Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes

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Immunology and Infection

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Summary

Nous présentons ici deux protocoles pour étudier les interactions Phagocyte -Mycobacterium abscessus : le criblage d’un transposon mutant pour carence intracellulaire bactérienne et la détermination des bactéries intracellulaire transcriptome de l’ARN séquençage. Les deux approches offrent un aperçu des avantages génomiques et transcriptomique des adaptations améliorant l’aptitude des bactéries intracellulaires.

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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Abstract

Ce qui le différencie des autres mycobactéries saprophytes Mycobacterium abscessus , c’est la capacité à résister à la phagocytose par les macrophages humains et la capacité de se multiplier à l’intérieur de ces cellules. Ces traits de caractère de virulence rendent M. abscessus pathogène, en particulier chez les hôtes vulnérables ayant une maladie pulmonaire structurelles sous-jacentes, telles que la fibrose kystique, dilatation des bronches ou la tuberculose. Comment les patients deviennent infectées par M. abscessus reste floue. Contrairement à nombreuses mycobactéries, M. abscessus ne se trouve pas dans l’environnement, mais pourrait résident à l’intérieur des amibes, les phagocytes environnementales qui représentent un réservoir potentiel pour M. abscessus. En effet, M. abscessus est résistant à la phagocytose amibiennes et la vie intra-amibe semble augmenter M. abscessus virulence dans un modèle expérimental d’infection. Cependant, on connaît M. abscessus virulence en soi. Pour déchiffrer les gènes conférant un avantage à M. abscessus vie intracellulaire, un criblage d’un transposon M. abscessus mutant a été développé. En parallèle, il a développé une méthode d’extraction de l’ARN des mycobactéries intracellulaires après co-culture avec des amibes. Cette méthode a été validée et a permis le séquençage de l’ensemble M. abscessus transcriptomes l’intérieur des cellules ; fournir, pour la première fois, une vue globale sur M. abscessus adaptation à la vie intracellulaire. Ces deux approches nous donnent un aperçu des facteurs de virulence de M. abscessus qui permettent à M. abscessus coloniser les voies respiratoires chez l’homme.

Introduction

Le genre Mycobacterium comprend des espèces allant des organismes saprophytes inoffensifs aux principaux agents pathogènes humains. Les espèces pathogènes notoires comme Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum et Mycobacterium ulcerans appartiennent au sous-groupe de croissance lente mycobactéries (SGM). En revanche, le sous-groupe de croissance rapide mycobactéries (RGM) se caractérise par leur capacité à former des colonies visibles en moins de 7 jours, sur un milieu gélosé. Le groupe RGM comprend plus de 180 espèces, principalement des mycobactéries saprophytes non pathogène. Études sur les interactions avec leurs hôtes RGM ont principalement porté sur Mycobacterium smegmatis et démontrent que ces mycobactéries sont rapidement éliminés par l’action bactéricide des macrophages.

Mycobacterium abscessus est l’un des rare GRM qui sont pathogènes pour l’homme et est responsable d’un large éventail d’infections allant de la peau et des tissus mous pour les infections pulmonaires et disséminées. M. abscessus est considéré, avec Mycobacterium avium, d’être le principal pathogène mycobactérie dans la fibrose kystique les patients1.

Diverses études effectuées sur M. abscessus indiquent que cette mycobacterium se comporte comme un agent pathogène intracellulaire, capable de survivre la réponse bactéricide des macrophages et des fibroblastes dans les poumons et la peau, ce qui n’est pas habituellement observée dans RGM 2 , 3 , 4. analyse du génome de M. abscessus a identifié les voies métaboliques se trouves généralement dans les micro-organismes environnementaux en contact avec le sol, les plantes et les milieux aquatiques, où les amibes libres sont souvent présent5. Ils ont également démontré que M. abscessus est doté de plusieurs gènes de virulence, introuvables dans le GRM saprophyte et non pathogènes, probablement acquis par le transfert horizontal de gènes dans un créneau favorable aux échanges génétiques qui pourraient rassembler diverses bactéries résistantes amibes.

Expérimentalement, l’un des premiers résultats frappants a été l’observation d’une croissance intracellulaire de M. abscessus dans les macrophages, ainsi que pour M. tuberculosis6. M. abscessus résiste également à l’acidification du phagosome, apoptose et autophagie, trois mécanismes essentiels de la résistance cellulaire à l' infection par2. Il a même été démontré que M. abscessus est en mesure d’établir une communication immédiate entre le phagosome et le cytosol, un environnement plus riche en nutriments qui pourrait favoriser la multiplication bactérienne,2. On en sait très peu sur les avantages de génomiques qui M. abscessus possède ou a acquis afin de permettre la survie dans un environnement intracellulaire. Co-culture d’amibes est une méthode efficace qui a permis l’isolement de nombreuses bactéries résistantes amibes nouveau comme Mycobacterium massiliense7,8. Une capacité de se multiplier dans les amibes a été observée, dans un modèle d’aérosolisation de M. abscessus chez la souris, qui peuvent conférer une virulence accrue à M. abscessus4. Une hypothèse est que M. abscessus avait développé des traits génétiques rencontrées au sein de cet environnement pour survivre dans les cellules phagocytaires, qui sont distinguent des autre non pathogènes RGM. Ces acquisitions pourraient favoriser la capacité de se propager et sa virulence chez l’hôte humain.

Ce rapport décrit les outils et méthodes pour mettre en évidence les avantages génomiques conférés à M. abscessus pour survivre dans l’environnement d’amibes. À cet effet, la projection des mutants de transposon M. abscessus est tout d’abord décrit, sur la souche de type Acanthamoeba castellanii , qui permet l’identification de défectueux de mutant pour croissance intracellulaire. Une seconde projection dans les macrophages est également signalée, pour vérifier si ce défaut persiste chez l’hôte humain. Deuxièmement, pour comprendre les mécanismes qui sont mobilisés par M. abscessus pour s’adapter à la vie en phagocytaires cellules et augmentation de sa virulence chez l’animal hôte, une méthode spécifiquement adaptée pour M. abscessus a été mis au point, après la co-culture en présence d’amibes qui a permis l’extraction de l’ARN total des bactéries intra-amibiennes. En conséquence, une vue d’ensemble des gènes de M. abscessus qui sont nécessaires pour mener une vie intracellulaire a été développée.

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Protocol

1. criblage

  1. Construction de la bibliothèque de mutant de Tn
    1. Obtenir une bibliothèque transposon.
      Remarque : Pour cette expérience, une bibliothèque mutante transposon a été obtenue de E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA. La bibliothèque a été construite d’une souche lisse clinique (43 s) de M. abscessus complexes (M. abscessus subsp massiliense) avec un phagemid introduit dans M. abscessus permettant l’insertion aléatoire d’un seul Tn dans un dinucléotide TA (91 240 séquences TA dans le génome de M. abscessus ). Pour plus d’informations, consultez Référence de Rubin et al. 9 et Laencina et al. 10.
  2. Titrage de la bibliothèque et la conservation des mutants M. abscessusTn en plaques
    Remarque : Cela prend une semaine.
    1. Dégelez la bibliothèque sur la glace. Déterminer la concentration bactérienne en effectuant des dilutions sériées dans 1 mL d’eau (10-1 à 10-15). Plaque d’une goutte de chaque dilution sur une boîte de Pétri contenant le milieu gélosé 11 7H avec kanamycine 250 mg/mL. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 3 à 4 jours.
      NOTE : Ici, un titrage de 1011 bactéries/mL ont été récupérés.
    2. Après avoir déterminé la concentration de la bibliothèque, diluer la bibliothèque à une concentration finale de 3 000 bactéries/mL dans 10 mL d’eau / glycérol de 25 %. Aliquote la bibliothèque en 10 cryotubes avec 1 mL de la bibliothèque dans chaque tube. Stocker les aliquotes à-80 ° C.
    3. Lorsque vous êtes prêt à utiliser, décongeler une aliquote de la bibliothèque diluée sur la glace et ajouter 100 µL de la bibliothèque à 10 plaques de gélose Mueller-Hinton (MH) carré (dimension 12 cm) pour récupérer les colonies individuelles de 200 à 300 après 3 – 4 jours d’incubation à 37 ° C.
    4. Avec des cure-dents stériles, transfert les colonies individuelles (environ 6 000 colonies en plaques de 60 x 96 puits) en plaques de 96 puits remplis de 200 µL de 7H 9 additionné à 0,2 % de glycérol, de 1 % de glucose, de 250 mg/mL de kanamycine. Incuber à 37 ° C pendant 5 jours sans agiter.
    5. Transférer 100 µL de la culture (étape 1.2.4) dans une plaque à 96 puits contenant 100 µL de 7H 9 moyenne avec 40 % de glycérol. Stocker la bibliothèque ordonnée à-80 ° C.
    6. Répétez les étapes 1.2.3. à 1.2.5. avec le reste de la bibliothèque jusqu'à 10 000 clones individuels sont récupérés (autour de plaque 100 x 96 puits et 30 plaques MH).
  3. Préparation des amibes
    1. Amibe Acanthamoeba castellanii (AC) de la culture dans des flacons de culture de tissus 75 cm2 à la température ambiante (RT) dans 30 mL de milieu PYG (tableau 1) pour l’amplification de la cellule ligne11.
      Remarque : Les trophozoïtes matures de grandes cellules adhésives avec nombreuses vacuoles digestives sont clairement visibles sur un microscope. Le temps de doublement cellulaire est estimé à 25 h. cellules ont été amplifiés tous les 3 jours en diffusant un tiers de la culture initiale dans des flacons de culture de tissus 75 cm2 .
    2. Retirez le support PYG avec une pipette 25 mL. Laver les cellules avec 10 mL de tampon d’AC (tableau 2), qui ne contient-elle aucune des sources de carbone ou azote12. Répéter le lavage deux fois plus.
      NOTE : Tampon AC qui ne contient aucune source de carbone ou d’azote permet d’éviter la croissance extracellulaire des mycobactéries. Ce milieu minimum entraîne l’enkystement des amibes. Pour limiter cela, inactivés par la chaleur des e. coli ont été ajoutés comme substrat (étape 1.4) à amibes et temps très court de la culture ont été promus (48 h pour la mutation de dépistage) et la culture de 4 h ou 16 h pour les expériences de RNAseq. Également utiliser ce moyen de communication mais enrichi avec support PYG (habituellement 10 %).
    3. Détachez l’amibe du fond de la fiole avec un hochement vigoureux unique de la fiole de culture de tissus.
    4. Nombre de cellules avec un hémocytomètre pour ajuster la concentration en cellules à 5 x 105 amibes/mL dilué dans un tampon AC.
  4. Préparation d’inactivés par la chaleur Escherichia coli bactéries pour nourrir l’amibe après infection
    1. Cultiver la souche isolat clinique d’e. coli provenant d’un stock de glycérol dans 100 mL de Luria bouillon (LB) pendant une nuit à 37 ° C.
    2. Récolter les bactéries par centrifugation à 1 835 x g pendant 10 min en tubes de 50 mL. Jeter le surnageant. Resuspendre le culot avec 10 mL d’eau / glycérol à 10 %. Répétez le laver deux fois plus.
    3. Resuspendre le culot avec 5 mL d’eau / glycérol à 10 %. Aliquote 0,5 mL dans des tubes de 1,5 mL. Déterminer la quantité de bactéries/mL en effectuant des dilutions successives et en ajoutant des dilutions sur plaques de gélose LB. Stocker les aliquotes à-80 ° C.
    4. La veille de l’infection de l’amibe, décongeler une aliquote sur glace et passez à la chaleur-massacre en incubant le tube à 70 ° C pendant 60 min.
      Remarque : Vérifier l’inactivation par l’ensemencement de 100 µL de bactéries inactivées sur plaques de gélose LB pendant une nuit à 37 ° C. Aucune colonie ne doit être visible après une nuit de la culture.
    5. Diluer les bactéries tuées par la chaleur à une concentration de 10 bactéries de7 à 50 µL de tampon de AC et stocker les bactéries dilués à 4 ° C pour pas plus d’une semaine.
  5. Co-culture d’amibes -M. abscessus Tn mutant : tout d’abord l’écran
    Remarque : Cela prend 3-4 mois pour le dépistage de 6 000 mutants.
    1. Propagation de 5 x 104 amibes/puits d’une plaque à 96 puits dans 100 µL de tampon de l’AC. Incuber pendant 1 h à 32 ° C sans agitation. Laisser le temps de trophozoïtes amibe flottant d’adhérer aux puits.
      1. Pendant l’incubation, décongelez les bactéries sur la glace pendant 1 h.
    2. Ajouter 5 µL des cultures de bactéries dégelés avec une pipette multicanaux électronique. Infecter de 1,5 h. écran autour de 6 000 clones individualisées de la plaque à 96 puits stock mutants Tn .
      Remarque : Le MOI est inconnu à cette étape du protocole ; Cependant, toutes les plaques de 96 puits contenant des mutants de Tn ont été cultivés en exactement de la même manière. Ce premier écran a pour but d’identifier rapidement des mutants déficients intracellulaires, sans prendre en compte les variations de densité de l’inoculum.
    3. Après les 1,5 h d’infection, il faut inverser la plaque à 96 puits sur des gazes stériles placés dans un bac stérilisé en métal pour enlever le milieu de AC sous une hotte aspirante. Remplissage avec 200 µL de milieu de AC. Répétez ce laver deux fois plus.
    4. Ajouter 200 µL de milieu frais additionné de 100 µg/mL amikacine à éliminer d’autres mycobactéries extracellulaires.
    5. Incuber pendant 2 h avant de procéder à 3 lavages supplémentaires (comme indiqué au point 1.5.3). Après lavage, préserver les cultures avec 50 µg/mL amikacine dans 200 µL de tampon de l’AC.
    6. Ajouter des bactéries Escherichia coli 5 x 107 inactivés par la chaleur (de l’étape 1.4) à la fin de l’infection et toutes les 24 h pour empêcher l’enkystement des amibes.
    7. Après 48 h de culture mixte, lyser les cellules en ajoutant 10 µL de 10 % SDS (sodium dodécyl sulfate) dans chaque puits et incuber 30 min à 32 ° C. Procéder à la dilution en série et ajouter sur plaques de gélose Columbia contenant 5 % sang de mouton (plaques de COS) afin d’évaluer le nombre de mycobactéries intracellulaires. Sceller la plaque avec du parafilm et incuber à 37 ° C.
    8. Quand les colonies apparaissent sur les plaques de gélose après 3-4 jours, photo de la plaque et identifient les mutants avec facultés affaiblies pour croissance intracellulaire en observant les dépôts avec le plus petit nombre de colonies bactériennes.
      Remarque : Ne me dérange pas sur la forme, la hauteur ou la densité de la colonie (Figure 1A). 136/6000 mutants ont été identifiés.
  6. Co-culture d’amibes -M. abscessusTn mutant : deuxième écran des mutants identifiés dans le premier écran
    Remarque : Cela prend 2 semaines. Un deuxième écran doit être effectué avec les mutants atténués 136 obtenus après le premier écran de quantifier avec précision le nombre des bactéries inoculées et le nombre de survie intracellulaire bactéries 2 jours après l’infection.
    1. Cultivé 1 colonie chaque mutant impact dans 50 mL de tubes remplis de 20 mL de 7H 9 additionné à 0,2 % de glycérol, de 1 % de glucose et de 250 mg/mL de kanamycine. Permettent aux bactéries d’atteindre la phase exponentielle (0,6 < OD < 0,8).
    2. Laver la culture par centrifugation (1 835 x g pendant 10 min) dans le milieu de l’AC. Jeter le surnageant. Répéter cela laver deux fois plus avec 20 mL de 7H 9 additionné à 0,2 % de glycérol, de 1 % de glucose et de 250 mg/mL de kanamycine.
    3. Remettre en suspension les bactéries dans 5 mL de tampon d’AC.
    4. Déterminer la colonie formant (colonies UFC) d’unité de concentration des mutants. En plaques 24 puits, ajouter 1 mL d’eau dans les deux premières rangées. Ajouter 100 µL de la suspension bactérienne dans le premier puits. Avec une micropipette, mélanger trois fois. Ensuite, aspirez bien 100 µL et dépôt à la seconde.
    5. Avec une nouvelle astuce, répétez l’étape 1.6.4 du deuxième puits à la troisième, etc. jusqu'à la douzième bien.
    6. Aspirer 30 µL de la dilution 10-12 et l’ajouter à une plaque de COS. Répétez pour les autres dilutions.
    7. Enrouler la plaque COS avec parafilm et incuber pendant 3 à 4 jours à 37 ° C. Déterminer la concentration par comptage des colonies.
    8. Effectuer des essais de culture mixte tel que décrit ci-dessus en trois exemplaires, une plaque 24 puits avec 5 x 104 amibe / puits dans 1 mL de milieu de culture Co d’AC. Ensemencer avec une multiplicité d’infection (MOI) de 10.
    9. Après 48 h de culture mixte, vous devez procéder à la lyse cellulaire comme indiqué au point 1.5.7. Effectuer des dilutions successives dans l’eau (10-1 à 10-6) et ajouter 30 µL dans les plaques de COS. Incuber les boîtes pendant 4 jours à 37 ° C avant de procéder au comptage d’UFC.
      Remarque : Après ce deuxième écran, 60 de 136 mutants ont été conservés.
    10. Stocker les mutants affectés pour leur survie à l’intérieur des cellules. Ajouter une colonie à un cryotube contenant un milieu LB avec glycérol (final de 20 %) ou dans un cryotube contenant la solution commerciale et microbilles pour favoriser une conservation à long terme et faciliter les future inoculation et ensuite stocker à-80 ° C.
    11. Évaluer la croissance mutante in vitro en mesurant la densité optique (do) à 600 nm tous les 2 jours.
      1. Grow 1 colonie de chaque mutant impact en tubes de 50 mL rempli de 20 mL de 7H 9 additionné à 0,2 % de glycérol, de 1 % de glucose et de 250 mg/mL de kanamycine. Permettent aux bactéries d’atteindre la phase exponentielle (0,6 < OD < 0,8) avant de régler le diamètre extérieur à 0,01 pour commencer la cinétique.
      2. Exclure les mutants ayant un in vitro la croissance défaut en comparaison avec la souche WT parmi l’ensemble des mutants déficients intracellulaires.
  7. Co-culture de macrophages -M. abscessus Tn mutant défectueux pour mener une vie intra-amibe
    Remarque : Cela prend 1 mois.
    1. Étaler les macrophages murins de J774.24 5 x 10 / puits d’une plaque 24 puits dans 1 mL de milieu riche, DMEM supplémenté de 10 % de sérum de veau foetal (FCS). Incuber les boîtes pendant 24 h à 37 ° C et 5 % de CO2 pour permettre l’adhérence de macrophages. Fournir 3 répétitions.
    2. Effectuer l’infection. Inoculer des mutants de Tn , avec un MOI de 10, dilué dans du DMEM avec 10 % de FCS dans un volume de 100 µL.
    3. Après 3 h d’infection, effectuer trois lavages avec 1 mL de DMEM (une pompe à vide peut être utilisée). Puis les traiter avec 250 µg/mL amikacine (en DMEM avec 10 % FCS) pendant 1 h à éliminer d’autres mycobactéries extracellulaires.
      1. Après que 3 autres lavages avec 1 mL de DMEM, maintenir les cultures dans 250 µg/mL amikacine (en DMEM avec 10 % FCS) pour un volume final de 1 mL à empêcher la multiplication mycobactérienne extracellulaire.
    4. 72 h après la co-culture, retirez le support et lyser les macrophages en ajoutant 1 mL d’eau froide. Incuber 30 min à 4 ° C.
    5. Effectuer des essais d’UFC sur plaques de COS pour évaluer le nombre de bactéries intracellulaires.
      1. Dans une plaque 24 puits, ajouter 1 mL d’eau dans les deux premières rangées. Ajouter 100 µL de la cellule co lysate dans le premier puits. Avec une micropipette, mélanger trois fois. Aspirer 100 µL et déposez-les dans le second bien.
      2. Avec une nouvelle astuce, répétez la dilution du deuxième puits à la troisième, etc. jusqu'à la douzième bien. Puis aspirer 30 µL de la dilution 10-12 et l’ajouter à une plaque de COS.
      3. Répétez pour les autres dilutions. Enrouler la plaque COS avec parafilm et attendre 3-4 jours pour observer et compter les colonies.
  8. Identification et séquençage du site d’insertion de l' AMT chez M. abscessus mutants
    Remarque : Cela prend 1,5 mois pour 60 mutants.
    1. Extraction génomique de l’identifié M. abscessus mutants
      1. Cultiver les mutants dans un tube de 50 mL avec 20 mL de 7H 9 milieu additionné de 0,2 % de glycérol, de 1 % de glucose et de kanamycine 250 mg/mL de la phase exponentielle (OD600= 0,8).
      2. Récolte 10 mL des cultures (2 396 x g, 5 min). Jeter le surnageant. Suspendre les bactéries dans 500 µL de solution j’ai (25 % de sucrose, 50 mM Tris pH 8, lysozyme de 10 mg/mL, thiourée 40 mM). Transvaser la solution dans les tubes de 2 mL avec bouchon à vis et incuber pendant 2 h à 37 ° C.
      3. Ajouter 500 µL de solution II (25 % de sucrose, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA). Après avoir effectué vers le haut et vers le bas 5 - 10 fois, ajouter des perles de zirconium jusqu'à un volume de 500 µL dans le tube.
      4. Procéder à la lyse des cellules avec un homogénéisateur (3 x 6 000 tr/min, 45 s) avec une incubation de 1 min sur glace entre chaque tour.
      5. Ajouter 5 µL de 20 mg/mL de protéinase K (final de 100 µg/mL) et incuber les échantillons durant la nuit à 55 ° C.
      6. Ajouter 1 mL de froid de phénol/chloroforme/isoamylique alcool (25:24:1) sous une hotte aspirante. Mélanger les échantillons au vortex avant de procéder à une centrifugation à RT et 16 500 g pendant 30 min.
      7. Après centrifugation, récupérer la phase aqueuse et ajouter un volume égal de solution froide phénol/chloroforme/isoamylique Alcool sous une hotte. Centrifuger les échantillons à 16 500 g pendant 30 min récupérer la phase aqueuse à nouveau.
      8. Ajouter 0,7 volume d’isopropanol RT à la phase aqueuse Récupérée sous une hotte aspirante. Inverser lentement les tubes pour permettre la précipitation de l’ADN et incuber 5 min à température ambiante. Puis centrifuger pendant 10 min à x 16 500 g et RT.
      9. Retirez le surnageant et laver le culot avec 500 µL d’éthanol à 70 % sous une hotte. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 16 500 x g à RT avant d’enlever l’éthanol. Incuber pendant 10 min permettre l’évaporation de l’alcool restant.
      10. Enfin, suspendre le granule d’ADN dans 100 µL d’eau libre de DNase/RNase. Déterminer le rendement et la pureté de l’ADN avec un spectrophotomètre.
      11. Retirer 1 µg d’ADN génomique et de digérer avec 10 U de ClaI pour une nuit pour clonage partiel du site d’insertion de Tn . Utilisez le protocole du fabricant.
        Remarque : La Claj’ai enzyme est l’une des enzymes de restriction plus fortement représentées dans le génome d’abscessus M. (2 173 sites de restriction). Une Claje site de restriction se retrouve également dans la séquence de Tn en amont de la cassette de résistance kanamycine du mutant Tn. Le Clamédiation j’ai subcloning permet ainsi, d’identifier le site d’insertion de Tn.
    2. Sous clonage dans un plasmide d’ADN génomique contenant l’AMT
      Remarque : Avant de procéder avec les Tn-subcloning dans le plasmide résistant à l’ampicilline 2 686 de bp sur les pUC19, ajouter un Claje site de restriction dans le site multiple de clonage du plasmide. La séquence du plasmide pUC19 peut être trouvée à ce lien https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Fabricant de suivi du protocole à digérer le plasmide pUC19 avec EcoRI et HindIII, qui libère un fragment de 51 bp et un fragment de 2635 BP. purifient le double vecteur digéré avec un kit de purification PCR commercial afin d’éliminer les 51 bp publié le fragment.
      2. Mélanger 1 µL (concentration 25 pmol/µL) de deux oligonucléotides complémentaires (5 'AGTC TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3 » et 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3 ») de 28 bp contenant chacune la Claje site de restriction et aux extrémités du HindIII et CRECO J’ai des sites de restriction. Chauffer à 100 ° C pendant 10 min et puis refroidir afin de les lier.
      3. Digérer les amorces appariés par EcoRI et HindIII selon le protocole du fabricant.
      4. Ligaturer 150 ng d’EcoRI /HindIII restrictions pUC19 plasmide avec concentration différente des amorces appariés (50 pmol/µL, 25 pmol/µL, 2,5 pmol/µL) pendant 1 h à RT avec 1 U de T4 DNA ligase, dans un volume final de 20 µL. vérifier le clonage par un autre digestion enzymatique.
      5. Digérer le plasmide modifié avec Claj’ai pendant 2 h à 37 ° C.
      6. Ligaturer 50 ng de Claj’ai restreint pUC19plasmide et 50 ng d’ADN génomique digéré par Claj’ai pendant 1 h à RT avec 1 U de T4 DNA ligase, dans 10 µL.
      7. Passez à e. coli electrocompetent transformation de bactéries avec 5 à 10 µL de la ligature (2500 V, 200 Ohms, 25 µF). Sélectionnez les clones sur plaques de gélose LB additionnés de 50 µg/mL kanamycine et 50 ampicilline µg/mL pour sélectionner les bactéries portant des plasmides avec des portions de séquences de l’AMT.
      8. Poussent des clones résistants pendant la nuit dans le milieu liquid LB avec la sélection antibiotique approprié (50 µg/mL kanamycine et 50 ampicilline µg/mL).
      9. Extraire l’ADN de plasmide. Vérifier la présence de l’insert par restriction enzymatique et l’extrémité 3' de l' AMT pour identifier le gène perturbé avec un oligonucléotide (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') correspondant aux dernière 17 paires de bases de la kanamycine Tn de séquence cassette de résistance.
      10. Aligner la séquence contre la souche d’aller 06 M. abscessus en effectuant un souffle de nucléotides (BLAST-N).

2. ARN Extraction des mycobactéries intracellulaires pour l’analyse de Rnaseq

Remarque : Cela prend 4 mois pour des expériences et 4 mois pour l’analyse de RNAseq.

  1. Co-culture d’amibes-M. abscessus en lots
    Remarque : Dans l’expérience suivante, co-culture est réalisée en tubes de 50 mL avec agitation à favoriser les bactéries aux contacts de la cellule.
    1. Poussent M. abscessus en 7 H 9 additionné de 0,2 % de glycérol, 1 % de glucose à la phase moyenne exponentielle à 120 tr/min.
    2. Laver les bactéries deux fois avec 10 mL de tampon d’AC.
    3. Estimation de la concentration de bactéries en mesurant l' OD600nm (1 OD600= 4 x 108 mycobactéries). Ajouter 8,5 x 108 mycobactéries à 8,5 x 106 amibes dans 10 mL de milieu de AC.
    4. Incuber pendant 1 heure à 30 ° C avec agitation modérée (environ 80 tr/min).
    5. Récolter les cellules par centrifugation à 253 x g pendant 12 min. Retirer le surnageant et suspendre les cellules dans 10 mL de tampon d’AC. Répétez ce laver deux fois plus.
    6. Remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon AC contenant 50 µg/mL amikacine pour éliminer les bactéries extracellulaires et incuber pendant 4 heures à 30 ° C avec agitation modérée (80 tr/min). Laver les cellules deux fois encore.
  2. Extraction d’ARN total d’intracellulaire M. abscessus
    Remarque : Effectuez les étapes 2.2.1–2.2.3 sous la hotte en raison de l’utilisation de réactifs toxiques.
    1. Après le lavage final, remettre en suspension les amibes infectées dans 4 mL de la solution froide III (tableau 3) extemporanément 280 µl de β-mercaptoéthanol pour perturber les amibes. Il s’agit de l’étape de thiocyanate (GTC) de guanidinium. Maintenir la suspension sur la glace pendant 10 min. Centrifuger la cellule lysat pendant 30 min à 2 396 x g et 4 ° C pour la bactérie intracellulaire libérée de granule.
    2. Retirez le surnageant et le culot bactérien de suspendre dans 1 mL de la solution froide III. Récolter les bactéries à 2396 x g pendant 30 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon d’extraction et transvaser dans un tube à vis 2 mL contenant des billes de zirconium (jusqu'à la gradation de 500 µL du tube). Stocker les tubes pendant au moins 24 h à-80 ° C.
      Remarque : Stockage dans le réactif de lyse permet l’inactivation des ribonucléases et cellule de dissolution.
    3. Lorsque vous êtes prêt à utiliser, décongeler les échantillons sur la glace et leur lyse avec un homogénéisateur en effectuant deux tours à 6 000 tr/min pour 25 s, suivie d’un tour à 6 000 tr/min pendant 20 s avec une incubation de 1 min sur glace entre chaque tour.
    4. Pour refroidir l’échantillon, les incuber sur glace pendant 10 min. Puis ajouter 200 µL de chloroforme dilué dans de l’alcool isoamylique. Après agitation, les échantillons pendant 1 min, centrifuger pendant 15 min à 16 500 x g et 4 ° C.
    5. Ajouter 0,8 mL d’isopropanol froid dans la phase aqueuse et incuber les échantillons pendant 2 – 3 h à 20 ° C. Centrifuger les échantillons pendant 35 min à 16 500 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant.
    6. Laver le culot de RNA en ajoutant 500 µL d’éthanol 70 % froid (ne pas mélanger).
    7. Centrifuger les échantillons à 16 500 x g pendant 10 min éliminer l’éthanol. Aspirer la solution et les sécher dans un concentrateur centrifuge.
    8. Une fois sec, remettre en suspension les pellets dans 100 µL d’eau libre de DNase/RNase.
      Remarque : Les échantillons doivent être traitées deux fois avec DNase pour éliminer les contaminants d’ADN selon les recommandations du fabricant.
    9. Évaluer l’intégrité de RNA sur gel d’agarose et confirmer en mesurant le nombre de l’intégrité du RNA (RIN) et le ratio ribosomique avec une méthode axée sur la puce l’électrophorèse capillaire.
      Remarque : Le RIN tienne compte de l’ensemble trace électrophorétique. Le RIN algorithme logiciel permet la classification de l’ARN total, basé sur un système de numérotation de 1 à 10, 1 étant le profil plus dégradé et 10 étant le plus intact. Pour procéder à la préparation de bibliothèque de cDNA, le RIN doit être sur 8 et le ratio ribosomique [28 s/18 s] aussi haut que possible, la valeur idéale étant de 2, en fonction de l’organisme et de ses spécificités.
    10. Stocker les échantillons d’ARN à-80 ° C jusqu'à ce que la préparation de l’ADNc de séquençage.
  3. Préparation de la Banque d’ADNc
    1. Pour procéder à la préparation de la bibliothèque, utiliser un kit de synthèse de cDNA disponibles dans le commerce (Table des matières) à l’aide du protocole par le fabricant.
    2. Consultez la bibliothèque pour la concentration et la qualité sur une puce à ADN.
      Remarque : Les quantification plus précise et exacte peut être effectuée avec des essais de quantification de base fluorescentes sensibles.
  4. Séquençage de bibliothèque
    1. Normaliser les échantillons à 2 nM et procéder au multiplexage selon l’organisation de cellules d’écoulement.
    2. Dénaturer les échantillons à une concentration de 1 nM à l’aide de NaOH 0,1 N pendant 5 min à température ambiante.
    3. Diluer les échantillons à 22:00. Chargez chaque échantillon sur la cellule de flux à 22:00.
    4. Procéder au séquençage d’un système de séquençage haut-débit qui permet de génomique à grande échelle. Ici la manche a été une course SRM (SR : lecture seule, PE : jumelé-fin lectures, M: multiplexés échantillons) de 51 cycles avec 7 bases index lire.
    5. Évaluer la qualité de l’enchaînement avec l' externe du programme FastQC13.
    6. Après le parage des séquences de l’adaptateur, procéder à des alignements lecture contre un génome de référence. Aligner contre le génome des cellules eucaryotes pour évaluer la contamination des échantillons et, si nécessaire, procéder à la compensation des lectures de non bactérienne.
  5. Analyse statistique
    1. Utiliser plusieurs logiciels disponibles en ligne pour définir des ensembles de gènes différentiellement exprimés : logiciel R, Bioconductor paquets DESeq2 et la trousse de PF2tools (version 1.2.12) mis au point à la plate-forme « Transcriptome et Epigénome » (Pasteur Institut, Paris).

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Representative Results

M. abscessus a la capacité de résister et de s’échapper des réponses bactéricides des macrophages et environnementales protozoaires comme les amibes. M. abscessus exprime des facteurs de virulence lorsqu’il est cultivé au contact des amibes, qui le rend plus virulent en souris4. Le premier objectif de ces méthodes a été d’identifier les gènes présents dans M. abscessus permettant sa survie et la multiplication dans les amibes.

Pour ce faire, un mutant de M. abscessus subsp massiliense, obtenue par Tn livraison9, a été criblée suite co-culture en présence d’amibes, d’identifier des mutants avec croissance atténuée dans ce intracellulaire environnement (Figure 1). Le comportement des mutants mêmes a également été évalué suivant la co-culture avec des macrophages pour analyser si cet affaiblissement de la croissance a été préservée dans les macrophages de souris.

Cette bibliothèque de transposon aveugle dépistage approche, a confirmé un phénotype de réplication défectueuse pour 47 de 6 000 mutants qui avaient un taux de survie de 50 % ou moins dans les amibes et/ou macrophages, par rapport au contrôle10. Afin d’exclure les mutants atténuée survie intracellulaire qui pourrait être due à un défaut de croissance intrinsèque de la mycobacterium, la croissance, courbes de toutes les Tn mutants ont été évalués dans un milieu de culture liquide enrichi en vitro (1 % glucose - 7 H 9). In vitro la croissance de tous les mutants a été suivie par la suite OD600 des cultures tous les 2 jours. Les différents mutants qui affiche un défaut la croissance in vitro par rapport à la souche sauvage correspondante ont été exclus de l’étude.

C’est d’une importance vitale pour ce test aveugle à reproduire chaque jour en utilisant exactement le même protocole. La limitation de cette technique était à la première projection visuelle, photographies ont été prises de chaque UFC pour fournir une image précise de renvoi. Dans ce groupe de mutants, 12 M. abscessus mutants (doublons inclus) ont été identifiés dans lequel le transposon a été inséré dans les gènes appartenant au locus du type système de sécrétion de VII qui souligne son importance dans l’intracellulaire ESX-4 croissance de M. abscessus10.

Jusqu'à présent, l’analyse de M. abscessus virulence a essentiellement reposé sur l’analyse comparée du génome de M. abscessus avec celle de M. chelonae, une mycobactérie appartenant au même groupe, mais provoquant des infections seulement de la peau chez l’homme. L’objectif était d’obtenir un catalogue des gènes exprimés dans des conditions différentes de culture mixte afin de mieux comprendre les mécanismes de virulence impliqués au cours de la co-culture en présence de l’environnement professionnel adaptation et potentiellement phagocytes. Analyse de cette virulence accrue grâce à une approche globale des ARN messagers séquençage total M. abscessus, a été effectuée afin de détecter l’ARN induit ou réprimée au cours de l’amibe co-cultures par rapport à l’ARN transcrit sous in vitro les conditions. L’expression différentielle de ces ARN peut conférer à M. abscessus une renforcée « virulence » expliquant la colonisation des voies respiratoires supérieures chez l’homme.

Ces cultures co ont été effectuées à nouveau dans un milieu minimal (aucune source de carbone ou d’azote) comme décrit ci-dessus, afin d’empêcher la croissance extracellulaire de M. abscessus et représentatives des conditions ambiantes rencontrées par ces mycobactéries et sous la pression de sélection d’un antibiotique pendant toute la durée de culture mixte pour sélectionner les mycobactéries intracellulaires.

Par conséquent, il a développé une technique pour isoler l’ARN de mycobactéries intracellulaires. La difficulté principale de cette extraction d’ARN mycobactérienne était évitant la contamination avec de l’ARN amibiennes (type eucaryote). Pour éviter cela, la lyse des amibes a été effectuée à des moments différents post culture mixte, à l’aide de guanidinium thiocyanate (GTC) ; étant donné que les mycobactéries intracellulaires sont résistants. Après cette étape, une extraction mécanique du RNAs mycobactérienne a été réalisée à l’aide d’une cellule-homogénéisateur en présence de billes de zirconium. Cette technique nous a permis d’obtenir des mycobactéries RNA de bonne qualité, avec un nombre RIN de haute qualité, indispensable pour améliorer la capacité de réaliser une analyse complète de la transcriptome M. abscessus , utilisant le séquençage de l’ARN messager (ARNm) variante (Figure 2). Cela n’a jamais été fait auparavant et nous a donné une vision fondamentale des familles de gènes induits ou réprimés, en les groupant selon leur rôle : la réponse de M. abscessus à un environnement limité dans sa source de nutriments et de minéraux, d’une hypoxie ou milieu acide et la résistance de M. abscessus à oxydatif et effort nitrosative et enfin l’expression de la virulence de M. abscessus dans environnement amibe.

Figure 1
Figure 1 : A. premier écran visuel de M. abscessus Tn mutants chez amoeba. Écran à grande échelle (A) des mutants Tn sur des amibes est réalisée en plaques de 96 puits avec une multiplicité aléatoire d’infection d’identifier rapidement les mutants atténués. (B) Identification des mutants atténués Tn perturbé des gènes. L’ADN génomique des AMT mutants est fragmentée et Claj’ai cloner le site d’insertion de l’AMT . M. abscessus génomes recèle 2500 Claj’ai des sites de restriction qui favorise l’obtention de l’ADN courte des fragments, mais réduit la probabilité de cloner le site d’insertion de Tn (1/2500). Les clones sont sélectionnés avec la kanamycine, ours de résistance par le transposon. Le gène perturbé est identifié par l’ordonnancement avec un apprêt à l’intérieur de la cassette de résistance Tn kanamycine (flèche noire). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse de l’extraction de l’ARN mycobactérienne. (A) RNA extraction d’intracellulaire M. abscessus lors amibes -M. abscessus co-culture. Les amibes co-cultures avec M. abscessus sont effectuées à une multiplicité élevée d’infection (c'est-à-dire, 100), en grandes quantités, en agitant doucement, à favoriser les cellules aux contacts de bactéries. Après co-cultures, les cellules sont récoltées et lysées avec une combinaison de GTC et β-mercaptoéthanol. Les bactéries de contenant du lysat cellulaire est traitée avec GTC pour affaiblir la paroi cellulaire de bactéries pour faciliter la lyse mécanique bactéries avant l’extraction de l’ARN. (B) RNA évaluation qualité et intégrité avec un bioanalyzer. Un gel d’électrophorèse est donné sur lequel les ARNr est observée (23 s, 16 s et 5 s). RIN doit être supérieur à 8 de procéder à la préparation de la bibliothèque de rapports de séquençage et ARNr (23 s/16 s) aussi hautes que possible en fonction de l’organisme, la valeur idéale étant de 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le comportement de M. abscessus est beaucoup plus semblable au comportement de SGM pathogène tels que M. tuberculosis que n’importe quel autres mycobactéries appartenance à RGM2. L’élément clé de la pathogénicité du SGM est leur capacité à survivre ou même multiplier au sein des cellules présentatrices d’antigène, tels que les macrophages et les cellules dendritiques.

M. abscessus a acquis certains avantages génomiques, comme en témoigne la séquence totale de son génome14 pour survivre au sein d’une cellule eucaryote phagocytaire. Le génome de M. abscessus s’est avéré être en évolution rapide et très plastique, avec de nombreux récemment introduit des séquences d’insertion comme les prophages et nouveaux gènes15. Bien qu’il y a moins de données sur la virulence facteurs M. abscessus comparée à M. tuberculosis, M. abscessus semble être en mesure d’évoluer rapidement et activement vers une virulence accrue. Jusqu'à présent, l’analyse de M. abscessus virulence était essentiellement fondée sur l’analyse comparée du génome de M. abscessus avec celle de M. chelonae, une mycobactérie appartenant au même groupe, mais provoquant des infections limitées à la peau chez l’homme. Certains gènes pas présenter à M. chelonae mais présents dans M. abscessus, tels que de la phospholipase C, ont partiellement expliquer la résistance de M. abscessus après la phagocytose par amibes environnement4.

Le développement d’une technique de culture mixte d’amibe additionné d’échantillons environnementaux a démontré sans ambiguïté amibe-mycobactériens interactions16,17. Ainsi, les mycobactéries pouvaient être isolées des lysats co cultivés en présence d’amibes dans un usine de traitement eau18, et M. massiliense a été isolé dans les expectorations du patient après co-culture avec des amibes, tandis que la culture seule n’a pas permettre l’isolement de cette mycobactérie8. Les amibes sont plus en plus considérées comme un incubateur pour les mycobactéries4 et Acanthamoebasp. comme un hôte naturel environnement de nombreuses mycobactéries non tuberculeuses. Amibe et mycobactéries co-culture systèmes sont plus en plus présentés comme des modèles simples et rapides pour caractériser les facteurs impliqués dans la croissance intracellulaire des mycobactéries19,20,21, 22,23,24.

Dans l’environnement, l’interaction entre les mycobactéries et les amibes est peu documentée. Le premier article décrivant la preuve d’un lien entre les mycobactéries et les amibes dans le domaine est sorti en 2014, et cette étude a porté sur l’analyse d’une eau potable réseau25.

À notre connaissance, il s’agit de la première projection décrite au cours d’une co-culture avec des amibes. Cette étude nous a permis de démontrer le rôle joué par les phagocytes environnementales dans le cadre de l’acquisition de la virulence d’un pathogène opportuniste qui affectent les humains. Afin de mettre en évidence les gènes nécessaires à la survie intracellulaire de M. abscessus, un écran d’une bibliothèque de mutant de transposition a été réalisé dans une sous-espèce de M. abscessus complexes et dans une souche clinique. Ce mutant a été criblée avec amibes, cette dernière ayant été démontrée comme un « terrain d’entraînement » pour accroître la virulence de M. abscessus en souris4, similaire à celui observé avec M. avium26. Le résultat majeur a été la découverte pour la première fois chez les mycobactéries du rôle essentiel du locus codant pour un système de sécrétion type VII et ancêtre du locus ESX-1 considéré comme essentiel pour la virulence et la survie intracellulaire de M. tuberculosis ESX-4 Mycobacterium microti et M. marinum27,28,29,30,31.

Le second objectif était d’obtenir un catalogue des gènes exprimés dans des conditions différentes de culture mixte afin de mieux comprendre l’adaptation et les mécanismes de virulence potentiels impliqués au cours de la co-culture en présence environnementale phagocytes professionnels. Analyse de cette virulence accrue grâce à une approche globale du séquençage total des ARN messagers M. abscessus, a été effectuée afin de détecter l’ARN induit ou réprimée au cours de l’amibe co-cultures par rapport à l’ARN transcrit sous in vitro les conditions. L’expression différentielle de ces ARN peut conférer à M. abscessus une renforcée « virulence » expliquant la colonisation des voies respiratoires supérieures chez l’homme. Parmi les espèces RGM, M. abscessus est une exception au phénotype non pathogènes ainsi que M. chelonae. La capacité de M. abscessus à provoquer des pathologies similaires à mycobactéries tuberculeuses rend encore plus unique. De nombreuses études ont signalé les adaptations intracellulaires de M. tuberculosis à vie à l’intérieur de macrophages32,33 , mais aucun n’ont porté sur M. abscessus adaptations in vivo. Réponse transcriptionnelle de M. abscessus à l’hypoxie a été décrit34 , mettant en évidence le rôle de mycobactins et le régulon dosR comme décrit chez M. tuberculosis. Analyse du transcriptome de M. abscessus à l’intérieur des amibes et les macrophages donne un aperçu sur les adaptations bactériennes à vie intracellulaire en soi. Une comparaison de ces transcriptomes permet l’évaluation du rôle des amibes dans le déclenchement de virulence de s M. abscessuchez l’homme et pour le déchiffrage des adaptations spécifiques aux cellules phagocytaires de mammifères. Une supposition a été faite que l’environnement amibiennes peut-être constituer un « terrain d’entraînement » pour M. abscessus avant transfert aux cellules humaines, afin de décrire la virulence abscessus M. en termes d’adaptation évolutive, rend cette approche originale .

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Acknowledgements

Nous reconnaissons grandement PR. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) pour le don précieux du mutant Bibliothèque et le Dr Ben Marshall (Faculté de médecine, Université de Southampton, Royaume-Uni) pour les corrections du manuscrit. Nous reconnaissons grandement l’Association de patients Français pour la fibrose kystique « Vaincre la Mucoviscidose » et « L'Association Gregory Lemarchal » pour leur soutien financier (RF20150501377). Nous remercions également l’Office National de la recherche (programme ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) et la Région Ile-de-France (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) pour le financement de la bourse de recherche postdoctorale pour V.L-M. L. L. est un doctorant de le « Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche ».

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

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References

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