الجيل الأول قلب مثل حقل المتكفل القلب و Cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا يمكننا وصف أسلوب لتحجيم، استخدام تركيبة بسيطة أضافت أ ووساطة lentivirus Id1-أوفيريكسبريشن، لتوليد أول قلب مثل حقل المتكفل القلب و cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yu, M. S., Spiering, S., Colas, A. R. Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57688, doi:10.3791/57688 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

توليد كميات كبيرة من فروعه القلب المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية الفنية وكارديوميوسيتيس من قلب محدد الحقل الأصل هو شرط مسبق لعلاجات أمراض القلب يستند إلى الخلية والنمذجة المرض. وقد أظهرنا مؤخرا أن الجينات معرف ضرورية وكافية لتحديد أول فروعه الميدانية القلب أثناء تطوير الفقاريات. هذا البروتوكول التمايز روافع هذه النتائج ويستخدم Id1 overexpression في تركيبة مع أضافت كرموز تحديد قوية لإنتاج أول قلب مثل حقل (فهف-L) موروث. الأهم من ذلك، تفرق المتكفل الناتجة عن كفاءة (~ 70 – 90%) في cardiomyocytes البطين الشبيهة. هنا يصف لنا طريقة مفصلة 1) توليد هبسكس Id1 overexpressing و 2) التفريق بين كميات قابلة للتطوير كريوبريسيرفابل فهف-L المتكفل و cardiomyocytes البطين مثل.

Introduction

الإنتاج على نطاق كبير من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس)-المتكفل القلب المشتقة و cardiomyocytes هو شرط مسبق للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية1، النمذجة2،3 ، وتوصيف السريع للمرض مسارات جديدة تنظم5،،من4التمايز القلب6 وفسيولوجيا7،8. على الرغم من أن عددا من الدراسات9،،من1011،،من1213،14،15 قد سبق وصف ذات كفاءة عالية بروتوكولات التمايز القلب من هبسكس، أي عالجت أصل الحقل القلب كارديوميوسيتيس الناجمة عن ذلك، وعلى الرغم من تحديد هوية اختلافات الجزيئية بين اليسار (قلب الحقل الأول) والحق (قلب الحقل الثاني) cardiomyocytes البطين16 ووجود القلب الخاصة بمجال أمراض القلب الخلقية؛ أي قلب اليسار التصنع متلازمة17 أو أرهيثموجينيك خلل التنسج البطين الأيمن18. وهكذا، أصبح توليد المتكفل القلب وكارديوميوسيتيس من قلب محدد الحقل الأصل من هبسكس ضروري من أجل زيادة أهميتها باعتبارها العلاجية والمرض أدوات النمذجة.

يعتمد هذا البروتوكول على أوفيريكسبريشن التأسيسي ل Id1، التي تم تحديدها مؤخرا5 أول قلب تحديد حقل جديلة التي في تركيبة مع أضافت، ضروري وكاف لبدء كارديوجينيسيس في هبسكس. جدير بالذكر أن كانينغهام et al. (2017) 5 إظهار أن المتكفل المستحثة Id1 الإعراب على وجه التحديد أول حقل القلب (HCN4، TBX5) لكن الثانية لا قلب الحقل علامات (SIX2، ISL1) فإنها تمر بالتمايز القلب. وباﻹضافة إلى ذلك، الكتاب تظهر أيضا أن وضع الأجنة الماوس المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى أسرة معرف من الجينات (Id1-4)، دون تشكيل أول قلب ميدان القلب موروث، بينما أكثر فروعه القلب الآنسي والخلفي ( يمكن أن لا تزال تشكل قلب الحقل الثاني)، مما يوحي أن معرف البروتينات ضرورية لبدء أول قلب ميدان كارديوجينيسيس في فيفو. مريح، يمكن cryopreserved المستحثة Id1 المتكفل وتفرق عفويا في cardiomyocytes عرض الخصائص الشبيهة بالبطين، بما في ذلك التعبير علامات خاصة بالبطين (IRX4, MYL2) و البطين مثل إمكانات العمل.

هنا يصف لنا طريقة بسيطة وقابلة للتطوير لإنشاء أول قلب مثل حقل (فهف-L) القلب المتكفل و cardiomyocytes البطين مثل من هبسكس overexpressing Id1. من السمات هامة لهذا البروتوكول هو إمكانية فصل الجيل القلب السلف من الإنتاج كارديوميوسيتي اللاحقة باستخدام خطوة تجميد مريحة. باختصار، هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة (1) توليد هبسكس Id1 overexpressing، (2) إنشاء فهف-L القلب موروث من هبسكس، (3) كريوبريسيرفي المتكفل الناتجة، و (4) استئناف فهف-L السلف القلب التمايز وتوليد عالي التخصيب (> 70 – 90%) ضرب cardiomyocytes البطين الشبيهة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-Id1 إعداد الفيروس والإصابة

  1. توليد Id1 lentivirus overexpressing pCMVDR8.74 المشترك ترانسفيكتينج و pMD2.G وبكده-EF1-Id1-PGK-برور (أدجيني: بلازميد #107735) في الخلايا HEK293T. جمع الجزيئات الفيروسية وفيلتراتي، وتنقية من المادة طافية وتخزينها في-80 درجة مئوية كما هو الحال في كيتامورا et al. (2003) 19-وبدلاً من ذلك، تنتج Id1 lentivirus تجارياً عن طريق إرسال بكده-EF1-Id1-PGK-بورور إلى بائع المنتجة لينتيفيروس.
    تنبيه: يرجى اتباع قواعد السلامة لينتيفيرال والبروتوكولات العملية القياسية.
    ملاحظة: هامة: عيار الفيروس الأمثل ينبغي أن يكون على الأقل 108 إلى 109 ترانسدوسينج وحدة/مل (تي يو/mL).
  2. قبل الإصابة، معطف بئر واحدة من 96 لوحة جيدا مع 50 ميليلتر من طلاء الكاشف، عادة خليط بروتين هلامية يفرز من الخلايا ساركومه الماوس انجيلبريث-هولم-سرب (انظر الجدول للمواد).
  3. فصل واحد من الخلايا الجذعية pluripotent نمت في صفيحة جيدا 6 بإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 + ومع 0.5 مم يدتا جيدا.
    ملاحظة: يختلف الوقت الانفصال من 3 – 10 دقيقة. عندما يتم فصل أكثر من 80% الخلايا من الجزء السفلي من اللوحة، تابع إلى الخطوة التالية.
  4. جمع تعليق خلية مع بيبيت العقيمة في أنبوب بلاستيكي للطرد المركزي 15 مل.
  5. تحييد كاشف الانفصال مع 5 مل من المحتوية على برنامج تلفزيوني Ca2 + و Mg2 +.
  6. بيليه الخلايا بالطرد المركزي (200 غ س لمدة 3 دقائق).
  7. إزالة المادة طافية ونفض الغبار الأنبوب بلطف من أجل إزاحة بيليه.
  8. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من الخلايا الجذعية وسائط الإعلام.
  9. عد الخلايا باستخدام عداد خلية الآلي اتباع إرشادات بائع.
  10. لوحة 20,000 خلايا قابلة للحياة الواحدة المغلفة جيدا (96-جيدا لوحة) في 50 ميليلتر وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 2 ميكرومتر رو/روك المسار المانع (انظر الجدولين 1 و 2).
  11. بعد 24 ساعة، رصد لمرفق خلية واستبدال وسائط الإعلام مع 100 ميليلتر الخلايا الجذعية الإعلامية تستكمل مع 2 ميكرومتر رو/روك المسار المانع وبروميد هيكساديميثريني 6 نانوغرام/مليلتر (انظر الجدولين 1 و 2)، ح واحد قبل الإصابة لينتيفيرال.
    ملاحظة: ترفق الخلايا إلى الجزء السفلي من اللوحة بقوة.
  12. ذوبان الجليد Id1-لينتيفيروس على الجليد.
  13. إضافة 3 ميليلتر من lentivirus المنقي للبئر الواحد (عيار الفيروس ينبغي أن يكون بين 108 إلى 109 تي يو/مليلتر)، ومن ثم نقل اللوحة إلى حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5% CO2، 20% س2).
  14. العدوى الفيروسية بعد 24 ساعة، بإضافة 100 ميليلتر من وسائط جديدة من الخلايا الجذعية إلى الخلايا المصابة.
  15. ح 48 لينتيفيرال ما بعد الإصابة، يستعاض عن الفيروسات التي تحتوي على وسائط الإعلام مع 200 ميليلتر من وسائط جديدة من الخلايا الجذعية وتستكمل مع 1 ميكروغرام/مل بوروميسين.
  16. تحديث وسائل الإعلام يوميا مع 200 ميليلتر من وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 1 ميكروغرام/مل بوروميسين.
  17. عند الثقافات تصل إلى 80% كونفلوينسي، فصل الخلايا باستخدام 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 + + 0.5 مم يدتا (لواحد من لوحة 96-جيدا جيدا).
  18. جمع تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي.
  19. تحييد كاشف الانفصال مع 5 مل من المحتوية على برنامج تلفزيوني Ca2 + و Mg2 +.
  20. بيليه الخلايا بالطرد المركزي (200 غ س لمدة 3 دقائق).
  21. إزالة المادة طافية ونفض الغبار الأنبوب بلطف من أجل إزاحة بيليه.
  22. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 2 ميكرومتر رو/روك المسار المانع.
  23. نقل كافة الخلايا (1 مل) إلى المغلفة جيدا من صفيحة 12-جيدا.
  24. بعد 24 ساعة، تستكمل رصد لمرفق خلية لوسائل الإعلام وكذلك استبدال مع 1 مل من الخلايا الجذعية وسائل الإعلام مع مثبط مسار رو/موسيقى الروك 2 ميكرومتر وبروميد هيكساديميثريني 6 نانوغرام/ملليلتر، ح واحد قبل توصيل.
  25. ذوبان الجليد Id1-لينتيفيروس على الجليد.
  26. إضافة 5 ميليلتر من الفيروسات المنقي للبئر (بئر 12 لوحة).
  27. ح 24 لينتيفيرال ما بعد الإصابة، يستعاض عن الفيروسات التي تحتوي على وسائط الإعلام مع 1 مل وسائط جديدة من الخلايا الجذعية وتستكمل مع 3 ميكروغرام/مل بوروميسين.
  28. ح 48 وظيفة الإصابة لينتيفيرال، والاستعاضة عن الفيروسات التي تحتوي على وسائط الإعلام مع 1 مل وسائط جديدة من الخلايا الجذعية وتستكمل مع 6 ميكروغرام/مل بوروميسين.
  29. عند الثقافات تصل إلى 80% كونفلوينسي، فصل الخلايا باستخدام 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 + ومع 0.5 مم يدتا (لواحد من لوحة 12-جيدا جيدا).
  30. نقل نصف (250 ميليلتر) تعليق خلية إلى بئر واحدة من كاشف الطلاء المغلفة لوحة 6-البئر الذي يحتوي على 2 مل وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 2 ميكرومتر رو/روك المسار المانع.
  31. استخدم النصف الآخر (250 ميليلتر) من العينة لاستخراج الحمض النووي الريبي وبكر قرة من أجل تحديد لينتيفيرال بوساطة مستويات التعبير Id1 ، كما هو الحال في الكولا et al. (2012) 4.
    ملاحظة: هام: إذا كانت مستويات التعبير مرناً Id1 أقل من 0.005 إضعاف مستويات التعبير جابده (انظر الجدول 3 للإشعال qRT-PCR)، كرر عملية العدوى كما هو موضح أعلاه حتى تتجاوز مستويات التعبير Id1 العتبة.

2-هبسكسId1 الصيانة

  1. الثقافة هبسكسId1 في البئر 6 المغلفة-لوحات وتنمو في 3 مل كل من وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 6 ميكروغرام/مل بوروميسين جيدا.
  2. عندما تصل إلى 80% كونفلوينسي، الخلايا مرور كمجاميع (نسبة تقسيم 1:6) باستخدام كاشف تفارق خالية من إنزيم اتباع إرشادات بائع هبسكسId1 وتنمو في 3 مل كل من وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 6 ميكروغرام/مل بوروميسين جيدا.

3-إعداد هبسكسId1 للتمايز

  1. معطف صفيحة 12-جيدا مع 500 ميليلتر كل من كاشف طلاء جيدا.
  2. عندما ننأى هبسكسId1 تصل إلى 90% كونفلوينسي الخلايا بإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 + ومع 0.5 مم يدتا كل بئر 5 – 10 دقيقة للتحقق من عملية تفكك كل دقيقة، ومرة 80% الخلايا يتم فصلها عن لوحة ، انتقل إلى الخطوة التالية.
  3. جمع تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي.
  4. تحييد كاشف الانفصال مع 5 مل من المحتوية على برنامج تلفزيوني Ca2 + و Mg2 +.
  5. بيليه الخلايا بالطرد المركزي (200 غ س لمدة 3 دقائق).
  6. إزالة المادة طافية ونفض الغبار الأنبوب بلطف من أجل إزاحة بيليه.
  7. إعادة تعليق الخلايا في 2 مل وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 2 ميكرومتر رو/روك المسار المانع.
  8. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية.
  9. لوحة 300,000 الخلايا كل بئر في 1 مل وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 6 ميكروغرام/مل بوروميسين، 2 ميكرومتر رو/روك المسار المانع ونقل اللوحة إلى حاضنة استنبات الأنسجة.
  10. تحديث وسائل الإعلام يوميا مع 2 مل وسائط الخلايا الجذعية وتستكمل مع 6 ميكروغرام/مل بوروميسين حتى تصل إلى الثقافات كونفلوينسي 90%. عند هذه النقطة، يبدأ التمايز القلب (الخطوة التالية).

4-التفريق بين هبسكسId1 في قلب أول حقل مثل "القلب موروث" (CPs فهف-L)

  1. لتنسيق لوحة 12-حسنا، تستكمل مع أضافت على التمايز الشروع (يوم 0) باستبدال وسائط الخلايا الجذعية مع 1.5 مل من تحريض وسائل الإعلام (الجدول 1) (100 نانوغرام/مل) (انظر الجدول 2 لاوصي وحدات التخزين وأضافت أ تركيزات ل لوحة مختلفة الأشكال).
  2. في يوم 1 (24 ساعة بعد بدء التمايز)، تحل محل وسائل الإعلام مع 2 مل الإعلام التعريفي دون أضافت A (لكل من صفيحة 12-جيدا جيدا).
  3. في يوم 3، تحل محل وسائل الإعلام مع 2 مل الإعلام التعريفي دون أضافت A (لكل من صفيحة 12-جيدا جيدا).
  4. في يوم 5، جمع CPs فهف-L لتجميد (الخطوة التالية).
    ملاحظة: هامة: نعد المفضل عند هذه النقطة، كما أنه يتيح لفصل جيل السلف القلب من كارديوميوسيتي اللاحقة إنتاج والمصرف البيولوجي دفعات كبيرة من الخلايا. لاحظ أنه بدلاً من ذلك، يوم 5 CPs فهف-L يمكن أن تنتقل إلى لوحة طازجة مغلفة مواصلة التمايز، الرجاء الرجوع إلى الخطوات 5.1 – 5.5 إلى النيابة العامة باسفهف-L وثم تابع إلى "الخطوة 6، 5" للتمايز.

5-تجميد CPs فهف-L

  1. نضح جميع وسائل الإعلام من الآبار التي تحتوي على يوم 5 CPs فهف-L وإضافة 1 مل الحارة (37 درجة مئوية) 1 × المحتوية على إنزيم كاشف الانفصال بسرعة (انظر الجدول للمواد). ضع لوحة في حاضنة استنبات الأنسجة.
  2. وبعد 1 دقيقة، اهتز لوحة جنبا إلى جنب في الحاضنة.
  3. بعد 2 دقيقة (إجمالي الوقت)، إزالة لوحة من الحاضنة وإضافة 1 مل 10% FBS وسائل الإعلام.
  4. بلطف بيبيت خلايا صعودا وهبوطاً مع بيبيت 5 مل تيسيرا للخلية المفرزة من اللوحة.
  5. جمع تعليق خلية إلى خلايا الأنبوب وبيليه الطرد مركزي باستخدام الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 3 دقائق
  6. إعادة تعليق خلية بيليه في 2 مل كاشف للواسمات.
  7. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية.
  8. إضافة كاشف للواسمات (انظر الجدول للمواد) في حجم كاف كريوبريسيرفي الخلايا في التركيز المطلوب (عادة 5-10 × 106 خلايا/مل).
  9. نقل الخلايا إلى تجميد قارورة ووضع قنينة في تبريد الجهاز (1 درجة مئوية/دقيقة) ووضع جهاز التبريد في الثلاجة-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  10. بعد 24 ساعة، نقل القنينات المجمدة بالنتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

6-فهف-L CP التمايز في Cardiomyocytes البطين مثل

  1. نقل قنينات CPs فهف-L المجمدة يوم 5 من تخزين النيتروجين السائل في وعاء الثلج الجاف.
  2. ضع قارورة في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 2 إلى 3 دقائق، حتى يتم إذابة تعليق خلية تماما.
    ملاحظة: هامة: عملية ذوبان الحساسة للوقت. تعريض الخلايا لوسائط الإعلام نعد لكمية زائدة من الوقت (أي، 10 دقيقة) ستنخفض بقاء الخلية.
  3. نقل الخلايا إلى 15 أو 50 أنبوب مل الطرد المركزي، اعتماداً على عدد القنينات المذابة.
  4. الاستغناء عن دروبويسي الوسائط كارديوجينيك المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) (5 قطرات كل 30 ثانية) (الجدول 1) إلى حل الخلية. تستمر هذه العملية حتى وسائل الإعلام نعد 1:3: يتم التوصل إلى نسبة كارديوجينيك وسائل الإعلام. عند هذه النقطة، زيادة معدل إضافة الوسائط كارديوجينيك حتى 01:10 للواسمات وسائل الإعلام: هو التوصل إلى نسبة كارديوجينيك وسائل الإعلام.
    ملاحظة: هامة: التغييرات السريعة الاسموليه ستزيد من موت الخلايا أثناء عملية ذوبان؛ ولذلك، إضافة دروبويسي لوسائل الإعلام كارديوجينيك كما هو موضح أعلاه يوصي بشدة.
  5. الطرد المركزي الخلايا خلية تعليق وبيليه بالطرد المركزي (200 غ س لمدة 3 دقائق).
  6. إزالة المادة طافية ونفض الغبار بلطف أنبوب الطرد المركزي لإزاحة بيليه الخلية.
  7. إعادة تعليق الخلايا مع وسائل الإعلام كارديوجينيك وتستكمل مع 2 ميكرومتر رو/روك المسار المانع.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف صلاحية خلية من ذوبان الجليد للذوبان، وبصفة عامة، > 65% بقاء يتنبأ بكفاءة جيدة والطلاء.
  8. تمييع تتركز تعليق خلية مع وسائل الإعلام كارديوجينيك وتستكمل مع 2 ميكرومتر رو/روك المسار مثبط للحصول على تركيز الخلايا المطلوب للطلاء (انظر الجدول 2 لتنسيقات لوحة مختلفة).
    ملاحظة: هامة: ملاحظة أن الكفاءة التمايز القلب قد تنخفض إذا هي تبذر الخلايا قليلة جداً.
  9. خلايا البذور على اللوحة.
  10. تبقى لوحة في هود زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة قبل نقلها إلى حاضنة استنبات الأنسجة.
  11. في يوم 6 من التمايز، رصد مرفق خلية.
    ملاحظة: يتم cryopreserved المتكفل القلب في يوم 5 من التفرقة. 24 ساعة بعد ذوبان الخلايا سيكون في يوم 6 من التفرقة.
    ملاحظة: وجود خلايا (ميتا) العائم الشائع.
  12. في يوم 7، نضح 50% من وسائل الإعلام واستبدل بمبلغ مساو لوسائل الإعلام كارديوجينيك الطازجة.
    ملاحظة: إضافة رو/روك المسار مثبط لوسائل الإعلام كارديوجينيك ليس من الضروري بعد هذه النقطة.
  13. تحل محل 50% من وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام كارديوجينيك كل يوم.
  14. ملاحظة ضرب العفوية التي تظهر بين اليوم 11 و 13 يوم.
  15. في يوم 15، قياس كفاءة القلب التمايز قبل الفلورة استخدام DAPI (نواة وصمة عار) و ACTC1 (العلامة عموم القلب).

7-تمرير وصيانة Cardiomyocytes البطين مثل

ملاحظة: قبل يوم 14 – 16، أحادي الطبقة عفوية التعاقد cardiomyocytes البطين مثل ينبغي الحصول على. عند هذه النقطة، اقترح لفصل وإعادة لوحة cardiomyocytes لمجانسة الثقافة ومنع الخلايا من فصلها من اللوحة.

  1. نضح جميع وسائل الإعلام من الآبار وإضافة 1 مل من قبل حرارة (37 درجة مئوية) 1 × المحتوية على إنزيم كاشف الانفصال بسرعة.
    ملاحظة: 1 × المحتوية على إنزيم تفارق كاشف وحدات التخزين تختلف تبعاً لشكل لوحة، ولكن ينبغي أن تغطي كامل الجزء السفلي من السطح جيدا.
  2. نقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
  3. بلطف يهز لوحة جنبا إلى جنب كل 2 دقيقة داخل الحاضنة لتسريع عملية مفرزة.
  4. بعد 5 – 15 دقيقة، عندما يتم فصل 80% إلى 100% الخلايا من الجزء السفلي من اللوحة، إزالة اللوحة من الحاضنة وتمنع 1 × المحتوية على إنزيم نشاط كاشف الانفصال عن طريق إضافة وحدة تخزين تساوي 10% FBS وسائل الإعلام.
    ملاحظة: يختلف وقت الحضانة مع تفكك المحتوية على إنزيم س 1 لهذه العملية من دفعة لدفعة.
  5. جمع تعليق خلية في أنبوب الطرد مركزي.
  6. مزيج من تعليق خلية مع خلايا بيبيت وعدد مرات استخدام عداد الآلي خلية.
  7. تمييع تعليق خلية لتركيز الخلايا المطلوب (انظر الجدول 2 لتنسيقات لوحة مختلفة) مع صيانة وسائل الإعلام وتستكمل مع 2 ميكرومتر رو/روك المسار المانع.
  8. بعد البذر كارديوميوسيتيس على اللوحة، توزيع الخلايا بشكل متساو وتسمح للخلايا لإرفاق لمدة 10 – 20 دقيقة قبل نقل اللوحة إلى حاضنة استنبات الأنسجة.
  9. رصد 24 ساعة بعد إعادة الطلاء، مرفق خلية والانتعاش.
    ملاحظة: وجود خلايا (ميتا) العائم الشائع. 48 – 72 ساعة بعد إعادة الطلاء، كارديوميوسيتي ينبغي أن تستأنف الانكماش عفوية.
  10. للحفاظ على ثقافة كارديوميوسيتي، تحل محل 50% من وسائل الإعلام مع المحافظة على وسائل الإعلام كل يوم حتى استخدام cardiomyocytes البطين مثل للتجارب اللاحقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

جيل هبسكس Id1 خطوط
هبسكس المصابين لينتيفيروس وساطة Id1 overexpression (الشكل 1أ). حالما يتم إنشاء هبسكId1 ، هو كمياً التعبير التحوير ب qRT-بكر (الشكل 1ب). ينبغي أن تستخدم فقط هبسكId1 خطوط التعبير عن Id1 مرناً في مستويات أكبر من حظيرة 0.005 من جابده للتمايز.

هبسكس Id1 الصيانة والإعداد لمد إيفيرينتييشن
شروط الثقافة المثلى ضرورية وحاسمة لنجاح أول القلب التمايز السلف القلب مثل حقل (الرقم 2A). وينبغي رصد الثقافاتId1 هبسك يوميا لصيانة مورفولوجيا الجذعية والانتشار المستمر. ينبغي أن تبدأ المفاضلة عند الوصول إلى مستعمرات الخلايا الجذعية محكم معبأة > 90% كونفلوينسي (الشكل 2ب). إذا كان يتم البدء التفريق قبل كونفلوينسي الأمثل، تتعزز بموت الخلايا وقد تنخفض كفاءة التمايز (الشكل 2-ج). وبالمثل، سوف تؤدي الثقافات متضخمة سيئة (الشكل 2د).

جيل من أول فروعه القلب مثل حقل القلب (CPs فهف-L) من هبسكس Id1
في يوم 1 (بدء التمايز وظيفة ح 24)، ينبغي أن ترصد الخلايا لمراقبة فقدان مورفولوجيا الجذعية (خلايا تظهر أبسط وأكثر قتامة من الخلايا الجذعية). ملاحظة موت الخلية المشتركة خلال اليوم الأول من التمايز، ولكن ينبغي الحفاظ على التقاء الخلية في > 75% (الشكل 2ه). إذا كان بعد 24 ساعة تمايز، 50% أو أكثر من مساحة مغطاة المفقودة، يجب أن يتم تجاهل الخلايا.

في يوم 3، ينبغي أن تظل متفاوت المسافات تمييز الخلايا وقد سد الثغرات التي تم إنشاؤها خلال 24 ساعة الأولى من الفترة الزمنية (الشكل 2و). خلايا مسطحة تنمو بشكل مستقل إرشادية لشروط التفريق دون المستوى الأمثل.

في يوم 4، ينبغي أن تظهر التمايز الأمثل التوسع المستمر وتغطية اللوحة.

في يوم 5، تحصد و cryopreserved الخلايا. ينبغي أن يؤدي الاختلاف الأمثل في مجموعات خلية أحكام متصلة بمظهر مورفولوجيا متجانسة (الشكل 2ز). علما بأن المجموعات ذات الكثافة السكانية المنخفضة من خلايا مسطحة مارك نتيجة تمايز دون الحد الأمثل. انظر الجدول 2 لمتوسط غلة اليوم ثقافة المتكفل القلب 5 الواحدة وكذلك في مختلف الأشكال.

جيل Cardiomyocytes البطين مثل من CPs فهف-L
يتم إذابة يوم 5 فهف-L CPs في الكثافة تعتمد على شكل لوحة المبينة في الجدول 2، بغية تحقيق أقصى قدر من التمايز القلب بهم المحتملين (الشكل 3أ و الجدول 2). الجدوى بعد ذوبان الجليد الاحتياجات التي يتعين رصدها. وبصفة عامة، صلاحية يتراوح من 70-80%. إذا كان البقاء أقل من 60 ٪، عائد كارديوميوسيتيس سوف تتأثر.

في يوم 6 (24 ساعة بعد استئناف التمايز)، ينبغي أن يشمل CPs فهف-L > 90% من تتوفر المساحة وتظهر كطبقة واحدة متجانسة من الخلايا (الشكل 3ب). سوف يقلل من التقاء منخفض في يوم 6 CPs فهف-L التمايز في cardiomyocytes.

بدء cardiomyocytes الناتجة للفوز بيوم 11-13 من التمايز (الشكل 3ج و 1 الفيلم). أثناء عملية ريبلاتينج يوم 14 – 16، انظر الجدول 2 لمتوسط غلة cardiomyocytes الواحدة وكذلك في مختلف أشكال الثقافة. هو عادة تقييم كفاءة التمايز الفلورة للقلب (ACTC1) وتنتجها الخلايا الليفية (تاجلن) وعلامات الأوعية الدموية غشائي (CDH5) والنووي (DAPI) علامات. نسب القياس الكمي تتم باستخدام الآلي الكمي التصوير والأسفار، كما هو الحال في كننغهام et al. (2017) 5 (الشكل 3د-ه). النوع الفرعي لتوصيف cardiomyocytes الناتجة يؤديها qRT-بكر (الشكل 3و) وتحليل إمكانات العمل عابر باستخدام التصوير الحركي والجهد الاستشعار المسابر (الشكل 3G و 2 فيلم). يتم إجراء القياس الكمي الأسفار لمجس الجهد وإمكانات العمل الناتجة عن تحليل التتبع (الشكل 3ح) كما هو موضح في ماكيثان et al. (2017) 7.

Figure 1
الشكل 1: توليد هبسكId1 خطوط. (أ) التمثيل التخطيطي من هبسكسId1 جيل البروتوكول. (ب) أمثلة لنتائج qRT PCR تبين مستويات مرناً Id1 الممثل المتولدة عن التعبير لينتيفيرال بوساطة من خطوط متميزة من هبسكId1 بما في ذلك خط هيس واحد وخطين من خطوط هبسك. خط متقطع يمثل عتبة التعبير Id1 ، أدناه التي هبسكId1 خطوط تحتاج إلى اجتياز دورة إضافية للإصابة Id1 lentivirus. "ف" يشير إلى عدد المرور. يشير الرقم في الأقواس عدد جولات عدوى Id1 لينتيفيرال. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري للتجارب التي أجريت في ثلاث نسخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: جيل من أول قلب فيلدليكي القلب موروث (CPs فهف-L) التمايز من هبسكId1. (أ) التمثيل التخطيطي لبروتوكول الجيل CP فهف-L. صور الممثل الميداني مشرق من هبسكId1 (يوم 0) في (ب)من الأمثل، روافد فرعية (رؤوس أسهم صفراء تشير إلى مناطق الفراغ بين الخلايا) الكثافة (د) (ج) وروافد المفرط. صور مشرقة الحقل الممثل التفريق بين هبسكId1 في اليوم 1، 3 و 5 على التوالي (ه)، (و)، (ز). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: جيل من البطين مثل كارديوميوسيتي من CPs فهف-L. (أ) التمثيل التخطيطي بروتوكول الجيل البطين مثل كارديوميوسيتي. (ب) صورة مشرقة ميدان يوم 6 تمايز الخلايا (يوم واحد بعد ذوبان الجليد). (ج) صورة مشرقة ميدان ثقافة الضرب يوم 12. (د) صورة الفلورة الممثل الثقافات 15 يوما (تنسيق لوحة 384-جيدا). علامات ACTC1 cardiomyocytes، تاجلن: العضلات الليفية/الملساء، CDH5: خلايا بطانية والأوعية الدموية، و DAPI: نوى (تظهر اقحم). (ه) نسب القياس الكمي للثقافات 15 يوما. (و) qRT PCR البيانات وقت التعبير بالطبع من يوم 5 إلى يوم 25 من العلامات الخاصة بالبطين (IRX4 و MYL2) وعموم القلب علامة (MYL7). (ز) الممثل العمل إمكانية تتبع من cardiomyocytes البطين مثل في يوم 25 من التمايز. (ح) إمكانية العمل مدة القياسات (APD50 و APD90) من الناتج cardiomyocytes البطين مثل (n = 12). أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري لتجارب أجريت في البيلوروسية (ما لم يذكر خلاف ذلك). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. رفو، وحدة الأسفار النسبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

متوسطة قاعدة المتوسطة المواد المضافة
وسائط الخلايا الجذعية mTesR1 n/a
وسائل الإعلام التعريفي المتوسط 1640 RPMI الملحق B-27 المصل مجاناً دون الأنسولين، س 1
وسائل الإعلام التعريفي المتوسط 1640 RPMI بوروميسين، 6 ميكروغرام/مل
وسائل الإعلام التعريفي المتوسط 1640 RPMI البنسلين والستربتوميسين، س 1
الوسائط كارديوجينيك المتوسط 1640 RPMI B-27 الملحق خالية من المصل، س 1
الوسائط كارديوجينيك المتوسط 1640 RPMI البنسلين والستربتوميسين، س 1
صيانة وسائل الإعلام المتوسط 1640 RPMI B-27 الملحق خالية من المصل، س 1
صيانة وسائل الإعلام المتوسط 1640 RPMI خروج المغلوب المصل الاستبدال، 2%
صيانة وسائل الإعلام المتوسط 1640 RPMI البنسلين والستربتوميسين، س 1

الجدول 1: مكونات وسائط الإعلام (انظر "الجدول للمواد" الإعلامية الأساسية والمضافات).

384 جيدا 96 جيدا 12 جيدا 6 جيدا 100 مم 150 مم
حجم الطلاء (لكل بئر) 10 ميليلتر 50 ميليلتر 500 ميليلتر 1 مل 5 مل 10 مل
متوسطة الحجم
(لكل بئر)
100 ميليلتر 300 ميليلتر 2 مل 5 مل 12 مل 30 مل
أضافت اليوم 0 التمايز بتركيز (ng/mL) 100 100 100 300
السلف القلب
العائد يوم 5
(خلايا/جيد)
1.0-1.2 × 105 2.5-3.0 × 105 1.0-1.5 × 107 2.0-3.0 × 107
السلف القلب يوم 5 ريبلاتينج أو ذوبان الجليد الكثافة (خلايا/جيد) 2.0 × 104 7.5 × 105 4.5 × 106 8.0 x 106 2.2 × 107
كارديوميوسيتي مثل بطيني
العائد يوم 14 – 16
(خلايا/جيد)
2.0-5.0 × 104 0.8-1.2 × 106 3.5-5.0 × 106 0.8-1.2 × 107 1.8-2.5 × 107
كارديوميوسيتي مثل بطيني ريبلاتينج الكثافة
(خلايا/جيد)
2.5 × 104 1.0 × 106 4.5 × 106 1.0 × 107 2.2 × 107

الجدول 2: معلمات قابلة التمايز (حجم طلاء، متوسطة الحجم، أضافت بتركيز، والغلال، ريبلاتينج الكثافة).

اسم الجين انضمام بنك الجينات التسلسل
جابده NM_001256799 F: جاجكجاجاتكككتككااات
R: جكتجتجتكاتاكتكتكاتج
ماوس Id1 NM_010495 F: ككتاجكتجتكجكتجاجك
R: كتككجاكاجاككاجتاككاك
IRX4 NM_016358 F: جكتككككاجتكتجاتج
R: تاجاككججكاجتاجاككج
MYL2 NM_000432 F: تججكجاجتجاكجتجااا
R: ككجاكجتاتكاجككتكاج
MYL7 NM_021223 F: جكككاكجتجتكتككا
R: كتككتككتكتججاكاكتك

الجدول 3: قرة-PCR التمهيدي متواليات.

Movie 1
الفيلم 1: تسجيل حقل مشرق (100 إطارات/ثانية) من يوم 15 كارديوميوسيتيس حيث يمكن ملاحظة تقلصات عفوية. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Movie 2
الفيلم 2: تصوير الحركية (100 إطارات/ثانية) حساسة للجهد المسبار الفلورسنت في cardiomyocytes البطين مثل التي يسببها id1 25 يوم. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

للاختلاف ناجحة، تأكد من اتباع التعليمات المذكورة أعلاه عن كثب. وباﻹضافة إلى ذلك، هنا نسلط الضوء على المعالم الرئيسية التي تؤثر بشدة على نتائج المفاضلة. قبل البدء بتفريق، وينبغي مراعاة المحددات المورفولوجية الثلاثة التالية: مورفولوجيا جذعية من هبسكسId1، ارتفاع ضغط خلوية والتقاء عالية (> 90%) للثقافة في اليوم 0. وفي هذا الصدد، تهيأ الظروف المثلى التمايز أفضل بطلاء نات هبسكسId1 كخلايا مفردة والسماح لهم بشكل محكم متفاوت المسافات مونولاييرس التي تنمو إلى التقاء ~ 90% خلال 2 إلى 3 أيام. على العكس من ذلك، إذا كان إظهار هبسكId1 الثقافات الفقيرة خلية ومورفولوجيا مستعمرة ومستعمرة منخفضة الضغط ووجود مساحات كبيرة من التمايز داخل الثقافة، من المرجح ناجحة CP فهف-L التمايز.

وسائط التخزين وأضافت بتركيزات من المعلمات حرجة من التمايز CP فهف-L، وتعتمد على شكل لوحة (انظر الجدول 2). أيضا ملاحظة أن أمثل A أضافت تركيزات قد تختلف تبعاً لخط هبسك المستخدمة وقد تتطلب التركيز الأمثل.

مستويات مرناً Id1 في هبسكس ذات أهمية حاسمة لتعزيز كفاءة فهف-L CP. الأمثل ستفشل Id1 مستويات إنتاج قوية CP فهف-L التمايز وسيراعي في موت الخلايا الضخمة خلال اليوم الأول من التمايز. يجب أن يتجاوز نسبة التعبير النسبي Id1--إلى--جابده 0.005 لتعزيز كفاءة التمايز. ينصح بالتحديد المستمر باستخدام جرعات كبيرة من بوروميسين (6-10 ميكروغرام/مل) من أجل الاحتفاظ بمستويات عالية من لينتيفيرال بوساطة التعبير Id1. تقييم مستويات مرناً Id1 ينصح كل الممرات 10.

الطلاء كثافات يوم 5 "كبسيس" فهف-L أيضا معلمة حاسم لكفاءة التمايز القلب. إذا كان يوم 5 CPs فهف-L هي مطلي بكثافات منخفضة، وستنخفض غلة القلب النسبي. وترد في الجدول 2 الكثافة المثلى والطلاء وهي لوحة تعتمد على تنسيق.

القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو استخدام لينتيفيرال بوساطة overexpression Id1 إلى بروموتيفهف-L CP المفاضلة التي قد تحد من استخدام العلاجية الناتجة عن موروث و cardiomyocytes البطين مثل. أيضا، منذ لينتيفيروسيس قد دمج في المواقع أنه يمكن أن يحتمل أن تؤثر هبسك الصيانة و/أو التنموية المحتملة، ستيمنيس هبسكس المستعمراتId1 ينبغي أن ترصد تقييم وقف التعبير الجيني ومراقبة علامات المورفولوجية التفريق. علما بأن أوفيريكسبريسينج Id1 استخدام ناقلات غير متكامل من شأنه التغلب على هذا القيد ويجري التحقيق حاليا في المختبر.

واحد ميزة مريحة من هذا الأسلوب هو بساطة البروتوكول التمايز إلا أنها تتطلب واحد سيتوكين، أضافت أ، إلى توليد CPs فهف-L من هبسكسId1. وبالمقارنة، تتطلب الأخرى بروتوكولات 9،10،11،12،13،،من1415 تسلسل معقد من تركيبات من السيتوكينات و/أو الجزيئات الصغيرة من أجل تعزيز والحفاظ على التمايز القلب. وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول فريد خطوة مريحة للواسمات التي تمكن من فصل توليد CP فهف-L من إنتاج كارديوميوسيتي اللاحقة. تمكن هذه الميزة لدفعات كبيرة المصرف البيولوجي فهف-L "مجلة الأحوال الشخصية" وإنشاء كارديوميوسيتيس بسرعة من فروعه المجمدة، كتمييز القلب استئناف من يوم 5 إلى ذوبان الجليد. هذه الاستراتيجية تسمح للحصول على 1 إلى 2 أسابيع وقت مقارنة ببدء التمايز القلب من هبسكس. وبالإضافة إلى ذلك، والأهم من ذلك، هذا البروتوكول هو بروتوكول أول تاريخ لتوليد المتكفل القلب من قلب محدد الحقل الأصل، بينما الأخرى بروتوكولات9،،من1011،12 13، ،،من1415 تظل غير محددة في هذا الصدد.

وباختصار، يحدد هذا البروتوكول وسيلة قوية وقابلة للتطوير لإنتاج كميات كبيرة (> 108–109) تنمويا ذات الصلة فهف-L CPs و cardiomyocytes البطين الشبيهة. وفي المقابل، يمكن استخدام الخلايا الناتجة لتحديد مسارات تنظيمية رواية السيطرة على التمايز القلب وعلم وظائف الأعضاء، والتجدد والمرض نمذجة الأغراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر أعضاء المختبر الكولا لإجراء مناقشات مفيدة وملاحظات حرجة من المخطوطة. وأيد هذه الدراسة بالمعاهد الوطنية للصحة/نيس R44ES023521-02 ومنح سيرم DISC2-10110 للدكتور الكولا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACTC1 antibody Sigma A7811
Activin A Stem Cell Technologies Hu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) Thermo Fisher Scientific 15240062
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement w/o - insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 supplement w/o - vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587001
CDH5 antibody R&D Systems AF938
CryoStor CS10 Stem Cell Technologies 7930 Cryopreservation reagent
DMEM high Glucose Mediatech 10-013-CV 
DPBS w/ Ca & Mg Corning 21-030-CV
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575-038
FBS VWR 89510-186
FluoVolt membrane potential kit   Thermo Fisher Scientific F10488 For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Matrigel, Growth Factor Reduced Corning 356231 Coating reagent
mTeSR1 media kit Stem Cell Technologies 5850
PBS w/o Ca & Mg Corning 21-040-CV
Penicillin-Streptomycin Gibco
Puromycin  Acros 227422500
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Enzyme-free dissociation reagent
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11875-093
TAGLN antibody Abcam ab14106
Thiazovivin Stem Cell Technologies 72254 RHO/ROCK pathway inhibitor
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12605 -010 1X enzyme-containing dissociation reagent
Tyrodes solution mix packets   Sigma T2145-10X1L (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  2. Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
  3. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  4. Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
  5. Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. (2017).
  6. McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit 1F 13 (2012).
  7. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
  8. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
  9. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
  10. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
  13. Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
  14. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  15. Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
  16. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
  17. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
  18. Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
  19. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics