Adskille bakterier af kapsel beløb ved hjælp af en diskontinuerlig tæthed farveforløb

Genetics
 

Summary

Vi demonstrere brugen af ikke-vedvarende tæthed gradienter at adskille bakteriel befolkning baseret på kapsel produktion. Denne metode bruges til at sammenligne kapsel beløb mellem kulturer, isolere mutanter med en specifik kapsel fænotype eller identificere kapsel regulatorer. Beskrevet her er optimering og drift af analysen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feltwell, T., Dorman, M. J., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient. J. Vis. Exp. (143), e58679, doi:10.3791/58679 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kapslen er en nøglen virulens faktor i mange bakteriearter, mægle immun unddragelse og resistens over for forskellige fysiske belastninger. Mens der findes mange metoder til at måle og sammenligne kapsel produktion mellem forskellige stammer eller mutanter, der er ingen udbredt metode til sortering bakterier baseret på hvor meget kapsel de producerer. Vi har udviklet en metode til at adskille bakterier af kapsel beløb, ved hjælp af en diskontinuerlig tæthed farveforløb. Denne metode bruges til at sammenligne kapsel beløb semi-kvantitativt mellem kulturer, isolere mutanter med ændrede kapsel produktion og rense capsulated bakterier fra komplekse prøver. Denne metode kan også kobles til transposon-indsættelse sekvensering til at identificere gener involveret i kapsel forordning. Her, er metoden demonstreret i detaljer, herunder hvordan du optimerer gradientbetingelserne for en ny bakteriel art, stamme, og hvordan at konstruere og køre tæthed farveforløb.

Introduction

Mange bakteriearter producere et polysaccharid kapsel, som beskytter den bakterielle celle fra forskellige fysiske belastninger og fra anerkendelse og drab af immunsystemet. I Klebsiella pneumoniaeer kapsel produktion et absolut krav for infektion1,2. K. pneumoniae kapsel medierer resistens over for antimikrobielle peptider, modstand mod komplement-medieret drab, forebyggelse af fagocytose, og undertrykkelsen af det medfødte immunforsvar3. Overskydende kapsel produktion er forbundet med forøget virulence og infektioner EF-erhvervet (i stedet for nosokomielle)4.

Der findes en række kvantitative og kvalitative undersøgelser at undersøge kapsel produktion. For Klebsiella arter omfatter disse den streng test5, hvor en tandstikker rørt til en koloni er trukket opad og længden af strengen produceret målt, og den mucoviscosity assay6, hvilket indebærer den langsom centrifugering af en kultur, efterfulgt af måling af Ekstinktionen af supernatanten. Disse metoder er enkel og hurtig, men mangler følsomhed når det bruges på klassisk Klebsiella stammer i stedet for kapsel overproduktion stammer. En anden metode til kapsel kvantificering er uronic syre analysen, som er teknisk udfordrende og kræver brug af koncentreret svovlsyre1. Endelig er kapsel synlig direkte ved mikroskopi (figur 1A). Af disse metoder, kun mikroskopi tillader brugeren at observere forskellige capsulation stater inden for en enkelt population, og ingen af disse metoder giver en fysisk adskillelse af capsulated og ikke-capsulated bakterier.

Densitet-baserede separationer af gradient centrifugering anvendes rutinemæssigt i cellebiologi for at oprense forskellige eukaryote celle typer7, men bruges sjældent i mikrobiologiske forskning. Mucoviscosity analysen for Klebsiella er baseret på den iagttagelse, at meget capsulated bakterier tager længere tid at pellet ved centrifugering, og vi mente, at dette kan skyldes nedsat overordnede tæthed af capsulated celler. Metoden vises her blev udviklet for at adskille K. pneumoniae populationer fysisk af kapsel beløbet tæthed gradient centrifugering (figur 1). Denne metode blev anvendt med succes til Streptococcus pneumoniae, hvilket viser, at det gælder for andre bakteriearter. Densitet-gradient adskillelse af en mættet transposon mutant bibliotek kombineret med transposon-indsættelse sekventering (densitet-TraDISort) er blevet brugt til at identificere gener involveret i den kapsel produktion og regulering8. På samme måde, denne metode blev brugt i forbindelse med tilfældige-prime polymerase kædereaktion (PCR) af enkelte kolonier til at isolere ikke-capsulated K. pneumoniae mutanter. Denne metode kan også bruges til hurtige sammenligninger af kapsel produktion mellem forskellige befolkningsgrupper og vilkår eller til at rense capsulated bakterier fra komplekse prøver (figur 1B). Endelig er der mulighed for at assay andre fænotyper, der påvirker tæthed, såsom cellestørrelsen eller sammenlægning.

Dette manuskript viser, hvordan du optimerer proceduren for en ny bakteriel art, stamme og demonstrerer opførelse og drift af en diskontinuerlig tæthed farveforløb til at adskille hyper-capsulated, capsulated og ikke-capsulated bakterier.

Protocol

Bemærk: Sikre, at enhver gældende at de bakteriestammer risikovurderinger er overholdt ved dyrkning og håndtering af prøver. Være opmærksom på, at oprettelsen af for mange farveforløb på et tidspunkt kan føre til muskel-og skeletbesvær som følge af presset på leddene fra de langsomme pipettering involveret. Planlægge arbejde og tage forholdsregler for at undgå skade.

1. forberedelse af bakteriestammer eller Mutant biblioteker

  1. Streak ud stammer skal testes på passende agar plader. Disse er stock plader til eksperimentet.
    1. Inkuber plader overnatning på den ønskede temperatur at opnå indre kolonier. For dette eksperiment, kultur K. pneumoniae (NTUH-K2044 og ATCC43816 stammer) på Luria bouillon (LB) agar ved 37 ° C og S. pneumoniae (23F vildtype og 23F Δcps) på blod agar i en fugtig stearinlys krukke ved 37 ° C.
  2. Vælge en enkelt koloni fra en bestand plade (trin 1.1) til podes 10 mL af passende bouillon ved hjælp af en steril løkke eller cocktail stick. Screening af tilfældige mutant biblioteker, podes bouillon med 10 µL af tilfældige mutant bibliotek lager (TraDIS bibliotek).
    1. Inkuber K. pneumoniae stammer i lav salt LB medier ved 37 ° C under omrystning og S. pneumoniae stammer i hjernen hjerte infusion (BHI) medier, statisk ved 37 ° C.
    2. Overføre den overnight kultur til en 15 mL rør og centrifugeres i et Bordcentrifuge i 10 min på 3.200 x g i sving ud spande med 15 mL tube skær og aerosol stramt låg.
    3. Supernatanten og resuspenderes i 2 mL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
      Bemærk: Bortskaffelse af supernatanten via den relevante flydende biologisk affald rute i laboratoriet. Formålet med centrifugering og resuspension trinene (1.2.2 og 1.2.3) er at koncentrere bakterier til nem visualisering på farveforløbet. Bakteriel kulturer kan indlæses direkte på farveforløbet, hvis det foretrækkes. Stærkt capsulated stammer kan ikke danne en stram pellet. Hvis dette sker, fjerne så meget supernatanten som muligt uden at fjerne enhver bakterieceller, tilføjes en endelige mængden af 5 mL 1 x PBS og resuspenderes. Fortsætte protokol med trin 1.2.5.
    4. For ikke-mucoid stammer, skal du gå til trin 2.
    5. Der centrifugeres rør som beskrevet i trin 1.2.2.
    6. Supernatanten og resuspenderes i 2 mL 1 x PBS. Cellerne er nu klar til brug.
      Bemærk: Tætheden af den bakterielle cellesuspension er ikke kritisk men skal være tilstrækkelig til visualisering i farveforløbet. Et minimum OD600 (optisk tæthed på 600 nm) af 4 foreslås.

2. forberedelse af Gradient fortyndinger og mini graduering Test

  1. Forberede gradient fortyndinger.
    Bemærk: Nøjagtige koncentrationer af tæthed gradient medium (f.eks.Percoll) skal i tæthed farveforløb til at opnå god adskillelse vil variere afhængigt af de bakterielle stamme og vækst betingelser anvendes. Mini graduering test udføres først, for at identificere de koncentrationer, der vil give den bedste adskillelse. Disse omfatter 500 µL af en enkelt fortynding i et 2 mL tube. Hvis bakterier bliver udvundet fra gradueringen og podes for downstream programmer, bør disse trin udføres under aseptiske forhold.
    1. Kombinere tæthed gradient medium med 1 x PBS tæthed gradient fortyndinger. Fortyndinger af 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% og 80% (f.eks., 2 mL af tæthed gradient medium plus 8 mL PBS, 1 x = 10 mL af 20% tæthed gradient medium).
    2. Alikvot 500 µL af 20% gradient fortynding i et 2 mL rør for hver stamme skal testes (f.eks., 4 stammer = 4 rør indeholdende 500 µL af 20% gradient fortynding).
    3. Gentag trin 2.1.2 for resten af de gradient fortyndinger.
  2. Anvende bakterier på farveforløbet.
    1. Anvende 100 µL af bakterieceller forberedt i trin 1.2.3 og 1.2.6 til toppen af hver gradient fortynding følge nedenstående trin.
      1. Tage op 100 µL af celler ved hjælp af en 200 µL pipette og placere pipette tip på siden af røret lige under menisk på mini gradueringen.
      2. Opsug bakterieceller på farveforløbet ekstremt langsomt, således at de danner et lag på toppen af gradient, uden blanding af grænsefladen.
      3. Gentag trin 2.2.1.1–2.2.1.2 for alle stammer, der skal testes.
    2. Ved hjælp af en fast vinkel rotor med en aerosol stramt låg, centrifugeres de rede rør i en microcentrifuge i 10 min på 8.000 x g.
    3. Efter centrifugering, skal du overføre rør til et rack til at visualisere den mindste gradient fortynding skal bevare celler lige over den gradient layer efter centrifugering.
    4. Hvis resultaterne ikke er klart, Gentag mini graduering test med intervaller af 5% tæthed gradient medium fortyndinger ovenfor og nedenfor de koncentrationer, der er defineret i trin 2.1.1 (f.eks., 25% og 35% fortyndinger bør testes, hvis resultatet på 30% er tvetydigt).
      Bemærk: Se figur 2A for typiske resultater på en enkelt tæthed gradient medium fortynding.
    5. Bruge resultaterne fra trin 2.2.3–2.2.4 til at bestemme de ideelle gradient fortyndinger til Adskil celler i større skala diskontinuert forløb.

3. forberedelse af celler til den vigtigste eksperiment

  1. Forberede Frisk overnight kulturer ved at vaccinere 10 mL af passende bouillon, som beskrevet i trin 1.2.
    1. Inkuber kulturer natten under passende forhold, som beskrevet i trin 1.2.1.
    2. Pellet overnight kultur, som beskrevet i trin 1.2.2.
  2. Cellerne vaskes som beskrevet i trin 1.2.3.
  3. Supernatanten og resuspenderes i 1 mL af 1 x PBS. Hvis belastningen er mucoid og ikke pellet nemt, resuspenderes i op til 2 mL PBS eller resterende medier. Cellerne er nu klar til brug.

4. forberedelse af diskontinuert tæthed gradienter

Bemærk: En alternativ metode til gradient forberedelse fra bunden (mest koncentreret) til toppen (mindste koncentreret) ved hjælp af en pipette er beskrevet i trin 7.

  1. Pipette overføres 1 mL af den mest fortyndede tæthed gradient fortynding i en 5 mL polypropylen runde nederste rør til at danne den øverste, mest fortyndede, lag af gradient.
    Bemærk:
    efterfølgende lag af mere koncentreret gradient fortyndinger vil blive tilføjet under dette lag, ved hjælp af en nål, for ikke for at forstyrre lag. Mindst to og højst tre gradient lag af 1 mL anbefales til robust adskillelse og let visualisering af bakterier.
    1. Brug en 1 mL engangs sprøjte med en 1,5 tomme nål knyttet, tage 1 mL af den næste mest koncentreret tæthed gradient medium ind i sprøjten. Undgå at tage op noget luft, som bobler kan forstyrre de gradient lag.
    2. Placer nålen ende i bunden af røret indeholder det første lag. Opsug sprøjte indholdet meget langsomt for at undgå at blande grænsefladen.
      Bemærk: Grænsefladen for de to fortyndinger vil stige som den mere koncentreret gradient fortynding er tilføjet. Observere grænsefladen ved at holde det op til lys eller et uden for vinduet. Hvis ingen særskilte interface er observeret, kassere gradient og starte igen.
      1. Fjern nålen fra forløbet meget forsigtigt for ikke for at forstyrre grænsefladen mellem de forskellige gradient fortyndinger. Glasset anbringes i et egnet stativ til at holde det oprejst.
    3. Hvis du bruger tre forskellige fortyndinger, skal du gentage trin 4.1.1–4.1.2.1, så den tætteste fortynding er nederst. Hvis forløbet er blevet konstrueret med succes, vil der være tre forskellige lag med ingen blanding på grænsefladerne.

5. tilføjelse rede celler til gradueringer og separering ved centrifugering

  1. Tilføje 600 µL af rede celler fra trin 3.3 til toppen af gradient i røret meget langsomt og uden at blande grænsefladen, som beskrevet i trin 2.2.
  2. Sted rør i rør adaptere og vejer kombineret adaptere og rør for at sikre, at de er afbalanceret.
    1. Placer røret adaptere i en fast vinkel rotor i en Bordcentrifuge. Der centrifugeres i 30 min. ved 3.000 x g.
    2. Efter centrifugering, forsigtigt fjerne rør, placere dem i en passende rack, og fotografere resultaterne som en post.
  3. Genskab de bakterielle brøker for uronic syre kvantificering eller DNA-ekstraktion ved at følge trin 6.
    1. Hvis downstream applikationer ikke er påkrævet, disponere over prøver/forløb via den relevante flydende biologisk affald rute i laboratoriet.
      Bemærk: Det er vigtigt at validere adskillelse for nye arter/stammer af bakterier. Enkelte fraktioner fra gradient bør undersøges ved mikroskopi af uronic syre assay (trin 8), eller en anden passende kvantitative analyse at bekræfte kapsel Fænotypen af hver fraktion. Hvis formålet er at adskille baseret på sammenlægning eller Cellestørrelse, bør uafhængige passende assays anvendes.

6. at inddrive prøve brøker og valgfri udvækst trin

  1. Genskab fraktioner fra et farveforløb ved at fjerne og kassere enhver væske fra den øverste fortynding, hvis ingen bakteriel brøkdel er til stede i dette lag.
    1. For at fjerne de øverste brøkdel, bruge P200 pipette og forsigtigt passere pipette spidsen gennem gradient til fraktion og tage op brøkdel. Placer brøkdel i en 1,5 mL tube og mærke korrekt.
    2. For at gendanne yderligere fraktioner, stadig bruger P200 pipette, indsætte spidsen forsigtigt gennem graduering til fraktion og genoprette brøk til en frisk 1,5 mL tube. Fjern overskydende gradient som brøker lavere ned gradient er tilgængelige.
    3. Hvis DNA-ekstraktion fra en fraktion indeholdende meget lav celle numre er påkrævet (f.eks. for tæthed-TraDISort), subkultur brøkdel af efter protokollen fra trin 6.2 for valgfri udvækst at opnå flere celler.
      Bemærk: Der vil være et lavt niveau af fremførsel fra celler i toppen af gradient i lavere fraktioner, fraktioner er fjernet fra top til bund. Minimere dette ved at arbejde omhyggeligt for ikke at blande gradient, ved hjælp af en nål til at fjerne lavere fraktioner, og ved at udføre re-rensning af meget lav overflod prøver hvor fremførsel kan påvirke resultaterne.
  2. Overførsel celler fra lav-overflod brøkdel inddrives i trin 6.1.1–6.1.2 i 5 mL af passende flydende medier. Sted i en inkubator og vokse i 2 timer ved 37 ° C.
    1. Efter 2 h af vækst eller når prøven har nået en OD600 1, skal du overføre kulturen til en 15 mL tube. Der centrifugeres røret i 10 min på 3.200 x g i en centrifuge med swing ud spande og aerosol stramt låg. Supernatanten
    2. Celle resuspenderes i 1 mL af 1 x PBS.
  3. Forberede en frisk single-koncentration tæthed farveforløb i 5 mL polypropylen rør. Brug gradient koncentrationen fra lige over placeringen af fraktionen i den oprindelige gradient (fx til rensning af ΔslyA mutant vist i figur 2D, 15% tæthed gradient medium ville blive brugt).
    Bemærk:
    denne re-rensning trin er valgfrit.
    1. Anvendelse af celler til toppen af gradient og centrifugeres som beskrevet i trin 2.2 og 5.1.
    2. Fjern rørene fra centrifugen og Anbring i en passende rack. Fotografere gradient og genoprette fraktion for DNA-ekstraktion som beskrevet i 6.1 – 6.1.2.
      Bemærk: Prøven er nu klar til DNA-ekstraktion eller andre downstream applikationer.

7. alternative metode for Gradient forberedelse fra bunden (mest koncentreret) til toppen (mindste koncentreret) ved hjælp af en Pipette

  1. Brug gradient Fortyndingerne bestemmes i trin 2.2.3. Ved hjælp af en 1.000 µL pipette, tilsættes 1 mL af den tætteste gradient fortynding til en 5 mL tube.
    1. Bruger en 200 µL pipette, tilføje 200 µL af den næste tætte gradient fortynding meget langsomt til toppen af lag i røret, så ikke at blande grænsefladen. Tilføje en anden 200 µL og derefter den endelige 600 µL. tilføjelse af flere mindre mængder giver mere kontrol over pipettering hastighed og forhindrer blanding af grænsefladen. Hvis grænsefladen blander, slette og starte igen.
    2. Gentag trin 7.1.1 med den tredje, det mindste tætte gradient koncentration, hvis der bruges tre fortyndinger. Røret skal nu have forløb af enten 2 mL eller 3 mL afhængigt af resultaterne fra trin 2.2.3.
    3. Gå til trin 5 i protokollen til at føje celler og fortsætte med eksperimentet.

8. måling af kapsel beløb af Uronic syre Assay

  1. Justere OD600 i hver gendannede brøk til 4.0 ved fortynding med PBS. Fortsætte med kvantificering af uronic syrer som tidligere publicerede1.

Representative Results

Repræsentative resultater er vist i figur 2. Det nøjagtige resultat kan forvente vil afhænge af bakteriearter, set-up af tæthed gradienter, og om brugeren undersøger en enkelt stamme eller en pulje af mutanter. De fleste stammer vil migrere til en enkelt placering i et forløb, som vist i figur 2A og 2D. Anvendelse af metoden til en bakteriel mutant bibliotek vil give anledning til en stor band over forløbet, en mindre tætte band distribueres gennem det øverste lag af gradient, og en mindre acapsular fraktion i bunden (figur 2B). Disse fraktioner har forskellige kapsel beløb som det fremgår af en analyse for uronic syrer (figur 2B). Transposon indsættelse sekventering af enkelte fraktioner resulterer i klare lokalisering af specifikke mutanter inden for forskellige gradient fraktioner, som vist for kapsel biosyntesen locus af K. pneumoniae ATCC43816 (figur 2C). Repræsentative resultater for renkulturer af K. pneumoniae NTUH-K2044 og S. pneumoniae, og forskellige kapsel biosyntesen eller regulerende mutanter, er vist i figur 2D.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk af tæthed centrifugering metode til at adskille bakterier baseret på kapsel, og dens anvendelsesmuligheder. (A) en elektron mikroskopi billede af en capsulated Klebsiella pneumoniae celle. Kapslen er synlig som en tætte lag på ydersiden af cellen. (B) programmer for tæthed centrifugering til studiet af capsulated bakterier. (Bi) Tæthed adskillelse kan bruges til at generere høj-, lav- og nej-kapsel brøkdele af en transposon mutant bibliotek og efterfulgt af transposon indsættelse sekventering at definere gener, der påvirker kapsel produktion. (Bii) Rensning af capsulated bakterier fra en sammensat prøve. (Biii) Brug af tæthed-baseret adskillelse for hurtige sammenligninger af kapsel beløb mellem prøver. Denne metode giver også mulighed for visualisering af heterogene kapsel produktion i bakteriel populationer, som vist i (Biii). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentative resultater. (A) eksempel på output fra mini graduering test. To forskellige K. pneumoniae stammer var centrifugere på 1 mL af 15% tæthed gradient medium. Hypermucoviscous NTUH-K2044 stamme bevares over tæthed gradient medium lag, mens ATCC43816 (hvilket gør mindre kapsel) vandrer til bunden af laget. (Bi) Brug af en tæthed farveforløb til at adskille en transposon mutant bibliotek i tre fraktioner. Bemærk at den nederste del indeholder en lav andel af mutanter og er ikke synlig på dette billede. (Bii) Validering af forskellige kapsel beløb i toppen, midten og bunden fraktioner ved hjælp af en analyse for uronic syrer. Celler fra øverste, midterste og forvokset bunden fraktioner var isoleret og genopslemmes i PBS til en OD600 4, derefter kapsel polysakkarider udvundet og uronic syrer målt1. (C) eksempel tæthed-TraDISort resultater. Mutation placeringer identificeret vises af blå linjer over kromosom diagram. Mutanter mangler kapsel kan identificeres som dem, der er til stede i inputbiblioteket men er opbrugt i den øverste del mens beriges i den nederste del, som vist her for kapsel biosyntesen locus8. (D) et eksempel på brugen af tæthed gradient centrifugering for at sammenligne kapsel beløb mellem vildtype og mutantstammen K. pneumoniae NTUH-K2044 og S. pneumoniae 23F. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Kapslen er en vigtig virulens faktor i mange bakteriearter herunder K. pneumoniae3, Streptococcus pneumoniae9, Acinetobacter10og Neisseria11 arter. Selvom der findes forskellige metoder til kvantificering og visualisering af bakteriel kapsler, på nuværende tidspunkt findes der ingen udbredt metode til fysisk separate capsulated og ikke-capsulated celler. I denne artikel, har vi vist en robust metode til kapsel-baserede adskillelse af bakteriel befolkning, med flere potentielle anvendelser i forbindelse med forskellige opstrøms eller nedstrøms protokoller.

Tilstedeværelsen af en overflade kapsel kan mindske bakteriel celle massefylde, som giver mulighed for adskillelse af tæthed gradient centrifugering (figur 2D). Vi har godkendt denne metode i K. pneumoniae NTUH-K204412 og ATCC4381613 samt Streptococcus pneumoniae 23F14 og dens Δcps mutant15. Denne metode bruger Percoll16 som den vigtigste bestanddel af tæthed farveforløb, som er en suspension af belagt kolloid silica partikler, der har lav viskositet og ingen toksicitet mod bakterier - i princippet, andre stoffer, der opfylder disse kriterier kunne være bruges til at oprette tæthed farveforløb.

Det kan være udfordrende for at lag af forskellig densitet Bland ikke, når bygge tæthed gradienter, og hvis blanding sker, metoden adskillelse vil ikke give ren resultater. Vi har inkluderet to alternative metoder til hælde gradienter, ved hjælp af en nål eller en pipette — begge er effektiv, og hvilken metode der skal bruges er simpelthen et spørgsmål om præference. For alle trin, der involverer pipettering et stof (enten en bakteriel suspension eller en mere fortyndet gradient layer) over en gradient layer, kan pipettering flere delprøver af mindre mængder gøre det lettere at opnå en skarp grænseflade uden blanding af lag.

En begrænsning af denne protokol er at dens præstationer med andre bakteriearter ikke kan garanteres. Derfor er det afgørende ved behandlingen af en ny bakteriel art, stamme til at validere tæthed-baseret adskillelse ved hjælp af en metode til yderligere og uafhængige kapsel kvantificering. Visualisere bakterier til stede i hver fraktion af mikroskopi med passende kapsel pletter er en pålidelig metode, detaljerede protokoller er tilgængelige17. Alternativt, kapsler indeholdende uronic syrer (såsom dem af Escherichia coli og K. pneumoniae) kan kvantificeres ved en bestemt analyse, som vist i figur 2B1. Centrifugering-baseret mucoviscosity-test er ikke egnet som en uafhængig valideringsmetode, da dette assay også afhænger af tætheden af de bakterieceller.

En anden begrænsning ved denne metode er at kapsel produktion er meget følsomme over for kultur betingelser, og selv små ændringer til vækstmediet, temperatur, eller luftning kan påvirke resultaterne af denne analyse. For at minimere dette problem, kan forskere bruger en defineret vækstmediet eller en batch-konsekvent komplekse medium, holde alle andre parametre, vækst identiske mellem eksperimenter og omfatter passende kontrol stammer for at aktivere fortolkningen af uventede resultater . Nogle bakteriel kapsler er skrøbelige og kan vride sig væk fra cellen, når kulturer er pipetted. For at undgå klipning af kapsler, kulturer centrifugeres og genopslemmes ikke mere end to gange under forberedelse til indlæsning på farveforløbet. Hvis tabet af kapsel under koncentration kulturer er stadig problematisk, bakteriel kulturer kan anvendes til en tæthed farveforløb direkte, med en større volumen af bakteriel suspension tilføjet om nødvendigt til visualisering.

Fremtidige anvendelser af denne metode er at anvende det til andre bakteriearter og bruge denne adskillelse i forbindelse med forskellige opstrøms og nedstrøms teknologier. Ud over tæthed-TraDISort8foreslår vi, at tæthed gradient adskillelse af capsulated bakterier kunne anvendes til isolering af mutanter med ændrede kapsel, til rensning af capsulated celler fra blandede kulturer eller komplekse prøver, og til hurtig profilering af kapsel produktion i flere stammer. Endelig, denne teknologi kan bruges til at undersøge andre bakterielle fænotyper som sammenlægning.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske interesser til at videregive.

Acknowledgments

Vi takker Jin-by Wang og Susannah Salter for udlevering af stammer, og medlemmer af gruppen Parkhill for nyttige diskussioner. Dette arbejde blev finansieret ved Wellcome Sanger Institute (Wellcome grant 206194) og en Sir Henry Wellcome postdoc stipendium til F.L.S. (grant 106063/A/14/Z). M.J.D. understøttes af en Wellcome Sanger Institute PhD Studentship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets Eppendorf 5810 718.007
Adapters for 15 mL tubes Eppendorf 5810 722.004
Fixed andgle rotor F-34-6-38 Eppendorf 5804 727.002
2.6 to 7 mL tube adapter Eppendorf 5804 739.000
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 Eppendorf 5424 000.460
2 mL tubes Eppendorf 0030 120.094
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086
5 mL polypropylene round bottom tube Falcon 352063
1 mL disposable syringe Luer slip Becton Dickinson 300013
AGANI Needle 21G Green x 1.5" Terumo AN 2138R1
P1000 pipette and tips
P200 pipette and tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Favre-Bonté, S., Licht, T. R., Forestier, C., Krogfelt, K. A. Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infection and Immunity. 67, (11), 6152-6156 (1999).
  2. Bachman, M. A., et al. Genome-wide identification of Klebsiella pneumoniae fitness genes during lung infection. mBio. 6, (3), 1-9 (2015).
  3. Paczosa, M. K., Mecsas, J. Klebsiella pneumoniae: Going on the offense with a strong defense. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. 80, (3), 629-661 (2016).
  4. Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., Russo, T. A. Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae. Virulence. 4, (2), 107-118 (2014).
  5. Fang, C. -T., Chuang, Y. -P., Shun, C. -T., Chang, S. -C., Wang, J. -T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae. strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. The Journal of Experimental Medicine. 199, (5), 697-705 (2004).
  6. Lai, Y. -C., Peng, H. -L., Chang, H. -Y. RmpA2, an activator of capsule biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43, regulates K2 cps gene expression at the transcriptional level. Journal of Bacteriology. 185, (3), 788-800 (2003).
  7. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), 1-10 (2014).
  8. Dorman, M. J., Feltwell, T., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. The capsule regulatory network of Klebsiella pneumoniae defined by density-TraDISort. (2018).
  9. Geno, K. A., et al. Pneumococcal capsules and their types: Past, present, and future. Clinical Microbiology Reviews. 28, (3), 871-899 (2015).
  10. Weber, B. S., Harding, C. M., Feldman, M. F. Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond. Journal of Bacteriology. 1986, (6), 880-887 (2016).
  11. Mubaiwa, T. D., Semchenko, E. A., Hartley-Tassell, L. E., Day, C. J., Jennings, M. P., Seib, K. L. The sweet side of the pathogenic Neisseria.: The role of glycan interactions in colonisation and disease. Pathogens and Disease. 75, (5), 1-9 (2017).
  12. Wu, K. -M. M., et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiellapneumoniae. NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. Journal of Bacteriology. 191, (14), 4492-4501 (2009).
  13. Broberg, C. A., Wu, W., Cavalcoli, J. D., Miller, V. L., Bachman, M. A. Complete genome sequence of Klebsiellapneumoniae. Strain ATCC 43816 KPPR1, a rifampin-resistant mutant commonly used in animal, genetic, and molecular biology studies. Genome Announcements. 2, (5), (2014).
  14. Croucher, N. J., et al. Role of conjugative elements in the evolution of the multidrug-resistant pandemic clone Streptococcuspneumoniae Spain23F ST81. Journal of Bacteriology. 191, (5), 1480-1489 (2009).
  15. Croucher, N. J., et al. Selective and genetic constraints on Pneumococcal serotype switching. PLoS Genetics. 11, (3), 1-21 (2015).
  16. Pertoft, H., et al. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  17. Breakwell, D. P., Moyes, R. B., Reynolds, J. Differential staining of bacteria: Capsule stain. Current Protocols in Microbiology. 15, (1), 1-4 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics