Evaluering av Biomarkers i Glioma av immunhistokjemi på parafin-Embedded 3D Glioma Neurosphere kulturer

Cancer Research

GE Global Research must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Neurospheres dyrket som 3D kulturer utgjør et kraftig verktøy for å studere glioma biologi. Her presenterer vi en protokoll for å utføre immunohistochemistry samtidig 3D oppbygning glioma neurospheres gjennom parafininnstøper. Denne metoden kan karakterisering av glioma neurosphere egenskaper som stemness og nevrale differensiering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Núñez, F. J., Mendez, F. M., Garcia-Fabiani, M. B., Pardo, J., Edwards, M., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (143), e58931, doi:10.3791/58931 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analyse av protein uttrykk i glioma er relevant for flere aspekter i studiet av dens patologi. Mange proteiner har blitt beskrevet som biomarkers programmer diagnose, prognosen, klassifisering, delstaten svulst progresjon og celle differensiering tilstand. Disse analysene av biomarkers er også nyttig å karakterisere svulst neurospheres (NS) fra glioma pasienter og glioma modeller. Svulst NS gi en verdifull i vitro modell for å vurdere ulike funksjoner av svulsten som de er avledet og kan mer nøyaktig speil glioma biologi. Her beskriver vi en detaljert metode for å analysere biomarkers i svulst NS med immunohistochemistry (IHC) på parafin-embedded svulst NS.

Introduction

Gliomas er primære solide svulster i sentralnervesystemet klassifisert av deres fenotypiske og genotypic egenskaper i henhold til Verdens helseorganisasjon1. Klassifiseringen inkluderer tilstedeværelse eller fravær av driveren mutasjoner, som representerer en attraktiv kilde biomarkers2. Biomarkers er biologiske egenskaper som kan måles og evalueres for å indikere normal og patologisk prosesser, samt farmakologiske svar til terapeutisk intervensjon3. Biomarkers kan oppdages i tumor vev og celler avledet fra glioma, slik at dens biologiske karakteristikk i ulike aspekter. Eksempler på glioma biomarkers er muterte isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1), en mutert enzym karakteristisk for lavere grad gliomas assosiert med bedre prognose4. Muterte IDH1 uttrykkes ofte i kombinasjon med TP53 og alpha-talassemi/mental retardasjon syndrom X-koblet (ATRX)-inaktivere mutasjoner, definere en bestemt glioma undertype4,5. ATRX-inaktivere mutasjoner også forekommer i 44% av pediatric høyverdig gliomas2,6 og er forbundet med aggressiv svulster og genomisk ustabilitet6,7. I tillegg er pediatric diffus iboende pontine gliomas (DIPG) differensiert i undergrupper etter tilstedeværelse eller fravær av en K27M mutasjon histone H3 genet H3F3A eller HIST1H3B/C gen1,6. Derfor innføringen av molekylære karakterisering tillater underinndeling, studiet og behandling av gliomas som separate enheter, noe som gjør mer utvikling av mer målrettet terapi for hver undertype. I tillegg kan analyse av biomarkers brukes til å evaluere ulike biologiske prosesser som apoptose8, autophagy9, celle syklus progresjon10, celle spredning11og celledifferensiering12 .

Genmodifiserte dyr modeller som havn genetisk lesjoner i kreft hos mennesker er avgjørende for å studere signalnettverk trasé som megle sykdomsprogresjon. Vårt laboratorium har implementert bruk av Sleeping Beauty (SB) transposase systemet å utvikle genmodifiserte musen modeller av glioma skjuler spesifikke mutasjoner som recapitulate menneskelige glioma subtyper13,14. Modellene genmodifiserte mus brukes for å generere svulst-avledet NS, som aktiverer i vitro studier i et 3D-system, speiling viktigste funksjonene finnes i svulster i situ15. Orthotopical transplantasjon av NS i mus kan også generere sekundære svulster som beholde funksjoner av den primære svulsten og etterligner egenskapene histopathological genomisk og fenotypiske av tilsvarende primære svulst15.

I serum-free kultur, hjerne svulst cellene med stilk celleegenskaper kan bli beriket, og i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF) og fibroblast vekstfaktorer (FGF), de kan dyrkes som enkelt celle-avledet kolonier som NS kulturer. I dette selektiv kultur-systemet dør mest unike eller differensierte celler raskt, mens stilk celler dele og danne mobilnettet klynger. Dette tillater generering av en NS kultur som opprettholder glioma svulst funksjoner16,17,18. Glioma NS kan brukes til å vurdere flere aspekter av svulst biologi, inkludert analyse av biomarkers som har programmer i diagnose, prognosen, klassifisering, delstaten svulst progresjon og celle differensiering tilstand. Her vi detalj en protokoll for å generere glioma NS og bygg inn 3D kulturer i parafin skal brukes til IHC farging. En fordel av bestemmer og innebygging glioma NS er at morfologi av NS opprettholdes bedre sammenlignet med konvensjonelle cytospin metoden19, som glioma NS er utsatt for stressende manipulasjon for cellen dissosiasjon og bli jevnet. I tillegg slukker innebygging alle endogene fluorophore uttrykk fra genmodifiserte svulsten NS, aktivere flekker over til fluorescerende spectra. Det overordnede målet med denne metoden er å bevare 3D strukturen av glioma celler gjennom en parafin innebygging prosessen og aktiverer karakterisering av glioma neurospheres med immunohistochemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Michigan.

1. generasjon av hjerne svulst Neurospheres avledet fra en musemodell

  1. Før disseksjon prosedyren, forberede nevrale stamceller media (NSC Media: DMEM/F12 med 1 x B27 supplement, 1 x N2 supplement, 1 x normocin og 1 x antibiotika/antimycotic supplert med menneskelige rekombinant EGF og basic-FGF i konsentrasjoner på 20 ng/mL hver). Fylle en 1,5 mL tube med 300 µL NSC medier og reserver for senere.
  2. Velg en mus med en stor svulst.
    Merk: Størrelsen på en svulst kan overvåkes av bioluminescens hvis plasmider eller virus injisert koder luciferin. Vanligvis, har en stor svulst en bioluminesens av > 106 fotoner/s/cm2/sr.
  3. Euthanize musen med en overdose av isoflurane: sette mot en papir med isoflurane og introdusere vevet i en euthanization kammer, unngå direkte kontakt med mus å hindre irritasjon. Vent til mus ikke viser en pedal refleks (vanligvis 5-10 min). Halshugge musen og dissekere hjernen som beskrevet i Calinescu et al. 13.
  4. Hvis svulstene fluorescerende, bruk dissecting mikroskop utstyrt med et lysrør for å identifisere svulst massen i hjernen. Med fine tang, dissekere svulsten (vanligvis 5-7 mm i diameter) fra normal hjernevev.
  5. Plass dissekert svulst i 1,5 mL tube med NSC media (trinn 1.1). Homogenize svulst med en engangs plast støter som passer inn i veggene i microcentrifuge røret ved å bruke lett trykk.
  6. Distansere celle klumper, legge til 1 mL av enzym-fri dissosiasjon media og ruge i 5 min på 37 ° C.
  7. Filtrere celle suspensjon gjennom en 70 µm celle sil og vask silen med 20 mL NSC media.
  8. Sentrifuge 300 x g i 5 min Dekanter nedbryting og å suspendere pellet til 6 mL eller 15 mL NSC media, avhengig av pellet.
  9. Plate svulst celle suspensjon i en T-25 eller T-75 kultur kolbe og kultur på 37 ° C i en vev kultur inkubator med en atmosfære av 95% luft og 5% CO2.
  10. Etter 3 dager, overføre sunn suspendert NS og re tallerkenen dem i en T-25 eller T-75 vev kultur kolbe. Om nødvendig Legg mer NSC media til kultur.
    Merk: Det vil vanligvis være en blandet befolkning av celler, noen vil være død, noen vil har overholdt og noen vil danne NS som vil bli flytende i media

2. vedlikehold og Passaging NS

Merk: Hindre overvekst og vedlikeholde celler på relativt høy tetthet. Samløpet bestemmes av kuler størrelse (svart sentre for store kuler mener overvekst). Veksten av NS avhenger oncogenes brukes til å generere svulster.

  1. Når NS kulturen har nådd confluency, samle kulturen i et sterilt sentrifuge rør og pellets NS på 300 x g i 5 min.
  2. Forkaste nedbryting, Legg 1 mL av cellen avdeling løsningen, og Pipetter for å suspendere re pellet.
  3. Inkuber ved 37 ° C i 5 min, flicking røret hver 2 minutter å cellen dissosiasjon.
    Merk: Når NS confluency, de vanligvis sees macroscopically små hvite kuler. For å sikre celle dissosiasjon, må minst alle synlige NS har forsvunnet.
  4. Legge til 5 mL av HBSS 1 x og pipette flere ganger. Pellet cellene på 300 x g for 5 min. forkaste nedbryting. Å avbryte pellet 5 mL NSC medier supplert med rekombinant EGF og grunnleggende FGF.
  5. Legge til 1 mL av celler i 15 mL NSC media og kultur i en T-75 bolle på 37 ° C i en vev kultur inkubator med en atmosfære av 95% luft og 5% CO2.
  6. Legge til vekst faktorer (EGF og grunnleggende FGF) hver tredje dag. Hvis mediet blir lys oransje og cellene ennå ikke confluent, endre media. Gjør sentrifuge NS på 300 x g for 4 min og å suspendere i NSC medier med vekstfaktorer.
    Merk: Avhengig av pellets dannet, cellene må deles inn i flere flasker.

3. frysing NS for langtidslagring

  1. Når NS kulturen blir confluent, distansere cellene som beskrevet i trinnene 2.1-2,4. Når pellet er nytt suspendert i HBSS, ta en aliquot og telle celler.
  2. Sentrifuge cellene på 300 x g for 4 min og fjerne så mye som mulig av nedbryting.
  3. Nytt utsette pellets i iskaldt media (inaktivert FBS, 10% DMSO). Det anbefales å fryse mellom 1 x 106 og 3 x 106 celler per medisinglass per mL.
  4. Del re suspendert cellene i så mange cryovials som nødvendig og sakte avkjølt hetteglass ved første overfører dem til is, deretter til 20 ° C, deretter til-80 ° C, og til slutt neste dag å en flytende nitrogen-beholderen.

4. fiksering av svulst NS

  1. Kultur svulst NS i en T-25 bolle i 2-3 dager før celler er confluent (~ 3 x 106 celler). Samle svulst NS i en 15 mL konisk rør fra en minst ett T-25 confluent kolbe. Pellets 300 x g i 5 min.
  2. Nytt suspendere pellet i 1 mL av 10% formalin og holde ved romtemperatur (RT) for 10 min. legge 5 mL 1 x HBSS og pellets cellene som gjort i trinn 3.2. Gjenta dette trinnet en gang.
  3. Sett 15 mL konisk røret som inneholder pellet på is.

5. parafin innebygging av svulst NS

  1. Avbryte nytt vasket NS pellet 500 µL av 2% varm væske agarose og bland forsiktig av pipettering.
  2. Umiddelbart plassere agarose-innebygd NS på is inntil agarose polymerizes. Fjern agarose skjuler NS. Plass polymerized agarose brikken med NS i kassetten for vev behandling (figur 2).
  3. Fortsett med vev behandling (med en automatisk parafin prosessor) og parafinen innebygging (med en innebygging stasjon).

6. skjæring av parafin-embedded NS

  1. Angi vannbad 42 ° c og sett bladet på mikrotomen forsiktig med to pensler for å sikre at den er jevnet. Bruk dette bladet bare for trimming.
  2. Plass parafin blokken på mikrotomen. Med ikke-dominante hånd, trykk ned på spaken på venstre side som kontrollerer tykkelsen på hver del. Trykk til andre stopp som angir en 30 µm tykkelse.
  3. Starte trimming blokken (dvs., fjerne overflødig parafin) ved å slå den grove kjedehjul med høyre hånd til overflaten av prøven er nådd. På dette punktet, slipp spaken som styrer trim tykkelsen til 10 μm eller 5 μm. Stopp trimming når overflaten av prøven er nådd.
  4. Fyll en isen boksen med is og Legg akkurat nok vann slik at når parafinen blokken er plassert på is, vannet fungerer som en film rundt parafin blokk, beskyttes mot direkte berøre isen. Inkuber parafin blokken på is 20 min.
  5. Slett gamle bladet og setter inn en ny snitting. Tørr blokk bruker gasbind, deretter plassere den på mikrotomen.
  6. Med ikke-dominante hånd, kan du få et par buede tang som skal brukes til å trekke parafin båndet. Holde en fuktig pensel i høyre hånd, som brukes til å overføre parafin båndet til vannbad. Begynne å delen av vrir grov hånd med høyre hånd på en rask tempo. Bruke pinsett i venstre hånd for å holde parafin båndet.
  7. Bruk fuktig maling pensel overføre parafin båndet til vannbad.
  8. Bruk kurven av tang til å bryte delene av overfladisk plassere tang mellom to parafinsnitt, så presser de to delene unna forsiktig.
    Merk: Denne bevegelsen skal være helt på overflaten av delen parafin. Ikke trykk ned delen.
  9. Bruk fuktig maling pensel for å presse de separerte parafinsnitt på positivt ladede vedheft objektglass.
  10. Gi lysbildene til tørr overnatting i kjemisk hette før du lagrer dem i lysbildet bokser. Lagring av lysbilder, avhenger av typen flekken utført.

7. immunhistokjemi (IHC) av parafin-embedded NS

  1. Smelt parafin ved å plassere lysbildene i et metall rack og rugende dem ved 60 ° C i 20 min.
  2. Deparaffinize lysbilder av inkubasjon i utvanning toget på RT: 3 x xylen for 5 min, 100% 2 x etanol 2 min, 95% 2 x etanol 2 min, 70% 1 x etanol for 2 min og 1 x deionisert vann i 2 min. Hereon, holde lysbildene i vann fra springen til antigen henting , som tørker ut vil føre til ikke-spesifikke antistoffer bindende.
  3. Inkuber lysbildene i citrate buffer (10 mM sitronsyre, 0,05% ikke-ioniske vaskemiddel, pH 6) på 125 ° C for 30 s og 90 ° C for 10 s. La dem avkjøles, deretter skylle lysbildene 5 ganger med destillert vann.
  4. Inkuber lysbilder på RT i 0,3% H2O2 for 30 min.
  5. Vask lysbildene 3 ganger i vaske bufferen (0.025% vaskemiddel i TBS) for 5 min med mild agitasjon.
  6. Inkuber skliene i RT med blokkering løsning (10% hest serum, 0,1% BSA i TBS) for 30 min.
  7. Inkuber lysbildene overnatting på 4 ° C i en fuktet kammer med primære antistoff i fortynning løsning (0,1% BSA i TBS). Vask lysbildene 3 ganger i vaske bufferen for 5 min med mild agitasjon.
  8. Inkuber lysbildene på RT 1t med biotinylated sekundære antistoff i fortynning løsning. Vask lysbildene 3 ganger i vaske bufferen for 5 min med mild agitasjon.
  9. Inkuber lysbildene på RT i mørket 30 min med avidin-biotinylated pepperrotperoksidase komplekse. Vask lysbildene 3 ganger i vaske bufferen for 5 min med mild agitasjon.
  10. Inkuber lysbildene med DAB-H2O2 substrat merker her i 2-5 min på RT.
  11. Skyll 3 ganger med vann fra springen. Dukkert (1-2 s) lysbildene i hematoxylin løsning på counterstain, og skyll grundig i vann fra springen til clearing.
  12. Tørke lysbildene som følger: ruge i destillert vann i 2 minutter, dyppe 3 ganger i 80% etanol, ruge i 95% etanol 2 ganger i 2 minutter hver, ruge i 100% etanol 2 ganger i 2 minutter hver, og til slutt i xylen 3 ganger i 3 minutter hver.
  13. Dekkglassvæske lysbilder med en xylen-baserte montering medium og la dem tørke på flate på RT før de er klart til avbilding.       Merk: Hvis utfører 3, 3-diaminobenzidine (DAB) flekker, lysbildene kan lagres på RT. Hvis immunofluorescence flekker er utført, bør imidlertid lysbilder lagres i mørket på 20 ° C til å redusere Foto-bleking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å overvåke tumor utvikling og vurdere om svulsten har nådd størrelse nødvendig å generere NS, analyserte vi luminescence slippes ut av svulster med bioluminescens. Dette gjør at studiet av signaltransduksjon effektivitet i pups og svulst progresjon av luminescence signalet fra luciferase (figur 1A og 1B). Når tumor størrelse når et signal på 1 x 107 fotoner/s/cm2/sr (figur 1B), kan hjernen behandles for NS generasjon. En annen fordel med dette systemet er at koding sekvensen av ulike fluorescerende proteiner kan legges til plasmider brukes for gen levering og tumor generasjon. Vi kan deretter bekrefte uttrykk for de innsatte genetiske endringene, bruker dissecting mikroskop utstyrt med et lysrør (figur 1C). NS genereres fra wt-IDH1 (figur 1D) og mIDH1 (figur 1E) svulster er identifisert av karakteristiske sfærisk morfologi og uttrykk for fluorophores forbundet med bestemt genetisk lesjonen ( i.e., GFP forbundet med shATRX og shp53 og Katushka forbundet med mIDH1; Figur 1 D og 1E). For å fortsette med IHC NS, er celler fast, og innebygd i agarose og parafin (figur 2). Innebygging NS i parafinblokkene har flere fordeler, inkludert bevaring av 3D strukturer av NS og tillater for langtidslagring. Innebygd NS kan være farget for bestemte glioma biomarkers. Bruker denne teknikken, vi analyserte uttrykk for ATRX, Ki67 og OLIG2 (oligodendrocyte differensiering markør) (Figur 3A-3_C). Vi bekreftet lav uttrykk nivåene av ATRX protein i våre NS kulturer (Figur 3A), som er en funksjon av LGG glioma undertype for tiden blir studert4. Ki-67, en godt beskrevet biomarkør celle spredning, var også positiv i mIDH1 NS (Figur 3B) viser aktive spredning, som er en viktig funksjon av kreftceller. Interessant var celler lokalisert i sentrum av større glioma NS klynger negativ for Ki-67 (Figur 3B), som indikerer at de ikke var voksende, i motsetning til Ki-67 positiv cellene lokalisert til periferien. Dette fenomenet kan være på grunn av at eksterne cellene ikke har tilgang til næringsstoffer fra vekst media. Når de når denne størrelsen, bør glioma NS avstand og passaged. Til slutt, wt-IDH1 NS var positivt på Olig2, en transkripsjon faktor deltar i oligodendrocyte differensiering (Figur 3C).

Figure 1
Figur 1 : Glioma neurospheres generert fra GFP - og Katushka-positiv sleeping beauty (SB) hjernesvulst. (A) selvlysende signal neonate museklikk injisert med SB-transposase plasmider i kombinasjon med Plasmidene skjuler genetisk lesjoner å indusere glioma (NRAS/shP53/shATRX/IDH1-R132H). (B) luminescence indikerer tumor utvikling på 132 dager etter injeksjon (PPT). (C) en lys-feltet og fluorescerende bildet av en hjerne høstet fra en mus som nådde end-point scenen. Svulst området er kodedel av den stiplede linjen og positivt for fluorescerende journalister, GFP og Katushka. (D og E) Svulst neurospheres generert fra SB hjernesvulster uttrykke GFP knyttet til shP53 og shATRX; og Katushka knyttet til IDH1-R132H. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representasjon av arbeidsflyten for parafin-embedded glioma NS. NS er Hentet fra en T-25 kolbe inn i et 15 mL konisk rør og fast i 10% formalin. Så, NS vasket med HBSS og innebygd i 2% agarose. Polymerized agarose som inneholder glioma NS er plassert i en kassett til vev behandling og parafininnstøper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant resultatene av immunohistochemistry med HRP-DAB deteksjon av biomarkers. (A-C) IHC på parafin-embedded mIDH1 glioma NS farget for ATRX (A) og Ki67 (B) og wt-IDH1 glioma NS farget OLIG2 (C). Røde piler indikerer positiv celler for den biomarkør flekker. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen detalj vi en allsidig og reproduserbar metode for å utføre immunohistochemistry på parafin-embedded glioma NS, som opprettholde karakteristiske 3D strukturen av kreftceller vokser i hjernen i situ. Denne teknikken har følgende fordeler over bruker celler belagt på glass eller plast overflater: jeg) bevaring av 3D NS; II) å unngå stress av cellen dissosiasjon før analyse av protein uttrykk. III) slukke alle endogene fluorophore uttrykk fra genmodifiserte svulsten NS, aktivere flekker over til fluorescerende spectra; og iv) langtidslagring.

Et viktig skritt i denne teknikken er å sikre at cellene er nytt suspendert i agarose slik at de er homogenously distribueres og ikke klumpet seg sammen. En begrensning av denne teknikken er tidkrevende trinnene celle dyrking og NS behandling før IHC flekker prosedyren. En andre begrensning er det høye antallet celler for å utføre denne metoden. Hvis antall celler er mindre enn 1 x 106 celler, vil det være for få celler per synsfelt NS klynger i hver inndeling. Derfor kan det være vanskelig å nå ideelt antall celler hvis glioma cellekultur er sakte voksende. Vi brukte en confluent T-25 kolbe som inneholder minst 3,0 x 106 celler. Antall celler brukes kan bli endret som ønsket; Det er imidlertid nødvendig for å oppnå NS pellets av passende størrelse for innebygging prosedyren. Etter dette innebygde NS kan manipuleres som en vanlig parafin-embedded blokk, og det kan deretter fortsette til snitting og IHC flekker for å analysere protein uttrykk av immunofluorescence eller IHC bruke DAB flekker.

Etter snitting av blokkene og følge protokollen for IHC bør delene være counterstained med hematoxylin (blå). Hvis vev uttrykker målet protein, skal en brun signalet være synlig (Figur 3). Hvis etter IHC delene for brun (høy bakgrunn), dette kan skyldes 1) ikke-spesifikk an den sekundære antistoff, 2) en ufullstendig leskende endogene peroxidase eller 3) utilstrekkelig blokkering. Disse problemene kan løses ved 1) bruker en negativ kontroll lysbildet (ruges bare med en sekundær antistoffer) for å sjekke uspesifisert binding av sekundær antistoffer, 2) øke peroxidase slukke tid eller 3) øke blokkerer inkubasjonstiden. På den annen side, hvis ikke finner noe signal, er det mulig at epitopes er fortsatt maskert, som kan være relatert til type bufferen for antigen henting. I vår erfaring, har vi hatt tilfredsstillende flekker bruker citrate buffer, men dette kan være vev og antistoff-avhengig, og forskjellige formuleringer for antigen henting buffere kan brukes som 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) buffer21. Dette er noen av de vanligste problemene knyttet til IHC flekker, men hvis andre problemer oppstår, feilsøking skal utføres som med alle andre IHC (dvs., prøver forskjellige fortynninger av av primære og sekundære antistoffer, ulike blokkerer reagenser, forskjellige blokkerer tider, etc).

En alternativ metode å evaluere protein uttrykk med parafin-embedded celler ble tidligere beskrevet av Hasselbach et al. 20. denne metoden inkluderer ikke agarose trinnene, som i denne protokollen aktiverer tilstrekkelig spesiell fordeling av 3D celle klynger. Vi beskriver også en nøyaktig metode NS dyrking, passaging og fryser for langtidslagring. Denne metoden viser også hvordan du samler fastsette og bygge inn NS uten å endre 3D-struktur (figur 2).

Siden NS kan genereres fra glioma vev innhentes fra pasienter og glioma dyremodeller, innebærer denne teknikken et kraftig verktøy som kan brukes til å analysere biomarkør uttrykk i ulike glioma suptypes og validere originale modeller. Her beskriver vi teknikken med NS stammer fra genmodifiserte mus ved hjelp av SB transposase systemet (figur 1). Men kan denne teknikken også brukes til å analysere protein i parafin-embedded menneskelige glioma cellene vokser som 3D kulturer uten modifikasjoner protokollen, enn celle kultur betingelsene. Så, denne metoden også kan brukes til 3D kulturer fra transplantable dyr modeller, human PDX-modeller og andre genmodifiserte modeller. Til slutt, kan denne metoden brukes med andre typer kreft, både musen modeller og menneskelige kreft, i tillegg til gliomas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av nasjonale institutter for helse/National Institute av nevrologiske lidelser og slag (NIH/NINDS) tilskudd R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 å M.G.C.; NIH/NINDS gir R01-NS076991, R01-NS082311 og R01-NS096756 P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Department of Neurosurgery; Leah Happy Hearts M.G.C. og P.R.L.; og RNA biomedisin Grant F046166 å M.G.C. F.M.M. støttes av en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. ble støttet av et Fulbright-argentinsk departementet av idrett og utdanning fellesskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated microtome blade HP35 Thermo Scientific 3150734
Microtome RM 2135 Leica MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-aldrich HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX, Santa Cruz Biotechnology sc-15408 IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67 Abcam Ab15580 IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated Dako E0432 IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT Biocare medical BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048
N-27 Supplement ThermoFisher A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution Biolegend 423201
AGAROSE LE GoldBio A-201-1000
Genesee Sc. Corporation Olympus 15 ml 21-103
Genesee Sc. Corporation TC-75 treated Flask 25-209
Genesee Sc. Corporation TC-25 treated Flask 25-207
DMEM/F12 Gibco 11330-057 NS media
HBSS GibcoTM 14175-103 balanced salt solution
C57BL/6 Taconic B6-f C57BL/6 mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131, (6), 803-820 (2016).
  2. Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14, (4), 439-452 (2014).
  3. Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131, (10), 1627-1638 (2012).
  4. Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164, (3), 550-563 (2016).
  5. Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372, (26), 2481-2498 (2015).
  6. Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32, (4), 520-537 (2017).
  7. Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8, (328), (2016).
  8. Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99, (6), 841-846 (2008).
  9. Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10, (10), 1081-1094 (2016).
  10. Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226, (2), 352-364 (2012).
  11. Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53, (1), 39-47 (2008).
  12. Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36, (3), 1943-1953 (2015).
  13. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  14. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69, (2), 431-439 (2009).
  15. Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2, (10), 1351-1363 (2015).
  16. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
  17. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26, (17), 2916-2924 (2008).
  18. Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133, (2), 263-282 (2017).
  19. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
  20. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
  21. Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183, (1), 116-123 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics