Sintesi, caratterizzazione e applicazione di nanosondanti di ossido di ferro superparamagnetico per il rilevamento della tubercolosi extrapolmonare

Medicine

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Summary

Per migliorare i test diagnostici sierologici per gli antigeni della tubercolosi Mycobacterium, abbiamo sviluppato nanosondie di ossido di ferro superparamagnetico per rilevare la tubercolosi extrapolmonare.

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Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

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Abstract

Una sonda di imaging molecolare composta da nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIO) e anticorpo superficiale Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) è stata sintetizzata per migliorare la sensibilità all'imaging per la tubercolosi extrapolmonare (ETB). Un nanosonda SPIO è stato sintetizzato e coniugato con MtbsAb. La nanosonda SPIO-MtbsAb purificata è stata caratterizzata utilizzando TEM e NMR. Per determinare la capacità di targeting della sonda, le nanosonda SPIO-MtbsAb sono state incubate con Mtb per analisi di imaging in vitro e iniettate nei topi inoculati da Mtb per l'indagine in vivo con risonanza magnetica (MR). La riduzione del miglioramento del contrasto sulla risonanza magnetica (MRI) delle cellule Mtb e THP1 ha mostrato proporzionale alla concentrazione di nanosonda SPIO-MtbsAb. Dopo 30 minuti di iniezione di nanosonda SPIO-MtbsAb per via endovenosa in topi infettati da Mtb, l'intensità del segnale del sito di granulomatous è stata migliorata di 14 volte nelle immagini MR ponderate T2 rispetto a quella dei topi che ricevono l'iniezione PBS. Le nanosonda MtbsAb possono essere utilizzate come nuova modalità per il rilevamento ETB.

Introduction

A livello globale, la tubercolosi extrapolmonare (ETB) rappresenta una percentuale significativa di casi di tubercolosi (TB). Tuttavia, la diagnosi di ETB è spesso mancata o ritardata a causa della sua presentazione clinica insidiosa e delle scarse prestazioni sui test diagnostici; I falsi risultati includono squali esatti negativi per bacilli acido-veloce, mancanza di tessuto granulomatoso sulla istopatologia, o fallimento della cultura Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Rispetto ai casi tipici, ETB si verifica meno frequentemente e comporta poca liberazione del Bacilli Mtb. Inoltre, di solito è localizzato in siti di difficile accesso, come linfonodi, pleura e aree osteoarticolari1. Pertanto, le procedure invasive per l'ottenimento di adeguati campioni clinici, che rendono la conferma batteriologica rischiosa e difficile, sono essenziali2,3,4.

I test di rilevamento degli anticorpi disponibili in commercio per l'ETB sono inaffidabili per il rilevamento clinico a causa della loro vasta gamma di sensibilità (0,00-1,00) e della specificità (0,59-1,00) per tutti i siti extrapolmonari combinati5. I saggi dell'immunospot indicizzato all'enzima (ELISPOT) per l'interferone-z, la proteina filtrante della coltura (CFP) e il bersaglio antigenico venoso precoce (ESAT) sono stati utilizzati per diagnosticare la tubercolosi e latb attiva. Tuttavia, i risultati variano tra diversi siti di malattia per la diagnosi di ETB6,7,8. Inoltre, la PPD cutanea (derivata della proteina purificata) e QuantiFERON-TB hanno spesso fornito risultati falsi negativi9. QuantiFERON-TB-2G è un saggio di reattività immunitaria del sangue intero, che non richiede un campione dall'organo interessato e questo può essere uno strumento diagnostico alternativo6,10,11. Altri metodi diagnostici tipicamente utilizzati per la meningite da TB, come la reazione a catena della polimerasi, sono ancora troppo insensibili per escludere con fiducia la diagnosi clinica12,13. Questi test convenzionali dimostrano informazioni diagnostiche insufficienti per scoprire il sito di infezione extrapolmonare. Pertanto, sono richieste clinicamente nuove modalità diagnostiche.

L'imaging molecolare mira a progettare nuovi strumenti in grado di vagliare direttamente specifici obiettivi molecolari dei processi di malattia in vivo14,15. L'ossido di ferro superparamagnetico (SPIO), un agente di contrasto NMR ponderato T2, può migliorare significativamente la specificità e la sensibilità dell'imaging a risonanza magnetica (MR) (MRI)16,17. Questa nuova modalità di imaging funzionale può disegnare con precisione i cambiamenti dei tessuti a livello molecolare attraverso interazioni ligando-recettore. In questo studio, è stata sintetizzata una nuova sonda di imaging molecolare, che comprende nanoparticelle SPIO, per coniugare con l'anticorpo superficiale Mtb (MtbsAb) per la diagnosi di ETB. Le nanosondpio SPIO sono minimamente invasive per tessuti e corpi in esame18,19. Inoltre, queste nanosonde possono dimostrare immagini REM precise a basse concentrazioni a causa delle loro proprietà paramagnetiche. Inoltre, le nanosonda SPIO appaiono suscitare reazioni meno allergiche perché la presenza di ioni di ferro fa parte della fisiologia normale. In questo caso, la sensibilità e la specificità delle nanosonde SPIO-MtbsAb rivolte a ETB sono state valutate sia nei modelli cellulari che in quelli animali. I risultati hanno dimostrato che le nanosonda erano applicabili come agenti di imaging ultrasensibili per la diagnosi di ETB.

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Protocol

Tutto il protocollo relativo all'esperimento sugli animali segue le procedure operative standard per l'allevamento degli animali da laboratorio in conformità con i National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8a edizione, 2011) ed è approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

1. Sintesi di nanoparticelle SPIO

  1. Preparare le nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite dextran mescolando vigorosamente una miscela di soluzioni Dextran T-40 (5 mL; 50% w/w) e aquese FeCl3x 6H2O (0,45 g; 2,77 mmol) e FeCl2x 4H2O (0,32 g; 2,52 mmol) soluzioni a temperatura.
  2. Aggiungere rapidamente NH4OH (10 mL; 7,5% v/v).
  3. Mescolare ulteriormente la sospensione nera per 1 h; successivamente, centrifugare a 17.300 x g per 10 min e quindi rimuovere gli aggregati.
  4. Separare gli ultimi prodotti SPIO dal T-40 dextran non legato dalla cromatografia a filtrazione in gel20.
  5. Caricare la miscela di reazione (volume totale 5 mL) in una colonna di 2,5 cm x 33 cm ed elutare con una soluzione tampone contenente 0,1 M di acetato di Na e 0,15 M NaCl a pH 7,0.
  6. Raccogliere le nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite di dextran nel volume vuoto e valutare che la colonna si elusi per ferro e dextran a 330 e 490 nm utilizzando rispettivamente l'acido cextrallorico e i metodi di fenolo/acido fenolo/solforico20.

2. Sintesi SPIO-MtbsAb

  1. Synthesize SPIO-coniugato EDBE utilizzando metodi precedentemente segnalati21,22.
  2. Sintetizzare l'anidride succinico SPIO-EDBE (SA).
    1. Mescolare una soluzione alcalina (5 M NaOH; 10 mL)) di SPIO-EDBE e SA (1 g; 10 mol) a temperatura ambiente per 24 h.
    2. Dialisi la soluzione con 20 cambi di 2 L di acqua distillata utilizzando tubi a membrana porosa molecolare (12.000-14.000 MW cutoff). 6 h per ogni cambiamento.
  3. Infine, aggiungere 100 L di SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL di Fe) a 400 idrossibenzotriazole e (benzotriazolo-1-yloxy) tripyrrolidinophosphosphonium hexafluorofosfato come catalizzatori e mescolare la soluzione a temperatura ambiente per 24 h.
  4. Infine, separare le soluzioni dall'anticorpo non legato attraverso la cromatografia della filtrazione del gel.
  5. Caricare la miscela di reazione (5 mL) su una colonna di 2,5 cm x 33 cm ed eluire utilizzando un buffer PBS. Confermare il complesso Ab-nanoparticle (cioè nanosonda) utilizzando un kit di analisi delle proteine dell'acido bicinchoninico23.

3. Osservazione della morfologia delle particelle e misurazione del livello di rilassamento

  1. Esaminare la dimensione media delle particelle, la morfologia e la distribuzione delle dimensioni utilizzando il microscopio elettronico di trasmissione ad una tensione di 100 kV.
    1. Getta la dispersione composita su una griglia di rame a 200 maglie e l'aria si asciuga a temperatura ambiente prima di caricarla al microscopio.
  2. Misurare i valori del tempo di rilassamento (T1 e T2) delle nanosondazioni utilizzando il rilassante NMR a 20 MHz e 37,0 c .
    1. Calibrare il relaxometer prima di ogni misurazione.
    2. Registrare i valori r1 e r2 degli otto punti dati generati tramite inversione-recupero e la sequenza di impulsi Carr-Purcell-Meiboom-Gill, rispettivamente, per determinare r1 e r2 rilassantità20.

4. Imaging cellulare

  1. Coltivare monociti umani THP-1 in RPMI 1640 con 10% siero bovino fetale, 50 g/mL di gentiluomo gentnamicina solfato, 100 unità/mL penicillin G sodium, 100 g di streptomicina solfato e 0,25 funghi g/mLmizone a 37.
  2. Incubare nanosond SPIO-MtbsAb (2 mM) con 106 unità formanti colonia (CFU) di Mycobacterium bovis BCG preincubate con 1 x 107 monociti attivati nei tubi di microcentrifuga (1 mL) in un 5% di CO2 incubatore a 37 gradi centigradi per 1 h.
  3. Centrifuga tubi a 200 x g e scartare il supernatante. Ridissolvere i pellet nel mezzo (200 l).
  4. Eseguire la scansione dei campioni utilizzando una sequenza di impulsi eco a gradiente veloce (Tempo di ripetizione (TR) - 500; Ecotime (TE) - 20; Per determinare la specificità e la sensibilità della nanosondada 21,22.

5. Inoculazione BCG (Bacillus Calmette–Guérin)

  1. Ricostituire il vaccino lofilizzato o lo stock batterico nel mezzo di Sauton e quindi diluire lo stock con la salina fino a disperdersi correttamente come descritto in precedenza24.
  2. Inoculare un ceppo attenuato vivo di M. bovis BCG, ottenuto da ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (ceppo Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) a un volume di 0,1 mL/topo (cioè 107 CFU) intradermente nella pelle scapolare dorsale sinistra o destra dei topi, come descritto in precedenza23. Iniettare la salina nei topi come controllo negativo. Monitorare gli animali ogni giorno dopo l'inoculazione BCG.
  3. Sacrificare gli animali 1 mese dopo l'inoculazione batterica utilizzando eutanasia di anidride carbonica. Raccogliere il tessuto dal sito di inoculazione intradermica. Fissare il tessuto in formalina del 10% e incorporare in paraffina per le sezioni seriali a 5-10 m. Sezioni di tessuto macchia con le macchie di ematossia/eosina e ziehl-Neelsen per i batteriacidi-veloci 24 e con il blu di Berlino per il ferro ferrico25.

6. Risonanza magnetica in vivo

  1. Iniettare chetamina (80 mg/kg di peso corporeo) e xylazina (peso corporeo 12 mg/kg) sottocutaneamente nei topi per l'anestesia animale.
  2. Iniettare le sonde SPIO-TbsAb (2 nmol/200) nelle vene posteriori dei topi. Mouse di immagine MR prima e subito dopo l'iniezione della sonda e poi ogni 5 min per 30 min per acquisire immagini spin-eco veloce peso T2 (TR - 3000; TE - 90 ANNI; campo visivo n. 8).
  3. Analizza quantitativamente tutte le immagini MR utilizzando l'intensità del segnale (SI), una misura di regioni di interesse definite in posizioni comparabili di un centro di granuloma Mtb e del muscolo posteriore adiacente ad una zona granulomato.
  4. Calcolare i miglioramenti relativi del segnale utilizzando la misura SI prima (SIpre; controllo) e 0-3 h dopo l'iniezione (SIpost) degli agenti di contrasto utilizzando la formula

    [(SIpost - SIpre)/SIpre]

    dove SIpre è la SI della lesione sulla scansione pre-migliorata e SIpost è la SI della lesione sulla scansione post-migliorata21,22.

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Representative Results

Sintesi e caratterizzazione della nanosonda SPIO-MtbsAb
Le nanoparticelle SPIO sono state progettate per coniugare con MtbsAb. Il dextran stabilizzato sulla superficie delle nanoparticelle SPIO è stato collegato tramite epichlorohydrin. Le nanoparticelle SPIO sono state successivamente incorporate con EDBE per attivare i gruppi funzionali dell'ammine primario alle estremità del dextran. SA è stata poi coniugata per formare SPIO-EDBE-SA. Le nanosonda SPIO-MtbsAb si sono formate nel passaggio finale attraverso la coniugazione di MtbsAb con SPIO-EDBE-SA in presenza degli agenti di accoppiamento. L'immagine TEM delle nanosond SPIO-MtbsAb (Figura 1) dimostra che le nanosonda SPIO-MtbsAb avevano un aspetto ben disperso. La dimensione media del nucleo della nanosonda SPIO-MtbsAb era di 3,8 x 0,4 nm (calcolo delle particelle).

In una soluzione acquosa, i valori di rilattività, r1 e r2, delle nanosondine erano rispettivamente 23 , 3 e 151 - 8 mM-1s-1, rispettivamente, a 20 MHz e 37,0 C . Il rapporto r1/r2 delle nanosonda SPIO-MtbsAb era simile a quello di Resovist; tuttavia, r1 e r2 di Resovist (rispettivamente 26 e 164 mM-1s-1, erano leggermente superiori a quelli delle nanosondinai SPIO-MtbsAb.

Caratterizzazione e imaging della nanosonda SPIO-MtbsAb in vitro
In primo luogo, abbiamo rilevato M. bovis BCG, un batterio acido-veloce, attraverso la colorazione di .iehl-Neelsen (Figura 2A). I batteri sono stati isolati e poi coltivati con sonde contenenti ferro ferrico, identificabili attraverso la colorazione blu di Berlino (Figura 2B). Il grado di puntamento Mtb della nanosonda SPIO-MtbsAb è stato determinato attraverso la risonanza magnetica ponderata T2; miglioramento negativo è stato proporzionato alla quantità di sonde attaccate alla cellula batterica. La diminuzione della SI in presenza delle nanosonda si è verificata in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 2C). A 2, 1 e 0,5 mM, le nanosonda coniugate con Mtb hanno esibito SI di 97,67 x 3,05, 131,67 , 4,51, e 257,33 x 5,03, rispettivamente, tutti più alti della SI di 90,75 x 2,47 per la nanosonda non congenerata di 1 mM. Rispetto al PBS (SI - 1073,43 x 13,62), quasi nessuna riduzione del segnale è stata rilevata nel gruppo solo TB (SI - 957.33 , 12,53). Pertanto, le sonde SPIO hanno preso di mira specificamente Mtb bacilli; inoltre, sulle immagini MR potenziate, il SI è diminuito con l'aumento della quantità di nanoparticelle SPIO.

Allo stesso modo, le riduzioni di SI sulle immagini MR potenziate sono state notate 1 h dopo la coltura dei monociti THP-1 con le nanosonde. Si è stata osservata una riduzione significativa del gruppo SI del gruppo TB rispetto a i gruppi somministrati solo con PBS (SI - 225,33 x 8,58) e 2 mM (SI 104 x 2,16) delle nanosond, rispetto ai gruppi somministrati solo con PBS (SI - 1005,33 x 16,74) o non somministrati con il nanopr (SI - 991 - 8,98). La riduzione della RM SI nei gruppi di Mtb per nanosonda da 1 e 2 mM era paragonabile a quella del solo gruppo positivo di nanosonda da 1 mM (SI - 112,33 x 3,68). Secondo i risultati di cui sopra, le nanosonda SPIO-MtbsAb potrebbero aiutare a monitorare il traffico di monociti THP-1 attivato da nanosonda.

Immagini nanosonda SPIO-MtbsAb in vivo
Dopo l'imaging cellulare, abbiamo determinato l'efficacia della risonanza magnetica in vivo per l'ETB. Le nanosonda SPIO-MtbsAb sono state iniettate per via endovenosa ai topi infettati da Mtb. Un segnale MR chiaramente rilevabile è stato notato nell'area granulomatosa Mtb 0,5 h dopo l'iniezione; tuttavia, il più alto SI di fondo è stato osservato dopo 1 h di iniezione. Una significativa riduzione della segnalazione MR è stata osservata nell'area del granulomatoso Mtb (Figura 3). SI è stato misurato prima (SIpre) e dopo l'iniezione dell'agente di contrasto (SIpost). Un'ora dopo l'iniezione della sonda, il miglioramento ponderato per il T2 della riduzione del segnale nelle aree di granulone Mtb(Figura 3B) è stato di circa 14 volte superiore a quello dei siti di controllo (Figura 3A; -1,68% - 1,32% e -23,43% - 7,24%; p < 0.001).

Valutazione istologica e immunohistochimica delle nanosondazioni SPIO-MtbsAb
Un granuloma sottocutaneo è stato sviluppato 1 mese dopo l'infezione nei topi C57BL/6. Nuova vascolarizzazione del sangue è stata notata all'interno di queste lesioni insieme ad aggregati di linfociti ed epitelioidi-macrofagi. Il granuloma organizzato era cresciuto progressivamente (Figura 4A). La correlazione delle lesioni da TB con i segnali SPIO-MtbsAb MR è stata ulteriormente determinata attraverso la reazione immunohistochimica dell'antigene superficiale Mtb con anti-MtbsAb. Espressione MtbsAb positiva è stata rivelata nelle aree granulomatose (Figura 4B), con bacilli acidi-veloce colorazione positivo nel sito di lesione (Figura 4C). Il blu berlinese, una macchia ferrica positiva al ferro, è stato utilizzato per determinare la sensibilità delle sonde alla sonda SPIO blu-positiva di Berlino è stato trovato nella stessa posizione di MtbsAb(Figura 4D). Tutte le coppie colocalizzate sono state mostrate nella Figura 4A-D.

Figure 1
Figura 1: Dimensione media del nucleo delle nanosonda SPIO-MtbsAb in TEM. La dimensione media del nucleo della nanosonda SPIO-MtbsAb era di 3,8 x 0,4 nm, misurata utilizzando l'analisi delle immagini TEM (calcolo di 200 particelle). Barra della scala: 15 nm. Questa cifra è stata modificata dal nostro studio precedente26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: caratterizzazione in vitro della nanosonda SPIO-MtbsAb. I bacilli acido-veloci sono identificati attraverso la colorazione(A) e (B) la coniugazione del ferro ferrico della nanosonda ai batteri identificati attraverso la colorazione blu di Berlino. (C) La risonanza magnetica ponderata T2, con un miglioramento negativo dopo che le nanosonda SPIO-MtbsAb sono incubate con l'eliminazione di Mtb. (2) 97,67 x 3,05 (Sonda da 2,0 m); (3) 131,67 x 4,51 (Sonda Mtb da 1,0 mM); (4) 257,33 x 5,03 (Mtb - Sonda da 0,5 mm); (5) 957,33 x 12,53 (Sonda Mtb 0 mM); (6) 1073.43 - 13,62 (PBS). Nessuna riduzione del segnale rilevabile rilevata nel gruppo di controllo PBS. (D) Miglioramento negativo dipendente dalla dose nei monociti THP-1 1 h dopo l'incubazione con le nanosondazioni. Le barre della scala in (C) e (D) sono di 5 mm. Questa cifra è stata modificata dal nostro studio precedente26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: nanosonda SPIO-MtbsAb in vivo in lesioni ETB sottocutanee del mouse C57BL/6. (A) Controllo e(B)Mtb aree granulomatous. Una significativa riduzione di 14 volte nella segnalazione MR si riscontra nelle aree granulomatose Mtb rispetto alle aree di controllo 1 h dopo la somministrazione della sonda (-1,68% - 1,32% contro -23,43% - 7,24%, p < 0,001). I risultati sono forniti come mezzi: SD. I confronti statistici hanno utilizzato i test t di Student a due code. p < 0,05 è stato considerato significativo. Questa cifra è stata modificata dal nostro studio precedente26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Correlazioni di istologia, immunoistochimica, acido-veloce e colorazione blu berlinese. Istologia delle aree granulomatose Mtb che dimostrano prevalentemente linfociti e macrofagi epitelioidi. Neovascolarizzazione e abbondante aggregazione di linfociti e macrofagi epitelioidi osservati in queste lesioni. (A) I granulomi organizzati sembrano svilupparsi progressivamente. (B) Colorazione immunoistochimica che dimostra l'espressione di MtbsAb nelle lesioni granulomatose, mentre i bacilli aacido-veloce (C)sono sparsi all'interno delle stesse aree. (D) Le sonde SPIO di colorazione blu berlinese si trovano nelle aree Colocalized MtbsAb. La colorazione blu berlinese per il ferro ferrico dimostra la coniugazione della sonda alle barre di scala Mtb. Questa cifra è stata modificata dal nostro studio precedente26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Analogamente agli studi pertinenti, i nostri risultati relativi alle nanosinde SPIO-MtbsAb hanno dimostrato una specificità significativa per Mtb27,28. Il granuloma sottocutaneo Mtb è stato trovato 1 mese dopo l'iniezione di TB nei modelli murini. Le tipiche scoperte dell'istoologia granulomatosa della TB includevano l'infiltrazione dei linfociti, la presenza di macrofagi epiteliaidi e la neovascolarizzazione. I bacilli acido-veloci sono stati sparsi nelle lesioni da TB, confermando i risultati dell'immunohistochimica MtbsAb. Ciò indicava una reazione immunologica tra l'antigene superficiale Mtb e MtbsAb. Il blu di Berlino ha evidenziato le stesse aree con MtbsAb, confermando la specificità delle sonde per la coniugazione con Mtb a acido-veloce.

In particolare, l'entità del miglioramento del contrasto negativo sulla risonanza magnetica per le cellule Mtb e THP1 monocitico è stata proporzionale alla concentrazione di nanosonda SPIO-MtbsAb. Quando sono stati somministrati i topi che cuscinetto Mtb granulomas sono stati somministrati nanosoni SPIO-MtbsAb, una riduzione del segnale di 14 volte nel sito di granulomatous è stata notata sulle immagini MR ponderate T2 rispetto a un sito opposto con iniezione PBS. Ciò indica un accumulo significativo dell'agente di contrasto. I risultati dimostrano la possibilità di ottenere una specifica targeting dell'agente di contrasto, che potrebbe ridurre il requisito di dose per la diagnosi clinica.

I nostri risultati indicano che queste nanosoni accumulano un volume rilevabile nelle lesioni granulomatose Mtb. Questi risultati possono essere confermati sviluppando una nanosonda SPIO utilizzando anti-hMtbsAb. Poiché il nucleo magnetico dell'ossido di ferro dello SPIO è stato applicato per indurre l'accorciamento del T2 negli agenti di contrasto della risonanza magnetica, i risultati suggeriscono un approccio pratico e non invasivo per rilevare comportamenti cellulari simili per le applicazioni di diagnosi clinica.

Qui, forniamo il protocollo che comprende 2 parti: le sezioni da 4 a 6 sono l'imaging cellulare e animale. Le tecniche riguardano la coltivazione cellulare, gli esperimenti sugli animali e l'imaging ottico. Le sezioni da 1 a 3 sono sintesi di sonde. Alcuni passaggi critici aiuteranno a replicare l'esperimento. La fase critica della sintesi delle nanoparticelle SPIO è quella di preparare nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite di dextran; è fondamentale mescolare vigorosamente e mescolare completamente le soluzioni Dextran T-40, aqueous FeCl3-6H2O e FeCl2-4H2O a temperatura ambiente. Il passo critico per la sezione 2, sintesi SPIO-MtbsAb, è coniugare MtbsAb a SPIO-EDBE-SA per sintetizzare SPIO-MtbsAb. Per selezionare i catalizzatori appropriati e mescolare adeguatamente la soluzione a temperatura ambiente sono anche critici. E il passo critico per la sezione 3, osservazione della morfologia delle particelle e misurazione del livello di rilassamento, è calibrare il relaxometer prima di ogni misurazione. Per calcolare con precisione la dimensione delle sonde, è fondamentale anche una calibrazione del relaxometer.

In questo studio, sono stati utilizzati M. bovis BCG e coniglio anti-Mtb. La reattività incrociata delle fonti bovine e di coniglio è stata considerata mite, anche se i dati hanno dimostrato che MtbsAb-coniugato SPIO ha rivelato forti interazioni con M. bovis BCG. La nostra scoperta ha suggerito che le nanosprobe SPIO mirano alla TB in modo specifico. L'incubazione dei batteri nanoprobe e Mtb ha mostrato un modo di miglioramento negativo dosaggio-dipendente, mentre la diminuzione del miglioramento osservato per le nanosonde SPIO sulla risonanza magnetica è stata correlata con l'esistenza di particelle SPIO. Sulla base dei nostri dati, ulteriori ricerche per esplorare possibili approcci di coniugazione degli anticorpi per migliorare la specificità della nanosonda sarebbero i benvenuti.

Studi precedenti dimostrano che SPIO mostra una citotossicità minima senza alterare l'attività cellulare ad una concentrazione utilizzata in questo studio29,30. In accordo con la ricerca precedente, i nostri risultati hanno dimostrato un effetto minimo delle nanosonda SPIO sulle cellule THP-1. Le cellule THP-1 sono state incubate con nanosonda SPIO con coniugazione batterica per 1 ora. SI ha presentato un calo significativo nei gruppi di Mtb con concentrazione di 1 mM o 2 mM nanoprobe, rispetto al gruppo di controllo senza trattamento nanoprobe o PBS da solo. Il risultato supporta la sicurezza della nanosonda SPIO e altri studi che applicano altri carichi batterici per convalidare la sensibilità della nanosonda sono i benvenuti.

Una limitazione del nostro studio è stata che non abbiamo quantificato la biodistribuzione della nanosonda SPIO-MtbsAb nei topi. Inoltre, non abbiamo studiato l'emivita intravascolari e la deposizione epatica della nanosonda, che potrebbe alterare il tempo di esposizione delle sonde alle cellule THP-1 situate presso le lesioni Mtb. Sono giustificate ulteriori ricerche sulla biodegradazione. Inoltre, la risonanza magnetica non poteva distinguere se le nanosonda SPIO potessero legarsi specificamente a batteri o monociti o se queste sonde fossero endocitosi.

In conclusione, abbiamo sviluppato un protocollo chiaro e fattibile per preparare e caratterizzare le nanosonda PIO-MtbsAb biocompatibili. Queste nanosonde sono idrofile e si disperdono bene in condizioni fisiologiche; sono minimamente citotossici a basse concentrazioni. Inoltre, queste nanosondpio SPIO-MtbsAb consentono di mirare e rilevare l'infezione da Mtb, come dimostrato dai nostri studi in vitro e in vivo. Pertanto, le nanosonda SPIO-MtbsAb possono essere applicate come agenti di contrasto RM per il rilevamento ETB.

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Disclosures

Nessuno degli autori ha alcun interesse proprietario nei materiali esaminati in questo studio.

Acknowledgments

Gli autori sono grati per il sostegno finanziario da parte del Ministero dell'Economia Taiwan (concede NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-038 -007, MOST 105-2622-B-038-004) per eseguire questo lavoro di ricerca. Questo manoscritto è stato curato da Wallace Academic Editing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

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References

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. Suppl 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

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