Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücreleri hissediyorum ve mekanik uyaranlara mechanotransduction denen bir süreç biyokimyasal olarak algılanabilir sinyallere dönüştürerek kendi ortamlarında fiziksel ipuçları yanıtlar. Mechanotransduction çok önemli bir adım güçleri iç ve dış ortamlar arasında iletimi yapılır. İletmeye zorlar, protein-protein etkileşimlerinin bir dizi tarafından oluşturulan sürekli, kesintisiz bir fiziksel bağlantı olması gerekir. Verilen protein-protein etkileşimi için mekanik yük ya da etkileşim üzerinde bir etkisi olabilir, etkileşimin daha hızlı ayırma için kurşun ya da etkileşim stabilize etmek. Nasıl moleküler yük anlama protein devir oranı canlı hücreler, buna karşılık mechanotransduction rolü elucidating bir protein, mekanik durumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir belirler. Kuvvet duyarlı protein dynamics ölçmek için varolan teknikleri protein yük doğrudan ölçümleri eksikliği veya hücresel bağlam dışında gerçekleştirilen ölçümlere kullanmaz. Burada, biz kuvvet duyarlı protein dynamics canlı hücreler içinde ölçüm sağlar photobleaching (FRET sıkı bağlamak) tekniği sonra Förster rezonans enerji transferi-floresan kurtarma için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu teknik potansiyel olarak herhangi bir gerginlik FRET tabanlı sensörü, kuvvet duyarlı protein dynamics hücre altı yapıları çeşitli ve farklı hücre tipleri çalışma kolaylaştırmak için geçerlidir.

Introduction

Hücre dışı ortam hücre davranış dikte fiziksel ve biyokimyasal cues zengin bir kaynağıdır. Özellikle, microenvironment fiziksel yapısı anahtar hücresel işlevler, hücre büyümesi, geçiş ve farklılaşma1,2,3,4de dahil olmak üzere arabuluculuk. Bozukluk microenvironment mekaniğinin henüz yeterli tedavi, kanser5, ateroskleroz6ve fibrozis7gibi var mı birçok hastalık için önemli bir bileşenidir. Nasıl fiziksel uyaranlara biyokimyasal olarak algılanabilir sinyalleri hücreleri dönüştürme tam bir anlayış, bir süreç mechanotransduction olarak adlandırdığı, aydınlatma güç iletim, içine ve hücrelere arabuluculuk moleküler mekanizmaları gerektirir ve birden çok hücre altı yapıları içinde.

Hücre altı yapıları içinde proteinler sürekli dönüm; bağlama ve ortakları8binding ile ilişkileri gücüne dayalı kesmeden. Başarılı bir şekilde fiziksel bir mesafe iletilebilmesi için güçlerini için protein-protein etkileşimleri, protein ciro sürdürmek ve onun bağlama ortak9güç iletimi yeterince yavaş olmalıdır anlam zinciri olmalı. Protein-protein etkileşimler genellikle, birkaç sigara-Kovalent bağlar protein etki alanları arasında oluşur iken, etkileşim kez farklı koşullarda10, altında ilişkisiz bir duruma geçiş yapabileceğini ilişkili bir devlet olarak kavramsallaştırma 11. verilen protein-protein etkileşimi için kuvvet etkisi üzerinde bir "ideal bond" olarak bilinen etkileşim, ömrünü, ömür boyu bir "slip bond" olarak bilinen etkileşimin azaltmak ya da etkileşim ömrünü artırmak Hayır olabilir mümkündür , bir "catch bond"10da bilinir. Böylece, protein yük ve biz kuvvet duyarlı dynamics bakın protein dinamikleri arasında karmaşık bir ilişki vardır.

Yük etkisi bond dynamics anlayış doğru son derece bilgilendirici deneyler bir dizi tek molekül düzeyde gerçekleştirilmiş. İzole protein veya proteinler ve manipülasyon teknikleri manyetik cımbız, Optik cımbız ve atomik kuvvet mikroskobu gibi parçaları kullanarak, bu çalışmalar için birkaç ilgili kuvvet duyarlı protein-protein etkileşimleri göstermiştir proteinler11,12. Transmembran proteinler hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri, sırasıyla şekillendirme için önemli olan her iki integrinler13 ve kaderin14, yüklemek için dinamikleri değişiklik göstermiştir. Hücre içinde vinculin her iki talin15 ve α-catenin16 için bir kuvvet bağlı şekilde oluşturulmuştur ve aktin17vinculin fokal yapışıklıklar (FAs) ve adherens kavşaklar (AJs için çok önemli bir rol gösteren, bir catch Bono oluşabilir ) yük altında. Tek molekül çalışmaları belirli protein-protein etkileşimleri yalıtım için izin ve kesin sonuçlar, ama onlar hücresel ortamı karmaşıklığı için hesap yapmak.

Landmark deneyler FAs ve AJs, dahil olmak üzere birkaç hücre altı yapıları mechanosensitive vardır ve dahili olarak oluşturulan veya dışarıdan uygulanan yük18,19yanıt olarak geliştirilmiş derleme sergi gösterdi, 20,21,22. Ayrıca, çeşitli teorik modeller mechanosensitive derleme kuvvet duyarlı protein dynamics23,24,25tarafından tahrik tavsiye ettiler. Bu kuvvet duyarlı dinamikler canlı hücreler içinde incelemek için birkaç dolaylı yaklaşımlar atılmıştır. Sıkı bağlamak ve ilgili teknikleri protein dynamics hücreleri26,27,28,29ölçmek için nispeten basit bir yöntem sağlar. Ancak, protein yük ölçümü daha sınırlı olmuştur. Protein dynamics ve genel hücre contractility8,30,31azaltmak için kullanılan bir hücre iskeleti inhibitörü maruz olmayan hücrelerdeki karşılaştırmak için tipik bir yaklaşımdır. Kavramsal olarak, bu yüksek yük ve düşük yük durumu arasında bir fark var. Ancak, her iki devlet arasında protein hiçbir miktar yük yoktur ve engelleyici, böyle bir F-aktin Filaman boyunca anahtar bağlayıcı siteleri kaybı istenmeyen biyokimyasal etkileri olabilir. Başka bir yaklaşım, FAs için belirli toplam kuvvet efor moleküler yük yaklaşık ve SK32içinde tek bir protein dinamikleri ile ilişkiyi incelemek için çekiş kuvveti mikroskopisi kullanılarak FA tarafından substrat olarak ölçmek için olmuştur. Bu yaklaşım toplam kuvvet miktar için izin verirken, tatlı bilgi sağlamaz. FAs birçoğu yük33ayı 200'den fazla farklı proteinlerin oluşur. Böylece, bir SK toplam güç çıkışını potansiyel olarak ölçüm birden çok güç iletim yolları olasılığı gizler ve güvenilir bir şekilde yük ölçüsü belirli bir protein sağlamaz.

Mechanobiology önceki yaklaşımlar, FRET tabanlı gerilim sensörler gelişiyle doğrudan sağlar ölçüm spesifik proteinlerin yaşam içinde yaşadığı yük hücreleri34,35,36. Burada, FRET tabanlı gerilim sensörler protein dynamics sıkı bağlamak tabanlı ölçü ile birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Biz bu teknik için FRET sıkı bağlamak bakın. Bu yaklaşım protein yük ve protein dinamikleri, böylece canlı hücreler (Şekil 1) kuvvet-duyarlı protein dinamiklerini değerlendirmesini sağlayan eşzamanlı ölçüm sağlar. Zaten, mekanik bağlayıcı protein vinculin37kuvvet duyarlı dinamikleri çalışma odasına perde sıkı bağlamak tekniği uygulanmıştır. Gerginlik sensörler hücre altı yapıları çeşitli ilgili çok sayıda proteinler için geliştirilmiştir. Örneğin, sensörler vinculin34 ve talin38,FAs, kaderin ve catenins AJs40,41,42, nesprin nükleer LINC karmaşık içinde39 için geliştirilmiştir. 43, α-Aktinin44 ve filamin36 sitoiskeleti ve MUC-1 glycocalyx45, diğerleri arasında '46. Benzer şekilde, yaygın olarak kullanılan bir teknik mechanosensitive proteinler odak yapışıklıklar8,31, adherens kavşaklar47, aktin korteks26ve çekirdek48içinde üzerinde kullanılan sıkı bağlamak 's. Varolan bu sensörler veya yeni perde sıkı bağlamak tekniği için geniş uygulanabilir olmalıdır ilerlemeye sensörler, kuvvet duyarlı dynamics hücre altı yapıları ve bağlamlarda geniş çeşitli ölçümler için izin geliştirdi. Bu amaçla doğru biz perde sıkı bağlamak tekniği bu farklı sistemlerde geçerli uygulama için ayrıntılı, genelleştirilmiş bir protokol sağlar. Umarım, bu çok çeşitli rolleri çeşitli mechanosensitive protein güç iletim düzenleyen ve hücre davranış arabuluculuk elucidating deneyler sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. görüntüleme için örnekleri oluşturmak

  1. İstediğiniz hücreye stabil hızlı gerilim sensör yapısı.
    1. Gerilim Algılayıcısı yapı clone pRRL vektör ya da diğer viral ifade plazmid.
      Not: Birkaç farklı moleküler klonlama aracı enzimleri kullanımı da dahil olmak üzere bu adımı ulaşmak, uzantı ve Gibson derleme35örtüşme hazırdır. PRRL vektör lenti viral iletim kullanılır ve insan sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici kullanılarak protein üretiminin önemli bir ölçüde sağlar. Farklı vektörel çizimler için belirli bir içeriği gerekli olabilir. Örneğin, CMV organizatörü bazı hücre türleri49yılında susturuldu. Ayrıca, yalnızca FRET tabanlı sensörler floresan protein içeren mTFP1 ve Venus A206K, gibi o-sizlik çekmek-güçlü sıra Homoloji istikrarlı hücre satırları oluşturmak için kullanılabilir. Camgöbeği floresan protein ve Sarı floresan protein içeren sensörler büyük olasılıkla Homolog rekombinasyon50tabi olacaktır.
    2. Lentivirus psPax2 ve pMD2.G ambalaj plazmid standart virüs üretim yöntemleri51kullanarak kullanarak insan böbrek (HEK) 293T embriyonik hücreleri oluşturur.
      Dikkat: Lentivirus sadece bir Biyogüvenlik seviye 2 laboratuvar ortamında düzgün eğitimli personel tarafından ele alınmalıdır.
      Not: Bu hücreler ve ambalaj plazmid kombinasyonunun pRRL ile kullanmak için uygundur. Diğer sistemleri diğer vektörleri ile gerekli olabilir.
    3. İstediğiniz hücreleri Standart iletim protokolleri52 kullanarak virüs ile transduce ve akış sitometresi her yapı yaklaşık endojen düzeyleri37ifade bir homojen nüfus seçerek hücreleri53 sıralamak için kullanın. Hücre seçimini sonra deneylerin hemen yapılabilir veya hücreleri cryogenically daha sonra kullanmak üzere donmuş olabilir. 2 donma-çözülme çevrimleri belli bir istikrarlı hücre satırı için fazla olamaz.
      Not: Sinyal gürültü oranı FRET deneylerde gibi aşırı ifade yapıları sınırlamak için hücre hatları okudu (Örneğin, vinculin- / - MEFs vinculin gerilim sensör ile kullanmak için) olması için protein eksik kullanımı artacak. Bu istikrarlı fare embriyonik fibroblast (MEF) satırları ifade önemli bir kayıp daha önce yaklaşık 15 pasajlar için kullanılabilir veya sensörlerin bozulması açıkça görülür. Eğer viral tabanlı yöntemleri istediğiniz değil, ticari reaktifler bir bolluk üreticinin protokole göre geçici pcDNA3.1 gibi uygun bir plazmid gerginlik sensörler ile hücre tipleri çeşitli transfect için kullanılabilir. En iyi ifade 24-48 h transfection takip olacaktır.
  2. Yüzeylerde hücre tohum için hazırlayın.
    1. 4, 35 mm cam popolu yemekler elde etmek.
    2. Bir hücre kültür mahallede çalışma, kurallı 15 mL tüp içinde 10 µg/mL fibronektin 4 mL steril PBS hücre kültür mahallede kullanarak fosfat tamponlu tuz (PBS) çözüm yapmak. Yavaşça bir kez tüp karıştırmak ve hücre kültür başlıklı 5 min için oturup çözüm izin tersine çevirin.
      Not: Konsantrasyon veya ECM protein türü diğer hücre tipleri için ayarlanması gerekebilir. Sağlanan MEFs için uygun koşullardır.
    3. Fibronektin çözüm her cam popolu yemeğin üzerine 1 mL pipet.
    4. Oda sıcaklığında 1 h için yemekleri fibronektin çözüm bırakın veya bir gece 4 ° C'de
    5. Fibronektin çözüm Aspire edin, bir kez PBS ile durulayın ve PBS 1 mL ekleyin.
  3. Tohum hücreleri üzerine hazırlanan yüzeyler.
    1. Subcultivation için uygun bir izdiham yüzde faiz 6 cm kültür tabağına hücreleri ile başlayın.
      Not: Farklı hücre tipleri farklı hücre kültür koşulları ve subcultivation protokol gerektirir. Bu bölümde MEFs için uygun yönergeleri verilmiştir. Genellikle, MEFs için % 85 izdiham subcultivation önce yetiştirilmektedir.
    2. Hücre kültür kukuIeta içinde çalışma, bir kez PBS 3 mL içeren hücreleri durulayın. 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
    3. Komple medya 3 mL 6 cm çanak ekleyin, hücreleri toplamak ve 15 mL konik tüp içine yerleştirin.
      Not: Kompozisyon komple medya için kullanılan hücre türüne bağlı olacaktır. MEFs için tam ortam kez yüksek glikoz Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 fetal Sığır serum, % 1 ile tanımlanır antibiyotik-Antimycotic (içeren Amfoterisin B, penisilin ve streptomisin) ve % 1 esansiyel olmayan amino asit (NEAA) çözüm.
    4. Hücreleri aşağı 1000 x g 5 min için spin.
    5. Medya Aspire edin ve hücre Pelet komple medya 1 mL resuspend.
    6. PBS fibronektin kaplı cam yemeklerini kaldırın. Hücreleri saymak ve 30.000 hücre son hacmi 1.5 mL için uygun komple medya ile her fibronektin kaplı cam yemeğin üzerine tohum.
      Not: Bu hücre yoğunluğu MEFs için uygundur ve dokunaklı ama son derece seyrek değildir hücreleri bir popülasyona götürecek. Tam cep numarasını diğer hücre tipleri veya diğer görüntüleme odası için ayarlanması gerekebilir.
    7. Hücreleri 4 tohum takip h için yaymak izin verir. Yayılma 2 h, büyüme medya Aspire edin ve bir kez medya, medya görüntüleme 1.5 mL bırakarak Imaging ile durulayın.
      Not: Yayılan bu sefer MEFs için uygundur ancak diğer hücreler için değiştirilmesi gerekebilir. Ancak, 6-8 h daha uzun süreler kuluçka ECM protein önemli birikimi serum tam medya üzerinden yol açacaktır. Medya görüntüleme komple bir medya olarak aynı eklemeler içermelidir ama optik temizleyin ve değil flavins gibi görüntüleme kanalları bulabilsem herhangi bir bileşikleri içerir veya floresan, fenol red gibi gidermek olmalıdır. Genellikle yararlı bir görüntü medya % 10 FBS ve % 1 NEAA çözümüyle takıma DMEM-gfp canlı hücre görselleştirme ortamıdır. Arka plan autofluorescence unacceptably yüksek ise, serum miktarı azaltılabilir. Bir medya değişiklik sonra ilk kaplama mümkün değilse, hücreler, tripsin inhibitörü ile desteklenen medya Imaging'de doğrudan resuspended.

2. görüntüleme için mikroskobu hazırlayın

  1. Mikroskobunun açın.
    1. Ark lambası açın.
      Not: Bir ark lambası zaten diğer ekipman zarar verebilir bir elektromanyetik darbe yayınlayacak.
    2. Filtre tekerlek denetleyicisi, otomatik sahne denetleyicisi, mikroskop-bilgisayar arayüzü ve kamera açmak.
    3. Sıkı bağlamak lazer açmak ve pozisyon denetleyicileri lazer.
      Uyarı: Yüksek güçlü lazer gözleri doğrudan görüntülerse zarar verebilir. Bu örnek doğru lazer yansıtacak şekilde ve engelleyecek bir beyazlatma sırasında bir ayna sıkı bağlamak ışın yolu taşıyarak gerçekleştirilebilir göz parçalara yönelik olarak gelen lazer uyarma engellemek için mikroskop sistemi yapılandırmak için önerilir mercek için.
    4. Bilgisayarınızı ve açık mikroskop kontrol yazılımı açın.
    5. Ark lambası ve ısınmak için sıkı bağlamak lazer 15 dakikadır izin.
  2. Sıkı bağlamak lazer kalibre.
    1. Lazer yapılandırma penceresini açın. Aydınlatma ayarı için örnek maruz lazer için uygun sıkı bağlamak aydınlatma ayarları (darbe sırasında) ayarlayın. Aydınlatma ayarı (sırasında görüntüleme) aydınlatma sadece alıcısı fluorophore görüntüleme için uygun ayarlar.
    2. Koordinat sistemi ayarıaltında kalibre için hedefi seçin. El ile kalibrasyon noktaları tıklatın uncheck ve kalibrasyon sırasında ekran görüntülerikontrol edin.
    3. Işınma Zamanı 10.000 µs ve bakliyat 100 sayısını ayarlayın.
    4. Coverslip yüzü sahne adaptör içine mühürlü bir cam slayt ve bir coverslip arasında etidyum bromür yapılmış kalibrasyon slayt yerleştirin.
      Dikkat: Etidyum bromür bir alkil ve eldiven kullanarak ele alınmalıdır. Slayt aşılırsa, kurumun kurallarına göre atın.
    5. Slayt, en parlak sinyali ile odak düzlem olarak tanımlanabilir yüzeyine odaklanmak için alıcısı aydınlatma ayarlarını kullanın. Kaplama içinde küçük kusurlar odaklanarak içinde yardım etmek için görünür.
    6. Slayt üzerinde görüntüleme uçak ile Tekdüzen floresan bir alana taşıyın.
    7. Ortam' ı tıklatın. Yazılım otomatik olarak beyazlatma ve ağartılmış noktasının konumunu algılama kalibrasyon işlemi başlatılır.
    8. Başarılı kalibrasyon bir 3 x 3 Kılavuzu eşit olarak dağıtılmış ağartılmış puan ve odak olacak son görüntü değerlendirmek emin olun. İleride başvurmak için kalibrasyon resmi kaydedin.
    9. Kalibrasyon slayt kaldırın ve güvenli bir biçimde depolayabilirsiniz. Kalibrasyon her deney başlamadan önce gerçekleştirilmesi gereken ama örnekleri arasında gerçekleştirilmesi gerekmez.

3. perde görüntüleme için parametrelerini seçin

  1. Düzeltme bir gerginlik duyumsal ile % 4 paraformaldehyde 10 dk. Paraformaldehyde çözüm için ifade hücre oluşturulan örneklerinin metanol ücretsiz, genellikle EM floresan proteinlerin denaturing önlemek için sınıf, verilen olmalıdır. PBS içinde fiksasyon sonra yerleştirin.
    Dikkat: Paraformaldehyde çözümleri zehirlidir. Bu adım-meli var olmak kılınmak duman kukuIeta ve çözüm, kurumsal ilkelerine göre atılmalıdır.
    Not: Bu iyileştirme protein dinamikleri üzerinde bağlı değildir ve hücre sağlık hakkında endişelenmeden için en fazla görüntüleme zaman sabit bir örnek sağlar.
  2. Örnek üç kez PBS ile durulayın ve PBS içinde bırakın.
    Not: Örnek54Imaging perde için uygun olmayan hale fluorophore özellikleri, en-piyasada montaj ortamların kullanımını etkiler. İdeal olarak, hücreleri hemen görüntüsü, ama bir gecede 4 ° C'de terk olabilir Uzun bekleme süreleri örnek bozulmasına neden olur.
  3. Örnek görüntüleme için mikroskop sahne tutucusuna koyun.
  4. Çok boyutlu edinme (MDA) aracını açın. Üç kanal sıralı bir görüntüleme kurmak: alıcısı tek uyarma ve emisyon (alıcısı kanal), donör uyarma ve alıcısı emisyon (FRET kanalı) ve donör tek uyarma ve emisyon (donör kanal).
    Not: Çeşitli şekillerde görüntü perde örnekleri vardır. PERDE verimliliği ölçmek için sistem ayarlama aracı ile eşleştirilmiş görüntüleme üç kanallı veya "üç-küp" yöntemi FRET tabanlı gerilim sensörler55,56için önerilir. Bu yaklaşım hızlı, basit, zararsız, yalnızca Standart Floresan mikroskop düşsel için ve farklı günlerde ve görüntüleme kurulumları üzerinden deneyler karşılaştırmasını sağlar.
  5. Bir çekim hızı 500 MS ve % 10 bir nötr yoğunluk (ND) filtresi kullanarak örnek inceden inceye gözden geçirmek. Bir yapıya ilgi açık yerelleştirme gerginlik sensörlü ifade bir hücre bulma.
  6. Bir çekim hızı 500 ms veya görüntüleme her kanal için istenilen uzunluğa ve % 100 bir ND filtre seçin ve bir FRET görüntü sırası elde etmek.
  7. Kameranın sensörünün ortalama yoğunluğu her görüntüleme kanal ilgi hücre altı yapıları, tahmin ediyoruz. Düşük sinyalleri yanlış düzeltme tahminler, dedektörleri veya arka plan sinyalleri önemli katkı linearities nedeniyle tutarsız sonuçlar neden olabilir. Kameranın dinamik alanı yüzde 10'u yukarıda yoğunluklarda hedeflemektir yaklaşık bir kılavuzdur (i.e., 16-bit kamera için yoğunluklarda 6.000-meli var olmak).
    Not: Aynı optik ayarları (pozlama süreleri, filtreler, hedefleri ve diğer değişkenler gibi kamera kazanç veya binning) Karşılaştırılacak tüm perde deneyler için kullanılması gerekir. Bu ayarlardan herhangi birini değiştirmek için bir değişiklik ya oluşturulan ve/veya mikroskobu set-up tespit FRET tutardaki yol açacaktır. PERDE verimlilik ölçümleri ayarlama bunlardan bağımsız, ancak perde verimliliği belirlemek için kullanılan kalibrasyon faktörleri değil. Teorik olarak, kalibrasyon faktörlerinin çeşitli setleri FRET verimliliği farklı optik ayarları oluşturmak için kullanılabilir, ancak bu önerilmez. Ağartma veya fototoksisite sahte sonuçları oluşturma çeşitli ayarlar arasında farklı olabilir.
  8. İkinci perde görüntü dizisi aynı görüş alanı elde etmek. Photobleaching görüntüleme her kanaldaki sensörünün ortalama yoğunluğu karşılaştırarak çerçeveler arasında tahmin ediyoruz. Photobleaching en az, sinyal kaybı % 1-5 daha az tercihen tutulmalıdır.
  9. Photobleaching en aza indirerek yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Kaba ayarlamalar için satın alma sırasında kullanılan ND filtre değiştirin. Daha hassas ayarlamalar için 250 ms adımlarla pozlama süresi değiştirin.
  10. Yeterli sinyal photobleaching en aza indirirken elde edilebilir 3.5 – 3,8 tamamlayana dek.
    Not: Normal olarak, vinculin- / - MEFs vinculin gerilim sensör için 1.500 ms, 1.500 ms ve verici, perde ve alıcısı kanallar için 1000 ms sırasıyla ayarlarıdır. En iyi değerleri aydınlatma sistemi, amaç, filtre setleri ve sensör ifade düzey türü ile değişir.

4. seçin parametrelerini görüntüleme sıkı bağlamak

  1. Faiz (ROI) bölgesinin çevresindeki ağartma veya duyarlilik neden olmadan tam beyazlatma emin olmak için lazer ayarlarını en iyi duruma getirme.
    1. Bir gerginlik duyumsal ile % 4 paraformaldehyde 10 dk için ifade hücre oluşturulan örneklerinin düzeltmek.
      Not: Bu iyileştirme protein dinamikleri üzerinde bağlı değildir ve hücre sağlık hakkında endişelenmeden için en fazla görüntüleme zaman sabit bir örnek sağlar. Bu-ecek da önlemek mobil proteinler tarafından beyazlatma, beyazlatma, etkisini izolasyon için hızlı, difüzyon-aracılı floresans kurtarma ağartma ve alma sıklığı arasında meydana gelen herhangi bir etkilerinden kaçınmak sağlar kurtarma ilk sonrası çamaşır suyu görüntü.
      Dikkat: Paraformaldehyde çözümleri zehirlidir. Bu adım-meli var olmak kılınmak duman kukuIeta ve çözüm, kurumsal ilkelerine göre atılmalıdır.
    2. Örnek 3 kez PBS ile durulayın ve PBS içinde bırakın.
      Not: En-piyasada montaj medya kullanımı örnek54Imaging sıkı bağlamak için uygun olmayan hale fluorophore özellikleri etkiler. İdeal olarak, hücreleri hemen görüntüsü, ama bir gecede 4 ° C'de terk olabilir Uzun bekleme süreleri örnek bozulmasına neden olur.
    3. Örnek görüntüleme için mikroskop sahne tutucusuna koyun.
    4. Lazer yapılandırma penceresini açın. Bir lazer Işınma Zamanı 1.000 µs ve 10 Bakliyat, yatırım getirisi üzerinde tarama her yerde tam güç lazer 10.000 µs alacaksınız anlamı ayarlama ile başlamak
      Not: Bir 500 mW, 515 nm lazer beyazlatma için kullanıldı. Bu seçime bağlı olarak maksimum verimlilik ile Venüs A206K, alıcısı vinculin gerilim sensör, çamaşır suyu için seçildi. FRET tabanlı gerilim sensörleri ile floresan diğer proteinler kullandıysanız, lazer, başka tür istihdam zorunda kalabilirsiniz.
    5. Bir yapıya ilgi açık yerelleştirme gerginlik sensörlü ifade bir hücre bulma ve bir görüntü elde etmek.
    6. Çamaşır suyu ve yatırım getirisi konum depolamak için alan özetleyen bir dikdörtgen yatırım getirisi çizin. Nabız lazer. Örnek başka bir resim çekin.
      Not: Kutu boyutuna yaklaşık tüm SK büyüklüğünde olmalıdır. Kutunun boyutunu büyük ölçüde deneyler arasında değişir değil özen gösterilmelidir. Proteinlerde olan dynamics tarafından difüzyon etkilenir ağartılmış alan dikkatle izlenmesi gerekir. Bu kaderin47gibi transmembran proteinler veya yavaş yavaş27,57diffüz proteinler potansiyel bir husustur.
    7. Photobleaching kalitesini yoğunluğu arka plan düzeylerine öyle ki tüm ROI ağartılmış kontrol ederek kontrol edin. Ayrıca, hiçbir yatırım getirisi dışında beyazlatma emin olun.
    8. Lazer ayarları içinde yatırım getirisi önemli yatırım getirisi dışında ağartma inducing olmadan ağartma önemli miktarda elde etmek için gerektiği şekilde değiştirin. Kaba ayarlamaları yükseltmek ve bekleme süresi içinde merdiven 100 µs ve ince ayar için daha düşük, yükseltmek ve adımlarla 5 Bakliyat, bakliyat sayısı düşük.
    9. 4.1.5-4.1.8 hangi yatırım getirisi tam hedef kapalı photobleaching ağartılmış en düşük ayarlara ulaşma kadar yineleyin.
      Not: fototoksisite inducing olmadan önemli bir başlangıç beyazlatma değeri elde bir anahtar sıkı bağlamak analiz yönüdür. Sabit örneklerinde tam bir çamaşır suyu neden lazer ayarları kullanın. Genel olarak, fotonlar olabildiğince az sayıda beyazlatma istenen seviyeye ulaşmak için kullanılmalıdır. Ayrıca, değişiklikler ölçümleri protein dynamics58etkileyebilir gibi beyazlatma Protokolü deneyler sırasında göreceli olarak tutarlı tutulmalıdır.
  2. Tam olarak photobleaching en aza indirerek faiz protein dinamikleri yakalamak için hızlandırılmış parametrelerini optimize etmek.
    1. Mikroskopi set-up ısıtmalı bir sahne ve amaç aynı zamanda CO2 kontrol ile tercihen canlı hücre görüntüleme için hazır olun. 20 dakikadır equilibrate olanak sağlar.
      Not: görüntülü hücrelerin sağlığını korumak için sıcaklık ve pH görüntüleme gemi içinde muhafaza edilmelidir. Isıtmalı aşamaları ve objektif ısıtıcılar çeşitli hücre sıcaklığı 37 ° C'de kolayca koruyabilirsiniz Birçok medya türleri için pH kontrolü geçişini nemlendirilmelidir %5 CO2 peristaltik pompa kullanımı örneği 15 mL/dak'üzerinde alternatif olarak gerçekleştirilebilir, CO2 denetim kullanılamıyor, canlı ise HEPES içeren medya görüntüleme için kullanılmalıdır büyük pH değişiklikleri koruma.
    2. Görüntüleme için mikroskop sahne tutucusuna gerilim sensör ifade hücre oluşturulan örneklerinin yerleştirin. 10 dakikadır equilibrate olanak sağlar.
    3. MDA aracını kullanarak, bir hızlandırılmış kadar 3-5 resimler önceden çamaşır suyu, yatırım getirisi çamaşır suyu ve 10-60 fotoğraf çekmek devam elde etmek için ayarlayın.
      Not: FAs, vinculin için her 5 Imaging s 5 dk sonrası çamaşır suyu için aşırı beyazlatma31tanıtımı olmadan dinamikleri gözlemlemek için yeterli. Görüntüleme oranı için yararlı başlangıç noktaları ve birçok diğer proteinler süre içinde edebiyat47,48,59,60bulunabilir.
    4. Örnek ışığa maruz kalma, faiz yapısını görüntü için yeterli bir sinyal gürültü oranını koruyarak en aza indirmek ayarlarını görüntüleme alıcısı kullanın. İyi bir başlangıç noktası ND filtre ve pozlama zaman alıcısı görüntüleme sırasında perde için gerekli yarısı kadardır.
    5. Bir yapıya ilgi açık yerelleştirme gerginlik sensörlü ifade bir hücre bulma ve görüntüyü oturtun.
    6. Çamaşır suyu ve yatırım getirisi konumu saklamak nerede vurgulamak için dikdörtgen bir yatırım getirisi çizin. Hızlandırılmış başlatın.
    7. Sonuç kümesini görüntüler için olası sorunları inceleyin.
      1. Önemli atlar (ilk yoğunluğu % 10 fazla) Floresan kurtarma, çerçeveler arasında iseniz, çerçeveler arasındaki saat adım azaltmak.
      2. Varsa Floresan (ilk yoğunluğu % 5-10 fazla), zaman içinde önemli bir küresel kaybına sonrası çamaşır suyu alınan yansıma sayısını azaltmak ve/veya örnek gün ışığına maruz kalma azaltmak için görüntü ayarlarını değiştirin.
      3. Floresans kurtarma değil monoton hızlandırılmış sonunda Eğer hızlandırılmış toplam uzunluğunu artırmak.
    8. Buna göre zaman hata parametrelerini ayarlamak ve 4.2.5-floresan kurtarma yeterince örnek genel fotoğraf-zarar vermeden yakalanan kadar 4.2.7 arasındaki adımları yineleyin.

5. perde sıkı bağlamak veri elde

  1. Mikroskopi set-up ısıtmalı bir sahne ve amaç aynı zamanda CO2 kontrol ile tercihen canlı hücre görüntüleme için hazır olun. 20 dakikadır equilibrate olanak sağlar.
    1. Görüntülü hücre sağlık sağlamak için sıcaklık görüntüleme odasında 37 ° C'de muhafaza. Kullanım geçmek peristaltik pompa pH korumak için 15 mL/dk örnek üzerinden %5 CO2 nemlendirilmelidir.
    2. Alternatif olarak, CO2 kontrol kullanılamıyorsa, HEPES içeren canlı görüntüleme medya büyük pH değişiklikleri engellemek için kullanın.
  2. MDA aracını açın ve parametreleri farklı filtre ayarlar da dahil olmak üzere, görüntüleme perde ile ayarlayın.
  3. Bu MDA MDA_FRET_Dateadını taşıyan deneysel klasörüne kaydedin.
  4. Lazer öncesi çamaşır suyu edinme sonra darbe için parametreleri farklı filtre setleri, hızlandırılmış ayarları ve günlük dahil olmak üzere, görüntüleme sıkı bağlamak ile başka bir MDA ayarlayın.
  5. Bu MDA MDA_FRAP_Dateadını taşıyan deneysel klasörüne kaydedin. MDA penceresini kapatın.
  6. Ekranın en üstündeki araç çubuğunda, günlüğü seçin | Kayıt işlemi.
  7. MDA penceresini açın, MDA_FRET_Date devlet yük ve Altuşuna basın. O zaman MDA_FRAP_Date devlet yüklemek ve Altuşuna basın.
  8. Satın alma ekranın en üstündeki araç çubuğunda, sonundaki günlüğü seçin | Kaydı Durdur.
  9. Bu günlük FRETFRAP_Date adını taşıyan deneysel klasörüne kaydedin ve kolay erişim için bir araç çubuğu ekleyebilirsiniz. MDA penceresini kapatın.
  10. Görüntüleme için mikroskop tutucusuna gerilim sensör ifade hücre oluşturulan örneklerinin yerleştirin. 10 dakikadır equilibrate olanak sağlar.
  11. Edinme altında resim alma kullanarak örnek gidin | Elde faiz hücreleri tanımlamak için en az pozlama ile zaman ve ND filtre.
  12. Cihazlar için gezinme tarafından sürekli otofokus ayarla | Odak. El ile örnek üzerinde doğru görüntüleme uçak erişene dek odaklan.
  13. Sürekli odaklama ayarla'yıtıklatın sistemi ayarlamak için bekleyip Başlamak sürekli odaklama' i tıklatın.
    Not: Bu gerekli değildir, ancak o odak sürüklenen örnek engeller sıkı bağlamak kurtarma eğrileri kalitesini önemli ölçüde artırır.
  14. Bir yapıya ilgi açık yerelleştirme gerginlik sensörlü ifade bir hücre bulma ve görüntüyü oturtun.
  15. Nerede çamaşır suyu için vurgulamak için dikdörtgen bir yatırım getirisi çizin. Yatırım getirisi konuma depolayın.
  16. Sıkı bağlamak hızlandırılmış başlatma tarafından takip FRET görüntüleri edinimi başlayacak FRETFRAP_Date günlüğü başlatılamıyor.
  17. 10-15 görüntü kümeleri iktisap 5.14-5,16 tamamlayana dek.
    Not: Ölçüm aynı hücrede yinelenemez. Bir kez photobleaching oluşur, FRET veri güvenilmez olduğunu.

6. perde sıkı bağlamak veri analiz

  1. Yazılım kullanarak FRET görüntüleri analiz.
    Not: Görüntü ve perde61ratiometric perde62 ve perde Dizin34,35de dahil olmak üzere, quantitate birkaç yolu vardır. Ancak, FRET verimliliği55,63 tahminleri FRET sıkı bağlamak veri yorumlanması için kullanmak için önerilir. Bu konunun daha fazla araştırma için bkz. Duyarlilasmis emisyon ve perde verimlilik hesaplanması için özel yazılım https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public Hoffman laboratuarda kullanılabilir.
  2. Ağartılmış her hücre altı yapısı için ilgili parametreleri ölçmek. Bu ortalama FRET Dizin/verimlilik ve ortalama ilk alıcısı yoğunluğu (konsantrasyon için orantılı) içermelidir ama aynı zamanda yatırım getirisi boyutu gibi fiziksel parametrelerini içerebilir.
  3. Yazılım kullanarak sıkı bağlamak görüntüleri analiz.
    Not: Sıkı bağlamak26,27,28,29quantitate için çeşitli yollar vardır. Anahtar deneysel endişeleri görüntüleme, değişiklikleri arka plan yoğunluk ve translocation fokal yapışıklıklar gibi son derece dinamik hücre altı yapıları sonrası çamaşır suyu sırasında beyazlatma için hesap oluşturma içerir. Arka plan aydınlatma değişimler ve düzeltmeler beyazlatma görüntüleri Kastarlamasız ve floresan olmayan bölgelerinde analizi ile gerçekleştirilebilir. Son derece dinamik hücre altı yapıları, özellikle aşırı büyüme veya parçalara ayırma dynamics gösterilen standart sıkı bağlamak analizleri ile uyumsuzdur ve değil analiz edilmelidir. Ayrıca, bir verileri normalleştirmek için çeşitli yollar vardır. Sağlanan adımlar basit analiz için verilmiştir.
  4. Etkileri beyazlatma için kurtarma verileri düzeltmek ve yoğunluklarda önceden çamaşır suyu için normalleştirmek. Yarı kurtarma ve mobil kesir aşağıdaki denklem28,34göre ölçmek:
    MF - (MF - Ro) e-kt
    MF mobil kesir, Ro nerede ilk kurtarma, ve k iyileşme oranı. Yarı kurtarma tarafından belirlenir:
    Τ1/2 = ln 2/k.
    Not: Çeşitli ImageJ eklentileri çeşitli yanı sıra bu analizleri64 tamamlamak için genel kullanıma sunulan yazılım paketleri vardır. Özel yazılım https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public Hoffman laboratuarda kullanılabilir. Daha fazla analizleri nerede difüzyon birden fazla zaman ölçekleri kurtarma, belirgin olduğu faiz, protein dinamikleri etkiler veya standart olmayan beyazlatma geometrileri kullanılır durumlar için kullanılmalıdır.

7. perde sıkı bağlamak verileri yorumlamak

  1. Her yatırım getirisi de dahil olmak üzere ilgili bilgileri derlemek: perde Dizin/verimlilik, alıcısı yoğunluğu, sıkı bağlamak yarı zamanlı, sıkı bağlamak mobil kesir.
    Not: Perde dizin veya verimliliği yatırım getirisi içinde protein genelinde ortalama yük belirlemek için kullanılır. Alıcısı yoğunluğu protein yerel konsantrasyon ölçer. Yarım saat kurtarma protein dynamics ölçüsüdür. Daha küçük bir yarım saat daha hızlı ciro gösterir. Sıkı bağlamak mobil kesir aktif teslim ROI içinde protein miktarını ölçer. Daha büyük bir mobil kısmını protein içinde yatırım getirisi daha büyük bir yüzdesi dönüm gösterir.
  2. Yerel konsantrasyonu protein devir hızı ve tutarını etkisini araştırmak için ilk alıcısı yoğunluk karşı sıkı bağlamak yarı zamanlı ve mobil kesir arsa.
  3. Protein Yük etkisi protein devir hızı ve tutarını soruşturma için FRET Dizin/verimlilik karşı sıkı bağlamak yarı zamanlı ve mobil kesir arsa.
    Not: protein veya yapısına bağlı olarak, bu da protein yük veya ciro yapı boyutu veya merkezcillik, gibi fiziksel parametrelerin etkilerini incelemek için ilginç olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ÜZÜLMEK, FRET-sıkı bağlamak iki floresan teknik kombinasyonu yapılır ve sıkı bağlamak. Biz protein yük etkileri üzerinde duruldu gibi biz perde tabanlı gerilim sensörler34,46kullanılır. Bu sensörler sık sık mTFP1 ve VenusA206K, bir flagelliform bağlayıcı (Şekil 1A) tarafından bağlı gibi iki floresan protein içeren modülü algılama bir gerginlik temel alır. Modül baş ve kuyruk etki alanları bir protein arasında yerleştirildiğinde, protein sarf yük ölçmek mümkündür. PERDE veri analiz ederken, alıcısı kanalda çekilen görüntüleri gerilim sensör yerelleştirme değerlendirmek için kullanılır ve bu sinyal olarak konsantrasyon FRET (Şekil 1B) bağımsızdır. PERDE verimliliği hesaplama sonra protein yük nerede FRET verimliliği soğuk renkleri doğru bir düşüşe protein yük artış gösterir ve kırmızı aralıktaki FRET verimliliği düşük protein yük ( belirtmek kolorimetrik bir ölçekte görüntülenmeyecektir Şekil 1B). Sıkı bağlamak görüntüleme alıcısı fluorophore bir tek hücre altı yapısı ve monitör kurtarma zaman (Şekil 1 c) içinde çamaşır suyu için bir lazer kullanılarak yapılır. Elde edilen normalleştirilmiş sıkı bağlamak eğrisi yarı kurtarma ve mobil kesir (Şekil 1 d) dahil olmak üzere protein dynamics tanımlayan parametreleri ayıklamak için analiz edilebilir. Çünkü FRET ve sıkı bağlamak analizleri aynı hücre üzerinde gerçekleştirilen, ortalama protein yük ve devir oranı, bir hücre altı yapısı tek bir noktası olarak çizilebilir. Birden çok hücre Imaging birden fazla puan verir ve ortaya çıkan bir eğilim bir protein olup belirtebilir (Şekil 1E) dengeleri bozdu ya da moleküler yük (Şekil 1F) tarafından stabilize.

Stabil vinculin içinde ifade vinculin gerilim sensör (VinTS) boş MEFs çok net bir şekilde yerelleştirir hücre yayılmış FAs için alıcısı kanal görüntü (Şekil 2A) bakarak görüldüğü gibi. Alıcısı kanal görüntü her bireysel FA görsel olarak farklı renkler (Şekil 2B) tarafından belirlenmiş benzersiz bir kimlik ile tanımlayan bölümleme maske oluşturmak için kullanılır. Segmentasyon algoritması "su" yöntemine dayanmaktadır ve FAs yaklaşık sırasına göre parlaklık, yukarıda açıklanan34,65olarak Etiketler. Segmentasyon sonuçları FRET verimlilik sonuçları (Şekil 2C) sonra uygulanan bir ikili maskesi dönüştürülür ve benzersiz her SK içinde ortalama FRET verimliliği hesaplanır (Şekil 2B). Ek özellikler için her SK ortalama alıcısı yoğunluğu, boyutu, merkezcillik ve hücre içinde yer de dahil olmak üzere benzer bir şekilde hesaplanır. Bu şekilde, hangisi daha sıkı bağlamak için SK seçilir benzersiz SK No ve ilişkili özellikler için eşleştirilebilir.

Sıkı bağlamak görüntüleme ve çözümleme, lazer de dahil olmak üzere ve parametreleri, Imaging kontrol edilebilir çeşitli faktörler ve genel SK istikrar26,27,28gibidenetlenemez bazı faktörler duyarlı, 29. Örneğin, çok fazla ışığa maruz kalma hızlandırılmış görüntüleme sırasında sıkı bağlamak veri yorumlama önemli konular yol açabilir. Denetim değil ağartılmış FAs analizi ile çok fazla örnek ışığa maruz kalma, zaman içinde küçük photobleaching için normalize etmek kullanılabilse normalleştirilmiş yoğunluğu DIP tarafından takip bir başlangıç kurtarma elde edilen sıkı bağlamak eğrisi gösteriyor bu doğru bir Üstel fonksiyon ile sığamaz. Bu etkiyi sürekli verilerde gözlenen ya çekim hızı azaltmak, görüntü kareleri arasında saat adım artırmak veya Hızlandırılmış örnek azaltmak amacıyla uzunluğu azaltmak için görüntüleme parametreleri yeniden en iyi duruma getirmek için gerekli ise, ışık.

Uninterpretable, photobleached yapıldı SK hızla sırasında kurtarma28translocates zaman sıkı bağlamak veri başka bir örneği. Aşırı translocation temsilcisi olgusu Şekil 3' te gösterilmiştir. İlk görüntü nerede ROIs seçilir, SK istikrar (Şekil 3A) belirtisi vermez. Ağartılmış SK zamanla kontrolü, hızlı bir şekilde uzak ilk konuma taşır ve otomatik izleme hemen photobleaching (Şekil 3A) takip düşük floresan sinyal nedeniyle takip edemiyor. Elde edilen sıkı bağlamak eğrisi floresans olduğunda bir atlama ile hafif kurtarma bir başlangıç aşamasında yazılım SK algılamak ve ROI (Şekil 3B) taşımak için yeterli kurtarılan gösteriyor. Bu eğri bir Üstel fonksiyon tarafından başarıyla sığamaz. SK hızlı translocation da SK yapısı kararsız olduğunu göstermektedir. Böylece, kararsız FAs aynı perde sıkı bağlamak analiz biyolojik ve teknik sorunlar nedeniyle istikrarlı FAs olarak dahil edilmesi gereken değil.

Tatmin edici FRET ve sıkı bağlamak veri ile bir sonraki adım aynı anda değerlendirilmesi protein yük ve dinamikleri FRET-sıkı bağlamak analizi tamamlamak üzeredir. Şekil 4A üç vinculin perde verimliliği haritaların null gösterir stabil VinTS ifade MEFs. Beyaz özetlenen FAs sıkı bağlamak analiz için seçilmiştir ve alıcısı yoğunluklarda zaman içinde gösterilir. Bu üç FAs yüklemek ve farklı vinculin kurtarma profil görüntülemek vinculin altında farklı miktarda var. Bu özellikleri yarı kurtarma hesaplama ve çizme her SK ortalama FRET verimliliği karşı tarafından miktarının artan yükü (Şekil 4B) tarafından stabilize vinculin genel eğilimini gösterir. Ancak, FRET verimliliği karşı çizilen mobil kesir o mobil kesir moleküler yük (Şekil 4 c) tarafından düzenlenir değil düşündüren hiçbir eğilim gösterir. Bir nokta mutasyon (A50I) VinTS, amino asit 50 içine tanıtımı vinculin bağlama FAs, talin66içinde büyük bağlama ortağa önlemek için gösterilmiştir. Bu protein-protein etkileşimi İLETİMLERİNİZE vinculin kuvvet duyarlı dinamikleri etkiler. Stabil VinTS A50I ifade Vinculin null MEFs farklı hücre ve SK türleri morfoloji, profilleri ve farklı vinculin dinamikleri (Şekil 4 d) yükleme farklı vinculin var. Kurtarma ve perde verimliliği buçuk kat miktarının ve komplo vinculin-talin etkileşim rahatsız zaman mobil kesir hiçbir eğilim (Şekil 4F gösterirken vinculin FAs, artan yükü (4E rakam) tarafından dengeleri bozdu olduğunu gösterir ).

Figure 1
Şekil 1: perde sıkı bağlamak teknik prensipleri. (A) bir protein ilgi ve gerginlik FRET sinyal üzerinde etkisini eklenen FRET tabanlı gerilim duyumsal ölçü birimi (TSMod) şeması. (B) perde duyarlilasmis emisyon kullanarak ölçmek için görüntüleri yakalama donör sinyal (gösterilmez), alıcısı sinyal ve perde sinyal alınır. Gerekli düzeltmeleri ile perde görüntü ne kadar gerilim sensör için uygulanan görselleştirmek için kolorimetrik bir ölçek atanabilir. (C) sıkı bağlamak için konsantrasyon doğrudan orantılıdır alıcısı sinyali kullanarak yapılır. (D) sıkı bağlamak görüntüleme analizi floresan yoğunluğu eğrileri protein dynamics belirlemek için matematiksel modeller kullanarak uygun zaman içinde üretir. (E, F) PERDE ve sıkı bağlamak birleştirildiğinde, güç ve devir oranı, tek bir SK ölçülebilir. Birden çok hücre içinde birden çok FAs ölçme protein yükü ve protein ciro arasındaki bir ilişkiyi verir. Bu analizde, hangi artan yükü ilişkilendirir artan ciro ile ilişkisi bir güç dengeleri bozdu devlet (E) denir. Bu analizde, artan yükü ilişkilendirir ile ciro azaltmak bir ilişki için bir kuvvet-sağlamlık olarak devlet (F) denir. Bu rakam Rothenberg vd değiştirildi 37. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: SK kimlik ve perde analizi. (A) bir vinculin MEF nerede yerel vinculin konsantrasyon yoğunluğu gösterir alıcısı kanalda görselleştirildiği VinTS ifade null. Ölçek çubuğu = 30 µm. (B) FAs nerede her SK burada farklı renk, parlaklık, sırasına göre yaklaşık olarak gösterilen benzersiz bir kimlik atanır SK No maske oluşturmak için alıcısı kanal göre bölümlenmiş. (C) SK No maske ikili bir maskeye dönüştürülür ve sadece FAs FRET verimlilik değerleri göstermek için FRET verimliliği görüntü uygulanır. (D) her SK içinde perde verimliliği çıkış veri tablosundaki SK kimliği ile ilişkili her FA için tek bir değer elde etmek için Ortalama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Resim 3: bir translocating SK örneği. (A) bir vinculin VinTS A50I mutant sensör ifade null MEF alıcısı kanal ile netlik için ters renk tablosu görüntülenir. Ölçek çubuğu 30 µm =. Siyah özetlenen SK beyazlatma için seçildi. Yakınlaştırılmış içinde imge SK zaman içinde nerede yazılım SK tanımlanan gösteren kırmızı anahat ile göstermek. Ölçek çubuğu 2 µm. (B) (a) verilerinden elde edilen normalleştirilmiş sıkı bağlamak eğrisi =. Orada bir yaklaşık % 5 atlama yoğunluğu aşağıdaki gelin 3 kaynaklanan SK hızlı bir şekilde yazılımın SK konum değişikliği algılamak yeterli kurtarma önce translocating dan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: temsilcisi FRET-sıkı bağlamak sonuç. (A) Vinculin null MEFs tüm hücre ortalama FRET verim imge göstermek VinTS ifade (ölçek çubuğu = 30 µm) sıkı bağlamak kurtarma ilerlemesi gösterilen alıcısı kanal görüntüleri yakınlaştırılmış bileşeniyle ters (ölçek çubuğu 2 µm =). (B) sıkı bağlamak yarı zamanlı kurtarma FRET verimlilik için 32 hücre, karşı kırmızı renkte hücrelerde (A) temsil eden noktaları ile çizilen. (C) sıkı bağlamak mobil kesir FRET verimlilik (B) aynı hücreler için karşı çizilen. (D) Vinculin null MEFs tüm hücre ortalama FRET verim imge göstermek VinTS A50I mutant sensör ifade (ölçek çubuğu = 30 µm) sıkı bağlamak kurtarma ilerlemesi gösterilen alıcısı kanal görüntüleri yakınlaştırılmış bileşeniyle ters (ölçek çubuğu 2 µm =). (E) sıkı bağlamak yarı zamanlı kurtarma FRET verimlilik için 21 hücreleri, karşı kırmızı renkte hücrelerde (D) temsil eden noktaları ile çizilen. (F) mobil kesir FRET verimliliği (e) aynı hücreler için karşı çizilen sıkı bağlamak. Veri aslında Rothenberg vd. yayınlandı 37 ve are burada yeni bir biçimde görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kuvvet duyarlı protein dinamikleri, doğrudan canlı hücreler içinde soruşturma zor olan bir özelliği doğrudan ölçümü için FRET sıkı bağlamak yöntemi sağlar. Protein dynamics moleküler yük duyarlılığını bir kuvvet verici veya dönüştürücü olarak protein'ın çalışması için önemlidir. Yükleme hem de dahili olarak oluşturulan iletimi için gereklidir ve dışarıdan uygulanan kuvvetler, mechanotransmission aradı ve biyokimyasal olarak algılanabilir sinyalleri bu kuvvetlere dönüştürme için mechanotransduction denir. Ancak, değişiklikler yük bir protein ilişkili kalır süresi etkileyebilir, böylece, bir protein taşıyan yük, kuvvet diğer proteinler için gönderilmesini veya bir biyokimyasal olarak algılanabilir sinyal transduced ve hissettim için daha az şansı daha az zaman harcıyor. PERDE sıkı bağlamak yöntemi daha geniş bir hücresel bağlamı içinde erişilecek kuvvet duyarlı dynamics moleküler ölçek ölçümleri vererek moleküler ve hücresel düzeyde arasındaki boşluğu arasında köprü görevi gören. Ayrıca, biyokimyasal olarak veya mekanik hücre içi veya hücre dışı ortam perturbing sırasında alınması gereken bu ölçümler sağlar. Bu teknik protein hücre altı yapıları ve ekstraselüler bağlamlarda çeşitli mekanik durumda soruşturma için izin herhangi bir gerginlik FRET tabanlı sensör için uygulanabilir olmalıdır.

PERDE sıkı bağlamak istediğiniz ölçümler elde edilen sağlanmasında kritik adımlar görüntüleme parametreler optimize etmek ve performans veri analizi ve yorumu içerir. Protokolde, açıklandığı gibi görüntüleme parametrelerini optimize duyarlilik örnek için FRET hesaplanması için yeterli sinyal gücü ve istenen yapıları ve dinamikleri ayırt edici olmak için izin verirken sınırlamak gereklidir. Bu görüntüleme parametreler belirli hücre satır ve protein ilgi için erken kurulması farklı deneysel grupları arasında doğrudan karşılaştırma kolaylaştıracaktır. Bu değişiklikler sisteme ilgi protein mutasyona veya inhibitörleri, tanıtımı gibi protein yerelleştirme (Böylece sinyal şiddeti değiştirme) ve dinamikleri değişikliklere yol açabilir dikkati çekiyor. En iyi duruma getirilmiş parametreleri açık, doğru ölçümler arasında tüm deneysel koşullar izin vermesi gerekir. Bu nedenle, bu yararlı olmanın aşırı sonunda, örneğin, zar zor sinyal gürültü ayırt edememek değil parametreleri seçmek için önerilir.

Bu iletişim kuralı görüntülemede bir epifluorescence mikroskop ve ekli sıkı bağlamak lazer modülü için açıklanan iken, FRET-sıkı bağlamak diğer görüntüleme sistemleri için geçerlidir. Örneğin, bu teknik bir ekli photobleaching modülü ile iplik-disk confocal mikroskoplar yanı sıra confocal mikroskoplar içini kaplamak scanning için adapte edilebilir. Ayarları görüntüleme yeterli sinyal gürültü duyarlilik veya aşırı photobleaching neden olmadan elde etmek için benzer bir şekilde optimize edilmelidir. Özellikle FRET görüntüleme ile ilgili olarak, yüksek kuantum verimliliği dedektörleri fluorophore hasar inducing olmadan başarılı perde hesaplaması için yeterli sinyal almak için gereklidir. FRET-sıkı bağlamak görüntüleme için optimizasyon kılavuzu için kullanılan bir confocal mikroskop67,68,69, kullanarak ayrı perde veya sıkı bağlamak görüntüleme açıklayan yayınlar vardır.

Deneme, veri analizi dikkatle tedavi ve tekrarlanabilir, tercihen otomatik bir şekilde gerçekleştirilen gerekir. Çok fazla beyazlatma daha önce tek bir hücre hücre altı bölgelerde 2-3'ten fazla çamaşır suyu yetersizlik nedeniyle protein mevcut havuzu, bu teknik verim nispeten sınırlı olduğunu. Böylece, veri kümelerini görüntüleme, veri tutarlı tedavi gerektiren birden çok gün boyunca kez birleştirilir. PERDE ve sıkı bağlamak veri analizi zorluklarla sunuyoruz. PERDE dizin ve perde verimlilik ölçümleri bir miktar protein yükü için izin verir. PERDE, perde verimlilik ölçümleri mutlak ve mikroskop ayarları55,70bağımsız olmakla mikroskop ayarlarına, son derece bağlı olan göreli bir ölçü dizinidir. Biz son zamanlarda daha önce gelişmiş bir yöntem "üç-küp" Imaging'i kullanma FRET verimlilik gelen FRET tabanlı gerilim sensörler56 kullanırken FRET dizini ile genellikle sayısal duyarlilasmis emisyon ölçümleri belirlemek için kullanılabilir göstermiştir . Gerginlik sensörler tarafından mutlak kuvvetleri deneyimi ölçümler hesaplanan34olmak FRET verimlilik ölçümleri gereklidir. PERDE tabanlı gerilim sensörler ifade hücreleri, yüksek geçiş numaralarından, özellikle kararlı hücreleri birleştireceğimi veya kullanılamaz FRET veri50' ye lider sensörler, bozulmasına yol açar. Hesaplama donör alıcısı oranları hesaplama sırasında verimliliği37,56 FRET ama FRET dizini kullanarak tespit etmek zor olabilir zaman bu kolayca tanınır. Bir FRET tabanlı gerilim sensör ile başlatırken, büyük bir veri kümesi elde etmek yararlı olabilir (> 50 hücreleri) sadece perde veri yapıları FRET beklenen Aralık verimliliği tanımlamak ilgi için. Ayrıca, sıkı bağlamak veri hızla kayar veya sökülmesi FAs gibi çok mobil yapıları ayıklamak zor olabilir. Bir subpopulation yapıların seçerek veya hücre kaplama koşulları bu etkiyi azaltmak için en iyi duruma getirme bu sorunu en aza indirmek için yardımcı olabilir.

Kavram, FRET sıkı bağlamak için herhangi bir FRET tabanlı sensör herhangi bir hücre altı bölgede uygun optimizasyon ile uygulanabilir. Uygulamada, kuvvet duyarlı dynamics önemli mekanik yük altında olan değil veya yarı-kez kurtarma çok kısa zaman ölçeği birkaç saniye veya dakika onlarca uzun zaman ölçeğini olan proteinlerin yakalamak zor olabilir. Tek molekül çalışmalar sonuçlarından kuvvet duyarlı dynamics canlı hücreler içinde görülebilir proteinler işaret edebilir. Şimdiye kadar bu birçok SK AJ proteinler ve13,14,15,16 yanı sıra bazı hücre iskeleti elemanları71,72,73içerir. Tesadüfen, FRET tabanlı sensörleri bu proteinleri46birçoğu için tasarlanmıştır. Bu sonuçlar bir protein ilgi yelpazesi rehberlik eder; Ancak, bu veri FRET sıkı bağlamak tam olarak bu tek molekül çalışmaların sonuçlarından ayna olacak beklenmelidir değil. Aslında, biyokimyasal yönetmelik, diğer proteinler ve yerel hücre iskeleti yapısı ile etkileşimleri belirsiz veya alter, protein-protein etkileşimleri kuvvetleri etkileri. Bu karmaşıklığı gözlemlemek yeteneği FRET sıkı bağlamak yaklaşım benzersiz bir gücüdür.

Manipülasyonlar hücreye bir arada ve faiz protein, protein dynamics düzenleyen en önemli faktörlerden aydınlatmak için kullanılabilir. Örneğin, orada-meli var olmak gibi protein ciro dynamics hiçbir bağımlılık tarafından bildirilen kuvvet kuvvet-duyarlı, silme veya bir kuvvet bağlayıcı etki alanı35,74 mutasyon yoluyla bir sensör için yararlı olabilir sensör. Ayrıca, diğer kritik bağlayıcı siteleri veya protein fosforilasyon sitelerini mutasyonlar protein ilgi nasıl düzenlenir, daha kapsamlı bir resmi sağlayabilir. Hücre veya hücre iskeleti inhibitörleri ile mi yoksa yüzey özellikleri (ex. hücre dışı matriks veya sertlik), anılan sıraya göre değişen çevre genel değişiklikler yapma, protein güç hassas dinamikleri nasıl yanıt belirlemenize yardımcı olabilir Mekanik rezonans. Protein yük ve kuvvet duyarlı dinamikleri hakkında bilgi protein biyofiziksel farklı özellikleri ile birleştirerek ilgi proteinin mekanik devlet kurmak için yardımcı olabilir. Bu yerelleştirme ve yerel protein-protein etkileşimler içinde bir hücre altı yapısı75,76içerebilir. Ayrıca, protein aynı hücre altı yapısına bağlı olarak içerik76,77içinde bile farklı uyum Birleşik yer. Protein yük, dinamikleri, yerelleştirme ve uyum olabilir tüm dahili olarak oluşturulan ve dışarıdan uygulanan kuvvetler37,76,78,79tarafından aynı anda etkilenen dikte bir güç iletim ve mechanotransduction protein rol. PERDE sıkı bağlamak yöntemi ve çeşitli proteinler ve manipülasyonlar ile olası uyumluluk çok yönlülük toplu mekaniği, protein dinamikleri ve mechanosensitive sinyal arasındaki etkileşimi aydınlatma etkinleştirmeniz gerekir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser hibe Amerikan Kalp Derneği (16GRNT30930019) ve ulusal Dr Brenton Hoffman ve bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM121739-01) yanı sıra Ulusal Bilim Vakfı Kariyer Ödülü (NSF-CMMI-14-54257) tarafından desteklenmiştir Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu Katheryn Rothenberg için ödüllendirildi. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NSF veya NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137, (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217, (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207, (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234, (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5, (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185, (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323, (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29, (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357, (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133, (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88, (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107, (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153, (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98, (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18, (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322, (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112, (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10, (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23, (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9, (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466, (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275, (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114, (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17, (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213, (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18, (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110, (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327, (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511, (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122, (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. The interactions of retroviruses and their hosts. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66, (6), 1031-1038 (2014).
  52. Addgene, Generating Stable Cell Lines with Lentivirus. Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016).
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45, (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6, (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L. 3rd, Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91, (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8, (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77, (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8, (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8, (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86, (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46, (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66, (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28, (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112, (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430, (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82, (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches--a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103, (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478, (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103, (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8, (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19, (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17, (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169, (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25, (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics