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비 계-무료 3 차원 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법

Bioengineering

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Summary

이 프로토콜 만족 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 3 차원 비 계 없는 심장 조직을 만들 순 형 기반 방법을 설명 합니다.

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Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

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Abstract

이 프로토콜 고 추가 비 계 자료 없이 3 차원 (3 차원) 심장 조직을 만들 쉬운 그물 형 기반 방법에 설명 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes (iPSC-CMs), 인간의 심장 섬유 아 세포 (HCFs), 그리고 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 격리 하 고 70 %iPSC-CMs, 15 %HCFs, 및 15 %HUVECs 세포 현 탁 액을 생성 하는 데 사용. 그들은 spheroids의 수백을 한 번에 집 광을 위한 micropores를 포함 하는 매우 낮은 첨부 파일 "걸기 하락" 시스템에서 공동 경작. 셀 집계 하 고 자발적으로 공동 문화의 3 일 후 구타 spheroids를 형성 한다. spheroids 수확, 새로운 금형 캐비티에 시드 고 인큐베이터에 통에 경작. spheroids가 성숙한 기능 조직 시드 후 약 7 일. 만족 스러운 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 융합된 spheroids 결과 다층된 조직에 의하여 이루어져 있다. 이 새로운 메서드는 나중에 심장 마비의 치료에 대 한 설계 조직 만들기를 재현 하 고 비용 효율적인 방법으로 유망 가능성이 있다.

Introduction

현재 심장 조직 공학의 목표는 대체 또는 손상 된 심근 조직1의 기능과 구조를 복구 하는 치료를 개발 하는 것입니다. 기본 심장 조직의 중요 한 수축 및 electrophysiological 속성을 전시 하는 3 차원 심장 조직 모델을 만드는 방법 급속 하 게 확대 되어 있다2,3. 다양 한 전략을 탐험 하 고 연구4,5에서 사용 되었습니다. 이 방법에서에서 범위 특정 합성 및 천연 생리 활성 hydrogels, 젤라틴, 콜라겐, 섬유 소, 그리고 펩 티 드6, 같은 사용 하 여 바이오 잉크 증 착 기술2 및 bioprinting 기술7.

그것은 비 자유로운 방법 외국 비 계 소재8통합의 단점 없이 소재 기반 방법으로 유사한 조직 생산할 수 표시 되었습니다. 오 렌 Caspi 외. 셀의 다양 한 종류의 매우 vascularized 인간의 조작된 심장 조직9의 세대 수는 설명 했다. 턱 외. spheroids에서 심장 패치 생성을 위한 3 차원 인쇄 방법을 개발. 결과 패치 cardiomyocytes, 섬유 아 세포, 내 피 세포는 70:15:15 비율10에 구성 됩니다. Spheroids 하 여 효과적인 "빌딩 블록" 비 계 없는 심장 조직 창조의 그들은 저 산소 증에 대 한 저항으로 이식11,12에 대 한 충분 한 기계적 무결성을가지고 표시 되었습니다. 이전 학문은 회전 타원 체 생성에 대 한 여러 가지 제작 방법을 설명 했다, 교수형의 사용을 포함 하 여 방법, 스피너 플라스 크13, 미세 시스템14및 비 점착 문화 표면 코팅 또는 코팅 agarose 마이크로 금형15. 이 프로토콜을 사용 하 여 교수형 드롭 장치, spheroids의 수백을 한 번에 집 광을 위한 micropores를 포함.

이 연구는 소설 평방 금형 캐비티에는 spheroids를 수동으로 시드 및 성숙에 대 한 통에 조직 배양 포함 심장 조직 창조에 대 한 효율적인 비 계 없는 방법을 선물 한다. 일반적인 정적 문화 조건 하에서 산소 보급 조직 구조, 중앙 괴 사 발생의 외부 측면에 제한 됩니다. 그러나, 그물 형 금형에 시드 모든 spheroids 영양분과 산소의 증가 보급에 대 한 수 있도록 지속적인 유체 운동, 미디어에 몰두. 또한,이 형 기반 방법 수동 최소의 노력으로 다른 크기의 조직 패치의 동시 생성 가능 하며 결과 조직 형에서 쉽게 제거 될 수 있습니다. 이 새로운 메서드는 비 계, 다층 심장 패치의 효율적이 고 재현 가능한 창조에 대 한 수 있습니다.

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Protocol

1입니다. Cardiomyocytes의 준비

  1. 앞에서 설명한17지하실 멤브레인 매트릭스와 문화 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)와 6 잘 플레이트 코트.
  2. 앞에서 설명한 방법18을 사용 하 여 hiPSC CMs로 hiPSCs를 구분 합니다.
  3. 16-18 d 후 차별화에서 일시 중지는 cardiomyocytes 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 2 mL와 함께 각 잘 헹 궈 서 칼슘 또는 마그네슘, 인큐베이션 1 mL/트립 신 또는 셀 분리 시 약 (참조 테이블의의 뒤에 없이 재료) 실 온에서 5 분.
  4. 트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 셀 미디어 B-27 (RPMI/B-27 셀 미디어)와 보완의 동일한 볼륨을 사용 하 여. 위쪽 및 아래쪽 준수 셀을 풀고 플라스틱.
  5. 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 정지 cardiomyocytes 수집 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.
  6. 세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 얻기 위해 상 온에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심
  7. RPMI/B-27 셀 미디어 10 mL에 펠 릿을 resuspend.
  8. 20 µ L 세포 현 탁 액의 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 결합 하 고 부드럽게 혼합.
  9. 수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.

2입니다. 섬유 아 세포의 준비

  1. 앞에서 설명한16인간의 심장 섬유 아 세포 (HCF) (성인 심 실 타입) 셀 라인의 문화를 시작 합니다.
  2. 트립 신 또는 셀 분리 시의 적절 한 금액으로 그들을 배양 하 여는 HCFs 일시 중단 ( 재료의 표참조) 실내 온도16시 5 분. T175 플라스 크에 10 mL의 트립 신 또는 셀 분리 시 약 사용 되었다.
  3. 트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 다음 50 mL 원뿔 튜브에 샘플을 전송 매체의 동일한 볼륨을 사용 하 여, 고를 실 온에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심을 펠 릿입니다.
  4. 섬유 아 세포 성장 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend ( 재료의 표참조).
  5. 20 µ L HCF 세포 현 탁 액의 0.4 %trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 결합 하 고 부드럽게 혼합.
  6. 자동된 셀 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 새로운 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.

3입니다. 내 피 세포의 준비

  1. 앞에서 설명한17인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC) 라인의 문화를 시작 합니다. 트립 신 또는 셀 분리 시의 적절 한 금액으로 그들을 배양 하 여는 HUVECs를 일시 중단 ( 재료의 표참조) 실내 온도17시 3 분. 트립 신 또는 셀 분리 시 중화 ( 재료의 표참조) 다음 50 mL 원뿔 튜브에 전송 매체의 동일한 볼륨을 사용 하 여, 및 펠 릿을 실 온에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심.
    참고: T175 플라스 크에 10 mL의 트립 신 또는 셀 분리 시 약 사용 되었다.
  2. 내 피 세포 성장 매체의 10 mL에 펠 릿을 resuspend ( 재료의 표참조).
  3. HUVEC 서 스 펜 션의 20 µ L를 결합 하 여 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 동일한 금액으로 그것을 얼룩 하 고 부드럽게 혼합.
  4. 자동된 셀 카운터 또는 수동 hemocytometer를 사용 하 여 계산 하 고 세포 현 탁 액의 농도 세포 생존 능력을 구하십시오.

4입니다. 드롭 Spheroids 매달려의 창조

  1. 교수형 장소 살 균 6 잘 플레이트에 (각각 350 µ m의 직경) 850 micropores를 포함 하는 드롭 장치.
  2. 위에서 설명한 세 가지 종류의 세포를 분리: hiPSC CMs, HCFs, 및 HUVECs. ML 당 2,475,000 세포의 농도에 RPMI/B-27 셀 미디어 70 %iPSC-CMs, 15% HCFs 50 mL 원뿔 튜브에서 15 %HUVECs 비율에 그들을 결합.
  3. 드롭 시스템 (350 µ m의 작은 직경) 6 잘 플레이트에 매달려 매우 낮은 첨부 파일의 각 음에 세포 현 탁 액 (mL 당 2,475,000 세포)의 4 mL를 분배.
  4. Spheroids는 교수형에 세포 현 탁 액을 분배의 12 h 이내 저절로 형성 드롭 장치. 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도에서 72 h (3 d)의 총에 대 한 문화는 spheroids의 성숙에 대 한 계속.
  5. 문화의 72 h 후 수확 교수형의 바닥에 숨 구멍을 통해 spheroids 매체와 접시에 장치를 배치 하 고 소용돌이 그것 부드럽게 교수형에서 spheroids를 해제 하 여 시스템을 드롭 드롭 장치.

5. 3 차원 패치 창조 소설 그물 형을 사용 하 여

  1. 기지, 평방 바닥판, 바닥 그물, 및 10 층된 측면 그물은 소독 집게의 쌍의 원조와 함께 소설 몰드를 만드는 조립 첫째, 스택 및 기지, 바닥판 평방, 정렬 하단 코너 게시물을 사용 하 여 net. 그런 다음 스택과 고급 스테인레스 스틸 접지 단자의 그물을 만드는 방향으로 번갈아에 10 쪽 그물 레이어.
  2. 플러시 PBS 또는 매체를 표면 장력을 감소, 다음, 전송 충전 베이스에 조립된 형 기본 작성.
  3. PBS와 같은 방법에 있는 매체 그물 금형 캐비티에 젖은. 천천히 원하는 크기의 전제 된 구멍에는 spheroids를 입력 (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 m m, 또는 6 x 6 x 1 m m).
    참고: 셀 집계에 꽉 연결 하 고 정적 유지 구멍에 spheroids의 예상된 하는 볼륨의 120% 공급 있는지 확인 합니다.
  4. Net 상단과 상단 스퀘어 플레이트 코너 게시물에 어셈블합니다 및 stoppers 및 지주 튜브는 spheroids의 유실을 방지 하기 위해 보안.
  5. 6 잘 플레이트 RPMI/B-27 셀 미디어 또는 전체 조립된 형을 충당 하기 위해 충분 한 매체와 멸 균 용기에 6 mL와 채워진된 그물 형 시스템 전송.
  6. 3000-4000 x g에 7-10 일 동안 스윙 통에 채워진된 금형 시스템 6 잘 플레이트를 품 어.
    참고:는 인큐베이션 기간 심장 패치의 크기에 의해 결정 됩니다. 큰 패치, 보육 시간 심장 패치 성숙에 대 한 증가 합니다.

6. 소설 그물 형에서 패치 제거

  1. 미디어에서 금형 시스템을 제거 하 고 소독된 처리 매트 살 균 10 cm 접시에에 놓습니다.
  2. 지주 관, stoppers, 상단 사각 접시 및 최고 그물을 제거 합니다. 신중 하 게 살 균 집게의 쌍을 가진 계층된 측면 그물 하나에 의해 밖으로 슬라이드. Decannulation, 후 그대로 심장 패치 하단의 그물 위에 얻을 수 있다.
  3. 소독 집게를 사용 하 여 패치 순 하단을 선택 하 고 하단의 net RPMI/B27 미디어의 5 mL와 함께 35 mm 접시에 전송. 부드럽게 천천히 접시, 또는 살 균 세포 스 크레이 퍼와 함께 그물을 소용돌이 의해 그물 아래에서 패치를 풉니다. 그물 아래에서 초연, 후 심장 조직 RPMI/B27 미디어 양식 수 있습니다.
  4. 35 mm 접시에 부동성 3 차원 심장 패치를 품 어 계속. 금형에서 제거 후 빠르면 24 시간 기능 동기 박동을 관찰할 수 있습니다.
  5. 그물 형에서 패치를 제거한 후 모양을 무결성 및 시간 동기 박동 증가의 강도 유지는 관찰 합니다.
    참고: 3 차원 그물 형 기반 심장 패치 전시 decannulation 후 구성 요소 cardiospheres의 전기 통합. 우리는 60에서 80 분당 60 일 이상 유지 하는 구타 주파수를 관찰.

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Representative Results

우리의 실험에 우리는 70 %iPSC-CMs, 15% HCFs RPMI/B-27 셀 미디어 mL 당 2,475,000 세포의 농도에 15 %HUVECs 세포 현 탁 액을 활용. 세포 현 탁 액을 만든 후 우리는 프로토콜의 4.3 단계에서 설명한 대로 드롭 시스템에 매달려 매우 낮은 첨부 파일의 각 음에 세포 현 탁 액 4 mL 적절. 교수형의 사용 문화 37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 습도에서 3 일 후에 spheroids를 치고 수백의 자발적인 형성 귀착되 었 다 드롭 시스템. Spheroids는 쉽게 4 배와 10 배 확대 한 평균 직경 350 µ m의 문화 (그림 1)의 72 h 후에 가벼운 현미경 아래 박동을 관찰 했다.

Spheroids, 수확 후 프로토콜의 6.5 단계의 끝에 금형 쉽게 간단한 pipetting 방법 시드 했다. Spheroids;의 융합에 대 한 허용 하는 곰 팡이의 배양 기계적 무결성 그대로 심장 패치 형의 후속 제거 결과. 제거 후 금형 및 문화의 24 시간에서 심장 조직의 기능과 동기 박동 확인 spheroids (그림 2, 왼쪽)의 기계적 통합 관찰 되었다. 우리는 또한 spheroids의 여러 레이어 조정 패션 가벼운 현미경 검사 법 (그림 2, 오른쪽)에 자발적으로 구타 했다 관찰 했다.

그물 형 기반 3 차원 심장 패치 또한 심장 마커 분 토니 공초점 영상과 수행의 immunohistochemical 분석 잘 정렬된 cardiomyocytes 보여주는 모든 전시 분 T 식 (그림 3).

Figure 1
그림 1 : 매달려 드롭 spheroids의 창조. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes (hiPSC-CMs), 인간의 심장 섬유 아 세포 (HCFs), 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 절연 그리고에 70 %iPSC-CMs, 15 %HCFs 15 %HUVECs, 세포 현 탁 액을 생성 하는 데 사용 되는 mL 당 2,475,000 세포의 농도입니다. 72 h 후 각 작은 세공에 자발적으로 형성된 spheroids 가벼운 현미경 검사 법에서 박동 수를 쉽게 관찰 되었다. 왼쪽된 패널에서 눈금 막대 = 1000 µ m; 오른쪽 패널에서 눈금 막대 = 400 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 다층된 심장 조직 구성 요소 spheroids의 통합 표시의 창조. 그물 형에서 분리, 후 3 차원 심장 패치 그 모양을 유지 하 고 동기 박동, 왼쪽된 패널에 표시 된 것 처럼, spheroids의 기계적 통합을 나타내는 설명 (어디 눈금 막대 = 1000 µ m). 오른쪽 패널에 표시 된 대로 spheroids의 누적된 다층 가벼운 현미경 검사 법, 검사 했다 (어디 눈금 막대 = 400 µ m), 그리고 자발적으로 박동을 관찰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 심장 조직 면역 형광 검사 평가. 면역 형광 분석에는 그물 형 기반 3 차원 심장 조직 분 T 식으로 잘 정렬 된 cardiomyocytes 이루어져 발견 됐다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 방법의 중요성의 재현성 및 결과 다층 심장 조직의 효율성에 있다. 심장 조직 공학 분야에서 현재 목표 중 하나는 치는, 다층, 고 기능 3 차원 심장 패치를 생성 하는 방법을 식별 하입니다. 우리는 spheroids 소설 그물 형으로 cardiomyocytes, 내 피 세포, 섬유 아 세포의 구성의 직접 수동 시드 다층된 심장 조직 만들기의 효율적이 고 재현 가능한 방법 보고. 이 방법에 사용 되는 그물 형 6 x 6 x 1 m m 2 x 2 x 1 밀리미터에서 배열 하는 조직의 창조에 대 한 서로 다른 크기의 다양 한 있다. 우리가 설명 또한 다른 금형 셰이프 및 원하는 조직 형상에 따라 시스템을 수정할 수 있습니다. HiPSC-CMs에 대 한 설명된 셀 농도 및 비율 이전 최적화 했다 하 고 다른 셀 형식에 대 한 수정 추가 평가 요구할 것 이다.

생체 외에서 의 창조 bioprinter 기술을 사용 하 여 3 차원 심장 조직 치료 및 진단 모델 개발의 희망으로 탐험 되었습니다. 그러나, 현재 bioprinting 메서드는 복잡 하 고 상당한 시간과 바늘 또는 비 계 자료 등 보조 지원 구조를 사용 하 여 필요. 이러한 보조의 존재 구조 감소 영양분 및 산소18의 보급을 지원 합니다. 따라서, 중앙 괴 사는19산소와 영양분을 공급 하는 모세 혈관의 부족으로 인해 현재 3 차원 심장 구조에 중요 한 관심사 이다. 사 카 구치 외. 지향 끼우기의 방법을 적용 시트와20내 피 네트워크 개발 하기 위해 혈관 침대 생물 반응 기를 사용 하 여 셀. 여기에 제시 된 그물 형 시스템에서 금형 캐비티 영양분과 지원 구조 또는 공중 발판의 요구 사항 없이 산소의 충분 한 보급을 허용할 수 있습니다. 또한, 그물 형 기반 메서드는 효율적 이며 모두 뿌리기는 spheroids의 금형 및 후속 패치의 유지 보수에 대 한 전문된 기술이 필요로 하지 않습니다. 이와 같이, 그것은 신속 하 고 저렴 한 방식으로 동기적으로 꺾고 취득 고 기능 심장 패치입니다.

회전 타원 체 지름과 각각에 사용 되는 spheroids의 수를 최적화 하기 위해 매달려 드롭 장치, 실시 문제 해결 및 세포 유형 및 수량에 관한 수정. 이 순 형 기반 방법에 대 한 회전 타원 체 직경 및 spheroids 사용의 수를 적절 한 크기의 기능 심장 조직을 만드는 가장 중요 했다. 우리는 심장 조직의 창조에 대 한 최고의 회전 타원 체 크기를 최적화 하기 위해 다른 셀 농도 했어요. 세 가지 유형의 셀 교수형에 의해 심장 spheroids를 만드는 데 사용 된 70 %iPSC-CMs, 15 %HCFs, 및 15 %HUVECs 포함 드롭 장치. 가벼운 현미경 검사 법, 아래 각 작은 세공에 자발적으로 형성된 spheroids 쉽게 치기 72 h 후에 관찰 되었다. 우리는 spheroids의 직경 교수형의 세포 농도 함께 증가 관찰 드롭 장치. 우리 시도 RPMI/B27 매체의 4 mL와 각 장치에서 300 spheroids 100 spheroids에서 spheroids의 다른 농도. 수많은 시험, 우리 발견 그 결과 spheroids의 최적 직경 나왔고 mL 당 2,475,000 세포의 농도. Spheroids의 최적화 된 직경, 우리는 어려움 컬렉션 및 다층 심장 조직 창조의 그물 형 기반 방법에 중요 한 단계는 누적된 순 형에 spheroids의 시드를 경험 했다.

프로토콜의 가장 중요 한 단계는 회전 타원 체 크기의 최적화 이다. Spheroids이이 메서드에서 사용 되는 다른 bioprinting 기술21에서 사용 하는 회전 타원 체 시체의 크기 보다 작은 언급 가치가 있다. 더 큰 spheroids 영양 및 산소22의 부족 한 보급으로 인해 중앙 괴 사를 발견 되었습니다. 으로 작은 직경을 가진 spheroids, 영양분과 산소를 각 회전 타원 체의 중심의 적절 한 보급은 더 쉽게 달성, 결과 패치의 모든 분야에서 세포 생존 능력을 증가. 여기에 제시 된 프로토콜에서 350 µ m의 회전 타원 체 직경은 향상 된 세포 생존 능력 및 spheroids, 사이 더 접촉 표면적 우리가 믿는 심장 조직 순 곰 팡이를 사용 하 여의 성공적인 창조에 기여 합니다. 따라서, 이것은 기술된 방법론에 중요 한 단계 이다. 다른 셀 형식 프로토콜에 맞게 추가 회전 타원 체 크기 최적화 실험이 필요 합니다.

이 방법의 한계는 정확 하 게는 spheroids의 스태킹 제어를 포함 합니다. 이 결과 조직 패치 및 이기종 두께의 균일도의 지역에서 발생합니다. 또한, 최소는 spheroids의 시드를 위한 실제 실습 시간 이지만, 큰 다중된 패치의 창조는 spheroids의 융합에 대 한 있도록 확장된 문화 시간을 필요 합니다.

미래 응용 프로그램,이 소설 그물 형 기반 방법은 수동 최소의 노력으로 3 차원, 비 계 없는 심장 조직 만들기의 효율적이 고 재현 가능한 방법이입니다. 만족 스러운 구조적 무결성 및 동기 박동 동작 융합된 spheroids 결과 다층된 조직에 의하여 이루어져 있다. 이 순 형 기반 선물 비용 효율적이 고 확장 가능한 현재 대체 바이오-제조 방법의 설계 조직 방법과의 목표와 함께 심장 마비의 치료에 대 한 임상 적용 가능한 심장 조직을 만들 가능성이 있다 허 혈 성 또는 역 기능 cardiomyocytes23교체. 또한,이 방법은 잠재적인 새로운 약물 치료24의 환자 관련 검 진에 대 한 심장 조직을 만드는 데 활용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

저자는 다음 자금 출처 인정: 심혈 관 연구에 대 한 마술을 문제 기금.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

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References

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