التركيب البلوري للمجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من إكسيلوستيلا بلوتيلا

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكولات تحديد التعبير وتنقية وبلورة وبنية البروتين المجال الطرفي ن من مستقبلات ريانوديني من فراشة diamondback (إكسيلوستيلا بلوتيلا).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nayak, B. C., Wang, J., Lin, L., He, W., You, M., Yuchi, Z. Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella. J. Vis. Exp. (141), e58568, doi:10.3791/58568 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

قد تم تطوير مبيدات حشرية قوية وفعالة تستهدف مستقبلات ريانوديني الحشرات (ريرس) من اهتمام كبير في مجال السيطرة على الآفات الزراعية. حتى الآن، العديد من مبيدات الحشرات دياميدي تستهدف مكافحة الآفات قد تم تسويقها ريرس، التي تدر الدخل السنوي 2 بیلیون دولار أمريكي. ولكن فهم طريقة عمل المبيدات الحشرية استهداف RyR محدودة بسبب الافتقار إلى المعلومات الهيكلية المتعلقة بالحشرات RyR. هذا بدوره يحد من فهم التنمية لمقاومة المبيدات الحشرية في الآفات. العثة diamondback (DBM) هو آفة مدمرة تدمير المحاصيل الصليبية في العالم، الذي ذكر أيضا تبدي مقاومة للمبيدات الحشرية دياميدي. ولذلك، أنها ذات أهمية عملية كبيرة لتطوير المبيدات الحشرية رواية استهداف RyR ديسيبل، تستهدف خصوصا منطقة مختلفة من موقع الربط دياميدي التقليدية. نقدم هنا، بروتوكولا لوصف المجال الطرفي ن من RyR من ديسيبل هيكلياً. بنية بلورية الأشعة السينية تم حلها عن طريق الاستبدال الجزيئي بدقة من 2.84، الذي يوضح فكرة قابلة لطي بيتا-البرسيم والحلزون ألفا ترافقه. هذا البروتوكول يمكن تكييفها للتعبير، وتنقية وتوصيف الهيكلية للبروتينات أو المجالات الأخرى بشكل عام.

Introduction

مستقبلات ريانوديني (ريرس) هي قنوات أيون محددة، والتوسط تخلل Ca2 + الأيونات عبر الأغشية شبكية الشبكة (SR) في خلايا العضلات. ولذلك، أنها تلعب دوراً مهما في اقتران عملية انكماش الإثارة. في شكله الوظيفي، تجمع RyR هومو تيترامير مع كتلة جزيئية من > 2 نجمة داود الحمراء، مع كل وحدة فرعية تتألف من بقايا الأحماض الأمينية ~ 5000. في الثدييات، هناك ثلاثة إيسوفورمس: RyR1-نوع الهيكل العظمى والعضلات وعضلة القلب نوع RyR2-وأعربت عن أوبيكويتوسلي في أنسجة مختلفة1-RyR3.

في الحشرات هناك نوع واحد فقط من RyR، التي يعبر عنها في أنسجة العضلات والجهاز العصبي2. RyR الحشرات أكثر مماثلة للثدييات RyR2 مع هوية تسلسل من حوالي 47%3. تم تطوير مبيدات الحشرات دياميدي استهداف RyR قشريات الجناح و Coleoptera وتسويقها من قبل شركات كبرى مثل باير (فلوبيندياميدي)، دوبون (تشلورانترانيليبرولي) وسينجينتا (سيانترانيليبرولي). منذ إطلاقها مؤخرا نسبيا، أصبحت المبيدات الحشرية دياميدي واحدة من الفئة الأسرع نمواً من المبيدات الحشرية. حاليا، تجاوزت المبيعات من هذه المبيدات الحشرية ثلاثة سنوياً 2 بیلیون دولار أمريكي بمعدل نمو بلغ أكثر من 50% منذ 2009 (أجرانوفا).

وأفادت الدراسات الأخيرة وضع المقاومة في الحشرات بعد بضعة أجيال من استخدام هذه المبيدات الحشرية4،،من56،،من78. المقاومة الطفرات في المجال ترانسميمبراني من ريرس من العثة diamondback (ديسيبل)، إكسيلوستيلا بلوتيلا (G4946E، I4790M) والمواقف المقابلة في نافقة أوراق الحمضيات الطماطم, توتا absoluta (G4903E، I4746M) تبين أن المنطقة قد يكون متورطا في ربط المبيد الحشري دياميدي كما هو معروف في هذه المنطقة أن تكون حاسمة بالنسبة النابضة للقناة4،،من89. على الرغم من بحوث مستفيضة في هذا المجال، لا تزال الآليات الجزيئية الدقيقة للمبيدات الحشرية دياميدي بعيدة المنال. وعلاوة على ذلك، من غير الواضح ما إذا كانت تؤثر الطفرات المقاومة على التفاعلات مع دياميديس اللوستيريكالي مباشرة أو غير مباشرة.

وأفادت الدراسات السابقة بنية المجالات RyR العديد من أنواع الثدييات، وهيكل كامل طول RyR1 الثدييات و RyR2 بعلم البلورات بالأشعة السينية والميكروسكوب الإلكتروني cryo، على التوالي10،11، 12،13،،من1415،16،17،،من1819،20،21 . ولكن حتى الآن، لا يوجد هيكل الحشرات RyR لم يبلغ، التي تحظر لنا من فهم تعقيدات الجزيئية لوظيفة مستقبلات فضلا عن الآليات الجزيئية لعمل المبيدات الحشرية والتنمية لمقاومة المبيدات الحشرية.

في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول معمم لتوصيف الهيكلي الطرفي ن β-البرسيم المجال من مستقبلات ريانوديني من العثة diamondback، الآفات مدمرة إصابة المحاصيل الصليبية في العالم22. تم تصميم بنية وفقا لأرنب المنشورة RyR1 NTD كريستال هياكل23،24والبرد-م النماذج الهيكلية16،17،،من1819، 20 , 21-هذا هو هيكل عالي الاستبانة الأولى ذكرت للحشرات RyR، الذي يكشف عن إليه لقناة النابضة ويقدم نموذجا هاما لتطوير المبيدات الحشرية إبلاغها باستخدام المخدرات على أساس هيكل تصميم. لتوضيح الهيكل، استخدمنا علم البلورات بالأشعة السينية، الذي يعتبر بمثابة 'المعيار الذهبي' لتصميم هيكل البروتين في القرب من القرار الذري. على الرغم من أن عملية تبلور يمكن التنبؤ بها وكثيفة العمالة، وهذا البروتوكول خطوة بخطوة ستساعد الباحثين التعبير عن وتنقية وتوصيف مجالات أخرى من الحشرات RyR أو غيرها من البروتينات بشكل عام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-استنساخ الجينات والتعبير البروتين، وتنقية

  1. [بكر] تضخيم الحمض النووي المقابلة للبروتين للفائدة (بقايا 1-205 من RyR ديسيبل، بنك الجينات الإدارية لا. AFW97408) واستنساخ في ناقلات الحيوانات الأليفة-28 ألف-جرارات باستنساخ مستقلاً عن عملية ربط (يسانس)25. ناقل هذا يحتوي على علامة الحامض الأميني والعلامة MBP وموقع TEV انقسام حوزتي في ن-المحطة15-
    1. تصميم المحامي كبسولة تفجير لتضخيم جينات المستهدفة مع الملحقات المتوافقة مع المحامي 5 ':
      إلى الأمام المحامي التمهيدي:
      تاكتككاتككاتجكاتجكجاجكجاججج 3 '5'
      عكس المحامي التمهيدي:
      تاتككاكتككاتجتاتاتاتجككجتكككجتاكجك 3 '5'
    2. الجمع بين المكونات رد فعل (50 ميكروليتر): 1 ميكروليتر من قوالب الحمض النووي (100 نانوغرام/ميكروليتر)، 1 ميكروليتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومترات)، 1 ميكروليتر من عكس التمهيدي (10 ميكرومترات)، ميكروليتر 0.5 من بوليميريز الحمض النووي (NEB)، ميكروليتر 5 10 x رد فعل المخزن المؤقت، 1 ميكروليتر من دنتب (25 مم) ، 40.5 ميكروليتر من رناسي مجاناً ddH2o.
      1. ضع المخلوط رد فعل في جهاز PCR وتشغيل البرنامج التالي.
      2. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم قم بتشغيل دورات 30 (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 15 ق، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة). احتضان عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وثم اضغط على 4 درجة مئوية.
      3. تشغيل هذا المزيج رد كامل (50 ميكروليتر) على 2% [اغروس] هلام واستخراج مع "مجموعة استخراج هلام". اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    3. مستقلة عن عملية ربط الاستنساخ (يسانس)
      1. أداء SspI الهضم (60 ميكروليتر): 20 ميكروليتر من ناقلات الحمض النووي (50 نانوغرام/ميكروليتر)، ميكروليتر 6 من 10 س رد فعل المخزن المؤقت و 4 ميكروليتر من SspI ميكروليتر 30 ddH2إينكوباتي سين في 37 درجة مئوية حاء 3 تشغيل رد فعل كامل المزيج على 1% [اغروس] هلام واستخراج مع "مجموعة استخراج هلام". اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      2. إجراء معاملة T4 دنا بوليميريز ناقل وإدراج الحمض النووي. الجمع بين ما يلي: 5 ميكروليتر من الحمض النووي متجه أو إدراج (50 نانوغرام/ميكروليتر)، ميكروليتر 2 10 x T4 المخزن المؤقت بوليميراز الدنا، 1 ميكروليتر من دجتب (25 مم) لناقل أو 1 ميكروليتر من دكتب (25 مم) لإدراج الحمض النووي، 1 ميكروليتر من DTT (100 ملم)، 0.4 ميكروليتر من T4 دنا بوليميريز (المحامي مؤهل) ، و 9.6 ميكروليتر ddH2O. إينكوباتي ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لأنزيم 40 دقيقة إلغاء تنشيط الحرارة عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: ناقل المحامي وإدراج الحمض النووي يجب معاملة منفصلة من ردود الفعل.
      3. أداء المحامي الصلب رد فعل. الجمع بين ما يلي: 2 ميكروليتر إدراج معاملة T4 الحمض النووي، 2 ميكروليتر من المحامي معاملة T4 ناقلات الحمض النووي. تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. تحويل BL21 (DE3) كولاي الخلايا مع هذا بلازميد المؤتلف.
    1. ذوبان الجليد الخلايا المختصة (50 ميكروليتر في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي) على الجليد.
    2. إضافة حوالي 1 ميكروليتر (50 نانوغرام) من بلازميد في الأنبوب. مزيج الخلايا والحمض النووي بالتحريك بلطف الأنبوب 2 – 3 مرات. ضع الأنبوبة في الثلج لمدة 20 دقيقة.
    3. حرارة صدمة في 42 درجة مئوية لمكان س. 40 الأنبوب على الجليد مرة أخرى للحد الأدنى 2 إضافة 1 مل من وسائل الإعلام في درجة حرارة الغرفة رطل إلى الأنبوب.
    4. مكان الأنبوب المخلوط في شاكر 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية ل 45 دقيقة نشر 150-200 ميليلتر من المخلوط على لوحات مختارة. عكس اللوحة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. اختيار مستعمرة واحدة وثقافة الخلايا في المتوسط 2YT 100 مل يحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. صباح اليوم التالي، تطعيم 1 لتر 2YT المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين مع 10 مل ثقافة بين عشية وضحاها، واحتضان في 37 درجة مئوية شاكر حاضنة 250 لفة في الدقيقة، حتى يصل OD600 ~ 0.6. وبعد ذلك حمل الثقافة مع إيبتج بتركيز نهائي من 0.4 مم وتنمو لآخر ح 5 في 30 درجة مئوية.
  4. حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في س 8,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع الخلايا وريسوسبيند كل الخلايا ز 10 في المخزن المؤقت لتحلل 40 مل (10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل، β-mercaptoethanol 10 مم، 25 ميكروغرام/مل lysozyme، 25 ميكروغرام/مل الدناز ، 1 مم بمسف).
    1. عرقلة من قبل سونيكيشن في السعة 65% لمدة 8 دقائق مع 1 ق ق 1 وعلى الخروج. إزالة الأنقاض الخلية باستخدام الطرد المركزي في 40,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تصفية المادة طافية بتمرير من خلال 0.22 ميكرومتر التصفية وتحميله في حلقة عينة.
  5. تنقية البروتين الانصهار وتنشق العلامة وإعادة تنقية البروتين الهدف.
    1. تنقية البروتين الانصهار باستخدام عمود ني-جاتا (المخزن المؤقت ملزم: 10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل؛ وشطف المخزن المؤقت: 10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل، ايميدازول 500 ملم) وتنقية بنظام تنقية، مع تدرج خطي ايميدازول 20-250 ملم.
    2. تنشق البروتين المستهدف التيد بحوزتي TEV (01:50 نسبة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    3. تنقية الخليط رد فعل الانقسام باستخدام عمود الراتنج اميلوز (ربط المخزن المؤقت: 10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل؛ وشطف المخزن المؤقت: 10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 250 ملم بوكل، مالتوس 10 ملم) وعمود ني-الإدارة الوطنية للسياحة لإزالة العلامة وحوزتي TEV. سوف تكون البروتين المستهدف في التدفق من خلال جزء صغير من هذين العمودين.
    4. دياليزي العينة ضد المخزن المؤقت للغسيل الكلوي (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 8.8، 50 مم بوكل، β-mercaptoethanol 10 ملم لخفض تركيز الملح. تنقية العينة على عمود صرف شاردة (المخزن المؤقت ملزم: 10 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 8.8، 10 مم β-mercaptoethanol؛ وشطف المخزن المؤقت: 10 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 8.8، 1 م بوكل، β-mercaptoethanol 10 ملم) بتدرج خطي من 20 – 500 مم بوكل في المخزن المؤقت شطف.
    5. كخطوة أخيرة في عملية تنقية، تركيز البروتين باستخدام مركزات الطرد المركزي (كاتشين موكو 10) وحقن في عمود هلام ترشيح للتأكد من التجانس سوبيرديكس 200 26/600.
  6. فحص نقاء البروتين بتشغيله على الحزب الديمقراطي الصربي 15% صفحة.
    ملاحظة: يتم تشغيل كافة الأعمدة على نظام تنقية بروتين مع تدفق ملزم بمعدل 2 مل/دقيقة، ومعدل تدفق شطف 4 مل/دقيقة باستثناء الترشيح جل في 1 مل/دقيقة.

2-البروتين إعداد وبلورة

  1. تركيز العينة البروتين المنقي إلى 10 ملغ/مل تستخدم exchange المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت لبلورة ومركزات الطرد المركزي (كاتشين موكو 10) قبل تخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. إجراء فحص التبلور (نسبة 1:1، 200 nL من البروتين و 200 nL من المخزن المؤقت للخزان) بالجلوس إسقاط أسلوب نشر بخار في ك 295 مع عدة مجموعات تبلور باستخدام سائل الآلي التعامل مع نظام الروبوتية في شكل 96-جيدا.
    ملاحظة: قمنا باستخدام مجموعات من البحث الأبعاد الجزيئية وهامبتون ومناولة السائل النظام الآلي العنقاء.
  3. إغلاق لوحة تبلور 96-جيدا لمنع التبخر وتمكين الموازنة انخفاض البروتين مع المخزن المؤقت الخزان. ثم الاحتفاظ اللوحات في الحاضنة كريستال عند 18 درجة مئوية.
  4. تحقق من لوحات 96-جيدا دورياً باستخدام مجهر ضوء لرصد تشكيل الكريستال والنمو.
  5. للتفريق بين بلورات البروتين من بلورات الملح، استخدم صبغة بروتين. أضف 1 ميليلتر من صبغة لإسقاط الهدف. انتظر حوالي 1 ح ومراقبة تحت المجهر. سوف تتحول بلورات البروتين الأزرق.
  6. استخدام شروط تبلور الإيجابية (كبريتات أمونيوم 1.5 م، م 0.1 تريس pH 8.0) لمواصلة تحسين بلورات معلقة باستخدام إسقاط أسلوب نشر بخار في لوحات 24-جيدا.
    1. تحسين درجة الحموضة من 7.0 إلى 8.5 مع الأس الهيدروجيني 0.5 وحدة الفاصل الزمني كل خطوة. تحسين تركيز كبريتات الأمونيوم من 1.2 متر إلى 1.7 متر مع الفاصل 0.1 م كل خطوة. (في حالتنا كان أفضل حالة إنتاج بلورات كبيرة على شكل لوحة كبريتات الأمونيوم pH 7.0 و 1.6 متر حبيس 0.1 M)

3. الكريستال تصاعد وجمع البيانات بالأشعة السينية، وتصميم هيكل

  1. جبل البلورات في كريولوب وبارد فلاش في النتروجين السائل باستخدام محلول خزان يحتوي على الجلسرين 20% كالبرد-protectant. ضع البلورات في أونيبوك للتخزين والنقل.
  2. قبل شاشة بلورات البروتين باستخدام ديفراكتور الأشعة سينية ريجاكو داخلية. اختر أفضل منها بقرارات أعلى لجمع البيانات في مرافق السنكروتروني (لدينا مجموعة من البيانات تم تجميعها من BL17U1 في شانغهاي الإشعاع السنكروتروني مرفق).
    1. استخدام برمجيات التحكم بيمليني بلويسي26 لتحميل ومركز البلورات بوظيفة التوسيط التلقائي أو اليدوي. إجراء اختبار التعرض لتحديد استراتيجية جمع البيانات، بما في ذلك ابتداء من الزاوية والمسافة الكاشف، عرض الإطار ووقت التعرض الأرقام.
    2. جمع البيانات وبناء على ذلك (جمعنا إطارات 180 مع وقت التعرض s 1، عرض الإطار 1° والمسافة للكشف عن 350 مم).
  3. فهرسة ودمج وتوسيع نطاق مجموعة البيانات باستخدام HKL2000 جناح27. أولاً القيام بوظيفة البحث الذروة للبحث عن البقع الحيود، والفهرس ثم البقع وحدد مجموعة الفضاء الصحيح. بعد التكامل الذروة، وتوسيع نطاق مجموعة البيانات مع النموذج الصحيح خطأ وحفظ ملف.sca الإخراج.
  4. حل مشكلة المرحلة باستبدال الجزيئية باستخدام فيزر28 في فينيكس29.
    1. حساب عدد جزيئات البروتين في الوحدة غير المتناظر نسخة ممكن إكسترياجي30.
    2. البحث عن قوالب بنية سليمة مع تسلسل عالية التشابه الهيكلية والهوية كالبروتين المستهدفة باستخدام الهياكل المعروفة من الأدب أو النماذج التي تولدها بنية التنبؤ الخادم مثل Phyre231 (استخدمنا الأرنب RyR1 NTD ك نموذج بحث، 2XOA معرف PDB).
    3. تشغيل فيزر باستخدام ملف البيانات الحيود وقالب بنية الملف والملف تسلسل البروتين لإيجاد الحل.
  5. أداء أوتوبويلد32 في فينيكس29 لتوليد النموذج الأولى باستخدام ملف الإخراج من فيزر وملف تسلسل من البروتين الهدف.
  6. يدوياً بناء الهيكل في كثافة الإلكترون التجريبية المعدلة باستخدام أبله33 وصقل باستخدام phenix.refine34 في دورات متكررة.
  7. التحقق من صحة النموذج النهائي باستخدام أدوات التحقق من صحة في فينيكس18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تنقية

وأعرب المجال الطرفي ن من RyR ديسيبل بروتين انصهار مع علامة هيكساهيستيديني وعلامة MBP وموقع انقسام حوزتي TEV. نحن اتباع استراتيجية تنقية خمس خطوات للحصول على بروتين نقي جداً، مناسبة لغرض بلورة. في البداية، كان تنقية البروتين الانصهار من الكسر القابلة للذوبان من الخلية ليستي بالعامود ني-جاتا (HP هيستراب). المقبل، البروتين الانصهار تعرضت لانشقاق حوزتي TEV وتمت إزالة مجموعة هيكساهيستيديني-MBP بعمود الراتنج اميلوز متبوعاً بعمود ني-الإدارة الوطنية للسياحة. علاوة على ذلك، تمت تنقية البروتين بعمود الصرف شاردة (HP سيفاروسي Q) وأخيراً بعمود هلام الترشيح (سوبيرديكس 200 26/600). وكان العائد النهائي للبروتين المنقي من ثقافة البكتيرية 1 لتر استخدام الوسائط 2YT ~ 4 ملغ. وأظهرت البروتين المنقي عصابة واحدة في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة في كاتشين ~ 21 (الشكل 1). وأكد حجم شطف من عمود هلام الترشيح NTD RyR المنقي لتكون مونومر (الشكل 1).

تبلور

الأولى تبلور الفرز في لوحات 96-كذلك أسفر عن البلورات في ظروف عدة. واختيرت هذه الشروط للتحسين كريستال في 24 لوحات جيدا. وكان الشرط المثلى حيث شكلت بلورات لوحة الشكل ذات جودة عالية 0.1 M حبيس كبريتات الأمونيوم pH 7.0 و 1.6 متر (الشكل 2).

تصميم الهيكل

الحصول على بلورات كان ديفراكتيد إلى 2.84 Å على بيمليني BL17U1 في "شانغهاي الإشعاع السنكروتروني مرفق". تمت فهرسة الكريستال في الفضاء الفريق ف61 مع معلمات خلية وحدة = 170.13، ب = 170.13، ج = 51.763, α = β = 90.00 °، γ = 120 °. لتحديد هيكل، وكان يعمل استبدال الجزيئية باستخدام الأرنب RyR1 NTD كنموذج بحث في فينيكس. حدث مزيد من الصقل للهيكل في فينيكس إلى النهائي Rالعمل وارمجاناً 21.63 و 24 ر 52 في المائة، على التوالي. إحصائيات جمع وتنقيح البيانات المذكورة في الجدول 1. ويرد هيكل حلها من NTD RyR ديسيبل تغطي بقايا 1-205 (5Y9V معرف PDB) في الشكل 3.

Figure 1
رقم 1: chromatogram ترشيح الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وجل تمثل تنقية ديسيبل RyR NTD35- تظهر الصفحة مخزونات النشر الاستراتيجي (15 في المائة) في اقحم المنقي NTD RyR ديسيبل كعصابة واحدة بعد الخمس خطوة استراتيجية تنقية. الممر الأيسر يظهر علامة البروتين القياسية (بعد الظهر). Chromatogram الترشيح جل الحصول عليها باستخدام عمود سوبيرديكس 200 26/600 يظهر ذروة شطف على 240 مل، الذي يتوافق مع شكل أحادي من البروتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. تبلور ديسيبل RyR NTD35بلورات NTD RyR ديسيبل أنتجت بطريقة الانتشار بخار كما يرى تحت مجهر خفيفة. وكان الشرط تبلور كبريتات الأمونيوم pH 7.0 و 1.6 متر حبيس 0.1 متر. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: هيكل NTD RyR ديسيبل (PDB المعرف 5Y9V)35حل هيكل البروتين سيظهر من بين طريقتي عرض. ويتم تمييز عناصر البنية الثانوية. وتظهر خيوط بيتا في الأرجواني. اللولب α والحلزون10 3 تظهر باللون الأزرق. وتظهر الحلقات في الأبيض. Nt والأشعة المقطعية تمثل الطرفي ن وجيم--المحطة الطرفية من البروتين، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: البيانات والإحصاءات جمع وتنقيح ل كريستال NTD RyR ديسيبل35- اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة، ونحن تصف الإجراء الذي ريكومبينانتلي إكسبريس وتنقية وبلورة وتحديد هيكل ديسيبل RyR NTD. للتبلور، شرط حاسم للحصول على البروتينات مع الذوبان العالية والنقاء والتجانس. لدينا بروتوكول، اخترنا أن استخدام ناقلات الحيوانات الأليفة-28 ألف-جرارات كما أنه يحتوي على علامة هيكساهيستيديني والعلامة MBP، التي يمكن أن تستخدم لتنقية للحصول على درجة نقاء إضعاف أعلى. بالإضافة إلى ذلك، الإيدز العلامة MBP في قابلية ذوبان البروتين الهدف. نحن تنقية البروتين بخمس خطوات متتالية مما أسفر عن البروتين التي كانت نقية للغاية ومناسبة لبلورة. أجرى الفحص تبلور باستخدام السائل الآلي التعامل مع النظام. مقارنة بالفحص التقليدي بإعداد دليل إسقاط، النظام الآلي يستخدم كميات صغيرة جداً من العينة، يوفر الوقت والطاقة. كما أنه يعزز إمكانية تكرار نتائج بسبب دقة المناولة السائل. بلورات كانت ديفراكتيد داخل المنظمة للفحص وفي السنكروتروني لجمع البيانات كما أنها توفر الأشعة السينية بكثافة أعلى وأقل اختلاف، مما تسفر عن بيانات عالية الجودة. وكان الاستبدال الجزيئي خيارنا الأول كقوالب هيكلية مماثلة كانت متوفرة في قاعدة البيانات. طريقة بديلة لاستخدام مراحل تجريبية، بما في ذلك جنون، حزين، مير، إلخ

بينما حل هيكل ديسيبل RyR NTD، ماثيوز المعاملات التي تم الحصول عليها من إكسترياجي30 اقترح أن الوحدة غير المتناظر (جامعة ولاية أريزونا) الواردة على الأرجح مونومرات الأربعة مع 46% مذيب المحتوى، الذي لديه احتمالية 49%. ومع ذلك، يمكن أن نجد لا الحل الصحيح مع أربعة جزيئات في جامعة ولاية أريزونا. كما لم يعمل اللاحقة للبحث عن جزيئات اثنين، ثلاثة، خمسة، ستة. في نهاية المطاف وجدنا الحل الصحيح مع جزيء واحد فقط في جامعة ولاية أريزونا، التي ليس لديها سوى 4 ٪ من احتمال وأكثر محتوى المذيبات 86%. محتوى المياه العالية وتأكدت بعد علينا حلها في الهيكل. وهكذا، المحتوى المذيبات عالية المدقع موجود اعتماداً على طريقة مضمنة في حزم البروتين الذي.

على الرغم من أن علم البلورات بالأشعة السينية معيار ذهب في تصميم هيكل البروتين، البروتينات مع اضطرابات كبيرة أو مناطق مرنة وبعض مجمعات البروتين الكبيرة مع تقارب ضعف تشكل تحديا لبلورة. أساليب هندسة البروتين، بما في ذلك حلقة-الاقتطاع، السطحية الانتروبيا الحد والعابرة للربط، يمكن تحسين فرصة الحصول على بلورات البروتين أفضل. إلى جانب الكشف عن هياكل البروتين عالية الدقة، يمكن أيضا استخدام البلورات بالأشعة السينية دراسة التفاعلات البروتين-مبيدات الآفات، التي سوف تساعدنا في التصميم على أساس هيكل مبيدات الآفات. وقد وجد تشي et al. أن أسر مختلفة من دياميديس قد ربط المواقع المتميزة التي تختلف عبر الأنواع36. استخدام استراتيجيتنا، واحد تحديد هياكل RyR من الأنواع المتعددة والتعرف على عناصر فريدة من نوعها المسؤولة عن سبيسيسسبيسيفيسيتي الملاحظة. عموما، هذا البروتوكول يمكن تكييفها للتعبير وتنقية وبلورة وهيكل تحديد أي البروتينات أو نطاقات البروتين بحد ذاتها أو في المجمع مع المخدرات جزيء صغير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

تمويل هذه البحوث المقدمة: الوطنية مفتاح البحث وبرنامج التنمية للصين (2017YFD0201400, 2017YFD0201403) والوطنية طبيعة مؤسسة العلوم الصينية (31320103922، 31230061) وبرنامج "المشروع للبحوث الأساسية الوطنية" (973) الصين (2015CB856500, 2015CB856504). ونحن ممتنون للموظفين بشأن بيمليني BL17U1 في شانغهاي الإشعاع السنكروتروني مرفق (سرف).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-28a-HMT vector This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain Novagen 69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL) GE Healthcare 45-000-325
Amylose resin column New England Biolabs E8021S
Q Sepharose high-performance column  GE Healthcare 17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO) Millipore UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column  GE Healthcare 28-9893-36
Automated liquid handling robotic system  Art Robbins Instruments Gryphon
96 Well CrystalQuick Greiner bio-one 82050-494
Uni-Puck Molecular Dimensions MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron Hampton Research HR4-955
CryoWand Molecular Dimensions MD7-411
Puck dewar loading tool Molecular Dimensions MD7-607
Nano drop Thermo Scientific NanoDrop One
Crystal incubator Molecular Dimensions MD5-605
X-Ray diffractor Rigaku FRX
PCR machine Eppendorf Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit Qiagen 27104
Gel extraction kit Qiagen 28704
SspI restriction endonuclease NEB R0132S
T4 DNA polymerase Novagen 2868713
Kanamycin Scientific Chemical 25389940
IPTG Genview 367931
HEPES Genview 7365459
β-mercaptoethanol Genview 60242
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall LYNX 6000 
Sonnicator Scientz II-D
Protein purification system GE Healthcare Akta Pure
Light microscope Nikon SMZ745
IzIt crystal dye Hampton Research HR4-710
Electrophoresis unit Bio-Rad 1658005EDU
Shaker Incubator Zhicheng ZWYR-D2401
Index crystal screen Hampton Research HR2-144
Structure crystal screen Molecular Dimensions MD1-01
ProPlex crystal screen Molecular Dimensions MD1-38
PACT premier crystal screen Molecular Dimensions MD1-29
JCSG-plus crystal screen Molecular Dimensions MD1-37

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15, (4), 313-323 (1995).
  2. Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337, (1), 81-87 (1994).
  3. Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8, (3), 107-119 (2008).
  4. Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
  5. Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69, (5), 661-665 (2013).
  6. Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108, (4), 1978-1985 (2015).
  7. Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70, (7), 1083-1089 (2014).
  8. Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42, (11), 873-880 (2012).
  9. Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
  10. Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70, (Pt 11), 2897-2912 (2014).
  11. Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279, (20), 3952-3964 (2012).
  12. Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
  13. Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
  14. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (27), 11040-11044 (2009).
  15. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17, (11), 1505-1514 (2009).
  16. des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167, (1), 145-157 (2016).
  17. Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517, (7532), 39-43 (2015).
  18. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354, (6310), (2016).
  19. Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26, (9), 977-994 (2016).
  20. Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517, (7532), 50-55 (2015).
  21. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517, (7532), 44-49 (2015).
  22. Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
  23. Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (27), 11040-11044 (2009).
  24. Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17, (11), 1505-1514 (2009).
  25. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, (20), 6069-6074 (1990).
  26. Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67, (3), 176-188 (2011).
  27. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62, (Pt 8), 859-866 (2006).
  28. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, (Pt 4), 658-674 (2007).
  29. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66, (Pt 2), 213-221 (2010).
  30. Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
  31. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10, (6), 845-858 (2015).
  32. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64, (Pt 1), 61-69 (2008).
  33. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68, (Pt 4), 352-367 (2012).
  35. Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
  36. Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107, (3), 321-326 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics