Valutazione di biomarcatori in Glioma mediante immunoistochimica su paraffina 3D Glioma Neurosphere culture

Cancer Research

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Summary

Neurosfere coltivate come 3D culture costituiscono un potente strumento per studiare la biologia di glioma. Qui presentiamo un protocollo per eseguire esame immuno-istochimico pur mantenendo la struttura 3D di glioma neurosfere mediante inclusione in paraffina. Questo metodo consente la caratterizzazione delle proprietà neurosphere glioma ad esempio di staminalità e del differenziamento neurale.

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Núñez, F. J., Mendez, F. M., Garcia-Fabiani, M. B., Pardo, J., Edwards, M., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (143), e58931, doi:10.3791/58931 (2019).

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Abstract

Analisi dell'espressione proteica in glioma sono rilevante per diversi aspetti nello studio della sua patologia. Numerose proteine sono state descritte come biomarcatori con applicazioni nella diagnosi, prognosi, classificazione, stato di progressione del tumore e stato di differenziazione delle cellule. Queste analisi di biomarcatori sono anche utili per caratterizzare tumore neurosfere (NS) generato da glioma pazienti e modelli di glioma. Tumore NS forniscono un modello prezioso in vitro per valutare diverse caratteristiche del tumore da cui sono derivate e più accuratamente possibile specchio glioma biologia. Qui descriviamo un metodo dettagliato per analizzare biomarcatori nel tumore NS usando immunohistochemistry (IHC) su paraffina-incastonato del tumore NS.

Introduction

I gliomi sono i tumori solidi primari del sistema nervoso centrale classificati dalle loro caratteristiche fenotipiche e genotipiche secondo l' organizzazione mondiale della sanità1. Questa classificazione incorpora la presenza o l'assenza di mutazioni di driver, che rappresentano una fonte interessante di biomarcatori2. Biomarcatori sono caratteristiche biologiche che possono essere misurate e valutate per indicare processi normali e patologici, come pure la risposta farmacologica ad un intervento terapeutico3. Biomarcatori possono essere rilevati nel tessuto del tumore e cellule derivate da glioma, permettendo la sua caratterizzazione biologica in diversi aspetti. Alcuni esempi di biomarcatori di glioma mutato Isocitrato deidrogenasi 1 (IDH1), un enzima del mutante caratteristico dei gliomas di qualità inferiore connesso con migliore prognosi4. IDH1 mutato è espressa frequentemente in combinazione con TP53 e sindrome ritardo mentale/di alfa-talassemia X-collegata (ATRX)-mutazioni inattivanti, definendo un glioma specifico sottotipo4,5. Mutazioni inattivanti ATRX anche verificano nel 44% dei gliomas di prima scelta pediatrica2,6 e sono state associate con i tumori aggressivi e l'instabilità genomica6,7. Inoltre, i gliomi pontine intrinseci diffusi pediatrici (DIPG) sono differenziati in sottogruppi secondo la presenza o l'assenza di una mutazione K27M nel gene di istone H3 H3F3A o in HIST1H3B/C gene1,6. Pertanto, l'introduzione di caratterizzazione molecolare permette la suddivisione, studio e trattamento dei gliomi come entità separate, che più vi permetterà lo sviluppo di ulteriori terapie per ogni sottotipo mirate. Inoltre, l'analisi dei biomarker può essere utilizzato per valutare i diversi processi biologici quali apoptosi8, autofagia9, ciclo cellulare progressione10, cellula proliferazione11e differenziazione delle cellule12 .

Modelli animali geneticamente ingegnerizzati che harbor le lesioni genetiche presenti nei cancri umani sono fondamentali per lo studio delle vie che mediano di progressione di malattia di segnalazione. Il nostro laboratorio ha implementato l'utilizzo del sistema transposase Sleeping Beauty (SB) per sviluppare modelli murini geneticamente di glioma che harboring le mutazioni specifiche che ricapitolano glioma umano sottotipi13,14. Caratteristiche salienti del mirroring presentano nei tumori in situ15, questi modelli murini geneticamente sono utilizzati per la generazione di NS tumore-derivato, che consentono gli studi in vitro in un sistema 3D. Inoltre, il trapianto di orthotopical di NS nei topi può generare tumori secondari che conservano le caratteristiche del tumore primario e imitano le proprietà istopatologiche, genomiche e fenotipiche del tumore primario corrispondente15.

Nella coltura privo di siero, cellule di tumore cerebrale con proprietà delle cellule staminali possono essere arricchite e in presenza di fattori di crescita epidermici (EGF) e fattori di crescita del fibroblasto (FGF), può essere coltivate come singole colonie di cellule derivate come culture NS. In questo sistema di coltura selettiva, la maggior parte delle cellule di differenziazione o differenziate rapidamente muoiono, mentre cellule staminali dividere e formare i cluster cellulari. Questo consente la generazione di una cultura di NS che mantiene glioma tumore caratteristiche16,17,18. Glioma NS può essere utilizzato per valutare diversi aspetti della biologia del tumore, tra cui l'analisi di biomarcatori che hanno applicazioni nella diagnosi, prognosi, classificazione, stato di progressione del tumore e stato di differenziazione delle cellule. Qui, abbiamo dettaglio un protocollo per generare glioma NS e incorporare le culture 3D in paraffina per essere utilizzato per la colorazione IHC. Uno dei vantaggi di fissaggio e l'incorporamento di glioma NS è che la morfologia del NS è mantenuta meglio rispetto ai convenzionali cytospin metodo19, in cui glioma NS sono sottoposti a manipolazione stressante per dissociazione delle cellule e diventare appiattito. Inoltre, l'incorporamento estingue qualsiasi espressione endogena fluoroforo da tumore geneticamente NS, consentendo la colorazione attraverso gli spettri di fluorescenza. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di preservare la struttura 3D delle cellule di glioma attraverso una processo di inclusione a paraffina e consentire la caratterizzazione di glioma neurosfere usando immunohistochemistry.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.

1. generazione di cervello tumore neurosfere derivata da un modello di Mouse

  1. Prima della procedura di dissezione, preparare i supporti delle cellule staminali neurali (NSC Media: DMEM/F12 con 1 supplemento di x B27, 1 x N2 supplemento, 1 x normocin e 1 x antibiotico/antimicotico completati con umana ricombinante EGF e basic-FGF alle concentrazioni di 20 ng/mL). Riempire una provetta da 1,5 mL con 300 µ l di media di NSC e prenotare per più tardi.
  2. Selezionare un mouse con un grande tumore.
    Nota: Se il virus iniettato o plasmide codifica luciferina, la dimensione di un tumore può essere monitorata da bioluminescenza. Di solito, un grande tumore ha una bioluminescenza di > 106 fotoni/s/cm2/sr.
  3. Eutanasia il mouse con un sovradosaggio di isoflurano: infondere una carta velina con isoflurano e introdurre il tessuto in una camera di euthanization, evitando il contatto diretto con i topi per evitare irritazioni. Attendere che i topi non mostrano un riflesso pedale (solitamente 5-10 min). Decapitare il mouse e sezionare il cervello come descritto in Calinescu et al. 13.
  4. Se i tumori sono fluorescenti, è possibile utilizzare un microscopio per dissezione equipaggiato con una lampada fluorescente per identificare la massa tumorale all'interno del cervello. Con una pinzetta, sezionare il tumore (di solito 5-7 mm di diametro) dal tessuto cerebrale normale.
  5. Posto il tumore dissecato nel tubo da 1,5 mL con media di NSC (punto 1.1). Omogeneizzare il tumore con un pestello di plastica usa e getta che si inserisce nelle pareti del tubo del microcentrifuge applicando pressione delicata.
  6. Per dissociare i grumi di cellule, aggiungere 1 mL di media senza enzima dissociazione e incubare per 5 min a 37 ° C.
  7. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 70 µm e lavare il filtro con 20 mL di media di NSC.
  8. Centrifugare a 300 x g per 5 min, decantare il supernatante e risospendere il pellet in 6 mL o 15 mL di media di NSC, a seconda della dimensione del pellet.
  9. Piastra di sospensione delle cellule del tumore in un matraccio di cultura T-25 o T-75 e la coltura a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con un'atmosfera di 95% aria e 5% CO2.
  10. Dopo 3 giorni, trasferire il NS sospeso sano e ri-impiattatelo in un matraccio di cultura del tessuto T-25 o T-75. Se necessario, è possibile aggiungere ulteriori NSC media alla cultura.
    Nota: Solitamente ci sarà una popolazione mista di cellule, alcuni saranno morti, alcuni vi hanno aderito, e alcuni si forma NS che sarà galleggiante nella media

2. mantenere e passaggio il NS

Nota: Prevenire la crescita eccessiva e mantenere le cellule relativamente ad alta densità. Confluenza è determinata dalla dimensione di sfere (neri centri delle sfere grandi media crescita eccessiva). Il tasso di crescita del NS dipenderà gli oncogeni utilizzati per generare tumori.

  1. Una volta che la cultura di NS ha raggiunto la confluenza, raccogliere la coltura in una provetta sterile e pellet il NS a 300 x g per 5 min.
  2. Eliminare il supernatante, aggiungere 1 mL della soluzione di distacco delle cellule e pipettare per risospendere il pellet.
  3. Incubare a 37 ° C per 5 min, sfogliando il tubo ogni 2 min per aiutare la dissociazione delle cellule.
    Nota: Quando NS raggiungere confluency, possono essere solitamente visti in modo macroscopico come piccole sfere bianche. Per assicurare la dissociazione delle cellule, almeno tutti i NS visibile deve sono scomparsi.
  4. Aggiungere 5 mL di HBSS 1 x e pipetta parecchie volte. Cellule di pellet a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 5 mL di media di NSC completati con EGF ricombinante e basic-FGF.
  5. Aggiungere 1 mL di cellule a 15 mL di NSC media e cultura in un fiasco di T-75 a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con un'atmosfera di 95% aria e 5% CO2.
  6. Aggiungere fattori di crescita (EGF e basic-FGF) ogni 3 giorni. Se i media si trasforma in luce arancione e le cellule non sono ancora confluenti, cambiare il supporto. Per effettuare questa operazione, centrifugare il NS a 300 x g per 4 min e risospendere in media di NSC completati con fattori di crescita.
    Nota: A seconda della dimensione del pellet formata, cellule potrebbero essere necessario suddividere più palloni.

3. congelamento NS per immagazzinaggio a lungo termine

  1. Quando la cultura di NS diventa confluente, dissociare le cellule come descritto ai punti 2.1-2.4. Una volta che il pellet è stato risospeso in HBSS, rimuovere un'aliquota e contare le celle.
  2. Centrifugare le cellule a 300 x g per 4 minuti e rimuovere per quanto possibile del surnatante.
  3. Risospendere il pellet in media (inattivati FBS, 10% DMSO) di congelamento. Si consiglia di congelare tra 1 x 106 e 3 x 106 cellule per fiala al mL.
  4. Dividere le cellule risospese in cryovials come molti come necessario e lentamente raffreddare le fiale prima trasferendoli al ghiaccio, quindi a-20 ° C, quindi a-80 ° C e, infine, il giorno successivo per un contenitore di stoccaggio di azoto liquido.

4. fissazione di tumore NS

  1. Tumore di cultura NS in un fiasco di T-25 per 2-3 giorni fino a quando le cellule sono confluenti (~ 3 x 106 cellule). Raccogliere tumore NS in una provetta conica da 15 mL da un'almeno una boccetta di confluenti di T-25. A pellet a 300 x g per 5 min.
  2. Risospendere il pellet in 1 mL di formalina al 10% e mantenere a temperatura ambiente (TA) per 10 min. aggiungere 5 mL di 1 x HBSS e appallottolare le celle come fatto nel passo 3.2. Ripetere questo passaggio un'altra volta.
  3. Posizionare il tubo conico da 15 mL contenente il precipitato sul ghiaccio.

5. paraffina incorporamento del tumore NS

  1. Risospendere il pellet di NS lavato in 500 µ l di 2% agarosio liquido caldo e mescolare dolcemente pipettando.
  2. Posizionare immediatamente la NS incorporato dell'agarosi su ghiaccio fino a quando l'agarosio polimerizza. Rimuovere il pezzo di agarosio che harboring il NS. Posizionare il pezzo di agarosio polimerizzata con la NS nel cassetto per lavorazione (Figura 2) del tessuto.
  3. Continuare con l'elaborazione del tessuto (utilizzando un processore automatico paraffina) e l'incorporamento (utilizza una stazione di incorporamento) di paraffina.

6. la divisione dei NS paraffina

  1. Impostare il bagno di acqua a 42 ° C e inserire la lama del microtomo attentamente utilizzando due pennelli per assicurarsi che si è livellato. Utilizzare questa lama solo per la guarnizione.
  2. Posizionare il blocco di paraffina del microtomo. Con la mano non dominante, premere la leva posizionata sul lato sinistro che controlla lo spessore di ogni sezione. Premere per la seconda tappa che indica uno spessore di 30 µm.
  3. Iniziare a tagliare il blocco (cioè., rimozione di paraffina in eccesso) girando la rotella di mano grossolana con la mano destra fino a raggiunta la superficie del campione. A questo punto, rilasciare la leva che controlla lo spessore taglio a 10 μm o 5 μm. Smettere di taglio quando si raggiunge la superficie del campione.
  4. Riempire una scatola di ghiaccio con ghiaccio e aggiungere acqua quanto basta in modo che quando il blocco di paraffina è collocato sul ghiaccio, l'acqua agisce come un film intorno al blocco di paraffina, proteggendolo da toccare direttamente il ghiaccio. Incubare il blocco di paraffina in ghiaccio per 20 min.
  5. Scartare la vecchia lama e inserire uno nuovo per il sezionamento. Blocco a secco utilizzando garza, poi metterlo sul microtomo.
  6. Con la mano non dominante, ottenere un paio di forcipe curvo che verrà utilizzato per tirare il nastro di paraffina. Tenere un pennello umido vicino alla mano destra, che verrà utilizzato per trasferire il nastro di paraffina a bagnomaria. Cominciano a sezione girando la rotella di mano grossolana con la mano destra ad un veloce ritmo. Utilizzare la pinza nella mano sinistra per tenere il nastro di paraffina.
  7. Utilizzare il pennello umido per trasferire il nastro di paraffina a bagnomaria.
  8. Utilizzare la curva delle pinze per suddividere le sezioni superficialmente ponendo il forcipe tra due sezioni di paraffina, quindi spingere delicatamente le due sezioni di distanza.
    Nota: Questo movimento dovrebbe essere interamente sulla superficie della sezione di paraffina. Non premere la sezione.
  9. Utilizzare il pennello umido per spingere le sezioni separate paraffina su vetrini da microscopio adesione positivamente caricati.
  10. Lasciare i vetrini per asciugare durante la notte all'interno di una cappa chimica prima di riporli in scatole di diapositiva. L'archiviazione di diapositive dipende dal tipo di macchia eseguita.

7. esame immuno-istochimico (IHC) di paraffina NS

  1. Fate sciogliere la paraffina posizionando i vetrini in un rack di metallo e incubarle a 60 ° C per 20 min.
  2. Deparaffinizzare le diapositive tramite incubazione in un treno di reidratazione a RT: 3x xilene per 5 min, 100% etanolo di 2x per 2 min, etanolo al 95% x 2 per 2 min, etanolo al 70% 1x per 2 min e 1 x acqua deionizzata per 2 min Hereon, tenere i vetrini in acqua di rubinetto fino al ricupero dell'antigene , come essiccazione causerà il legame non specifico anticorpo.
  3. Incubare i vetrini in tampone citrato (acido citrico 10 mM, detergente non ionico 0.05%, pH 6) a 125 ° C per 30 s e a 90 ° C per 10 s. Lasciatele raffreddare, quindi sciacquare i vetrini 5 volte con acqua distillata.
  4. Incubare i vetrini a temperatura ambiente in 0,3% H2O2 per 30 min.
  5. Lavare i vetrini 3 volte in tampone (0.025% detergente in TBS) per 5 min con agitazione delicata di lavaggio.
  6. Incubare i vetrini a temperatura ambiente con blocco soluzione (siero di cavallo di 10%, 0,1% BSA in TBS) per 30 min.
  7. Incubare i vetrini durante la notte a 4 ° C in una camera umidificata con l'anticorpo primario preparato in diluizione soluzione (0,1% BSA in TBS). Lavare i vetrini 3 volte in tampone per 5 minuti con agitazione delicata di lavaggio.
  8. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 h con anticorpo secondario biotinilato preparato in soluzione di diluizione. Lavare i vetrini 3 volte in tampone per 5 minuti con agitazione delicata di lavaggio.
  9. Incubare i vetrini a temperatura ambiente al buio per 30 min con perossidasi di rafano avidina-biotinylated complessa. Lavare i vetrini 3 volte in tampone per 5 minuti con agitazione delicata di lavaggio.
  10. Incubare i vetrini con DAB-H2O2 substrato marche qui per 2-5 minuti a TA.
  11. Lavare 3 volte con acqua di rubinetto. Immergere (1-2 s) i vetrini nella soluzione di ematossilina di colorante di contrasto e sciacquarli in acqua di rubinetto fino a schiarimento.
  12. Disidratare i vetrini come segue: Incubare in acqua distillata per 2 min, immergere 3 volte in 80% etanolo, Incubare in etanolo al 95% 2 volte per 2 minuti ciascuno, Incubare in etanolo 100% 2 volte per 2 minuti ciascuno e infine in xilene per 3 min ciascuno per 3 volte.
  13. Vetrino coprioggetti i vetrini con un mezzo di montaggio a base di xilene e lasciarli asciugare su una superficie piana a RT fino a quando non sono pronti per l'imaging.       Nota: Se eseguendo 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) colorazione, le diapositive possono essere memorizzate a TA. Tuttavia, se viene eseguita la colorazione di immunofluorescenza, i vetrini devono essere conservati al buio a-20 ° C per ridurre foto-candeggio.

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Representative Results

Per monitorare lo sviluppo del tumore e valutare se il tumore ha raggiunto le dimensioni necessarie per generare NS, abbiamo analizzato la luminescenza emessa dai tumori tramite bioluminescenza. Questo consente lo studio dell'efficienza di trasduzione nei cuccioli e la progressione del tumore dal segnale di luminescenza della luciferasi (Figura 1A e 1B). Quando le dimensioni del tumore raggiungono un segnale di 1 x 107 fotoni/s/cm2/sr (Figura 1B), il cervello possa essere elaborato per la generazione di NS. Un altro vantaggio di questo sistema è che la sequenza di codificazione di proteine fluorescenti differenti possa essere aggiunti per i plasmidi usati per la generazione di consegna e del tumore del gene. Possiamo quindi confermare l'espressione delle alterazioni genetiche inserite, utilizzando un microscopio per dissezione equipaggiato con una lampada fluorescente (Figura 1C). Il NS generato da wt-IDH1 (Figura 1D) e mIDH1 (Figura 1E) tumori è identificato dalla caratteristica morfologia sferica e l'espressione di fluorofori associato con la lesione genetica specifica ( vale a dire., GFP associato con shATRX e shp53, e Katushka associato con mIDH1; Figura 1 D e 1E). Per procedere con l'IHC su NS, cellule sono fisse, quindi incorporate in agarosio e paraffina (Figura 2). Incorporare il NS in blocchi di paraffina ha diversi vantaggi, tra cui il mantenimento delle strutture 3D del NS e consentendo per immagazzinaggio a lungo termine. Il NS incorporato può essere macchiato per biomarcatori specifici glioma. Utilizzando questa tecnica, abbiamo analizzato l'espressione di ATRX, Ki67 e OLIG2 (indicatore di differenziazione del oligodendrocyte) (Figura 3A-3_C). Abbiamo confermato i livelli di espressione bassa di proteina ATRX nelle nostre culture NS (Figura 3A), che è una caratteristica del glioma LGG sottotipo attualmente essere studiato4. Inoltre, Ki-67, un biomarcatore ben descritto di proliferazione delle cellule, è stata positiva nel NS mIDH1 (Figura 3B), dimostrando la proliferazione attiva, che è una caratteristica fondamentale delle cellule del tumore. È interessante notare che, cellule localizzate nel centro dei glomeruli più grandi di glioma NS erano negative per Ki-67 (Figura 3B), che indica che essi erano non proliferano, a differenza di Ki-67 positive cellule localizzate alla periferia. Questo fenomeno può essere dovuto al fatto che le cellule periferiche non hanno accesso alle sostanze nutrienti dal supporto di crescita. Quando raggiungono questa dimensione più grande, il glioma NS dovrebbe essere dissociato e attraversato. Infine, wt-IDH1 NS erano positive per Olig2, un fattore di trascrizione che partecipano nella differenziazione del oligodendrocyte (Figura 3C).

Figure 1
Figura 1 : Glioma neurosfere generato da GFP-Katushka-positive e di sonno del tumore di cervello di bellezza (SB). (A) luminescenti segnale di un topo neonato iniettato con SB-transposase plasmide in combinazione con plasmidi che harboring le lesioni genetiche per indurre il glioma (ANR/shP53/shATRX/IDH1-R132H). (B) luminescenza che indica lo sviluppo del tumore a post-iniezione 132 giorni (DPI). (C) un campo chiaro e fluorescente immagine di un cervello raccolto da un mouse che ha raggiunto la fase di end-point. L'area del tumore è delimitata dalla linea tratteggiata e positivo per il reporter fluorescenti, GFP e Katushka. (D ed E) Neurosfere tumore generato da tumori di cervello SB che esprimono GFP associati a shP53 e shATRX; e Katushka associati a IDH1-R132H. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Rappresentazione del flusso di lavoro per il glioma paraffina NS. NS vengono raccolti da una boccetta di T-25 in una provetta conica da 15 mL e fissati in formalina al 10%. Quindi, NS sono lavate con HBSS e incorporato in agarosio al 2%. Polimerizzato agarosio contenente glioma NS sono collocati in una cassetta per la lavorazione del tessuto e inclusione in paraffina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Risultati rappresentativi di immunohistochemistry con HRP-DAB rilevazione di biomarcatori. (A-C) IHC eseguita il glioma di paraffina mIDH1 NS macchiato per ATRX (A) e Ki67 (B) e wt-IDH1 glioma NS macchiato per OLIG2 (C). Le frecce rosse indicano le cellule positive per la macchiatura del biomarcatore. Barra della scala = 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

In questo articolo, abbiamo dettaglio un metodo versatile e riproducibile per eseguire esame immuno-istochimico su paraffina glioma NS, che mantengono la caratteristica struttura 3D delle cellule del tumore crescendo nel cervello in situ. Questa tecnica possiede i seguenti vantaggi rispetto all'utilizzo di cellule piastrate su vetro o superfici in plastica: io) conservazione della struttura 3D del NS; II) evitando di stress di dissociazione di cella prima dell'analisi dell'espressione della proteina; III) tempra di qualsiasi espressione endogena fluoroforo da tumore geneticamente NS, consentendo la colorazione attraverso gli spettri di fluorescenza; e iv) conservazione a lungo termine.

Un passaggio fondamentale di questa tecnica è quello di garantire che le cellule sono risospese in agarosio per garantire che siano distribuiti omogeneamente e non raggruppate insieme. Una limitazione di questa tecnica è la procedura che richiede tempo legata alla coltura delle cellule e NS elaborazione prima la procedura di colorazione IHC. Una seconda limitazione è l'elevato numero di cellule necessarie per eseguire questo metodo. Se il numero delle cellule è meno di 1 x 106 cellule, ci saranno troppo poche cellule per campo di vista NS cluster in ogni sezione. Di conseguenza, potrebbe essere difficile raggiungere il numero ideale di cellule, se la coltura delle cellule di glioma è a crescita lenta. Abbiamo usato una bottiglia di T-25 confluente contenente almeno 3,0 x 106 celle. Il numero di celle utilizzate possa essere modificato come desiderato; Tuttavia, è necessario ottenere un pellet di NS di dimensioni adeguate per la procedura di incorporamento. Dopo questo, il NS incorporato possa essere manipolato come un normale blocco di paraffina e si può quindi procedere a sezionamento e IHC che macchia per analizzare l'espressione della proteina mediante immunofluorescenza o IHC usando la macchiatura DAB.

Dopo il taglio dei blocchi e seguendo il protocollo per IHC, sezioni dovrebbero essere controcolorati con ematossilina (blu). Se tessuto esprime la proteina bersaglio, un segnale marrone dovrebbe essere visibile (Figura 3). Se dopo IHC le sezioni sono troppo marrone (alta priorità bassa), questo potrebbe essere dovuto 1) aspecifici biding dell'anticorpo secondario, 2) una tempra incompleta della perossidasi endogena o blocco 3) insufficiente. Questi problemi possono essere risolti 1) mediante un vetrino di controllo negativo (incubato con un anticorpo secondario) per verificare il legame non specifico dell'anticorpo secondario, 2) aumentando la perossidasi tempra tempo o 3) il periodo di incubazione di blocco. D'altra parte, se non viene rilevato alcun segnale, è possibile che gli epitopi sono ancora mascherati, che possono essere correlati al tipo di buffer utilizzato per ricupero dell'antigene. Nella nostra esperienza, abbiamo avuto soddisfacente colorazione utilizzando tampone citrato, ma questo può essere tessuto - e anticorpo-dipendente, e diverse formulazioni per i buffer di recupero dell'antigene possono essere utilizzati come 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) buffer21. Questi sono alcuni dei problemi più comuni legati alla macchiatura di IHC, ma in caso di altre difficoltà, di risoluzione dei problemi dovrebbe essere effettuata come con qualsiasi altro IHC (cioè., provando varie diluizioni degli anticorpi primari e secondari, bloccando diverse reagenti, diversi tempi di blocco, ecc).

Un metodo alternativo per valutare l'espressione della proteina usando cellule di paraffina è stata precedentemente descritta da Hasselbach et al. 20. questo metodo non include i passaggi di agarosio, consentendo in questo protocollo speciale adeguata distribuzione dei cluster cella 3D. Inoltre descriviamo un metodo accurato per NS coltura, passaggio e congelamento per immagazzinaggio a lungo termine. Questo metodo viene inoltre illustrato come raccogliere, difficoltà e incorporare NS senza alterare la struttura 3D (Figura 2).

Poiché la NS possono essere generati dal tessuto di glioma ottenuto da pazienti e modelli animali di glioma, questa tecnica costituisce un potente strumento che può essere utilizzato per analizzare l'espressione di biomarcatore in glioma differenti suptypes e validare i modelli originali. Qui descriviamo la tecnica con NS ha provenuto da topi geneticamente modificati utilizzando il sistema di transposase SB (Figura 1). Tuttavia, questa tecnica utilizzabile anche per analizzare la proteina in cellule di glioma umano paraffina che crescono come 3D culture senza modifiche del protocollo, diverse dalle condizioni di coltura delle cellule. Così, questo metodo può essere applicato anche a 3D colture ottenute da modelli animali trapiantabili, modelli umani di PDX e altri modelli geneticamente. Infine, questo metodo può essere utilizzato con altri tipi di cancro, sia modelli murini e cancri umani, oltre a gliomi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) sovvenzioni R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 a m.g.c.; NIH/NINDS concede R01-NS076991, R01-NS082311 e R01-NS096756 al Domaine; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; il reparto di neurochirurgia; Cuori felici di Leah m.g.c. e Domaine; e RNA biomedicina Grant F046166 a m.g.c. f.m.m. è supportato da un F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. era sostenuto da una Fulbright-argentino Ministero dello sport e formazione Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated microtome blade HP35 Thermo Scientific 3150734
Microtome RM 2135 Leica MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-aldrich HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX, Santa Cruz Biotechnology sc-15408 IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67 Abcam Ab15580 IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated Dako E0432 IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT Biocare medical BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048
N-27 Supplement ThermoFisher A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution Biolegend 423201
AGAROSE LE GoldBio A-201-1000
Genesee Sc. Corporation Olympus 15 ml 21-103
Genesee Sc. Corporation TC-75 treated Flask 25-209
Genesee Sc. Corporation TC-25 treated Flask 25-207
DMEM/F12 Gibco 11330-057 NS media
HBSS GibcoTM 14175-103 balanced salt solution
C57BL/6 Taconic B6-f C57BL/6 mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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