Synthese, Charakterisierung und Anwendung von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanosonden zur Erkennung von extrapulmonaler Tuberkulose

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Summary

Um serologische diagnostische Tests für Mycobacterium tuberculosis Antigene zu verbessern, haben wir superparamagnetische Eisenoxid-Nanosonden entwickelt, um extrapulmonale Tuberkulose zu erkennen.

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Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

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Abstract

Eine molekulare bildgebende Sonde mit superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (SPIO) und Mycobacterium tuberculosis-Oberflächenantikörper (MtbsAb) wurde synthetisiert, um die bildgebende Empfindlichkeit für extrapulmonale Tuberkulose (ETB) zu verbessern. Eine SPIO-Nanosonde wurde synthetisiert und mit MtbsAb konjugiert. Die gereinigte SPIO-MtbsAb Nanosonde wurde mit TEM und NMR charakterisiert. Um die Targeting-Fähigkeit der Sonde zu bestimmen, wurden SPIO-MtbsAb-Nanosonden mit Mtb für In-vitro-Bildgebungstests inkubiert und in Mtb-inokierte Mäuse zur In-vivo-Untersuchung mit Magnetresonanz (MR) injiziert. Die Kontrastverstärkungsreduktion bei der Magnetresonanztomographie (MRT) von Mtb- und THP1-Zellen zeigte proportional zur SPIO-MtbsAb-Nanosondenkonzentration. Nach 30 min intravenöser SPIO-MtbsAb-Nanosondeninjektion in Mtb-infizierte Mäuse wurde die Signalintensität der granulomatösen Stelle in den T2-gewichteten MR-Bildern um das 14-fache erhöht, verglichen mit der von Mäusen, die eine PBS-Injektion erhielten. Die MtbsAb-Nanosonden können als neuartige Modalität für die ETB-Erkennung verwendet werden.

Introduction

Weltweit stellt die extrapulmonale Tuberkulose (ETB) einen erheblichen Anteil der Tuberkulose-Fälle (TB) dar. Dennoch wird die ETB-Diagnose aufgrund ihrer heimtückischen klinischen Darstellung und der schlechten Leistung bei diagnostischen Tests oft übersehen oder verzögert; Falsche Ergebnisse sind Sputumabstriche negativ für säureschnelle Bacilli, Mangel an granulomatösem Gewebe auf Histopathologie, oder Versagen der Kultur Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Im Vergleich zu typischen Fällen tritt ETB seltener auf und beinhaltet wenig Befreiung der Mtb-Bazillen. Darüber hinaus ist es in der Regel an schwer zugänglichen Stellen lokalisiert, wie Lymphknoten, Pleura, und osteoarticularBereiche1. Daher sind invasive Verfahren zur Gewinnung geeigneter klinischer Proben, die eine bakteriologische Bestätigung riskant und schwierig machen, wesentlich2,3,4.

Kommerziell erhältliche Antikörpernachweistests für ETB sind aufgrund ihrer großen Empfindlichkeitsspanne (0,00-1,00) und Spezifität (0,59-1,00) für alle außerpulmonalen Standorte zusammen5für den klinischen Nachweis unzuverlässig. Enzymgebundene Immunospot-Assays (ELISPOT) für Interferon-, Kulturfiltratprotein (CFP) und frühes sekretorees antigenes Ziel (ESAT) wurden zur Diagnose latenter und aktiver TB verwendet. Die Ergebnisse variieren jedoch zwischen den verschiedenen Krankheitsstellen für die Diagnose von ETB6,7,8. Darüber hinaus lieferten Haut-PPD (gereinigtes Proteinderivat) und QuantiFERON-TB häufig falsch negative Ergebnisse9. QuantiFERON-TB-2G ist ein Vollblut-Immunreaktivitätstest, der keine Probe aus dem betroffenen Organ erfordert und dies kann ein alternatives diagnostisches Werkzeugsein 6,10,11. Andere diagnostische Methoden, die typischerweise für TB-Meningitis verwendet werden, wie polymerase Kettenreaktion, sind immer noch zu unempfindlich, um die klinische Diagnose12,13sicher auszuschließen. Diese konventionellen Tests zeigen unzureichende diagnostische Informationen, um die extrapulmonale Infektionsstelle zu entdecken. Daher sind neue diagnostische Modalitäten klinisch erforderlich.

Die molekulare Bildgebung zielt darauf ab, neuartige Werkzeuge zu entwickeln, die spezifische molekulare Ziele von Krankheitsprozessen in vivo14,15direkt abschirmen können. Superparamagnetisches Eisenoxid (SPIO), ein T2-gewichtetes NMR-Kontrastmittel, kann die Spezifität und Empfindlichkeit der Magnetresonanzbildgebung (MRT)16,17deutlich verbessern. Diese neue funktionelle bildgebende Modalität kann Gewebeveränderungen auf molekularer Ebene durch Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen präzise skizzieren. In dieser Studie wurde eine neue molekulare Bildsonde, bestehend aus SPIO-Nanopartikeln, synthetisiert, um mit Mtb-Oberflächenantikörpern (MtbsAb) für die ETB-Diagnose zu konjugieren. SPIO-Nanosonden sind minimal invasiv für Gewebe und Körper, die untersucht werden18,19. Darüber hinaus können diese Nanosonden aufgrund ihrer paramagnetischen Eigenschaften präzise MR-Bilder bei geringen Konzentrationen nachweisen. Darüber hinaus scheinen SPIO-Nanosonden am wenigsten allergische Reaktionen auszulösen, da das Vorhandensein von Eisenionen Teil der normalen Physiologie ist. Hier bei Zell- und Tiermodellen wurden die Empfindlichkeit und Spezifität der SPIO-MtbsAb-Nanosonden auf ETB untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nanosonden als ultraempfindliche Bildgebungsmittel für die ETB-Diagnose anwendbar waren.

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Protocol

Alle Protokolle über Tierversuche entsprechen den Standardverfahren für die Labortierzucht gemäß den National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage, 2011) und sind von der institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss.

1. SPIO Nanopartikelsynthese

  1. Bereiten Sie dextranbeschichtete Eisenoxid-Magnet-Nanopartikel vor, indem Sie eine Mischung aus Dextran T-40 (5 ml; 50% w/w) und wässrigen FeCl 3-6H2 O(0,45 g; 2,77 mmol) und FeCl2x 4H2 O(0,32 g; 2,52 mmol) Bei Raumtemperatur kräftig rühren.
  2. NH4OH (10 ml; 7,5% v/v) schnell hinzufügen.
  3. Rühren Sie die schwarze Aufhängung für 1 h weiter; anschließend zentrifugieren Sie 10 min bei 17.300 x g und entfernen Sie dann die Aggregate.
  4. Trennen Sie die endgültigen SPIO-Produkte von ungebundenem Dextran T-40 durch Gelfiltrationschromatographie20.
  5. Das Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen = 5 ml) in eine 2,5 cm x 33 cm große Säule und mit einer Pufferlösung mit 0,1 M Naacetat und 0,15 M NaCl bei pH 7,0 zu belasten.
  6. Sammeln Sie die gereinigten dextranbeschichteten Eisenoxid-Magnet-Nanopartikel im Hohlraumvolumen und untersuchen Sie die Säuleneluate für Eisen und Dextran bei 330 bzw. 490 nm mit Salzsäure und den Phenol/Schwefelsäure-Methoden20.

2. SPIO-MtbsAb-Synthese

  1. Synthesize SPIO-konjugierte EDBE mit zuvor gemeldeten Methoden21,22.
  2. Synthesize SPIO-EDBE-succinic anhydrid (SA).
    1. Eine alkalische Lösung (5 M NaOH; 10 ml)) von SPIO-EDBE und SA (1 g; 10 mol) bei Raumtemperatur für 24 h rühren.
    2. Dialysieren Sie die Lösung mit 20 Veränderungen von 2 L destilliertem Wasser mit molekularporösen Membranschläuchen (12.000-14.000 MW Cutoff). 6 h für jede Änderung.
  3. Schließlich möchte ich, SPIO-EDBE-SA (4 mg/ml Fe) zu 400 l 4,5 mg/ml MtbsAb hinzufügen, um SPIO-MtbsAb unter Verwendung von 1-Hydroxybenzotriazol und (Benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphat als Katalysator zu synthetisieren und die Lösung bei Raumtemperatur für 24 h zu rühren.
  4. Trennen Sie schließlich die Lösungen vom ungebundenen Antikörper durch Gelfiltrationschromatographie.
  5. Das Reaktionsgemisch (5 ml) auf eine Säule von 2,5 cm x 33 cm laden und mit einem PBS-Puffer löschen. Bestätigen Sie den Ab-Nanopartikel-Komplex (d. h. Nanoprobe) mit einem Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit23.

3. Partikelmorphologie Beobachtung und Entspannungstiermessung

  1. Untersuchen Sie die durchschnittliche Partikelgröße, Morphologie und Größenverteilung mithilfe des Transmissionselektronenmikroskops bei einer Spannung von 100 kV.
    1. Die Zusammengesetzte Dispersion auf ein 200-Maschen-Kupfergitter werfen und bei Raumtemperatur lufttrocken machen, bevor sie auf das Mikroskop geladen wird.
  2. Messen Sie die Entspannungszeitwerte (T1 und T2) der Nanosonden mit dem NMR Relaxometer bei 20 MHz und 37,0 °C bei 0,1 °C.
    1. Kalibrieren Sie das Relaxometer vor jeder Messung.
    2. Zeichnen Sie die r1- undr2-Werte aus den acht Datenpunkten auf, die durch Inversions-Recovery erzeugt werden, und der Carr-Purcell-Meiboom-Gill-Pulssequenz, um r1 und r2 Relaxivitäten20zu bestimmen.

4. Zellbildgebung

  1. Kultivieren Sie menschliche Monozyten THP-1 in RPMI 1640 mit 10% fetalem Rinderserum, 50 g/ml Gentamycinsulfat, 100 Einheiten/ml Penicillin G-Natrium, 100 g Streptomycinsulfat und 0,25 g/ml-Pilzzone in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C.
  2. Inkubieren SPIO-MtbsAb-Nanosonden (2 mM) mit 106 koloniebildenden Einheiten (CFU) von Mycobacterium bovis BCG vorbrütet mit 1 x 107 aktivierten Monozyten in Mikrozentrifugenröhren (1 mL) in einem 5%CO2-Inkubator bei 37 °C für 1 h.
  3. Zentrifugenrohre bei 200 x g und entsorgen den Überstand. Pellets im Medium (200 l) wieder auflösen.
  4. Scannen Sie die Proben mit einer schnellen Gradienten-Echopulssequenz (Wiederholungszeit (TR) = 500; Echozeit(TE) = 20; Drehwinkel = 10°) durch 3,0-T MRT zur Bestimmung der Spezifität und Empfindlichkeit der Nanosonde21,22.

5. BCG (Bacillus Calmette–Guérin) Impfung

  1. Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Impfstoff oder bakteriellen Vorrat in Sautons Medium und verdünnen Sie den Bestand dann mit Salin, bis er ordnungsgemäß dispergiert ist, wie zuvor beschrieben24.
  2. Impfen Sie einen lebenden abgeschwächten Stamm von M. bovis BCG, der aus ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (Connaught-Stamm; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) mit einem Volumen von 0,1 ml/Maus (d.h. 107 KBE) intradermally in die linke oder rechte dorsale skapulierfarbene Haut von Mäusen, wie zuvorbeschrieben 23. Injizieren Sie Saline in Mäuse als negative Kontrolle. Überwachen Sie Tiere täglich nach BCG-Impfung.
  3. Opfern Sie Tiere 1 Monat nach der Inokulation von Bakterien mit Kohlendioxid-Euthanasie. Ernten Sie das Gewebe von der intradermalen Impfstelle. Fixieren Sie das Gewebe in 10% Formalin und betten Sie es in Paraffin für serielle Abschnitte bei 5-10 m ein. Fleckengewebeabschnitte mit den Hämatoxylin/Eosin- und Ziehl-Neelsen-Färbungen für säurebefaste Bakterien24 und mit Berlin blau fürEiseneisen 25.

6. In-vivo-MRT

  1. Injizieren Sie Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12 mg/kg Körpergewicht) subkutan in Mäuse zur Tieranästhesie.
  2. Injizieren Sie SPIO-TbsAb-Sonden (2 nmol/200 l) in Schwanzvenen von Mäusen. MR-Bildmäuse vor und unmittelbar nach der Sondeninjektion und dann alle 5 min für 30 min, um T2-gewichtete schnelle Spin-Echo-Bilder zu erfassen (TR = 3000; TE = 90; Sichtfeld = 8).
  3. Quantitative Analyse aller MR-Bilder mit Hilfe der Signalintensität (SI), einer Messung definierter Interessensgebiete an vergleichbaren Standorten eines Mtb-Granulomzentrums und des Rückenmuskels neben einem granulomatösen Bereich.
  4. Berechnen Sie relative Signalverstärkungen mit der SI-Messung vor (SIpre; Steuerung) und 0-3 h nach (SIpost) Injektion der Kontrastmittel mit der Formel

    [(SIpost - SIpre)/SIpre]

    wobei SIpre die SI der Läsion auf dem vorverstärkten Scan und SIpost ist die SI der Läsion auf dem post-verbesserten Scan21,22.

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Representative Results

SPIO-MtbsAb Nanosondensynthese und Charakterisierung
SPIO-Nanopartikel wurden entwickelt, um mit MtbsAb zu konjugieren. Der auf der Oberfläche von SPIO-Nanopartikeln stabilisierte Dextran wurde durch Epichlorhydrin vernetzt. SPIO-Nanopartikel wurden anschließend mit EDBE aufgenommen, um primäre Aminfunktionsgruppen an den Dextranenden zu aktivieren. SA wurde dann zur SPIO-EDBE-SA konjugiert. SPIO-MtbsAb Nanosonden entstanden im letzten Schritt durch die Konjugation von MtbsAb mit SPIO-EDBE-SA in Gegenwart der Kupplungsmittel. Das TEM-Bild von SPIO-MtbsAb-Nanosonden (Abbildung 1) zeigt, dass die SPIO-MtbsAb-Nanosonden ein gut dispergiertes Aussehen hatten. Die durchschnittliche Größe des SPIO-MtbsAb-Nanosondenkerns betrug 3,8 x 0,4 nm (200 Partikelberechnung).

In wässriger Lösung lagen die Entspannungswerte r1 und r2der Nanosonden bei 23 x 3 und 151 x 8 mM-1s-1bei 20 MHz bzw. 37,0 °C bei 0,1 °C. Das r1/r2 Verhältnis von SPIO-MtbsAb Nanosonden war ähnlich wie das von Resovist; r 1 und r2 von Resovist (26 bzw. 164 mM-1s-1)waren jedoch etwas höher als die von SPIO-MtbsAb-Nanosonden.

In vitro SPIO-MtbsAb Nanosondencharakterisierung und Bildgebung
Zuerst entdeckten wir M. bovis BCG, ein säureschnelles Bakterium, durch Ziehl-Neelsen-Färbung (Abbildung 2A). Die Bakterien wurden isoliert und dann mit Sonden kultiviert, die Eiseneisen enthielten, erkennbar durch Die blaue Färbung Berlins(Abbildung 2B). Der Mtb-Targeting-Grad der SPIO-MtbsAb-Nanosonde wurde durch T2-gewichtete MRT bestimmt; negative Verbesserung wurde an die Menge der Sonden, die an der Bakterienzelle befestigt waren, proportional. Die Abnahme des SI in Gegenwart der Nanosonden erfolgte in konzentrationsabhängiger Weise (Abbildung 2C). Bei 2, 1 und 0,5 mM zeigten die mit Mtb konjugierten Nanosonden SIs von 97,67 x 3,05, 131,67 x 4,51 und 257,33 x 5,03, alle höher als die SI von 90,75 x 2,47 für 1 mM nicht konjugierte Nanoprobe. Im Vergleich zu PBS (SI = 1073,43 x 13,62) wurde in der tb-einzigen Gruppe fast keine Signalreduktion festgestellt (SI = 957,33 x 12,53). So zielten SPIO-Sonden gezielt auf Mtb-Bazillen ab; Darüber hinaus verringerte sich bei den verbesserten MR-Bildern die SI mit zunehmender Menge an SPIO-Nanopartikeln.

In ähnlicher Weise wurden die Reduktionen von SI auf verbesserte MR-Bilder 1 h nach der Kultivierung von THP-1-Monozyten mit den Nanosonden festgestellt. Eine signifikante Verringerung der SI der TB-Gruppe wurde festgestellt, wenn 1 mM (SI = 225,33 x 8,58) und 2 mM (SI = 104 x 2,16) Konzentrationen der Nanosonden im Vergleich zu den Gruppen verwendet wurden, die nur mit PBS verabreicht wurden (SI = 1005,33 x 16,74) oder nicht mit dem Nanopr verabreicht wurden. (SI = 991 x 8,98). Die MRT-SI-Reduktion in den Mtb-Gruppen für 1 und 2 mM Nanosonden war vergleichbar mit der in der positiven 1 mM Nanoprobe-Einzelgruppe (SI = 112,33 x 3,68). Nach den oben genannten Ergebnissen könnten die SPIO-MtbsAb-Nanosonden bei der Überwachung des nanosondonaktivierten THP-1-Monozytenhandels helfen.

In vivo SPIO-MtbsAb Nanosonden-Bildgebung
Nach der Zellbildgebung haben wir die Wirksamkeit von In-vivo-MRT für ETB ermittelt. SPIO-MtbsAb-Nanosonden wurden mtb-infizierten Mäusen intravenös injiziert. Ein deutlich nachweisbares MR-Signal wurde im Mtb-Granulomatousbereich 0,5 h nach der Injektion festgestellt; jedoch wurde der höchste SI-Hintergrund nach 1 h Injektion beobachtet. Im Mtb-Granulomatousbereich wurde eine signifikante Verringerung der MR-Signalgebung festgestellt (Abbildung 3). SI wurde vor (SIpre) und nach (SIpost) Kontrastmittelinjektion gemessen. Eine Stunde nach der Einspeichung der Sonde war die T2-gewichtete Verbesserung der Signalreduktion an den Mtb-Granulamatousbereichen(Abbildung 3B) etwa 14-mal höher als die an den Kontrollstellen (Abbildung 3A; -1,68 % bei 1,32 % und -23,43 % bei 7,24 %; p < 0,001).

Histologische und immunhistochemische Bewertung von SPIO-MtbsAb-Nanosonden
Ein subkutanes Granulom wurde 1 Monat nach der Infektion bei C57BL/6-Mäusen entwickelt. Neue Blutvaskularisation wurde innerhalb dieser Läsionen zusammen mit Lymphozyten und Epithelioid-Makrophagen-Aggregaten festgestellt. Das organisierte Granulom war nach und nach gewachsen (Abbildung 4A). Die Korrelation von TB-Läsionen mit SPIO-MtbsAb MR-Signalen wurde durch die immunhistochemische Reaktion von Mtb-Oberflächenantigen mit Anti-MtbsAb weiter bestimmt. Positive MtbsAb-Expression wurde in den granulomatosen Bereichen(Abbildung 4B), mit säureschneller Bacilli-Färbung positiv an der Läsionsstelle (Abbildung 4C) gezeigt. Berlin blue, ein eisenpositiver Eisenfleck, wurde verwendet, um die Empfindlichkeit der Sonden gegenüber mtb zu bestimmen. Die blau-positive SPIO-Sonde wurde am selben Ort wie MtbsAb gefunden (Abbildung 4D). Alle kolokalisierten Paare wurden in Abbildung 4A-Ddargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Mittlere Kerngröße von SPIO-MtbsAb-Nanosonden in TEM. Die durchschnittliche Größe des SPIO-MtbsAb-Nanosondenkerns betrug 3,8 x 0,4 nm, gemessen mit der TEM-Bildanalyse (200 Partikelberechnung). Skalenbalken = 15 nm. Diese Zahl wurde gegenüber unserer vorherigen Studie26geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: In-vitro-Charakterisierung der SPIO-MtbsAb-Nanosonde. Die säureschnellen Bazillen werden durch (A) Ziehl-Neelsen Färbung und (B) die Konjugation des Eiseneisens der Nanosonde zu Bakterien identifiziert, die durch Die blaue Färbung In Berlin identifiziert wurden. (C) T2-gewichtete MRT mit negativer Verbesserung nach der Inkubation der SPIO-MtbsAb-Nanosonden mit Mtb. Eliminierung von SI-abhängigen Dosen nach der Einarbeitung der Nanosonden mit Mtb: (1) 90,75 x 2,47 (1,0 mM Sonde); (2) 97,67 x 3,05 (Mtb + 2,0 mM Sonde); (3) 131,67 x 4,51 (Mtb +1,0 mM Sonde); (4) 257,33 x 5,03 (Mtb + 0,5 mM Sonde); (5) 957,33 x 12,53 (Mtb +0 mM Sonde); (6) 1073,43 x 13,62 (PBS). Keine nachweisbare Signalreduktion in der PBS-Kontrollgruppe festgestellt. (D) Dosisabhängige negative Verbesserung in THP-1-Monozyten 1 h nach Inkubation mit den Nanosonden. Die Skalenstäbe in (C) und (D) sind 5 mm. Diese Zahl wurde gegenüber unserer vorherigen Studie26geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: In vivo SPIO-MtbsAb Nanosonden in subkutanen ETB-Läsionen der C57BL/6-Maus. (A) Kontrolle und (B) Mtb granulomatous Gebiete. Eine signifikante 14-fache Reduktion der MR-Signalgebung ist in den Mtb-Granulomatonbereichen im Vergleich zu den Kontrollbereichen 1 h nach der Verabreichung der Sonde zu finden (-1,68 % bei 1,32 % vs. -23,43 % bei 7,24 %, p < 0,001). Die Ergebnisse werden als Mittel angegeben, d. h. als SDs. Statistische Vergleiche verwendeten zweischwanzige Schüler-T-Tests. p < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Diese Zahl wurde gegenüber unserer vorherigen Studie26geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Korrelationen von Histologie, Immunhistochemie, säureschneller und Berliner Blaufärbung. Histologie der Mtb-Granulomatous-Gebiete, die überwiegend Lymphozyten und epitheliaide Makrophagen zeigen. Neovaskularisation und reichliche Aggregation von Lymphozyten und epithelioiden Makrophagen, die bei diesen Läsionen beobachtet wurden. (A) Organisierte Granulome scheinen sich schrittweise zu entwickeln. (B) Immunhistochemische Färbung, die die MtbsAb-Expression in den granulomatären Läsionen demonstriert, während (C) säureschnelle Bazillen in denselben Gebieten verstreut sind. (D) Berlin blaue Färbung SPIO Sonden sind in den kolokalisierten MtbsAb Bereichen gefunden. Die Berliner Blaufärbung für Eisen eisenzeigt die Sondenkonjugation zu Mtb. Scale-Bars sind 100 m. Diese Zahl wurde gegenüber unserer vorherigen Studie26geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Ähnlich wie in einschlägigen Studien zeigten unsere Ergebnisse zu SPIO-MtbsAb-Nanosonden eine signifikante Spezifität für Mtb27,28. Das subkutane Mtb-Granulom wurde 1 Monat nach der TB-Injektion in den Mausmodellen gefunden. Die typischen Ergebnisse der physikalischen Histologie des TB umfassten Lymphozyteninfiltration, Das Vorhandensein epithelioider Makrophagen und Neovaskularisation. Säureschnelle Bacilli wurden in den TB-Läsionen verstreut, was die MtbsAb-Immunhistochemie-Befunde bestätigte. Dies deutete auf eine immunologische Reaktion zwischen Mtb-Oberflächenantigen und MtbsAb hin. Berlin blau hob die gleichen Bereiche mit MtbsAb hervor und bestätigte die Sondenspezifität für die Konjugation mit dem säureschnellen Mtb.

Insbesondere war das Ausmaß der negativen Kontrastverstärkung bei MRT für Mtb- und monozytäre THP1-Zellen proportional zur SPIO-MtbsAb-Nanosondenkonzentration. Wenn Mäusen, die Mtb-Granulome trugen, SPIO-MtbsAb-Nanosonden verabreicht wurden, wurde eine 14-fache Signalreduktion an der granulomatosen Stelle auf T2-gewichteten MR-Bildern im Vergleich zu einer gegenüberliegenden Stelle mit PBS-Injektion festgestellt. Dies deutet auf eine signifikante Akkumulation des Kontrastmittels hin. Die Ergebnisse zeigen eine Möglichkeit, eine spezifische Ausrichtung auf Kontrastmittel zu erhalten, die den Dosisbedarf für die klinische Diagnose reduzieren könnte.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Nanosonden ein nachweisbares Volumen in Mtb-Granulomatousläsionen ansammeln. Diese Ergebnisse können durch die Entwicklung einer SPIO-Nanosonde mit Anti-hMtbsAb bestätigt werden. Da der magnetische Eisenoxidkern des SPIO angewendet wurde, um eine T2-Verkürzung in MRT-Kontrastmitteln zu induzieren, deuten die Ergebnisse auf einen praktischen und nichtinvasiven Ansatz hin, um ähnliche Zellverhalten für klinische Diagnoseanwendungen zu erkennen.

Hier stellen wir das Protokoll aus 2 Teilen zur Verfügung: Abschnitte 4 bis 6 sind Zell- und Tierbildgebung. Die Techniken umfassen die Zellkultivierung, Tierversuche und optische Bildgebung. Die Abschnitte 1 bis 3 sind Sondensynthesen. Einige wichtige Schritte helfen bei der Replikation des Experiments. Der entscheidende Schritt der SPIO-Nanopartikelsynthese besteht darin, ein dextranbeschichtetes Eisenoxid-Magnet-Nanopartikel herzustellen; es ist wichtig, die Dextran T-40, wässrige FeCl3-6H2O und FeCl2-4H2O Lösungen bei Raumtemperatur kräftig zu rühren und vollständig zu mischen. Der entscheidende Schritt für Abschnitt 2, SPIO-MtbsAb Synthese, ist die Konjugierung von MtbsAb zu SPIO-EDBE-SA zur Synthese von SPIO-MtbsAb. Die Auswahl der geeigneten Katalysatoren und das entsprechende Rühren der Lösung bei Raumtemperatur sind ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Und der entscheidende Schritt für Abschnitt 3, Partikelmorphologie Beobachtung und Entspannungsstufenmessung, ist das Relaxometer vor jeder Messung zu kalibrieren. Um die Größe der Sonden genau berechnen zu können, ist auch eine Kalibrierung des Relaxometers entscheidend.

In dieser Studie wurden M. bovis BCG und Kaninchen Anti-Mtb verwendet. Die Kreuzreaktivität von Rinder- und Kaninchenquellen wurde als mild angesehen, obwohl die Daten belegten, dass MtbsAb-konjugierte SPIO starke Wechselwirkungen mit M. bovis BCG aufwies. Unsere Ergebnisse legten nahe, dass SPIO-Nanosonden speziell auf TB abzielen. Die Inkubation von Nanosonden- und Mtb-Bakterien zeigte eine negative Verbesserungsmethode dosisabhängig, während die Abnahme der für SPIO-Nanosonden beobachteten Verbesserung auf MRT mit der Existenz von SPIO-Partikeln korrelierte. Auf der Grundlage unserer Daten wären weitere Forschungen zur Erforschung möglicher Antikörperkonjugationsansätze zur Verbesserung der Spezifität der Nanosonde willkommen.

Frühere Studien zeigen, dass SPIO eine minimale Zytotoxizität ohne Veränderung der Zellaktivität in einer in dieser Studie verwendeten Konzentrationzeigt 29,30. In Übereinstimmung mit früheren Forschungsergebnissen zeigten unsere Ergebnisse eine minimale Wirkung von SPIO-Nanosonden auf THP-1-Zellen. THP-1-Zellen wurden 1 Stunde lang mit SPIO-Nanosonden mit Bakterienkonjugation inkubiert. SI zeigte einen signifikanten Rückgang der Mtb-Gruppen mit einer Konzentration von 1 mM oder 2 mM Nanosonden, verglichen mit Kontrollgruppen ohne Nanoprobebehandlung oder PBS allein. Das Ergebnis unterstützt die Sicherheit der SPIO-Nanosonde, und weitere Studien, die andere bakterielle Belastungen anwenden, um die Empfindlichkeit der Nanosonde zu validieren, sind willkommen.

Eine Einschränkung unserer Studie war, dass wir die Bioverteilung der SPIO-MtbsAb-Nanosonde bei Mäusen nicht quantifiziert haben. Darüber hinaus haben wir die intravaskuläre Halbwertszeit und die Leberablagerung der Nanosonde nicht untersucht, was die Expositionszeit der Sonden gegenüber THP-1-Zellen an den Mtb-Läsionen verändern könnte. Weitere Forschungen zum biologischen Abbau sind gerechtfertigt. Darüber hinaus konnte die MRT nicht unterscheiden, ob SPIO-Nanosonden gezielt an Bakterien oder Monozyten binden konnten oder ob diese Sonden endozytosiert waren.

Abschließend haben wir ein klares und praktikables Protokoll zur Herstellung und Charakterisierung biokompatibler SPIO-MtbsAb-Nanosonden entwickelt. Diese Nanosonden sind hydrophil und dispergieren sich gut unter physiologischen Bedingungen; sie sind minimal zytotoxisch bei niedrigen Konzentrationen. Außerdem ermöglichen diese SPIO-MtbsAb-Nanosonden die Ausrichtung und den Nachweis von Mtb-Infektionen, wie unsere In-vitro- und In-vivo-Studien zeigen. So können SPIO-MtbsAb-Nanosonden als MRT-Kontrastmittel zur ETB-Erkennung eingesetzt werden.

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Disclosures

Keiner der Autoren hat ein proprietäres Interesse an den in dieser Studie untersuchten Materialien.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch das Ministerium für Wirtschaft Taiwan (Zuschüsse NSC-101-2120-M-038-001, MOST 104-2622-B-007, MOST 105-2622-B-038-004) für diese Forschungsarbeit durchzuführen. Dieses Manuskript wurde von Wallace Academic Editing herausgegeben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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