जीन थेरेपी डीएनए Origami Nanostructures के संरक्षण के लिए प्रेरित Polycation कोटिंग

Chemistry
 

Summary

यहां, एमजी में डीएनए origami nanostructures के संरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल समाप्त हो गया और nuclease-प्राकृतिक cationic polysaccharide chitosan और सिंथेटिक रैखिक polyethyleneimine (LPEI) कोटिंग्स का उपयोग कर अमीर मीडिया प्रस्तुत किया है ।

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Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

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Abstract

डीएनए origami nanostructures एक अपार क्षमता पकड़ जैविक और चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए । हालांकि, कम नमक की स्थिति और शारीरिक तरल पदार्थ में nucleases विकार और आत्म इकट्ठे डीएनए nanostructures के क्षरण के लिए प्रेरित । गैर वायरल जीन डिलिवरी में, डीएनए के एंजाइमी क्षरण एक cationic खोल में नकारात्मक आरोप डीएनए के encapsulation से दूर है । इस के साथ साथ, जीन प्रसव प्रगति, एक सरल, एक कदम और मजबूत पद्धति से प्रेरित डीएनए origami nanostructures के स्थिरीकरण के लिए उंहें chitosan और रैखिक polyethyleneimine के साथ कोटिंग द्वारा प्रस्तुत किया है । polycation कोटिंग कुशलतापूर्वक एमजी-घट और nuclease-रिच मीडिया में डीएनए origami nanostructures की रक्षा करता है । यह विधि भी एंजाइम की पूर्ण पता और डीएनए nanostructures के aptamer आधारित functionalization को बरकरार रखता है ।

Introduction

डीएनए नेनो संरचनाओं1के प्रोग्राम स्व-विधानसभा के लिए एक बहुमुखी इमारत ब्लॉक है । डीएनए nanostructures बनाने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीका डीएनए origami तकनीक है, जो स्वयं पर आधारित है एक लंबे परिपत्र के विधानसभा, एकल असहाय डीएनए पाड़ छोटे आकार के सैकड़ों की सहायता के साथ सिंथेटिक स्टेपल किस्में2का निर्धारण । आज, डीएनए nanostructures का निर्माण लगभग किसी भी ज्यामिति और आकृति विज्ञान में आसानी से संभव है । डीएनए nanostructures साइट हो सकता है-विशेष रूप से उच्च परिशुद्धता के साथ कार्यात्मक3,4 और allosteric के गठन के परिवर्तन से गुजरना क्रमादेशित किया जा सकता है5,6। इसलिए, एक निर्माण सामग्री के रूप में डीएनए का उपयोग कर अद्वितीय संवेदन, निदान और दवा वितरण में अनुप्रयोगों के लिए प्रोग्राम और उत्तरदायी कस्टम डिजाइन nanostructures बनाने का अवसर प्रदान करता है । हालांकि, डीएनए nanostructures exoद्वारा पाचन के लिए अतिसंवेदनशील होते है-और इंडो-nucleases, और जाली आधारित 3 डी डीएनए origami nanostructures आम तौर पर उच्च लवणता बफ़र्स (जैसे, 5-20 mM मिलीग्राम+ 2) की आवश्यकता को बनाए रखने के लिए अपने निष्ठा7,8.

रक्त में मौजूद nucleases द्वारा डीएनए का तेजी से क्षरण और extracellular मैट्रिक्स9कोशिकाओं में आनुवंशिक उत्पादों के वितरण vivo में कुशल करने के लिए एक बड़ी बाधा है । इस सीमा पर काबू पाने के लिए, गैर वायरल जीन डिलीवरी में, डीएनए एक cationic बहुलक के साथ एक परिभाषित एन/पी चार्ज अनुपात में मिलाया जाता है (polycation में डीएनए में फॉस्फेट्स के अनुपात)10। एक cationic बहुलक के साथ डीएनए के परिसर, polyplex के रूप में जाना जाता है, nuclease-मध्यस्थता क्षरण से डीएनए की रक्षा और अपनी सेलुलर वृद्धि11बढ़ाता है । जीन डिलिवरी प्रगति से प्रेरित, oligolysine12, oligolysine-पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) copolymers13, पाली (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-आधारित पॉलिमर14, और वायरस कैप्सिड प्रोटीन15 डीएनए origami nanostructures स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

हाल ही में, हम डीएनए origami nanostructures के संरक्षण के लिए एक विधि की सूचना दी मिलीग्राम-घट और nuclease-रिच प्राकृतिक cationic polysaccharide chitosan और सिंथेटिक रैखिक polyethyleneimine (LPEI) का उपयोग कर मीडिया16बताया गया था । यह लेख हमारे पहले काम का एक अनुकूलन है और polyplexes की तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन, उनके लक्षण वर्णन, नग्न और संरक्षित nanostructures में कम नमक और nuclease अमीर मीडिया की स्थिरता का परीक्षण और जांच एंजाइम की पता-और aptamer कार्यात्मक polycation कोटिंग पर डीएनए origami nanostructures ।

Protocol

1. तैयारी Polycation स्टॉक समाधान

  1. LPEI स्टॉक समाधान
    1. इसमें 10 मिलीग्राम LPEI की एक ग्लास यूरिन में < 10 एमएल वाला एच2ओ शामिल है ।
    2. LPEI को पूरी तरह से भंग करने के लिए, pH २.० तक पहुंचने तक HCl (३२%)
    3. NaOH (10 मीटर) जोड़कर पीएच ७.० को समायोजित करें ।
    4. 1 मिलीग्राम/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए मात्रा समायोजित करें ।
    5. एक ०.२२ µm झिल्ली के माध्यम से LPEI स्टॉक समाधान छानने का ।
  2. Chitosan स्टॉक समाधान
    1. भंग १६.६ chitosan oligosaccharide स्तनपान की मिलीग्राम (एमडब्ल्यू ~ 5 केडीए, ६०% oligosaccharide संरचना, deacetylated से काइटिन ९०%) एसिटिक एसिड की 1 मिलीलीटर में (10%) जलीय मीडिया 10 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के साथ एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए ।

2. डीएनए Origami Nanostructures का शुद्धिकरण

  1. मिश्रण १०० डीएनए origami नमूने के µ एल (में 5 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA, 5 मिमी NaCl बफर (चिह्नित के रूप में टीबी) सहित 18 मिमी MgCl2) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में 22 मिमी MgCl2 पूरक टीबी (१०० µ एल) के समकक्ष मात्रा के साथ.
  2. शुद्धि बफर के २०० µ एल जोड़ें (15% (डब्ल्यू/वी) खूंटी ८,०००, 5 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA और ५०५ मिमी NaCl). ट्यूब उलटा द्वारा धीरे मिश्रण ।
  3. 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान (r.t.) पर १६,००० × g पर नमूना स्पिन ।
  4. supernatant ध्यान से त्यागें और 16 मिमी MgCl2 पूरक टीबी बफर में गोली resuspend । supernatant और गोली अतिरिक्त प्रधान किस्में होते है और डीएनए origami क्रमशः उपजी ।
  5. एक thermomixer में ६५० rpm पर r.t. में एक दिन के लिए नमूना मशीन । यह कदम डीएनए origami के पूर्ण पुनर्निलंबन के लिए है ।

3. Agarose जेल ट्रो (आयु)

  1. 2% agarose जेल को तैयार करने के लिए एक ग्लास यूरिन में १.६ जी का agarose और ८० एमएल का 0.5 x ताे बफर (20 एमएम Tris, ०.५ mm EDTA, 10 एमएम एसिटिक एसिड, pH 8) डालें । माइक्रोवेव के लिए 5 min. एक पानी के स्नान में 1 मिनट के लिए चोंच की सामग्री घूमता । 11 मिमी MgCl2के साथ जेल तैयार करने के लिए MgCl2 (२.५ मीटर) के ३५२ µ एल जोड़ें । डीएनए जेल दाग के 10 µ एल के साथ जेल के पूर्व दाग ।
  2. जेल समाधान एक सूखी जेल बॉक्स में डालो और एक जेल ट्रो कंघी डालें । चलो समाधान 15-30 मिनट के लिए r.t. पर जमना ।
  3. 11 मिमी MgCl2के साथ चल रहे बफर (0.5 x ताे बफर) का पूरक ।
  4. मिश्रण 10-20 6x लोड हो रहा है बफर के 20% के साथ नमूने के µ एल (30% (वी/वी) ग्लिसरॉल, ०.२५% (डब्ल्यू/वी) bromophenol ब्लू, ०.२५% (डब्ल्यू/वी) xylene cyanol एफएफ) और यह agarose जेल कुओं में लोड ।
  5. चलाने के ७० वी पर r.t. में २.५ के लिए जेल-3 एच ।
  6. एक यूवी स्कैनर के साथ जेल कल्पना ।

4. नकारात्मक दाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (nsTEM)

  1. पतला nanostructure या एक चमक पर polyplex के 5 µ एल लागू-निर्वहन कार्बन लेपित Cu400 उनि ग्रिड । इसे कै .1 मिनट के लिए adsorb दें ।
  2. फिल्टर कागज के एक टुकड़े से ग्रिड के किनारे से अतिरिक्त तरल नाली ।
  3. एक 2% uranyl एसीटेट जलीय समाधान के 5 µ एल लागू करें और 1 मिनट के लिए रुको ।
  4. ग्रिड के किनारे से पूरी तरह से अतिरिक्त तरल नाली के लिए फिल्टर कागज किनारे का उपयोग करें ।
  5. इसे उनि में इंजेक्ट करने से पहले ग्रिड को पूरी तरह से सूखने दें ।

5. Polyplex गठन

नोट: उदाहरण के लिए एक डीएनए origami और chitosan एन/पी 0.01-8 अनुपात में शामिल polyplex की तैयारी के लिए मिसाल ।

  1. सूत्र-1 (Table 1) का उपयोग करते हुए प्रति polycation अमीनों की संख्या की गणना करें ।
  2. शुद्ध डीएनए origami की एकाग्रता उपाय २६० एनएम पर एक अल्ट्रा वायलेट spectrophotometer का उपयोग कर । मशीन जांचने के लिए रिक् त के रूप में टीबी बफर के 2 µ l का प्रयोग करें । फॉर्मूला-2 का उपयोग कर "फास्फेट के nmol" की गणना.
  3. फॉस्फेट के 1 nmol सहित डीएनए origami संरचना के 15 µ एल तैयार करें ।
  4. chitosan की मात्रा की गणना करने के लिए फॉर्मूला-3 का उपयोग करें, जो N/P 0.01-8 पर polyplex तैयार करने के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, N/P 8 पर polyplex तैयार करने के लिए, १.८ µ l of chitosan (०.८ mg/एमएल) की जरूरत है (N/P 8 है, फॉस्फेट के nmol 1 है, chitosan के आणविक भार है ५,००० g/, chitosan स्टॉक समाधान की एकाग्रता है ०.८ मिलीग्राम/एमएल और chitosan प्रति अमीन की संख्या 28 है) । जोड़ें टीबी के १३.२ µ l को १.८ µ l के chitosan (०.८ mg/ जोड़ें 15 µ एल के chitosan समाधान (०.८ मिलीग्राम/एमएल) 15 µ एल के लिए डीएनए origami के कदम से ५.३ एक डीएनए origami-chitosan polyplex NP 8 के साथ पाने के लिए । polyplex का गठन अनायास ही हो जाता है ।
  5. अलग N/P अनुपात पर polyplexes तैयार करने के लिए ५.४ चरण दोहराएं ।
  6. चरण 3 (चित्र 1a) में वर्णित आयु के अनुसार कार्य करें । नग्न डीएनए origami नियंत्रण के रूप में शामिल करें ।
  7. छवि polyplex चरण 4 (चित्रा 2) में वर्णित के रूप में ।

    सूत्र-1) polycation प्रति अमीन समूहों की संख्या
    Equation 1

    सूत्र-2) फॉस्फेट के तिल
    =Equation 2

    सूत्र-3) polycations की मात्रा (µ l)
    =Equation 3

6. Dextran सल्फेट के साथ Decapsulation

  1. फार्मूला-4 (तालिका 2) का उपयोग कर dextran सल्फेट प्रति सल्फेट समूहों की संख्या की गणना ।
  2. सूत्र-5 का उपयोग कर एक पूर्वनिर्धारित a/P अनुपात में polyplex के संमिश्रता के लिए आवश्यक dextran सल्फेट की मात्रा की गणना करें । a/p प्रभार अनुपात polyanion के सल्फेट समूहों के बीच अनुपात (ए) फॉस्फेट समूहों के लिए (पी) डीएनए origami का है । dextran सल्फेट की एक अतिरिक्त राशि polyplexes (जैसे 500-1000) के एक कुशल परिसर के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, धारा 5 में तैयार polyplex को जटिल करने के लिए (polyplex में 1 nmol फॉस्फेट होता है) A/P १,०००, ३.६ µ l के dextran सल्फेट ४० केडीए (५० मिलीग्राम/एमएल) की जरूरत है (ए/पी है १,०००, nmol फॉस्फेट की है 1, dextran सल्फेट के आणविक वजन है ४०,००० ग्राम/ , dextran सल्फेट स्टॉक समाधान की एकाग्रता ५० मिलीग्राम/एमएल और सल्फेट की संख्या २२० है) है । dextran सल्फेट (५० मिलीग्राम/एमएल) के ३.६ µ एल जोड़ें चरण ५.४ से polyplex और अच्छी तरह से मिश्रण ।
  3. यदि किसी chitosan polyplex के साथ कार्य करना हो, तो NaOH की प्रक्रिया को सुगम बनाने के लिए जोड़ें । 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए NaOH जोड़ें । LPEI polyplexes के लिए यह चरण छोड़ें ।
  4. चरण 3 (चित्र 1b) में बताए अनुसार कोई आयु निष्पादित करें । एक नग्न डीएनए origami और नियंत्रण के रूप में polyplex शामिल करें ।

    सूत्र-4) polyanion प्रति सल्फेट समूहों की संख्या =
    Equation 4

    सूत्र-5) dextran सल्फेट की मात्रा (µ l)
    =Equation 5

7. स्थिरता की ओर Mg कमी

  1. धो 20 µ एल के एक डीएनए origami या इसी polyplex (2 nmol फॉस्फेट सहित) 4x ६०० µ एल के एमजी शून्य बफर (5 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA और 30 मिमी NaCl) का उपयोग कर ultrafiltration स्तंभ (MWCO ~ 3 केडीए). १४,००० × r.t. में 3-5 मिनट के लिए जी पर प्रत्येक धो स्पिन ।
  2. शेष समाधान (८० µ l) लीजिए और एक दिन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक thermomixer में ६५० rpm पर मशीन ।
  3. यदि परीक्षण LPEI polyplex, 16 मिमी MgCl2की एक अंतिम एकाग्रता के लिए MgCl2 (५०० मिमी) के २.५ µ एल जोड़ें । फिर, dextran सल्फेट के 7 µ एल जोड़ें-४० केडीए (५० मिलीग्राम/एमएल) (एक/पी १,००० के बराबर) कोर डीएनए nanostructures (decapsulation, देखें चरण 6) को खंडित करने के लिए ।
    नोट: chitosan polyplex या नग्न डीएनए origami के साथ काम कर अगर इस कदम को छोड़.
  4. चरण 3 (चित्रा 2) में वर्णित के रूप में nsTEM इमेजिंग का पालन करें ।

8. DNase मैं नग्न डीएनए Origami की अनुमापन परख Nanostructures

  1. 2 µ एल के साथ 1 nmol फॉस्फेट सहित नग्न डीएनए origami के 3 µ एल मिक्स 10x DNase मैं बफर (१०० mM Tris-HCl, 25 एमएम MgCl2, 5 एमएम CaCl2, पीएच ७.६), 1 µ एल के MgCl2 (२५० एमएम), ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूबों में 12 µ एल का पानी । DNase I (10x) के 2 µ l को जोड़ें । DNase मैं (10x) के शेयर एकाग्रता को समायोजित करने के लिए अंतिम DNase मैं 0.25-2 यू/एमएल की सांद्रता ।
  2. एक thermocycler में 1-2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन ।
  3. नमूनों को बर्फ में विसर्जित करें और ५०० mm dithiothreitol (डीटीटी) और µ (३३ mM) के २.५ EGTA l के 2 µ l को जोड़कर nucleolytic गतिविधि को निष्क्रिय कर दीजिये ।
  4. एक उंर का उपयोग कर नमूने के रूप में चरण 3 में वर्णित विश्लेषण ।

9. DNase के प्रति Polyplexes की स्थिरता I

  1. मिश्रण 4 µ l का एक polyplex (1 nmol सहित फॉस्फेट, अलग N/P अनुपात पर तैयार) एक DNase i बफर (10x) के १.५ µ एल के साथ, 8 µ एल के टीबी और १.५ µ एल के DNase मैं (१०० U/एमएल) एक ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में ।
  2. एक thermocycler में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए नमूना मशीन ।
  3. एक thermocycler में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए DNase I. की मशीन को पचाने के लिए proteinase K (20 मिलीग्राम/एमएल) के 2 µ एल जोड़ें ।
    नोट: एंजाइमी पाचन के बजाय, DNase की रासायनिक निष्क्रियता मैं डीटीटी (५०० mm) के १.५ µ एल जोड़कर और µ के 2 EGTA एल (३३ mm) किया जा सकता है ।
  4. कोर डीएनए nanostructures को खंडित करने के लिए dextran सल्फेट के ३.६ µ l को जोड़ें-४० केडीए (५० mg/एमएल) (ए पी १,००० के समकक्ष).
  5. चरण 3 में वर्णित उम्र के अनुसार कार्य करें (चित्र३, चित्र 3 c). को मापने और जेल पर बैंड तीव्रता की तुलना के लिए नियंत्रण के रूप में ताजा डीएनए origami शामिल करें ।
  6. उत्पाद की उंर पर बैंड और एक निचोड़ फ्रीज निष्कर्षण आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान की प्रोटोकॉल के आधार पर कॉलम द्वारा डीएनए origami निकालें ।
  7. चरण 4 (चित्रा 2) में वर्णित के रूप में nsTEM इमेजिंग का पालन करें ।

10. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) की ओर स्थिरता

  1. मिश्रण 4 µ एल के नग्न डीएनए origami या उसके इसी polyplex (सहित 1 nmol फॉस्फेट) की 17 µ एल के साथ टीबी + 10% FBS में ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों. हौसले से गल FBS का इस्तेमाल करें ।
  2. 24 घंटे के लिए एक थर्मल साइकिल चालक में ३७ ˚ सी पर नमूना मशीन ।
  3. एक बर्फ स्नान में नमूना विसर्जित कर दिया ।
  4. polyplex का परीक्षण करते हैं, तो dextran सल्फेट के ३.६ µ l को जोड़कर decapsulation प्रक्रिया निष्पादित करें-४० केडीए (५० mg/ साथ ही, यदि chitosan polyplexes के साथ कार्य NaOH जोड़ें (चरण ६.३ देखें)
  5. चरण 3 में वर्णित के रूप में कोई आयु निष्पादित करें । को मापने और जेल पर बैंड तीव्रता की तुलना के लिए नियंत्रण के रूप में ताजा डीएनए origami शामिल हैं ।
  6. आयु पर बैंड और एक निचोड़ फ्रीज निष्कर्षण कॉलम द्वारा डीएनए origami निकालने एक्साइज ।
  7. एक ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूब में निकाले डीएनए origami समाधान (20 µ एल) के लिए proteinase कश्मीर (20 मिलीग्राम/एमएल) के 2 µ एल जोड़ें । nanostructures के लिए बाध्य सीरम प्रोटीन को पचाने के लिए एक thermocycler में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
  8. 5x ५०० µ एल के साथ नमूना धो 16 मिमी MgCl2 सहित टीबी के ultracentrifugation कॉलम (MWCO ~ १०० केडीए) का उपयोग proteinase कश्मीर (मेगावाट ~ २८.९ केडीए) धोने के लिए दूर । १४,००० × r.t. में 3-5 मिनट के लिए जी पर प्रत्येक धो स्पिन ।
  9. चरण 4 (आरेख 3) में वर्णित के रूप में nsTEM इमेजिंग निष्पादित करें ।
    नोट: कदम १०.६ से जेल निकाले नमूना nsTEM इमेजिंग के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, इमेजिंग डीएनए origami nanostructures करने के लिए सीरम प्रोटीन के लगाव के कारण बहुत चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इसलिए, proteinase K उपचार (चरण 10.7-10.9) इमेजिंग प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए अनुशंसित है ।

11. परीक्षण सहिजन Peroxidase एंजाइम के पते की (एचआरपी)-Polycations के साथ कोटिंग पर कार्यात्मक डीएनए Origami

  1. चरण 2 में वर्णित के रूप में स्व-इकट्ठे biotinylated-nr (बायोटिन-nr) शुद्ध.
  2. मशीन २०० µ शुद्ध बायोटिन की एल-NR (३६ एनएम, 16 मिमी पूरक टीबी बफर में) २०० µ एल के साथ एचआरपी-संयुग्मित streptavidin (५४० एनएम, टीबी बफर में). 14 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए MgCl2 (५०० मिमी) के ४.८ µ एल जोड़ें । एक thermomixer में ६५० rpm पर 12 एच के लिए r.t. में मशीन
  3. एक खूंटी शुद्धि विधि (के रूप में चरण 2 में वर्णित) से असीम एचआरपी एंजाइमों को दूर करने के लिए एचआरपी-कार्यात्मक nr (एचआरपी-nr) शुद्ध. 16 मिमी MgCl2सहित टीबी में उपजी एचआरपी-NR resuspend.
  4. 1, 2, 4, 10 और 20 ( फॉर्मूला 3का उपयोग) के N/P अनुपात में polyplex तैयार करने के लिए संस्करण सांद्रता के polycations के ६.५ µ एल के साथ शुद्ध एचआरपी-NR (३६ एनएम) के ६.५ µ एल मिक्स ।
  5. दोहराएँ चरण 11.2-11.4 गैर-biotinylated के लिए NR. के रूप में एचआरपी एंजाइम गैर विशेष रूप से डीएनए origami को बांध सकता है, गैर biotinylated डीएनए origami, जो एचआरपी एंजाइमों और खूंटी के साथ इलाज किया जाता है शुद्ध (बायोटिन-NR के समान), परख में नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे ।
  6. 1, 2, 4, 10 और 20 के परिभाषित N/P अनुपात के लिए इसी संस्करण सांद्रता के polycations के ६.५ µ l के साथ आसुत पानी की ६.५ µ एल मिक्स । ये नमूने रिक्त समूह के रूप में कार्य करते हैं ।
  7. तैयार समाधान के चरणों में जोड़ें 11.4-11.6 (१२.५ µ l) ७२.५ µ l HEPES बफ़र (25 मिमी HEPES, 20 मिमी KCl, २०० मिमी NaCl, ०.०५% ट्राइटन X-१००, 1% DMSO, पीएच ७.४) और अच्छी तरह से मिश्रण सहित एक ९६-well थाली करने के लिए ।
  8. 2, 2 '-azino-बीआईएस (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic एसिड) (ABTS) (15 मिमी) के 10 µ एल जोड़ें ।
  9. एच22 (12 मिमी) के 5 µ एल जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । एच22 प्रतिक्रिया शुरू होता है ।
  10. एक बहुपद्वति प्लेट रीडर (चित्रा 4a) के साथ 4 एच पर ४२१ एनएम पर अवशोषक उपाय ।

12. परीक्षण हेमीन की पता-बाध्यकारी Aptamers (बांधणी)-Polycations के साथ कोटिंग पर कार्यात्मक डीएनए Origami

  1. प्रकार्यात्मक बांधणी-nr (बांधणी-nr) चरण 2 में वर्णित के रूप में शुद्ध. MgCl2 (उच्च नमक एकाग्रता के एकत्रीकरण के लिए होता है) 6 मिमी के साथ पूरक टीबी में उपजी बांधणी-nr resuspend-nr).
  2. 1, 2, 10 और 20 के परिभाषित N/P अनुपात के polyplex तैयार करने के लिए अलग एकाग्रता पर polycations के 10 µ एल के साथ बांधणी-NR (४० एनएम) के 10 µ एल मिश्रण ।
  3. 1, 2, 10 और 20 के N/P अनुपात के लिए इसी अलग सांद्रता पर polycations के 10 µ एल के साथ-नंगे-NR (४० एनएम) या आसुत-पानी के 10 µ एल मिश्रण ।
  4. जोड़ें 20 µ l चरण १२.२ और १२.३ से ९६ अच्छी तरह से HEPES बफर के ६० µ एल सहित थाली से समाधान तैयार (25 मिमी HEPES, 20 मिमी KCl, २०० मिमी NaCl, ०.०५% ट्राइटन एक्स-१००, 1% DMSO, पीएच ७.४) और अच्छी तरह से मिश्रण. 20 µ l polyplex या polycation समाधान (चरण १२.२ और १२.३ से) पानी के साथ की जगह कम से कम एक रिक्त नमूना शामिल करें ।
  5. हेमीन (०.०४ मिमी) के 5 µ एल जोड़ें ATBS (15 मिमी) के 10 µ एल द्वारा पीछा किया । 5 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर थाली प्लेस ।
  6. एच22 (12 मिमी) के 5 µ एल जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  7. बहुपद्वति प्लेट रीडर (फिगर 4B) के साथ ४२१ nmover 30 मिनट में अवशोषक को मापने ।

Representative Results

तीन डीएनए origami nanostructures विभिंन विंयास के डिजाइन किए गए थे, जिसमें एक nanorod (NR), एक nanobottle (एनबी) और एक वायरफ़्रेम nanostructure (WN) (nanostructures के 3d मॉडल चित्रा 2में सचित्र हैं) । NR और NB एक वर्ग और छत्ते जाली के आधार पर डिजाइन किए गए थे, क्रमशः,17 caDNAno का उपयोग कर और WN डेडोलस सॉफ्टवेयर18का उपयोग कर बनाया गया था. डिजाइन और आत्म डीएनए nanostructures के विधानसभा के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल पहले से ही प्रकाशित किया गया है19,20,21,22। आकार विशिष्ट स्टेपल किस्में आदेश दिया, स्वयं इकट्ठे हुए थे और आगे एक Stahl एट अलद्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर शुद्ध । 23 (चरण 2) ।

Polyplexes जेल मंदता परख और nsTEM इमेजिंग द्वारा विशेषता थे । polycations, कैथोड की ओर नग्न nanostructure बैंड में एक बदलाव के साथ डीएनए origami मिश्रण पर (चित्रा 1) मनाया गया । यह polycations के लिए बाध्यकारी और परिसर के समग्र आकार वृद्धि पर फॉस्फेट समूहों के नकारात्मक प्रभार के प्रतिसंतुलन के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । dextran सल्फेट जैसे polyanions की एक अतिरिक्त राशि जोड़ने polyplex गठन रिवर्स कर सकते हैं । इस संबंध में, उच्च आणविक वजन की dextran सल्फेट (एमडब्ल्यू ~ ४० केडीए) कम आणविक भार dextran सल्फेट (एमडब्ल्यू ~ 4 केडीए) की तुलना में विरूपण के लिए अधिक कुशल होना दिखाया (चित्रा 1बी).

जबकि इमेजिंग LPEI polyplexes द्वारा uranyl एसीटेट नेगेटिव दाग उनि, यह किसी भी कणों छवि मुश्किल था । यह कल्पना की थी कि LPEI uranyl एसीटेट के लिए डीएनए origami के तंग ढाल के कारण फॉस्फेट रीढ़ की बाध्यकारी से बाधा हो सकती है । इसलिए, nsTEM इमेजिंग करने से पहले, dextran सल्फेट की एक अतिरिक्त राशि LEPI polyplexes में जोड़ा गया था । खंडित डीएनए origami nanostructures दोष और न ही अपघटन का कोई संकेत नहीं दिखाया । इसके विपरीत, chitosan polyplexes सफलतापूर्वक polyanion उपचार (चित्रा 2) के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ छवि थे ।

सभी नग्न डीएनए nanostructures (अपने अलग विंयास की परवाह किए बिना) पूरी तरह से ३७ ° c में एमजी में एक दिन के बाद विकृत थे शूंय बफर, के रूप में nsTEM इमेजिंग द्वारा की पुष्टि की । इसके विपरीत, N/P ≥ 1 पर LPEI या chitosan के साथ लेपित nanostructures बरकरार रहे । इसी प्रकार, DNase मैं अनुमापन परख एंजाइमी पाचन के प्रति असुरक्षित nanostructures की संवेदनशीलता को दिखाया । जबकि नग्न nanostructures पूरी तरह से 1 यू की उपस्थिति में पचा रहे थे/एमएल DNase मैं 2 घंटे के बाद, LEPI या chitosan समझाया डीएनए origami मिलीग्राम में बरकरार शूंय बफर 10 U/एमएल DNase मैं एक दिन की एक ंयूनतम के लिए के साथ पूरक (2 चित्रा) । nucleolytic पाचन की दिशा में उच्च स्थिरता polyplexes के एन/पी अनुपात में वृद्धि के द्वारा प्राप्त किया गया था । इसके अतिरिक्त, LPEI डीएनए nanostructures अधिक कुशलता से chitosan (चित्रा 3, चित्रा 3सी) की तुलना में, शायद LEPI के उच्च प्रभार घनत्व के कारण, और इस प्रकार, 24 डीएनए के प्रति उच्च बाध्यकारी अपनत्व की रक्षा करता है . अलग आणविक भार (चित्रबी) के LPEI का उपयोग करते समय कोई अंतर नहीं देखा गया ।

एक बहुलक खोल में encapsulation के बाद डीएनए nanostructures में कार्यात्मक समूहों के पते एक महत्वपूर्ण विशेषता है । इसके अलावा, सहिजन peroxidase एंजाइम (एचआरपी) और हेमीन-बाध्यकारी aptamers (बांधणी) कार्यात्मक डीएनए origami के साथ polycation कोटिंग की अनुकूलता की जांच की थी । तीन biotinylated स्टेपल किस्में NR की सतह से बहर और फिर एचआरपी संयुग्मित streptavidin के साथ कार्यात्मक (डीएनए origami प्रति तीन एंजाइमों) थे । उत्प्रेरक अत्यधिक सक्रिय (कश्मीरडी: ४३९ एनएम) बांधणी aptamer PS2 । एम (5 '-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3 ') को इन प्रयोगों के लिए25चुना गया था । के लिए 24 स्टेपल किस्में एक 5 एनएम लंबाई linker (5 '-AAAAGAAAAGAAAAA-3 ') PS2 द्वारा पीछा के साथ NR सतह से फैला रहे थे । एम अनुक्रम (डीएनए origami प्रति 24 aptamers) । एंजाइमी या aptamer गतिविधि का कोई उल्लेखनीय बाधा कोटिंग एचआरपी पर देखा गया था-या बांधणी-कार्यात्मक डीएनए origami के साथ LPEI और chitosan पर संस्करण N/P अनुपात (चित्रा 4A-B)16. हालांकि, एचआरपी एंजाइम की काइनेटिक है नाटकीय रूप से डीएनए origami (चित्रा 4सी) के लिए बाध्यकारी के बाद बदल गया है ।

Figure 1
चित्रा 1 : polyplex गठन और decapsulation के प्रतिनिधि आयु छवियां । (क) 0.01-8 के एन/पी अनुपात में chitosan के साथ मिश्रित नायब के लिए electrophoretic गतिशीलता पारी परख । प्रत्येक लेन 1 nmol एनबी शामिल हैं । पहली लेन के संदर्भ एनबी है । (B) polyanionic dextran सल्फेट (DS) द्वारा polyplexes का Decapsulation. यह आंकड़ा एक पहले से प्रकाशित चित्र16से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : नकारात्मक दाग उनि डीएनए का माइक्रोग्राफ origami और polyplexes. 3d मॉडल और nsTEM नग्न डीएनए origami nanostructures के माइक्रोग्राफ (कॉलम 1 और 2) । LPEI polyplexes (decapsulation के बाद) और chitosan polyplexes (कॉलम 3 और 4) के nsTEM माइक्रोग्राफ । नग्न और संरक्षित डीएनए origami (polyplex) के nsTEM छवियों को एमजी कमी (कॉलम 5, 6 और 7), एंजाइमी क्षरण (कॉलम 8 और 9), सीरम पाचन (कॉलम 10 और 11) के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक दिन के लिए अधीन । इस परख में LPEI-5 केडीए का इस्तेमाल किया गया । नग्न डीएनए nanostructures 1 यू/एमएल DNase मैं या टीबी में 10% FBS की उपस्थिति में एक उंर पर पता लगाने से परे नीचा थे ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन के 2 एच के बाद । स्केल बार्स: १०० एनएम । यह आंकड़ा एक पहले से प्रकाशित चित्र16से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : DNase मैं सुरक्षा परख के प्रतिनिधि परिणाम । (क) LPEI के साथ WN के polyplexes के लिए DNase I प्रोटेक्शन परख-5 केडीए, LPEI-10 केडीए और LPEI-25 केडीए ने 2, 4, 8 और 10 के एन/पी अनुपात में तैयार किया. नमूने ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 10 यू/एमएल DNase I के अधीन थे । पिछले लेन नियंत्रण WN है । polyplexes जेल में लोड करने से पहले decapsulated थे । (ख) उम्र छवि से निकाले गए विभिन्न LPEI के साथ डीएनए origami के polyplexes के लिए सामान्यीकृत मतलब बैंड तीव्रता-A. Y अक्ष सामान्यीकृत माध्य बैंड तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है । (ग) 1, 2, 4, 10 और 20 के N/P अनुपात में तैयार chitosan-WN polyplexes की DNase I protection परख । नमूने ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 10 यू/एमएल DNase I के अधीन थे । लेन 6 नियंत्रण polyplex (N/पी 20) है । पिछले लेन नियंत्रण WN है । सभी chitosan polyplexes जेल में पहले से लोड decapsulated थे । यह आंकड़ा एक पहले से प्रकाशित चित्र16से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: वर्णमिति एंजाइम के प्रतिनिधि परिणाम-और aptamer-कार्यात्मक डीएनए origami परख । (क) एंजाइम की वर्णमिति परख कार्यात्मक nanostructures (एचआरपी-NR) प्रतिक्रिया शुरू होने के बाद chitosan ३.७ ज के साथ लेपित । (ख) aptamer के वर्णमिति परख कार्यात्मक nanostructures (बांधणी-NR) chitosan, प्रतिक्रिया दीक्षा के बाद 6 मिनट के साथ लेपित । Y अक्ष सामान्यीकृत अवशोषक का प्रतिनिधित्व करता है । (ग) एचआरपी की वर्णमिति परख और एचआरपी-NR समय के साथ निगरानी. यह आंकड़ा एक पहले से प्रकाशित चित्र16से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Cationic पॉलीमर्स Chitosan LPEI-5 केडीए LPEI-10 केडीए LPEI-25 केडीए
बहुलक का आणविक भार (केडीए) 5 5 10 25
मोनोमर के Molecualr वजन (g/ १६१ ४३ ४३ ४३
प्रति मोनोमर अमीन की संख्या 1 1 1 1
प्रति बहुलक अमीन की संख्या 28 ११६ २३२ ५८१

तालिका 1. polycation प्रति अमीन समूहों की संख्या की गणना.

dextran सल्फेट (केडीए) का आणविक भार 4 ४०
मोनोमर के आणविक वजन (जी/ ३६६ ३६६
प्रति मोनोमर सल्फेट की संख्या 2 2
प्रति बहुलक सल्फेट की संख्या 22 २२०

तालिका 2. प्रति polyanion सल्फेट समूहों की संख्या की गणना.

Discussion

आत्म-डीएनए origami के विधानसभा में, प्रधान किस्में आम तौर पर पाड़ को 5-10 अतिरिक्त अनुपात में जोड़ रहे हैं । ये अतिरिक्त प्रधान किस्में भी monometer रेंज में polycation और फॉर्मल polyplexes को बाँधती हैं जो आगे चलकर मुश्किल से डीएनए origami polyplexes से अलग हो जाती हैं. इसलिए, polyplex गठन में एक महत्वपूर्ण कदम अतिरिक्त प्रधान किस्में हटाने और अच्छी तरह से शुद्ध डीएनए origami nanostructures का उपयोग करने के लिए है ।

अंय तरीकों से एक क्लिक प्रतिक्रिया26के माध्यम से डीएनए किस्में के cyclization जैसे डीएनए nanostructures स्थिर करने के लिए विकसित किया गया है । के रूप में alkyne-और azide-संशोधित स्टेपल किस्में इंटरलॉकिंग एकल-असहाय छल्ले के गठन के लिए आवश्यक हैं, इस तकनीक छोटे nanostructures के स्थिरीकरण ऐसे डीएनए catenane के लिए सीमित है, और यह बड़ा डीएनए origami के लिए आसानी से स्केलेबल नहीं है इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए लोगों के रूप में संरचना । हाल ही में, Gerling एट एएल27 आबंध cyclobutene न्यूक्लियोटाइड डिमर (सीपीडी) डीएनए thymidines में पराबैंगनी विकिरण का उपयोग कर के भीतर पड़ोसी nanostructures के बीच बांड बनाने के लिए एक विधि की सूचना दी । हालांकि इस विधि साइट चयनात्मक और स्केलेबल है, डीएनए origami की रक्षा में अपनी दक्षता polycation कोटिंग की तुलना में बहुत कम है । उदाहरण के लिए, सीपीडी-स्थिर डीएनए origami वस्तुओं केवल ०.४ यू/एमएल DNase मैं 1 घंटे के लिए सहना, जबकि polyplexes 10 यू/एमएल DNase मैं कम एक दिन के लिए की उपस्थिति में स्थिर थे ।

संक्षेप में, जीन थेरेपी प्रेरित chitosan और LPEI कोटिंग एक कम लागत, एक कदम और कुशल विधि के लिए डीएनए origami nanostructures की दीर्घकालिक स्थिरता का पता है Mg-घट और nuclease-रिच मीडिया । polyplex गठन की reversibility बहु-चरणीय नैदानिक परीक्षणों में अपने आवेदन की सुविधा देती है जहां nucleolytic क्षरण या नमक-घट के विरुद्ध डीएनए origami की सुरक्षा एक कदम में महत्वपूर्ण है लेकिन अन्य चरणों में ऐसी समस्या पैदा हो सकती है जैसे डीएनए प्रवर्धन. साथ ही, polycation कोटिंग के लिए एक संभावित दृष्टिकोण है सेलुलर बढ़ाने के लिए डीएनए origami nanostructures दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए28.

Disclosures

लेखक इस रिपोर्ट से संबंधित हित का कोई टकराव नहीं घोषित करते हैं.

Acknowledgments

इस परियोजना को अनुदान समझौते सं ६८६६४७ के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है. उनि छवियां एक Morgagni पर दर्ज की गई ८० एम पर संचालित वियना के लिए केंद्र की सुविधा GmbH (VBCF) । हम चित्रमय डिजाइन में सहायता के लिए Tadija Kekic और एलिसा De LIano वायरफ़्रेम nanostructure डिजाइनिंग के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

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