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Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

Bioengineering

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Summary

Ce protocole décrit une méthode axée sur le moule nette pour créer des tissus cardiaques exempte d’échafaudage tridimensionnels avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone.

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Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

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Abstract

Ce protocole décrit un procédé nouveau et facile net axée sur le moule pour créer des tissus cardiaques d’en trois dimensions (3d) sans matériel d’échafaudage supplémentaires. Cardiomyocytes de DERIVES de cellules-souches humaines pluripotentes (iPSC-CMs), les fibroblastes cardiaques humaines (CS) et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont isolées et utilisés pour générer une suspension de cellules avec 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs. Ils sont conjointement mis en culture dans un système de « goutte suspendue » de fixation ultra faible, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné. Les cellules agrègent et forment spontanément sphéroïdes de battement après 3 jours de culture mixte. Les sphéroïdes sont récoltés, ensemencées dans une cavité de moule roman et cultivées sur un agitateur dans l’incubateur. Les sphéroïdes devient un tissu fonctionnel mature environ 7 jours après le semis. Les tissus multicouches qui en résulte se composent des sphéroïdes fusionnés avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone. Cette nouvelle méthode a un potentiel prometteur comme une méthode reproductible et rentable de créer des tissus conçus pour le traitement de l’insuffisance cardiaque à l’avenir.

Introduction

Ingénierie de tissu cardiaque actuelle vise à développer une thérapie pour remplacer ou réparer la structure et la fonction du tissu myocardique lésée1. Méthodes pour créer des modèles 3D de tissu cardiaque présentant les propriétés contractiles et électrophysiologiques importantes du tissu cardiaque indigène ont rapidement étendu2,3. Diverses stratégies ont été exploré et utilisé dans les études4,5. Ces méthodes vont de l’utilisation des hydrogels bioactifs naturels et synthétiques spécifiques, comme la gélatine, le collagène, fibrine et peptides6, à la bio-encre dépôts technologies2 et bioprinting technologies7.

Il a été démontré que méthodes exempte d’échafaudage peuvent produire des tissus comparables comme les méthodes axées sur les biomatériaux, sans les inconvénients de l’incorporation de matière étrangère échafaudage8. Oren Caspi et coll. ont montré que l’incorporation de différents types de cellules active la génération de fortement vascularisé humain tissu cardiaque machiné9. Menton et coll. mis au point une méthode d’impression 3D pour la création de patch cardiaque de sphéroïdes. Correctifs qui en résultent sont composées des cardiomyocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales dans un ratio de 70:15:1510. Sphéroïdes ont démontré être efficaces « building blocks » de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage, comme ils résistent contre l’hypoxie et posséder une intégrité mécanique suffisante pour implantation11,12. Des études antérieures ont démontré plusieurs méthodes de fabrication pour la création de sphéroïde, y compris l’utilisation de la pendaison de glisser méthode, fileur flacons13, de systèmes microfluidiques14et les surfaces de culture non adhérents non couchés ni enduits avec d’agarose micro-moules15. Dans ce protocole, nous utilisons la pendaison goutte périphérique, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné.

Cette étude présente une nouvelle et efficace méthode sans échafaudage pour la création de tissu cardiaque, qui comprend l’ensemencement manuellement les sphéroïdes dans une cavité de moule carré et en incubant le tissu sur un agitateur pour la maturation. Dans des conditions de culture statique habituel, diffusion de l’oxygène est limitée aux aspects extérieurs de la construction des tissus, entraînant une nécrose centrale. Cependant, avec le moule net, tous les sphéroïdes ensemencées dans le moule sont immergés dans les médias avec un mouvement constant fluidique, permettant la diffusion accrue de nutriments et d’oxygène. En outre, cette méthode axée sur le moule permet la création simultanée de patchs de tissus de différentes tailles avec un minimum d’effort manuel et le tissu qui en résulte peut être facilement retiré du moule. Cette nouvelle méthode permet la création efficace et reproductible des patchs cardiaques sans échafaudage et multicouches.

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Protocol

1. préparation des Cardiomyocytes

  1. Plaques 6 puits manteau avec membrane basale matrice et la culture anthropique des cellules souches pluripotentes (hiPSCs) comme décrit plus haut17.
  2. La différence de hiPSCs en hiPSC-CMs à l’aide des méthodes décrites précédemment,18.
  3. À différenciation après d 16-18, suspendre les cardiomyocytes en rinçant chaque puits avec 2 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ou magnésium, suivi par incubation avec 1 mL/puits de la trypsine ou cellule réactif de dissociation (voir Table de Matériaux) pendant 5 min à température ambiante.
  4. Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un volume égal de milieux cellulaires de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionnés de B-27 (milieux de cellules RPMI/B-27). Pipetter en haut et en bas pour décoller les cellules adhérentes.
  5. Recueillir les cardiomyocytes suspendus avec une pipette sérologique de 10 mL et de les transférer dans un tube conique de 50 mL.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot cellulaire.
  7. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieux cellulaires RPMI/B-27.
  8. Combinez 20 µL de suspension cellulaire avec une quantité égale de solution de bleu de Trypan 0,4 % et mélanger doucement.
  9. Utilisez un hémocytomètre manuels pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la suspension cellulaire.

2. préparation des fibroblastes

  1. Initier une culture d’une lignée de cellules de fibroblaste cardiaque humain (HCF) (type adulte ventriculaire) comme décrit plus haut16.
  2. Suspendre les CS en incubant eux avec une quantité appropriée de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) pendant 5 min à température ambiante,16. Pour un flacon de T175, 10 mL de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire a été utilisé.
  3. Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un égal volume de liquide, puis transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 mL et centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un Pellet.
  4. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de croissance de fibroblaste (voir Table des matières).
  5. Combinez 20 µL de la suspension cellulaire HCF avec une quantité égale de solution de bleu de trypan 0,4 % et mélanger doucement.
  6. Utiliser un compteur de cellules automatisé ou manuel hémocytomètre pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la nouvelle suspension cellulaire.

3. préparation des cellules endothéliales

  1. Initier une culture d’une lignée de cellules endothéliales (HUVEC) de veine ombilicale humaine comme décrit plus haut17. Suspendre les HUVECs en incubant eux avec une quantité appropriée de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) pendant 3 min à température ambiante17. Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un égal volume de liquide, puis transférer dans un tube conique de 50 mL et centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir une boulette.
    Remarque : Pour un flacon de T175, 10 mL de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire a été utilisé.
  2. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture de cellules endothéliales (voir Table des matières).
  3. Mélanger 20 µL de la suspension HUVEC et souiller avec une quantité égale de solution de bleu de Trypan 0,4 % et mélanger doucement.
  4. Utiliser un compteur de cellules automatisées ou un hémocytomètre manuels pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la suspension cellulaire.

4. création de la pendaison des sphéroïdes Drop

  1. Placez la pendaison goutte périphérique qui contient des 850 micropores (chacun avec un diamètre de 350 µm) en plaques de 6 puits stériles.
  2. Isoler les trois types de cellules comme décrit ci-dessus : hiPSC-CMs, CS et HUVECs. Combiner dans une proportion de 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs dans un tube conique de 50 mL avec les milieux cellulaires RPMI/B-27 à une concentration de 2 475 000 cellules / mL.
  3. Diluer 4 mL de la suspension cellulaire (2 475 000 cellules / mL) dans chaque puits d’un accessoire ultra faible système goutte (d’un diamètre de micropore de 350 µm) assis dans une plaque 6 puits.
  4. Sphéroïdes seront forme spontanément dans les 12 h de dispenser la suspension cellulaire dans la pendaison goutte périphérique. Continuer à la culture pour un total de 72 h (3 jours) à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité pendant la maturation des sphéroïdes.
  5. Après 72 h de culture, récolter les sphéroïdes à travers les pores au bas de la pendaison drop système en plaçant l’appareil dans un plat avec un moyen et en agitant délicatement pour libérer les sphéroïdes de la pendaison goutte périphérique.

5. création de Patch 3D en utilisant le nouveau moule Net

  1. La base carré plaque de fond, filet de base et 10 côté couches filets sont assemblés pour créer le nouveau moule à l’aide d’une paire de pince stérile. Tout d’abord, empiler et alignez la base, le socle carré et fond net en utilisant les poteaux d’angle. Ensuite, la pile et couche les filets 10 côté en alternant les instructions pour créer un réseau de fines broches en acier inoxydable.
  2. Rincer le remplissage base avec PBS ou moyen pour réduire la tension superficielle et, ensuite, transférer le moule assemblé sur la base de remplissage.
  3. Mouiller la cavité du moule net avec PBS ou moyen dans la même méthode. Remplir lentement les sphéroïdes dans la cavité présupposée de la taille désirée (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, ou 6 x 6 x 1 mm).
    Remarque : Assurez-vous que 120 % du volume prévu des sphéroïdes est introduit dans la cavité, afin que les agrégats de cellules sont en lien étroit et restent statiques.
  4. Assembler le haut net et le haut de la page plaque carrée sur les poteaux d’angle et sécuriser les bouchons et les tubes d’exploitation afin d’éviter un affaissement des sphéroïdes.
  5. Transférer le système rempli de moisissure net à une plaque 6 puits 6 ml de milieux cellulaires RPMI/B-27 ou dans un contenant stérile avec assez moyen pour couvrir le moule assemblé ensemble.
  6. Incuber la plaque 6 puits avec le système de moule rempli sur un agitateur oscillant pendant 7 à 10 jours à 3 000-4 000 x g.
    Remarque : La durée de l’incubation est décidée par la taille des patchs cardiaques. Avec des taches plus grandes, le temps d’incubation devra être augmentée pour la maturation de patch cardiaque.

6. suppression du correctif du roman moule Net

  1. Enlever la moisissure des médias et placez-le sur le tapis de manutention stérilisé dans un récipient stérile de 10 cm.
  2. Enlever le tube de l’exploitation, bouchons, la plaque carrée supérieure et le haut de la page net. Glisser délicatement les filets côté en couches une par une avec une paire de pince stérile. Après décanulation, un patch cardiaque intact est obtenu au sommet du filet de base.
  3. Transférer le filet de base dans un plat de 35 mm avec 5 mL de RPMI/B27 médias et relever le filet de base avec le correctif à l’aide d’une pince stérile. Desserrer doucement le patch dans le filet de base en agitant doucement le filet dans le plat, ou avec un grattoir de cellules stériles. Après le détachement du fond net, le tissu cardiaque peut être cultivé avec médias RPMI/B27.
  4. Continuer à incuber le patch cardiaque 3D flottant librement dans le plat de 35 mm. Battement synchrone fonctionnelle peut être observée dès 24h après l’enlèvement du moule.
  5. Après avoir enlevé le patch du moule net, observer que sa forme est maintenue avec intégrité et de l’intensité de battement synchrone augmente avec le temps.
    Remarque : Les correctifs cardiaques 3D basé sur moule nets exposé intégration électrique du composant cardiospheres après décanulation. Nous avons observé une fréquence de battement allant de 60 à 80 battements par minute qui perdure depuis plus de 60 jours.

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Representative Results

Dans nos expériences, nous avons utilisé une suspension cellulaire de 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs en milieux cellulaires RPMI/B-27 à une concentration de 2 475 000 cellules / mL. Après avoir créé la suspension cellulaire, nous avons distribué 4 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’un accessoire ultra faible chute de système, comme indiqué au point 4.3 du protocole. L’utilisation de la pendaison goutte système conduit à la formation spontanée de centaines de battre sphéroïdes après 3 jours de culture à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité. Les sphéroïdes ont été facilement observable à battre sous microscopie optique 4 X et le grossissement de 10 X avec un diamètre moyen de 350 µm après 72 h de culture (Figure 1).

À la fin de l’étape 6.5 du protocole, après la récolte les sphéroïdes, le moule a été facilement ensemencé avec des méthodes simples de pipetage. Culture du moule prévue une fusion des sphéroïdes ; retrait subséquent du moule a entraîné un patch cardiaque intact avec intégrité mécanique. Après le retrait de la moule et les 24h de la culture, battement synchrone et fonctionnelle du tissu cardiaque a été observée, confirmant l’intégration mécanique des sphéroïdes (Figure 2, gauche). Nous avons également observé que les couches multiples de sphéroïdes étaient battant spontanément de manière coordonnée sur la microscopie optique (Figure 2, droit).

Une analyse immunohistochimique du filet axée sur le moule 3D patch cardiaque a également été réalisée avec l’imagerie confocale de marqueurs cardiaques troponine T. a montré que les cardiomyocytes bien alignées tout exposé expression troponine T (Figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Création de la pendaison des sphéroïdes goutte. Cardiomyocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CMs), les fibroblastes cardiaques humaines (CS) et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) ont été isolés et utilisés pour générer une suspension de cellules possédant 70 % iPSC-CMs et 15 % CS HUVECs 15 %, à un concentration de 2 475 000 cellules / mL. Après 72 h, les sphéroïdes spontanément formés dans chaque micropore étaient facilement observable à battre sous microscopie optique. La barre d’échelle dans le panneau gauche = 1 000 µm ; la barre d’échelle dans le panneau droit = 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Création d’un tissu cardiaque multicouche montrant l’intégration des sphéroïdes composant. Après le détachement du moule net, le patch cardiaque 3D maintient sa forme et démontré battement synchrone, indiquant l’intégration mécanique des sphéroïdes, comme montré dans le panneau de gauche (où la barre d’échelle = 1 000 µm). Les multicouches empilés des sphéroïdes ont été inspectés par microscopie optique, comme indiqué dans le panneau de droite (où la barre d’échelle = 400 µm) et observé à battre spontanément. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Évaluation d’immunofluorescence du tissu cardiaque. Sur l’analyse de l’immunofluorescence, le net axée sur le moule 3D tissu cardiaque s’est avéré se composent des cardiomyocytes bien alignées avec l’expression de la troponine T. La barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’importance de cette méthode réside dans sa reproductibilité et l’efficacité du tissu cardiaque multicouche qui en résulte. Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cardiaque, l’un des objectifs actuels est d’identifier une méthode pour construire les patchs cardiaques 3D battant, multicouches et fonctionnelles. Nous rapportons une méthode efficace et reproductible de création de plusieurs couches de tissus cardiaques par semis manuel direct des sphéroïdes composés des cardiomyocytes, cellules endothéliales, fibroblastes et dans un nouveau moule net. Le moule nets utilisé dans cette méthode a une variété de différentes tailles pour la création de tissus allant de 2 x 2 x 1 mm à 6 x 6 x 1 mm. Les techniques que nous avons décrites peuvent également être modifiées pour moule différentes formes et des systèmes en fonction de la géométrie des tissus souhaités. Les concentrations cellulaires décrits et des rapports ont été optimisées précédemment pour hiPSC-CMs, et modifications apportées à un type de cellule différente exigera une évaluation supplémentaire.

La création in vitro de tissus cardiaques 3D, en utilisant la technologie bioprinter a été explorée avec l’espoir de développer des modèles thérapeutiques et diagnostiques. Cependant, les méthodes actuelles de bioprinting sont lourdes et nécessitent beaucoup de temps et de l’utilisation de structures de soutènement connexes tels que les aiguilles ou le matériel d’échafaudage. La présence de ces accessoires support diminue de structures la diffusion des nutriments et l’oxygène18. Par conséquent, la nécrose centrale est une préoccupation majeure dans les concepts actuels cardiaques 3D, en raison du manque de capillaires pour fournir de l’oxygène et des nutriments19. Sakaguchi et coll. appliqué la méthode du sandwich axé sur des cellules feuilles et à l’aide de bioréacteurs de lit vasculaire pour développer un réseau endothéliales20. Dans le système de moule net présenté ici, la cavité du moule peut permettre une diffusion suffisante de nutriments et d’oxygène sans l’obligation de prise en charge des structures ou échafaudages. En outre, la méthode axée sur le moule nette est efficace et ne nécessite pas de compétences spécialisées pour les deux l’ensemencement des sphéroïdes dans le moule et le maintien du patch ultérieur. Par conséquent, c’est une manière rapide et peu coûteuse d’acquérir battant synchroniquement et patchs cardiaques fonctionnels.

Afin d’optimiser le diamètre de sphéroïde et le nombre des sphéroïdes utilisé dans chaque suspension drop dispositif, nous avons effectué dépannage et modifications portant sur les types de cellules et les quantités. Pour cette méthode axée sur le moule du net, le diamètre de l’ellipsoïde et le nombre des sphéroïdes utilisés étaient d’une importance primordiale pour créer un tissu cardiaque fonctionnel de taille adéquate. Nous avons essayé les concentrations cellulaires différentes afin d’optimiser la meilleure taille de sphéroïde pour la création du tissu cardiaque. Trois types de cellules ont été utilisés pour créer des sphéroïdes cardiaques par la pendaison goutte périphérique, qui comprend 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs. En vertu de la microscopie photonique, les sphéroïdes spontanément formés dans chaque micropore étaient facilement observable à battre après 72 h. Nous avons observé que le diamètre des sphéroïdes augmente avec la concentration cellulaire de la pendaison goutte périphérique. Nous avons essayé différentes concentrations des sphéroïdes, des 100 sphéroïdes à 300 sphéroïdes dans chaque appareil, avec 4 mL de milieu RPMI/B27. Avec de nombreux essais, nous avons constaté que la concentration de 2 475 000 cellules / mL ont un diamètre optimal des sphéroïdes qui en résulte. Avec le diamètre optimisé des sphéroïdes, nous avons connu la collection sans effort et l’ensemencement des sphéroïdes dans le moule net empilé, qui ont été des étapes importantes à la méthode axée sur le moule nette pour la création de tissu cardiaque multicouche.

L’étape la plus critique du protocole est l’optimisation de la taille de sphéroïde. Il est à noter que les sphéroïdes utilisées dans cette méthode sont plus petites que la taille des organes sphéroïde utilisés dans d’autres techniques de bioprinting21. Sphéroïdes plus grandes ont été trouvés pour avoir une nécrose centrale en raison d’une diffusion insuffisante de la nutrition et l’oxygène22. Avec sphéroïdes avec un diamètre plus petit, diffusion suffisante de nutriments et d’oxygène au centre de chaque sphéroïde est plus facilement réalisable, augmentant la viabilité cellulaire dans tous les domaines du patch qui en résulte. Dans le protocole présenté ici, permet à un diamètre de sphéroïde de 350 µm pour la viabilité cellulaire améliorée et plus de contact surface entre les sphéroïdes, dont nous pensons que contribue à la création du tissu cardiaque à l’aide de ce moule net. C’est donc une étape cruciale dans la méthodologie décrite. Pour adapter le protocole à d’autres types de cellules, sphéroïde supplémentaires taille optimisation des expériences sont nécessaires.

Les limites de cette approche incluent l’incapacité de contrôler précisément l’empilement des sphéroïdes. Cela se traduit par des zones de non-uniformité des patchs de tissu qui en résulte et épaisseur hétérogène. En outre, bien que le temps réel de pratique pour l’ensemencement des sphéroïdes est minime, la création de grandes plaques multicouches nécessite un temps de culture prolongée pour permettre la fusion des sphéroïdes.

En ce qui concerne les futures applications, cette nouvelle méthode axée sur le moule nette est une méthode efficace et reproductible de création 3D, exempt d’échafaudage les tissus cardiaques avec un minimum d’effort manuel. Les tissus multicouches qui en résulte se composent des sphéroïdes fusionnés avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone. Cette méthode axée sur le moule nette présente une rentable et évolutive alternatives au courant bio-fabrication des méthodes d’ingénierie tissus et a le potentiel pour créer des tissus cardiaques cliniquement applicables pour le traitement de l’insuffisance cardiaque dans le but de remplacement des cardiomyocytes ischémiques ou dysfonctionnel23. En outre, cette méthode peut être utilisée pour créer des tissus cardiaques pour les examens préalables spécifiques à un patient de potentiels nouveaux médicaments thérapies24.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent la source de financement suivante : la magie que de questions Fonds recherche cardiovasculaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

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References

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