吞噬细胞内复制脓肿分枝杆菌毒力标志物的鉴定

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

在这里, 我们提出两个协议来研究吞噬-分枝杆菌脓肿的相互作用: 座子突变文库的筛选和 RNA 中细菌细胞内转录的测定测 序。这两种方法都提供了对基因组优势和 transcriptomic 适应增强细胞内细菌适应性的洞察力。

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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Abstract

区分脓肿分枝杆菌与其他腐生分支杆菌的区别是能够抵抗人类巨噬细胞吞噬功能, 以及在这种细胞内繁殖的能力。这些毒力特征使m. 脓肿致病性, 特别是在易受感染的宿主与潜在的结构性肺病, 如囊性纤维化, 支气管扩张症或肺结核。患者如何感染 m.脓肿仍然不清楚。与许多分枝杆菌不同, m. 脓肿在环境中找不到, 但可能居住在阿米巴, 环境吞噬, 代表m 脓肿的潜在水库。事实上, m. 脓肿对 amoebal 吞噬功能有抵抗力, 而在实验性感染模型中, 变形虫的生命似乎增加了m 脓肿的毒力。然而, 对m. 脓肿的毒力本身知之甚少。为了破译对m 脓肿细胞内生命具有优势的基因,脓肿座子突变体文库进行了筛选。同时, 建立了阿米巴共培养后细胞内分枝杆菌的 RNA 提取方法。验证了该方法, 并允许细胞内全m 脓肿transcriptomes 的测序;第一次提供了关于m. 脓肿适应细胞内生活的全球观点。这两种方法都让我们对m. 脓肿致病因子的洞察力, 使m 脓肿能够在人类中殖民呼吸道。

Introduction

分枝杆菌属包括从无害的腐生有机体到主要人类病原体的种类。众所周知的致病物种, 如结核分枝杆菌, marinum 分枝杆菌和杆菌分枝杆菌属于慢生长的分枝杆菌 (上海市) 亚组。与此相反, 快速生长的分枝杆菌 (RGM) 亚群的特征是它们在琼脂培养基上在不到7天内形成可见菌落的能力。RGM 组包括180多种, 主要为非致病性腐生分枝杆菌。RGM 与寄主的相互作用的研究主要集中在耻垢分支杆菌上, 并表明这些分枝杆菌被巨噬细胞的杀菌作用迅速消除。

脓肿分枝杆菌是一种罕见的 RGM, 是人类的致病性, 并负责广泛的感染范围从皮肤和软组织感染到肺部和传播感染。m. 脓肿杆菌分枝杆菌一起被认为是囊性纤维化患者1的主要结核杆菌病原体。

m. 脓肿上进行的各种研究表明, 这种分枝杆菌的行为类似于胞内病原体, 能够在肺部和皮肤中存活的巨噬细胞和成纤维细胞的杀菌反应, 而这通常不是在 RGM2,3,4. m. 脓肿基因组分析确定了在与土壤、植物和水生环境接触的环境微生物中通常发现的代谢通路, 那里的自由阿米巴经常存在5。他们还表明, m. 脓肿被赋予在腐生和非致病性 RGM 中未发现的几种毒力基因, 可能是在有利基因交换的利基水平基因转移中获得的, 可能会聚集各种抗虫病菌。

实验中, 第一个显著的结果是观察脓肿 m . 型巨噬细胞细胞内生长和结核6m. 脓肿也抵抗吞噬体的酸化, 细胞凋亡和自噬, 三细胞抵抗的基本的机制对传染2。它甚至表明, m.脓肿能够建立一个即时沟通之间的吞噬体和细胞质, 一个更富营养的环境, 可能有利于细菌增殖2。很少有人知道m. 脓肿拥有或已经获得的基因组优势, 以允许在细胞内环境中生存。变形虫共培养是一种有效的方法, 允许分离许多新的抗虫菌massiliense7,8分枝杆菌。在小鼠脓肿的 aerosolization 模型中观察到在阿米巴内繁殖的能力, 这会使m 脓肿4的毒力增加。一个假说是, m. 脓肿在这个环境中发现了遗传特征, 在吞噬细胞中生存, 这与其他非致病性 RGM 不同。这些收购可能有利于传播能力和它在人类宿主的毒力。

本报告介绍了一些工具和方法, 以突出基因组优势授予m. 脓肿生存在阿米巴环境中。为此, 首先描述了 m.脓肿座子突变体的筛选,棘阿米巴 castellanii型菌株, 它允许鉴定突变体细胞内生长缺陷。另外还报告了巨噬细胞的第二次筛查, 以确认这种缺陷是否在人类宿主中持续存在。其次, 为了了解在脓肿中利用哪些机制来适应吞噬细胞的生命, 增加其在动物宿主中的毒力, 在共培养后, 开发了一种特别适合m 脓肿的方法。在阿米巴的存在, 允许从 amoebal 内细菌中提取总 RNA。因此, 对细胞内生命所需的m 脓肿基因的综合看法得到了发展。

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Protocol

1. 图书馆筛选

  1. Tn突变体库的构建
    1. 获取座子库。
      注: 本实验中, 美国波士顿大学公共卫生学院 E.J. 鲁宾 (座子) 提供了一个变种人图书馆。图书馆是由m. 脓肿综合症 (m 脓肿亚种. massiliense) 的平滑临床应变 (43S) 构建的, phagemid 引入m 脓肿允许随机插入单个Tn成 ta 二核苷酸 (91240 TA 序列在m 脓肿基因组)。有关详细信息, 请参阅鲁宾的参考资料。9和 Laencina10
  2. 图书馆的滴定与abscessusTn突变体的保护
    注: 这需要一周时间。
    1. 把图书馆解冻在冰上。通过在1毫升水中执行串联稀释来确定细菌浓度 (10-1到 10-15)。在含有7H11 琼脂培养基的培养皿上, 每稀释一滴, 250 毫克/毫升卡那霉素。在37摄氏度的3–4天内孵化盘子。
      注: 在这里, 一个滴定 1011细菌/毫升被恢复。
    2. 在确定了库的浓度后, 将图书馆稀释到3000细菌/ml 的最后浓度, 在10毫升25% 甘油-水中。整除图书馆在 10 cryotubes 与1毫升图书馆在每个管子。把整除数-80 摄氏度。
    3. 当准备使用, 解冻一个稀释的图书馆的整除在冰并且增加100µL 图书馆到10平方米勒-韩丁 (MH) 琼脂板材 (大小 12 cm) 恢复200到300各自的殖民地在3–4天孵化以后在37°c。
    4. 与无菌牙签, 转移各自的殖民地 (大约6000个殖民地在 60 x 96-井板材) 入96个井板材填装与200µL 7H9 培养基补充与0.2% 甘油, 1% 葡萄糖, 250 毫克或毫升卡那霉素。孵育37°c 5 天, 不摇晃。
    5. 将培养的100µL (步 1.2.4) 转移到含有100µL 7H9 培养基的96井板中, 含40% 甘油。将有序库存储在摄氏-80 摄氏度。
    6. 重复步骤1.2.3。1.2.5。与图书馆的其余部分, 直到1万个人克隆被恢复 (大约 100 x 96 井板和 30 MH 板材)。
  3. 阿米巴的制备
    1. 培养变形虫棘阿米巴 castellanii (AC) 在 75 cm2组织培养烧瓶在室温 (RT) 在30毫升 PYG 培养基 (表 1) 为放大细胞线11
      注: 成熟的个滋养体从大的黏附细胞与许多消化液泡在显微镜清楚地是可看见的。细胞加倍的时间估计是25小时, 细胞被放大每3天通过传播一第三的最初的文化在 75 cm2组织培养烧瓶。
    2. 用25毫升的吸管去除 PYG 培养基。用10毫升的交流缓冲器 (表 2) 冲洗细胞, 不含任何碳或氮源12。重复洗两次。
      注: 不含碳或氮源的交流缓冲器避免分枝杆菌胞外生长。这个最小的媒介导致阿米巴的 encystment。为了限制这种情况, 将热灭活大肠杆菌作为基质 (步骤 1.4) 添加到阿米巴, 并促进了非常短的培养时间 (48 小时的突变筛选和 4 h 或 16 h 培养 RNAseq 实验)。或者, 使用这种培养基, 但丰富的 PYG 培养基 (通常 10%)。
    3. 将变形虫从烧瓶的底部分离出来, 并在组织培养瓶中进行一次剧烈的摇动。
    4. 用 hemocytometer 计数单元格, 将单元浓度调整到交流缓冲器稀释的 5 x 105阿米巴/毫升。
  4. 细菌感染后热灭活大肠杆菌的制备
    1. 在100毫升的 Luria 汤 (磅) 中, 一夜37摄氏度, 将大肠杆菌的临床分离菌株从甘油中生长。
    2. 在50毫升管中以 1835 x g为10分钟, 以离心的方法收割细菌。放弃上清。并用重悬10毫升10% 甘油-水的颗粒。重复洗两次。
    3. 并用重悬5毫升10% 甘油-水的颗粒。整除0.5 毫升成1.5 毫升管。通过执行串行稀释和添加稀释在 LB 琼脂板上确定细菌/毫升的数量。把整除数-80 摄氏度。
    4. 在变形虫感染前一天, 解冻一整除在冰上, 并进行热杀死通过孵化管在70°c 60 分钟。
      注: 在37摄氏度一夜之间, 用100µL 的 LB 琼脂板上的灭活细菌进行钝化检查。在文化的一夜之后, 任何殖民地都不应该可见。
    5. 将被加热的细菌稀释到50µL 的交流缓冲液中 107细菌浓度, 并将稀释后的细菌贮存在4摄氏度, 不超过一周。
  5. 阿米巴-m 脓肿的共培养突变体: 第一屏
    注意: 这需要3–4月的时间来筛选6000变种人。
    1. 传播 5 x 104阿米巴/井到96井板在100µL AC 缓冲器。在32摄氏度孵育1小时, 不摇晃。允许漂浮的变形虫 trophozoïtes 时间坚持水井。
      1. 在孵化时, 冰上的细菌解冻1小时。
    2. 添加5µL 的解冻细菌培养与电子多通道吸管。感染1.5 小时左右的6000个个体化克隆从96井板块Tn变种股票。
      注: 在本议定书的这一步骤中, 教学语言是未知的;然而, 所有含有Tn突变体的96井板块都是以同样的方式栽培的。第一个屏幕的目的是快速识别胞内缺陷突变体, 而不考虑接种密度的变化。
    3. 在1.5 小时的感染后, 将96井板上的无菌纱布放在一个灭菌的金属托盘中, 以去除通风罩下的交流介质。用200µL 的交流介质填充。重复这洗两次。
    4. 添加200µL 的新鲜培养基补充100µg/毫升丁胺卡那霉素, 以消除剩余的胞外分枝杆菌。
    5. 孵育2小时, 然后再进行3洗涤 (如步骤1.5.3 中所述)。洗涤后, 保持文化与50µg/毫升丁胺卡那霉素在200µL 的交流缓冲器。
    6. 添加 5 x 107热灭活大肠杆菌细菌 (从步骤 1.4) 在感染结束, 每24小时, 以防止 encystment 的阿米巴。
    7. 经过48小时的共培养, 溶解细胞通过增加10µL 10% SDS (月桂酸钠) 到每个井和孵化30分钟在32°c。继续进行系列稀释, 并添加在哥伦比亚琼脂板块含有5% 羊血 (COS 板块), 以评估细胞内分枝杆菌的数量。用 parafilm 封住盘子, 孵育37摄氏度。
    8. 3-4 天后, 当菌落出现在琼脂板块上时, 通过观察细菌菌落数量最低的沉积物, 对该板块进行拍照, 识别出细胞内生长的突变体。
      注意: 不要介意菌落的形状、高度或密度 (图 1A)。发现了136/6000 变种人。
  6. 阿米巴-m abscessusTn突变体的共培养: 第一屏中发现的突变体第二屏
    注: 这需要2周。第二个屏幕必须与在第一个屏幕后获得的136减毒突变体, 以精确量化的细菌接种数量和细胞内生存细菌的数量2天后感染。
    1. 在50毫升内填充20毫升7H9 培养基的每一个受影响突变体的1个菌落, 补充0.2% 甘油, 1% 葡萄糖和250毫克/毫升卡那霉素。允许细菌达到指数阶段 (0.6 < 外径 < 0.8)。
    2. 用离心法 (1835 x g 10 分钟) 在交流介质中清洗养殖。放弃上清。重复此洗涤两次以上20毫升的7H9 培养基补充0.2% 甘油, 1% 葡萄糖和250毫克/毫升卡那霉素。
    3. 并用重悬5毫升交流缓冲器中的细菌。
    4. 确定突变体的菌落形成单元 (CFU) 浓度。在24井板, 增加1毫升水的两个第一行。将100µL 的细菌悬浮液添加到第一井。微, 混合三次。然后, 吸入100µL, 并存入第二井。
    5. 用一个新的技巧, 重复步骤1.6.4 从第二个井到第三个,等等, 直到第十二井。
    6. 吸入30µL 的 10-12稀释, 并添加到一个 COS 板。对其他稀释重复。
    7. 用 parafilm 裹住 COS 板, 在37摄氏度3–4天孵化。通过计数菌落来确定浓度。
    8. 在24井板上以 5 x 104个变形虫为单位, 在1毫升交流共培养培养基中, 执行上述三种共培养化验。接种以传染多样性 (语言) 10。
    9. 在共培养48小时后, 按照步骤1.5.7 中的描述进行细胞裂解。在水中执行串行稀释 (10-1到 10-6), 并在 COS 板上添加30µL。在进行 CFU 计数前, 在37摄氏度孵育盘子4天。
      注意: 在第二个屏幕之后, 60 136 变种人被保存。
    10. 储存突变体对细胞内存活的影响。添加一个 cryotube 含有 LB 介质与甘油 (20% 最终) 或在一个 cryotube 含有商业溶液和微球有利于长期保护和促进未来接种, 然后存储在-80 摄氏度。
    11. 通过测量每2天 600 nm 的光学密度 (OD) 来评估体外突变生长。
      1. 在50毫升内填充20毫升7H9 培养基的每一个受影响突变体中生长1个菌落, 补充0.2% 甘油, 1% 葡萄糖和250毫克/毫升卡那霉素。允许细菌达到指数阶段 (0.6 < OD < 0.8) 之前, 调整 OD 到0.01 开始的动力学。
      2. 与细胞内缺陷突变组的应变相比, 排除与体内生长缺损相比较的突变株。
  7. 巨噬细胞-m 脓肿 Tn突变体在变形虫体中的共培养
    注: 这需要1月。
    1. 5 x 104 J774.2 小鼠巨噬细胞每井24井板在1毫升丰富的培养基, DMEM 补充10% 胎小牛血清 (FCS)。在37摄氏度和 5% CO2上孵化24小时的板材, 以允许巨噬细胞黏附。提供3个复制。
    2. 执行感染。接种的Tn突变体, 以10的语言, 稀释在 DMEM 与 10% FCS 在容量100µL。
    3. 经过3小时的感染, 执行三洗涤与1毫升的 DMEM (一真空泵可以使用)。然后治疗与250µg/毫升丁胺卡那霉素 (在 DMEM 与 10% FCS) 1 小时, 以消除剩余的胞外分枝杆菌。
      1. 在3额外洗涤与1毫升 DMEM, 保持文化在250µg/毫升阿米卡星 (在 DMEM 与 10% FCS) 到最后容量1毫升防止胞外结核杆菌增殖。
    4. 72 h 在共培养后, 通过添加1毫升冷水去除培养基并溶解巨噬细胞。孵育30分钟, 在4摄氏度。
    5. 对 COS 板进行 CFU 化验, 以评估胞内细菌的数量。
      1. 在24井板中, 将1毫升的水添加到两个第一排。将共细胞裂解液中的100µL 加入第一井。微, 混合三次。吸入100µL 并存入第二井。
      2. 用一个新的提示, 重复的稀释从第二井到第三个,等等, 直到第十二井。然后吸入30µL 的 10-12稀释, 并添加到一个 COS 板。
      3. 对其他稀释重复。用 parafilm 包住 COS 板, 等待3-4 天观察和计数菌落。
  8. m. 脓肿突变体中Tn插入部位的鉴定和测序
    注意: 这需要1.5 月的60变种人。
    1. 鉴定的m. 脓肿突变体的基因组提取
      1. 在50毫升管中生长突变体, 用20毫升的7H9 培养基补充0.2% 甘油, 1% 葡萄糖和卡那霉素250毫克/毫升到指数相 (OD600= 0.8)。
      2. 收获10毫升的文化 (2396 x g, 5 分钟)。放弃上清。悬浮细菌在溶液 I 的500µL (25% 蔗糖, 50 毫米三 pH 值 8, 10 毫克/毫升溶菌酶, 40 毫米硫脲)。将溶液转化为2毫升管, 螺钉盖和孵育2小时37摄氏度。
      3. 添加500µL 溶液 II (25% 蔗糖, 50 毫米三 pH 值 8, 50 毫米 EDTA)。吹打后5-10 次, 加入锆珠, 直到500µL 在管内的体积。
      4. 进行细胞裂解与匀质机 (3 x 6000 rpm, 四十五年代), 每轮之间的冰1分钟孵化。
      5. 添加5µL 20 毫克/毫升蛋白酶 K (100 µg/毫升最终) 和孵化的样品隔夜在55摄氏度。
      6. 在通风罩下添加1毫升的苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)。在进行涡流离心和 16500 x g 30 分钟之前, 将样品混合均匀。
      7. 离心后, 恢复水相, 并在罩下加入等量的冷苯酚/氯仿/异戊醇溶液。离心样品在 16500 x g 30 分钟恢复水相。
      8. 将0.7 体积的 RT 异丙醇添加到通风罩下恢复的水相。慢慢地反转管子, 允许 DNA 沉淀, 在 RT 中孵化5分钟。然后离心机10分钟在 16500 x g和 RT。
      9. 取出上清液, 用500µL 70% 乙醇在罩下清洗颗粒。在去除乙醇之前, 在 RT 上离心管10分钟, 在 16500 x g处。孵育10分钟, 允许剩余的酒精蒸发。
      10. 最后, 将 DNA 颗粒悬浮在100µL 的 DNase/RNase 游离水中。用分光光度法测定 dna 产量和纯度 dna。
      11. 删除1µg 的基因组 DNA 和消化与 10 U一晚, 为亚克隆的Tn插入站点。使用制造商的协议。
        注: 中局 I 酶是 m. 脓肿基因组中最具代表性的限制酶之一 (2173 个限制点)。在 tn 突变体的卡那霉素电阻盒上游的 tn 序列中也发现了中局 I 限制点。因此, 中局 I 介导的亚克隆可以识别 Tn 插入站点。
    2. 含 Tn 基因组 DNA 质粒的亚克隆
      注: 在 2686 pUC19 抗氨苄西林质粒中进行Tn-亚克隆之前, 在质粒的多个克隆部位添加一个ciaI 限制点。pUC19 质粒的序列可以在这个链接 https://www.addgene.org/50005/sequences/找到。
      1. 遵循制造商的协议消化 pUC19 质粒与EcoRI 和后III, 其中释放 51 bp 和一个片段的 2635 bp. 用商用 PCR 纯化试剂盒纯化双消化载体, 消除 51 bp释放片段。
      2. 混合1µL (浓度 25 pmol/µL) 的两个互补寡核苷酸 (5 ' AGCT 塔塔 AGATCT 塔塔 ATCGAT TATA3 ' 和 5 ' 的 TAA TAA TCG) 的 28 bp 的每一个包含中局 I 限制站点和结束后 III 和EcoR我限制网站。加热100摄氏度10分钟, 然后冷却, 以约束他们。
      3. 根据制造商的协议, EcoRI 和后 III 消化配对底漆。
      4. 结扎 150 EcoRI/后 III. 型 pUC19 质粒, 不同浓度的配对底漆 (50 pmol/µL, 25 pmol/µL, 2.5 pmol/µL) 1 h 在 RT 与 1 U T4 DNA 连接酶在最后的数量20µL. 通过不同的方法检查克隆酶消化。
      5. ciaI. 在37摄氏度的2小时消化改性质粒。
      6. 结扎 50 pUC19质粒和50的基因组 DNA, 经 ciai. 1 h 在 RT 与 1 U 的 T4 DNA 连接酶在10µL.
      7. 进行大肠杆菌electrocompetent 细菌转化5-10 µL 结扎 (2500 伏, 200 欧姆, 25 µF)。选择在 LB 琼脂板上的克隆, 辅以50µg 卡那霉素和50µg/毫升氨苄西林, 选择含 Tn 序列部分的细菌轴承质粒。
      8. 使用适当的抗生素选择 (50 µg/毫升卡那霉素和50µg/毫升氨苄西林) 在 LB 液培养基中过夜, 以抗性克隆生长。
      9. 提取质粒 DNA。通过酶的限制检查插入物的存在, 并序列 3 ' 的tn的末端, 以识别被中断的基因与寡核苷酸 (5 ' TTGACGAGTTCTTCTGA 3 ') 对应于最后17基对Tn卡那霉素电阻盒。
      10. 通过执行核苷酸爆炸 (脓肿) 将序列与 m. 的06菌株对齐。

2. RNA 提取细胞内分枝杆菌用于 Rnaseq 分析

注意: 这需要4月的实验和4月的 RNAseq 分析。

  1. 阿米巴-m 脓肿的共培养
    注: 在下面的实验中, 共培养在50毫升的管与鼓动, 以利于细菌的细胞接触。
    1. 生长m 脓肿在7H9 培养基补充与0.2% 甘油, 1% 葡萄糖到中间指数阶段在120转每分钟。
    2. 用10毫升的交流缓冲液清洗细菌两次。
    3. 通过测量外径600nm (1 od600= 4 x 108分枝杆菌) 来估计细菌浓度。在10毫升交流介质中添加 8.5 x 108分枝杆菌到 8.5 x 610阿米巴。
    4. 孵育1小时在30°c 与柔和的鼓动 (大约 80 rpm)。
    5. 用离心 253 x g的12分钟来收割细胞. 取出上清液并将细胞悬浮在10毫升交流缓冲器中。重复这洗两次。
    6. 并用重悬10毫升的交流缓冲器中含有50µg/毫升丁胺卡那霉素的细胞, 以消除胞外细菌和孵育4小时在30°c 与温和搅拌 (80 rpm)。再洗两次细胞。
  2. 细胞内脓肿中总 RNA 的提取
    注: 执行步骤 2.2. 1–2.2. 3 在油烟机下由于使用有毒试剂。
    1. 在最后洗涤之后, 并用重悬被传染的阿米巴在4毫升冷的解答 III (表 3) 与即兴280µL β巯基乙醇干扰阿米巴。这是胍硫氰酸盐 () 的步骤。在冰上保持悬浮10分钟. 离心细胞裂解30分钟, 在 2396 x g和4°c, 以颗粒释放胞内细菌。
    2. 清除上清液, 在1毫升的冷溶液中悬浮细菌颗粒。在4摄氏度时, 以 2396 x g为30分钟, 收割细菌。并用重悬1毫升的萃取缓冲器中的颗粒, 并将其转移到含有锆珠的2毫升螺旋管中 (直到管的500µL 级)。贮存管至少24小时, 在-80 摄氏度。
      注: 溶解试剂中的贮存允许 RNases 的灭活和细胞溶解。
    3. 当准备好使用时, 在冰上解冻样品, 并通过每轮6000转, 在二十五年代溶解两次, 然后以 6000 rpm 的1分钟的时间在冰层之间进行一次转。
    4. 把样品冷却下来, 在冰上孵化10分钟。然后加入200µL 氯仿稀释在异戊醇中。在涡流样品1分钟后, 离心机为15分钟, 在 16500 x g和4°c。
    5. 在水相中加入0.8 毫升的冷异丙醇, 并在20摄氏度的 2–3 h 上孵化样品。离心样品35分钟在 16500 x g和4°c。放弃上清。
    6. 通过添加500µL 70% 乙醇 (不混合) 来清洗 RNA 颗粒。
    7. 离心样品在 16500 x g 10 分钟, 以去除乙醇。在离心浓缩器中吸入溶液并干燥。
    8. 干燥后, 并用重悬100µL DNase/RNase 游离水中的颗粒。
      注: 样品必须与 DNases 处理两次, 以消除 DNA 污染物根据制造商的建议。
    9. 用基于芯片的毛细管电泳方法, 对琼脂糖凝胶的 rna 完整性进行评估, 并通过测量 rna 完整性数和核糖体率来确定。
      注: 该玲考虑到整个电泳痕迹。该软件算法允许对总 RNA 的分类, 基于编号系统从1到 10, 1 是最退化的外形和10是最原封的。为了进行 cDNA 文库的准备, RINs 必须超过8和核糖体比 [二十八年代/十八年代] 尽可能高, 理想的价值是 2, 取决于有机体和它的特殊性。
    10. 将 RNA 样品储存在-80 摄氏度, 直到准备 cDNA 文库进行测序。
  3. cDNA 文库的制备
    1. 要进行图书馆准备工作, 请使用制造商的协议, 利用商业上可用的 cDNA 合成试剂盒 (材料表)。
    2. 检查图书馆的浓度和质量的 DNA 芯片。
      注意: 用敏感的荧光定量测定方法可以进行更精确和准确的量化。
  4. 库排序
    1. 将样品规范化为 2 nM, 并根据流动细胞组织进行多路复用。
    2. 变性样品浓度为 1 nM, 使用 0.1 N 氢氧化钠, 在 RT 中为5分钟。
    3. 在下午10点稀释样品。在下午10点将每个样本加载到流单元中。
    4. 进行排序与高通量测序系统, 使大规模基因组学。奔跑这里是 SRM 奔跑 (SR: 唯一读, PE: 配对结束读, M: 复用的样品) 51 个周期与7个索引基地读。
    5. 评估与外部 FastQC 程序13的测序质量。
    6. 在调整适配器序列后, 继续对引用基因组进行读取对齐。对真核细胞基因组进行校准, 以评估样本污染, 如有必要, 进行非细菌性阅读的修剪。
  5. 统计分析
    1. 使用一些在线可用的软件来定义差异表达的基因集: R 软件, Bioconductor 包, 包括 DESeq2 和在 "转录 et Epigénome" 平台上开发的 PF2tools 包 (版本 1.2.12) (巴斯德学院, 巴黎)。

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Representative Results

m. 脓肿具有抵御和逃避巨噬细胞和环境原生动物如阿米巴的杀菌反应的能力。m. 脓肿在接触阿米巴时表达毒力因子, 使其在小鼠中更具毒性4。这些方法的第一个目的是识别m 脓肿中存在的基因, 使其在阿米巴中存活和增殖。

为此, 由Tn交付9获得的m . 脓肿亚种的变种人图书馆在阿米巴存在的共同养殖下进行了筛选, 以确定这种胞内生长发育不全的突变体。环境 (图 1)。对同一突变体的行为进行了研究, 并与巨噬细胞共培养分析了这种生长衰减是否保存在小鼠巨噬细胞中。

这种盲目的座子图书馆筛选方法, 证实了一个有缺陷的复制表型为 47 6000 变种人存活50% 或更少的阿米巴和/或巨噬细胞, 与对照10。为了排除由于分枝杆菌的内在生长缺陷而导致细胞内存活减弱的突变体, 对所有选择的Tn变种人的生长曲线进行了评价, 并在试管液培养富集培养基 (1%glucose-7H9)。所有变种人的体外生长每2天跟踪600次培养。本研究排除了与相应野生型菌株相比, 显示出体外生长缺损的不同突变株。

每天使用完全相同的协议来复制这个盲测试是非常重要的。这项技术的局限性是在第一次视觉筛选, 拍摄的每 CFU 提供一个准确的图像, 以供参考。在这组突变体中 , 发现了 12 m 脓肿突变体 ( 包括重复项 ) , 其中座子入到属于 VII 型分泌系统 ESX - 4 轨迹的基因中 , 这突出了它在细胞内的重要性。增长m. 脓肿10

到目前为止, 对 m.脓肿毒力的分析基本上是基于对 m脓肿基因组与m 龟, 属于同一组的分枝杆菌的比较分析, 但只导致感染皮肤的人。目的是获得在不同的共同文化条件下表达的基因的目录, 以便更好地了解在环境专业人士的共同文化中所涉及的适应性和潜在的毒力机制。吞噬.利用m. 脓肿总序信使 rna 的综合方法, 对这种增强的毒力进行分析, 以检测在变形虫共培养过程中诱导或压制的 rna 与 rna 转录在体外条件。这些 rna 的差异表达可以赋予 m.脓肿一个增强的 "毒力" 解释在人类上呼吸道的殖民化。

这些共同文化再被执行了在一个极小的媒介 (没有碳或氮气的来源) 如上所述, 为了防止m. 脓肿的胞外生长并且是代表面对这些的环境条件分枝杆菌和在选择抗生素的压力下, 在联合培养期间选择胞内分枝杆菌。

为此, 研制了一种分离细胞内分枝杆菌 RNA 的技术。结核杆菌 rna 提取的主要难点是避免 amoebal rna (真核细胞型) 的污染。为避免这种情况, 利用胍硫氰酸盐 (法) 对不同时间后共培养的变形虫进行了裂解;因为胞内分枝杆菌耐药性。在此步骤之后, 在锆珠存在的情况下, 利用细胞均质器对结核杆菌 rna 进行机械提取。这项技术使我们能够获得质量优良的结核杆菌 RNA, 具有高品质的数量, 必须提高对m 脓肿转录进行完整分析的能力, 使用信使 RNA 测序 (mRNA)技术 (图 2)。这从来没有做过, 并给了我们一个基本的愿景, 基因家庭的诱导或压抑, 通过分组, 根据他们的作用: m. 脓肿的反应, 在其养分和矿物质来源的环境有限, 到缺氧或脓肿对氧化和 nitrosative 胁迫的酸性环境和耐药性, 并最终表达脓肿在环境变形虫体内的毒力。

Figure 1
图 1: a. 脓肿在变形虫中的首次视觉屏幕.(A) 在阿米巴上进行大范围的Tn突变体筛查, 在96井板上进行随机多重感染, 快速识别减毒突变株。(B) 鉴定被减毒的Tn突变体破坏的基因。tn突变体的基因组 DNA 碎片与ciaI 克隆的Tn插入站点。m. 脓肿基因组海港2500中局 I 限制网站, 有利于获得短 DNA 片段, 但降低了克隆Tn插入点的可能性 (1/2500)。克隆被选择与卡那霉素, 抵抗熊由座子。被打乱的基因是通过测序与一个底漆内的Tn卡那霉素电阻盒 (黑色箭头)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 结核杆菌 RNA 提取的分析.(A) 在阿米巴脓肿共培养过程中, RNA 提取细胞内脓肿。阿米巴联合文化与m. 脓肿在高多样性被执行在传染 (即, 100), 在大容量, 以柔和的鼓动, 倾向细胞对细菌联络。在共同文化之后, 细胞被收获并且裂解与ß和巯基乙醇的组合。在 RNA 提取前, 细胞内含有的含裂解细菌再次被使用, 以削弱细菌细胞壁, 促进细菌机械裂解。(B) bioanalyzer 的 RNA 质量和完整性评估。给出了 rRNA 的电泳凝胶 (23S、16S 和 5S)。rRNA 必须在8以上, 才能根据生物体的需要, 进行测序和比对库的准备 (二十三年代/十六年代) 尽可能高, 理想值为2。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

m. 脓肿的行为与 RGM2的其他分枝杆菌相比, 与结核菌病等致病性通用的行为更为相似。该病致病性的关键因素是它们在抗原呈现细胞中存活甚至繁殖的能力, 如巨噬细胞和树突状体细胞。

m. 脓肿已经获得了某些基因组优势, 如其基因组14的总序列所示, 以便在真核吞噬细胞中生存。m 脓肿的基因组已经被证明是迅速发展和非常塑料, 与许多最近引入的插入序列例如 prophages 和新的基因15。虽然相比结核m.脓肿的毒力因子数据较少, m. 脓肿似乎能够迅速和积极地发展, 以增加毒力。到目前为止, 对 m.脓肿毒力的分析主要是基于 m脓肿基因组与 m., 属于同一组的分枝杆菌的比较分析, 但导致感染仅限于皮肤在人。有些基因不存在m. 龟但目前在m. 脓肿, 如磷脂酶 C, 已部分解释了脓肿后的抗吞噬功能的环境阿米巴4

与环境样品互补的变形虫共培养技术的发展表明, 结核杆菌的相互作用16,17。因此, 分枝杆菌可以从裂解物共培养阿米巴在一个水处理厂18, 和m massiliense是从病人的痰分离后, 与阿米巴共培养, 而文化本身并没有允许隔离这个分枝杆菌8。阿米巴越来越被认为是4分枝杆菌和Acanthamoebasp的孵化器。作为许多非结核分枝杆菌的天然环境宿主。变形虫加分枝杆菌共培养系统正越来越多地被建议作为简单快速的模型来描述参与分枝杆菌192021的胞内生长的因素, 22,23,24

在环境中, 分枝杆菌和阿米巴之间的相互作用是缺乏记录的。第一篇文章描述了在2014年阿米巴的分枝杆菌与该领域的联系的证据, 这项研究的重点是对25饮水网的分析。

对我们的知识, 这是第一次筛选描述在与阿米巴的共同文化。这项研究使我们能够证明环境吞噬在获取影响人类的机会主义病原体的毒力方面所起的作用。为了突出显示m. 脓肿细胞内生存所需的基因, 在m 脓肿复合体的一个亚种和一个临床菌株中, 通过转位进行了一个突变库的屏幕。这个变种人图书馆被阿米巴, 这最后被证明作为一个 "训练场" 增加脓肿的毒力在小鼠4, 相似与观察与m. 杆菌26。主要的结果是在分枝杆菌中首次发现了 ESX-4 位编码 a 型七种分泌系统的重要作用, 以及 ESX-1 位的祖先被认为对结核的毒力和细胞内生存至关重要. 分枝杆菌 microtim. marinum27,28,29,30,31

第二个目标是获取在不同的共同文化条件下表达的基因的目录, 以便更好地了解在环境中存在的共同文化中所涉及的适应性和潜在的毒力机制。专业吞噬。通过对m. 脓肿信使 rna 总序列排序的综合方法, 对这一增加的毒力进行分析, 以检测在变形虫共培养过程中诱导或压制的 rna 与 rna 转录在体外条件。这些 rna 的差异表达可以赋予 m.脓肿一个增强的 "毒力" 解释在人类上呼吸道的殖民化。在 RGM 种中, m 脓肿是非致病性表型与m 龟的例外。m. 脓肿对结核分枝杆菌产生类似病理的能力使其更加独特。许多研究报告了 m.结核的细胞内适应在巨噬细胞内的生命32,33 , 但没有一个集中在m. 脓肿适应在体内m. 脓肿对缺氧的转录反应已经被描述了34 , 突出了 mycobactins 和 dosR regulon 的作用, 如结核中所述。阿米巴和巨噬细胞内脓肿转录的分析为细胞内生命本身的细菌 adaptions 提供了一种洞察力。比较那些 transcriptomes 允许评估阿米巴的作用在触发m. abscessu的毒力在人和破译具体适应对哺乳动物吞噬细胞。有人推测, amoebal 环境可能构成m. 脓肿在转移到人类细胞之前的 "训练场", 以便描述 m. 脓肿在进化适应方面的毒力, 使这种方法原始.

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Acknowledgments

我们非常感谢公关. E.J. 鲁宾 (哈佛医学院, 美国波士顿) 为变种人图书馆的珍贵礼物, 并且马修博士 (医学学院, 英国南安普敦大学) 为原稿的更正。我们非常感谢法国病人协会的囊性纤维化 "Vaincre la Mucoviscidose" 和 "L ' 协会格雷戈里 Lemarchal" 为他们的财政支持 (RF20150501377)。我们还感谢国家研究机构 (DIMIVYR 项目 (ANR-13-BSV3-0007-01)) 和 Région 法国 (酒庄 Intérêt 不可抗力疾病 Infectieuses et Emergentes) 为博士后奖学金提供给 v. m。李涅是 "部 Enseignement 高级研究所" 的博士研究员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

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References

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