4,5. Patogena stammar av C. perfringens transporterar specifika virulensfaktorer, såsom den NetB toxin6, administreras för att orsaka nekrotiserande enterit i kycklingar7. Principen om ersättning är därför svårt att uppnå i sådana fall eftersom dessa virulensfaktorer inte kanske är lika kritisk hos andra djurarter. De flesta modeller för nekrotiserande enterit hos kycklingar använder en kombination av riskfaktorer, såsom koccidios och förändrad kost för att inducera nekrotiserande enterit följt av sondmatning av buljong kultur som innehåller ett stort antal C. perfringens2. Dessa modeller kommer att framkalla sjukdomen i ett stort antal kycklingar, och dödligheten kan vara viktigt i sådana prövningar8, vilket gör att farhågor om begränsning och förfining principerna i djurförsök.

Intestinal sammanskrivna loopar modeller är ett önskvärt alternativ för studier av sjukdomar orsakade av intestinal patogener med avseende på principen minskning, och förfining. I dessa modeller skapas intestinal segment kallas 'öglor' genom att placera ligaturer längs tarmkanalen att bilda oberoende och hermetiska fack där patogener kan injiceras ensam9 eller med andra molekyler, såsom vaccinkandidater 10 , 11. patogenerna av intresse är placerade i nära kontakt med de intestinala cellerna och efter några timmar av infektion tid, intestinal prover kan återvinnas för vidare analys. Detta tillåter användning av flera behandling och kontrollgrupper på samma djur. Statistisk analys kan utföras med upprepade mätningar modeller, vilket ökar kraften av diskriminering mellan grupper och minskar antalet nödvändiga kycklingar jämfört med oral sondmatning prövningar. Även utförs kirurgiska ingrepp och efterföljande infektion gånger under kontinuerlig generell anestesi och analgesi, därmed minimera djurens smärta. Slutna nering är en idealisk mall för att minska värd nummer och skapa ett mer humant system i djurförsök.

Intestinal sammanskrivna loopar modeller är väl beskrivna i olika arter, såsom kalvar, kaniner och möss2,9, men dåligt beskrivs i kycklingar7. För en optimal användning av denna kirurgiska modell är rätt teknik och genomförande avgörande för skapandet av sammanskrivna intestinal slingor för att undvika skador på tarmen integritet. Målet med detta manuskript är att beskriva en steg för steg metod i skapandet av flera tarm loopar i en kyckling-modell. Denna teknik är begränsad av kirurgens skicklighet och erfarenhet, eftersom korrekt förfaranden är viktiga för framgången av projektet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden med användning av levande djur var godkänts av den etiska kommittén av den veterinärmedicinska fakulteten, Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d' éthique de l'utilisation des Animaux').

1. överväganden före operation

  1. Välj 10 veckor gamla specifika patogener gratis (SPF) leghorn höns för operationen.
    Obs: Sin vikt måste vara mellan 1,0 och 1,2 kg.
  2. Återkalla foder 12 h innan förfarandena för att tömma tarmen.
  3. Före operation, placera kycklingarna under narkos efter ett protokoll som verifieras av en anestesiologist. Premedicate varje kyckling 15 min före operationen med en intramuskulär (I.M.) injektion av midazolam 1 mg/kg och butorfanol 4 mg/kg. Upprepa, varje 4 h, injektion av butorfanol 4 mg/kg IM eller när de andas mönster förändringar och frekvens ökar under anestesi. För narkos, under alla förfaranden, administrera isofluran i en koncentration mellan 1,5 och 2,5% med en intratrakeal röret.
    Obs: Användningen av premedicinering för sedering och analgesi rekommenderas eftersom de kommer att avsevärt förbättra djup anestesi, minska mängden bedövningsmedel nödvändigt under alla förfaranden, samt ge forskarna möjlighet att kontrollera smärta nivåer.
  4. Övervaka anestesi genom inspelning kroppstemperatur, puls och elektrokardiogram (EKG), respiratorisk takt och rytm, syremättnad, utgångna koldioxid (CO2) och neurologiska reflexer.
    Obs: En person måste tilldelas övervaka dessa parametrar i hela alla förfaranden.
  5. Följ sterilitet principer i hela de kirurgiska ingrepp. Säkerställa att kirurgen och assistent kirurgen dress med steril kappor, handskar, en mask och skyddsglasögon enligt institutionella preoperativa protokoll. Säkerställa att kirurgen skrubbar händerna med klorhexidin glukonat impregnerade steril borste upp till armbågen med betoning på naglarna och varje finger yta.
  6. Sterilisera Kirurgiska instrument med en autoklav.

2. kirurgiska iordningställande

  1. För det första, manuellt ta bort fjädrarna från buken med en mild dragkraft.
  2. Skrubba operationsområdet med klorhexidin glukonat tvättmedel impregnerade steril borste. Försiktigt skrubba huden från mitten på utsidan för en total kontakt tid 5 min utan att komma tillbaka till centrum.
  3. Utför 3 alternativa passager på operationsområdet med klorhexidin glukonat lösning och isopropylalkohol använder sterila Flor.
    Obs: Passagen måste börja från mitten av operationsområdet gränsar till undvika kontaminering från icke-desinficeras områden till operationsområdet.
  4. Placera den sterila kirurgiska draperingen på kycklingen.

3. utvinning av tunntarmen från bukhålan

  1. Incisionsfilm kirurgiska drapera med sax för att exponera bara huden i operationsområdet.
  2. Incisionsfilm huden genom att utföra ett '' L'' form låg-mittlinjen snitt med en skalpell blad #3.
    1. Börja första snittet 1 cm kaudalt till bröstbenet och avsluta den på 1 cm kraniala till en kloak.
    2. Utföra andra snitt vinkelrätt mot första snittet. Börjar från kaudala slutet av första snittet och 5 cm på vänster sida av buken genom att följa raden bäckenet.
      Obs: Denna öppning kommer att skapa en flik som gör att en enklare utvinning av tarmarna.
  3. Med kirurgi klippa sax, peritoneum och magmusklerna med samma '' L'' form mönster att öppna bukhålan.
    Obs: Detta kommer att utsätta luftblåsor. Tarmarna är placerat under dessa strukturer. Luftblåsor måste vara fuktad med Flor mättad med steril saltlösning 0,85% att undvika uttorkning och möjliga bristning under hela förfarandet.
  4. Infoga en Snook spay krok i bukhålan genom att följa den vänstra bukväggen och arbeta på sättet runt buken luftblåsor.
  5. Försiktigt exteriorize tarmarna och sprida dessa ut på operationsområdet.
    Obs: Hålla tarmarna tilluften genom sprutning ofta steril koksaltlösning 0,9% under hela förfarandet. Flor fuktad med steril koksaltlösning kan också placeras på tarmarna att undvika uttorkning.
  6. Ta tag i tarmen med hjälp av en torr steril gasbinda och dra försiktigt ut tunntarmen genom manuell dragning att exponera i jejunum.
    Obs: Mesenteriala fartyg är bräcklig och överdriven spänning kan brista dem vilket kan leda till intestinal ischemiska lesioner och kraftigt äventyra resultatet av förfarandet.

4. tillverkning av tarm loopar

  1. Skapandet av loop nr 1.
    1. Placera en enkel ligatur med en polyglactin multifilament resorberbar syntetmaterial i den proximala jejunum genom att undvika ligatur av stora mesenteriala fartyg.
    2. Placera en distala ligatur 2 cm från den proximala ligaturen.
      Obs: Enkel ligaturer med multifilament sutur material placeras längs tarmkanalen att skapa hermetiska segment. Ett schema (figur 1) beskriver platsen för alla ligaturer. Öglorna består av en proximal och distal ligatur avgränsade med 2 cm.
  2. Skapandet av interloop nr 1.
    1. Placera en enkel ligatur 0,5 cm aborally till distala ligatur av loop no.1.
      Obs: Mellan successiva loopar finns det interloops på 1 cm, dvs segment att göra en fysisk separation mellan slingorna. Sannolikt minska risken för korskontaminering från en slinga till en annan genom är en enkel ligatur placerad i mitten av interloop (0,5 cm från distala och proximala ligatur av 2 intilliggande slingor). Detta minskar risken för en möjlig läcka förorening från en slinga att nå ligatur av en intilliggande loop. Dessa segment är inte obligatoriska men kommer att minska risken för korskontaminering.
  3. Skapandet av efterföljande loopar och interloops.
    1. Upprepa steg 4.1 och 4.2 att erhålla antalet önskad slingor.
      Obs: I detta experiment, 9 slingor och 8 interloops skapades. Total längd uppgick till 26 cm. Antalet slingor kan justeras beroende på studien.

5. injektion av Clostridium perfringens stammar in the loopar

  1. Injicera med en steril spruta och nål 26 G patogenet i loop no.1. Försiktigt in nålen på antimesenteric sida av tarmen i 45° vinkel.
    Obs: I detta experiment, 0,2 mL av hjärnan hjärtat infusion (BHI) som innehåller 1 x 106 CFU (colony bildar enheter) av C. perfringens i mitten av log tillväxtfasen injicerades i varje slinga. 5 olika stammar injicerades i 5 olika slingor och de 4 återstående loopar injicerades med en negativ kontroll som innehåller inga bakterier (steril BHI), omväxlande patogener och sterila BHI loopar.
  2. Upprepa steg 5.1 att injicera alla loopar.
  3. Försiktigt ersätta tarmkanalen i området dorsala i bukhålan, under luftblåsor.

6. avslutande av bukhålan

  1. Sutur av bukhinnan och magmusklerna.
    1. Sutur av bukhinnan och magmusklerna längs bäckenet (tillverkad i steg 3.3) med en enkel kontinuerlig sutur mönster med hjälp av en polyglactin multifilament resorberbar syntetmaterial.
    2. Sutur av bukhinnan och magmusklerna från bröstbenet till en kloak (i steg 3.3. med en enkel kontinuerlig sutur mönster med hjälp av en polyglactin multifilament resorberbar syntetmaterial.
  2. Sutur av huden.
    1. Med hjälp av en polyglactin nära multifilament syntetmaterial och en enkel kontinuerlig sutur mönster, snittet i huden längs bäckenet i steg 3,2.
    2. Använda samma multifilament ligatur material och en enkel kontinuerlig sutur mönster, nära snittet i huden från bröstbenet och den kloak i steg 3,2.

7. slutsats

  1. Efter de kirurgiska ingrepp, hålla kycklingen under narkos med korrekt användning av analgetika att minimera djurens smärta under infektion. Fortsätt bedövningsmedel övervakning för att säkerställa en adekvat anestesi.
  2. Efter önskad infektion, humant sätt avliva kyckling av cervikal dislokation under narkos.
    Obs: För dessa förfaranden, de krävs tid att framkalla mikroskopiska lesioner med C. perfringens patogena stammar var 7 h.
  3. Med en skalpell blad #3, skära en 0,5 cm till 1 cm långa slinga avsnitt och placera den i 10% formalin för fixering över natten och ytterligare histopatologisk analys.
  4. Med samma skalpell bladet, skära avsnittet återstående loop och placera den i en steril mikrocentrifug rör för isolering av C. perfringens stammar i varje slinga ytterligare bakteriologiska analys för deras genetisk karakterisering.
  5. Upprepa steg 7.2 och 7.3 för alla loopar genom att ändra skalpell bladet mellan varje slinga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En schematisk bild av de 9 intestinal slingorna och 8 interloops visas i figur 1. I denna modell, totalt 9 slingor och 8 interloops skapas med enkla ligaturer. En loop består av proximala och distala ligaturer fördelade av 2 cm mätt från den proximala ligaturen. Två angränsande slingor separeras av en interloop 1 cm. För att minska risken för korskontaminering mellan loopar av läckage från en ligatur, placeras en interloop ligatur halvvägs från distala ligatur och proximala ligatur av 2 intilliggande slingor. Antalet slingor kan justeras beroende på kraven i studien.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av sammanskrivna tarm loopar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2A (HPS fläcken) visar en tarm loop injiceras med en kontroll sterilt medium mikroskopiska utseende. Slemhinnor borste gränsen är intakt och det finns ingen nekros i avsnittet. Mild överbelastning kan förekomma i segmenten intestinal lager (slemhinna, submucosa, muscularis och serosa). Figur 2B (HPS fläcken) visar slemhinnor nekros 7 timmar efter injektion av en patogen stam av Clostridium perfringens återhämtat sig från ett kliniskt fall av nekrotiserande enterit på en hönsfarm. Villi tips är eroderade med nekrotisk enterocyter kring villi tips. I nekrotiska materialet omger villina, observeras kluster av stora stavformade bakterier (pilar). Dessa bakterier identifierades ytterligare grampositiva bakterier med en Twort fläck (visas inte). Detta konstaterande, kombinerat med isolering av bakteriologi mängder av Clostridium perfringens, anger lesioner var orsakad av denna bakterie. Figur 2 c (HPS fläcken) visar histologiska skador av en ischemisk loop, där nekros är inte relaterad till injektion av patogena C. perfringens stammar men resultatet av dåligt utförda förfaranden. Denna förstoring visar kraftig koagulering nekros som kunde misstolkas som skador orsakade av Clostridium perfringens. Dock kan inga bakterier observeras i detta avsnitt. Blodkärlen i den muskulösa lagret är dessutom kraftigt vidgade av ansamling av stora mängder degenererande erytrocyter (pilar). Detta är tecken på vaskulär trängsel och i detta fall trängseln berodde sammanskrivna mesenterica blodkärl. Ischemisk loopar kan lätt urskiljas makroskopiskt under de kirurgiska ingrepp; efter svår vaskulär trängsel blir slemhinnorna mörkblå istället för dess normala rosa-rödaktig färg.

Figure 2
Figur 2: histopatologiska fynd 7 h efter infektion. (A) det finns ingen nekrotiska lesioner i slemhinnan på histopatologi efter injektion av hjärnan hjärtat Infusion (BHI), en steril odlingsmedium. (B) loopar injiceras med en patogen stam av Clostridium perfringens, det är märkt nekros av slemhinnan med talrika stora grampositiva stavformade bakterier som täcker slemhinnan. (C) ischemiska lesioner kan likna nekrotiska lesioner orsakade av C. perfringens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I denna studie injicerades loopar med antingen en steril kontroll odlingsmedium (BHI) eller någon av de fem olika stammarna av Clostridium perfringens återhämtat sig från olika antibiotika gratis kyckling flockar påverkas eller inte med nekrotisk enterit12 . Tio kycklingar användes i denna studie. Stammar patogenicitet kunde bestämmas utifrån förmåga att upprepade gånger orsaka lesioner förenliga med nekrotisk enterit till slemhinnan. Stammar som återhämtat sig från kliniska fall av nekrotiserande enterit visade förmågan att orsaka slemhinne nekros 7 h efter infektion, stammar återhämtat sig från kliniskt friska kyckling gårdar inducerade inte slemhinnor nekros och slemhinnan var liknande till normal resultaten från reglerkretsarna injiceras med BHI12. Genom att använda många loopar på samma djur, skulle fem C. perfringens stammar och fyra reglerkretsar kunna användas i samma fågeln.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Intestinal loopar modeller har beskrivits i många arter att studera värd-patogen interaktion och patogenes av sjukdomar orsakade av olika intestinala patogener som Clostridium perfringens, Clostridium difficile och Salmonella enterica7,9,13,14,15. Det har också använts för att analysera de slemhinna immunsvar16, effekten av antikroppar att neutralisera bakteriella toxiner utsöndras av intestinal patogener11 och utvärdera vaccinkandidater för att förhindra tarmsjukdomar10 . Men denna modell med talrika ligated loopar i ett enda enskilda djur är dåligt beskrivna i kycklingar och standardisering av denna teknik är obligatoriskt att erhålla giltiga resultat som otillräcklig manipulationer kan leda till felaktiga resultat och feltolkningar . Detta manuskript visar skapandet av 9 successiva sammanskrivna slingor ligger i jejunum och ileum av kyckling mag-tarmkanalen. Denna studie använde specifik patogen fri (SPF) Livorno manliga kycklingar som väger mellan 1,0 och 1,2 kg. Det maximala antalet slingor som tillåts av denna ras på denna vikt var 9, eftersom 26 cm av tunntarmen kunde vara enkelt exteriorized från det coelomic hålet. Det är inte uteslutet att med hjälp av en annan ras eller en tyngre Livorno manliga kyckling, det totala antalet loopar som skapats kan vara olika, ännu högre än 9. Intestinal loopar längd kan också ändras, men 2-cm längd ansågs optimalt att tillåta insamling av prover för histopatologisk och bakteriologi medan du använder den maximala kapaciteten av tillgängliga tarmens längd.

Den intestinala sammanskrivna loop-teknik som beskrivs i denna artikel kan vara ett värdefullt alternativ till de nuvarande modellerna som finns tillgängliga att studera nekrotiserande enterit hos kycklingar som orsakas av Clostridium perfringens. Enligt resultaten beskrivs i en tidigare artikel12, var utvärderingen av 5 C. perfringens stammar med 10 kycklingar tillräcklig för att skilja mycket virulent och kommensaler stammar av C. perfringens. I jämförelse kräver andra infektion modeller använder per os inympning för att reproducera nekrotiserande enterit med C. perfringens ett stort antal individer att få samma resultat. I litteraturen, antalet fåglar behövs för att utvärdera virulens hos C. perfringens stammar varierar från 10 till 30 kycklingar per grupp17,18,19 till hundra värdar per grupp20. När det gäller principen förfining för användning av djur i forskning, skulle det rådas att använda teknik som kräver det lägsta antalet värdar för att uppnå betydande resultat. Intestinal sammanskrivna loop modellen beskrivs i denna artikel är troligen modell kräver det lägsta antalet kycklingar att jämföra virulens hos C. perfringens stammar.

Eftersom korskontaminering av läckage från en ligatur kunde utvärderas först efter C. perfringens kultur och karakterisering av pulsade fält gelelektrofores (PFGE) många dagar efter förfaranden, var det av yttersta vikt att minimera detta risken av inklusive 1 cm interloops som innehåller en interloop ligatur halvvägs mellan 2 intilliggande slingor. Genom att ta dessa försiktighetsåtgärder, var det möjligt att undvika ett möjligt korskontaminering. Faktiskt, medan patogena stammar orsakade mikroskopiska nekrotiska lesioner samstämmiga med nekrotisk enterit, det var ingen betydande mikroskopiska lesioner i intilliggande loopar injiceras med icke-patogena C. perfringens stammar eller BHI kultur medium negativ kontroll. Detta var vägledande att olika stammar säkert kunde injiceras i intilliggande tarm loopar av samma kyckling.

En av de mest utmanande problem med denna modell var exteriorisering av tunntarmen utan att kompromissa med ventilation och intestinal vaskularisering. Fåglar har en olika respiratoriska systemet än däggdjur. Membranet är frånvarande och ventilation styrs av dom, tunnväggiga strukturer i bukhålan. Det finns 7 av dessa i kycklingar och de är uppdelade i livmoderhalsen (1), främre bröstkorg (2), bakre bröstkorg (2) och buk (2) luftblåsor. Dessa ballong-liknande strukturer är direkt anslutna till lungorna och möjliggör förflyttning av luft i luftvägarna. Vid öppna bukhålan mellan bröstbenet och kloak, buken dom är framträdande och tenderar att vara enkelt spruckit, speciellt om det är torrt. Därför är det viktigt att underlätta ordentlig ventilation och anestesi under förfaranden konstant befuktning med Flor dämpad med steril koksaltlösning. Dessutom kan det vara svårt att undvika små punkteringar i den buk dom medan exteriorizing tarmarna ur bukhålan. Det är viktigt att övervaka bedövningsmedel parametrar, såsom andningsfrekvens och mönster, palpebrala reflexer, hjärtfrekvens och kycklingfötter rörelser, att se till att kycklingen förblir under en adekvat planet av anestesi. Små luftläckage är mindre sannolikt att påverka kvaliteten på anestesi, men detta läckage skall minimeras. Det är viktigt att hermetiskt stänga bukhinnan efter förfaranden. Detta kommer att återupprätta det inre lufttrycket och ventilation kommer att återgå till det normala efter detta steg. Efter nedläggningen av denna struktur, bör det finnas ingen luftläckage från buken. Detta kan kontrolleras genom att spraya en liten mängd steril koksaltlösning på suturerna och leta efter bubbla bildandet indikerar luft kommer från bukhålan. Om detta inträffar kan ytterligare enkel hud suturer placeras på webbplatsen luft läckage.

En annan tekniskt utmanande aspekt är relaterad till risken för ischemiska lesioner utveckla i tunntarmen på grund av dåligt utförda kirurgiska ingrepp. Ischemi händer när det finns en begränsning av blodtillförseln till vävnader, orsakar en brist på syre och andra molekyler som behövs för cellulär metabolism. I det här fallet tarmen blir snabbt makroskopiskt mörkblå istället för rosa-rödaktig och intestinal mucosal cellerna kommer urarta snabbt. Detta kommer att orsaka ischemiska lesioner obesläktad till injicerade patogenen och det kommer att störa den histopatologiska tolkningen. Två problematiska situationer kan leda till ischemi. Först, ligatur av mesenteriala fartyg av ouppmärksamhet kommer att orsaka detta tillstånd. Därför är det viktigt att noga överväga placeringen av ligaturer längs tarmkanalen att undvika inklusive den mesenteriala fartygen. Andra, ischemi kan hända om blödningar mesenteriska fartyg uppstår under förfarandena. Dessa strukturer är tunna väggar och skör. Överdriven spänning kan leda till deras bristning och samtidigt manuellt exteriorizing tarmarna, uppmärksamhet bör ägnas åt spänningen på den mesenteriala fartygen att säkerställa deras integritet under detta steg. Dessutom kan mesenteriala fartyg blödning uppstå om dessa är punkteras med en nål i kirurgiska suturer. Kirurgen måste titta noga på den plats som genomborrat krös med nålen. Blödning kan stoppas i båda situationerna, men Koaguleringsprocessen slutar eller avsevärt minska blodflödet till dessa intestinal segment, därför orsakar irreversibla organskador och att äventyra giltigheten av resultaten.

Denna modell är användbart för studien av värd-patogen interaktioner och patogenes av intestinala sjukdomar orsakade av smittämnen. Den modell som föreslås kan anpassas beroende på studien genom att ändra antalet slingor skapade eller genom att ändra längden på varje slinga. Innan du implementerar ändringarna, rekommenderas det att standardisera metoden för att säkerställa betydande resultat. Begränsningar av denna teknik är skill-orienterad och endast utbildad personal ska utföra denna operation på levande djur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av stolen i fjäderfä forskning (M. Boulianne) från den veterinärmedicinska fakulteten av den Université de Montréal. DRS. Boulianne och förälder utvecklat modellen. DRS. Boulianne och förälder utförs operationerna. Dr. Burns hjälp utveckla protokollet anestesi. Dr. Parent redigerade videon och skrev manuskriptet. DRS Burns, Desrochers och Boulianne redigerade manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Scrub 747 Becton Dickinson and Company 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes 
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L Commercial isopropyl alcohol P016IP70 Web address: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine Sigma-Aldrich 282227-1G Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z
WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration Veterinary Specialty Products 32724 Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.
detail&productgroup_id=15
Scalpel blades #3 Swann-Morton 301 Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterile saline NaCl 0.9% Sigma-Aldrich S8776-100ML Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr&region=CA
Vicryl 3-0 Ethicon D9003 Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Syringe 1 ml with 26G needle Becton Dickinson and Company 329652 Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion Sigma-Aldrich 1104930500 Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr&region=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorf tube Sigma-Aldrich T9661-500EA Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr&region=CA&gclid=EAIaIQ
obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh
30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formalin solution, buffered neutral, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr&region=CA
Clostridium perfringens strains Université de Montréal, Chaire en recherche avicole N/A Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2, (1), 1-4 (2015).
  2. Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. (2015).
  3. Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41, (1), 112-116 (1977).
  4. Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21, (2), 230-240 (1977).
  5. Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56, (4), 1229-1231 (1977).
  6. Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4, (2), e26 (2008).
  7. Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32, (6), 503-512 (2009).
  8. Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45, (3), 365-369 (2016).
  9. Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149, (1), 103-112 (2013).
  10. Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47, (1), 52 (2016).
  11. Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12, (1), 101 (2016).
  12. Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46, (2), 138-149 (2017).
  13. Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7, (9), e45608 (2012).
  14. Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68, (12), 7122-7125 (2000).
  15. Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40, (1), 5 (2009).
  16. Gerdts, V., et al. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256, (1-2), 19-33 (2001).
  17. Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
  18. Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16, (3), 289-292 (2010).
  19. Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142, (3-4), 323-328 (2010).
  20. Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51, (4), 834-839 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics