三维肿瘤球体的纵向形态和生理监测

Cancer Research

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Summary

光学相干断层扫描 (oct) 是一种三维成像技术, 用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。证明了采用体素计数法精确定量肿瘤球体的体积, 并基于固有光学衰减对比度对球体中无标签的死组织检测进行了验证。

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Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).

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Abstract

肿瘤球体已被开发为癌症研究和抗癌药物发现中的三维细胞培养模型。然而, 目前, 由于光穿透、荧光染料扩散和荧光检测的有限, 利用明亮场或荧光检测的高通量成像模式无法解决肿瘤球体的整体三维结构。深度解析。最近, 我们的实验室展示了光学相干断层扫描 (oct) 的应用, 一种无标签和非破坏性的三维成像模式, 在96孔板中对多细胞肿瘤球体进行纵向表征。oct 能够获得高度约为600μm 的肿瘤球体的三维形态和生理信息。本文展示了一种高通量 oct (ht-oct) 成像系统, 该系统可自动扫描整个多井板, 并获得肿瘤球体的三维 oct 数据。我们描述了 HT-OCT 系统的细节和协议中的构造指南。从三维 oct 数据中, 可以用三维渲染和正交切片来可视化球体的整体结构, 根据肿瘤球体的大小和体积的形态信息来描述肿瘤球体的纵向生长曲线, 并监测肿瘤球体的生长情况。基于光学固有衰减对比度的肿瘤球体中的死细胞区域。我们表明, HT-OCT 可以作为一种高通量的成像方法进行药物筛选, 并对生物磨料样品进行表征。

Introduction

癌症是世界上第二大死因1。开发针对癌症的药物对患者至关重要。然而, 据估计, 90% 以上的新抗癌药物在开发阶段失败, 因为缺乏疗效和意外毒性在临床试验2。部分原因是使用了简单的二维细胞培养模型进行复合筛选, 这些模型为药物发现的以下阶段提供了化合物疗效和毒性预测有限的结果2,3 个,4. 最近, 已经开发出三维 (3d) 肿瘤球体模型, 为抗癌药物发现345 提供临床相关的生理和药理数据。,6,7,8,9,10, 11,12, 13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25。由于这些球体可以模仿肿瘤在体内的组织特异性特性, 如营养和氧梯度、缺氧核心以及耐药19, 使用这些模型有可能缩短药物发现的时间,降低投资成本, 更有效地为患者带来新药。评估三维肿瘤球状发育复合疗效的一个关键方法是监测治疗9,26下的球体生长和复发。要做到这一点, 定量定性的肿瘤形态, 涉及其直径和体积, 高分辨率成像方式, 是必不可少的。

传统的成像方式, 如明亮场、相位对比 792224和荧光显微镜8、9、16 18,22可以提供测量球体直径, 但不能解决球体在三维空间中的整体结构。造成这些限制的因素很多, 包括探测光在球体中的穿透;荧光染料扩散到球体中;由于强吸收和散射, 从激发荧光染料内部或球体相对表面发出荧光信号;这些成像方式的深度分解性。这通常会导致不准确的体积测量。球体坏死核心的发育类似体内肿瘤中的坏死 6101519、25.这种病理特征不可能在二维细胞培养19252728 中复制。球体尺寸大于 500μm, 在球体 6, 10 中可以观察到三层同心结构, 包括增殖细胞的外层、中间的静止细胞层和坏死的核心 ,15,19,25, 由于缺乏氧气和营养。活细胞和死细胞荧光成像是标记坏死核边界的标准方法。然而, 同样, 这些荧光染料和可见光的穿透阻碍了探测坏死核的潜力, 以监测其实际形状的发展。

另一种三维成像方式, 光学相干断层扫描 (oct) 被引入到表征肿瘤球体。oct 是一种生物医学成像技术, 能够从生物组织 29303132、33中高达 1-2 毫米的深度获取无标签、非破坏性的3d 数据,34。oct 采用低相干干涉测量法检测来自样品不同深度的反向散射信号, 并在横向和纵向以微米级空间分辨率提供重建的深度分辨图像。oct 已被广泛应用于眼科35,36,37和血管造影38,39。以往的研究已经使用 oct 观察了基底膜基质 (matrigel) 中体外肿瘤球体的形态, 并评估了它们对光动力疗法40,41的反应。最近, 我们的团队建立了一个高通量 oct 成像平台, 系统地监测和量化三维肿瘤球体在多井板42的生长动力学。基于固有光学衰减对比度, 采用体素计数法和无标签坏死组织检测法, 对三维肿瘤球体进行了精确体积定量。本文详细介绍了 oct 成像平台是如何构建和应用于获取肿瘤球体的高分辨率三维图像的。描述了三维肿瘤球体生长动力学的逐步定量分析, 包括对球体直径和体积的精确测量。并提出了基于固有光学衰减对比度的 oct 对坏死组织区域进行无损检测的方法。

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Protocol

1. 细胞的制备

  1. 从合格的供应商处获取细胞系。
    注: 验证感兴趣的细胞系的细胞在培养基中或在基板 (基底膜基质, 如 matrigel) 的帮助下可以形成球体。查看文献9或执行一轮预实验进行检查。
  2. 按照细胞线供应商提供的特定程序解冻冷冻细胞。一般程序可在其他地方找到43。
  3. 在25厘米2培养瓶培养1-2 个通道的细胞。然后, 这些细胞就可以用于3d 细胞培养了。
  4. 每天监测细胞的健康状况, 并在标准条件下 (37°c、5% co 2、95% 湿度)将其保存在孵化器中。根据需要刷新媒体。
    注: 培养基包括 dmem (4.5 gl 葡萄糖), 1% 抗生素-抗真菌, 10% 的胎牛血清。亚培养细胞在到达培养瓶中的融合之前。遵循供应商提供的细胞培养指南。一个一般的做法可以找到其他地方 44.
  5. 根据以下一般协议9, 在多孔板中执行3d 细胞培养。
    1. 从培养瓶中取出培养基, 用消毒的磷酸盐缓冲盐水 (pbs, 加热至 37°c) 清洗。
    2. 在烧瓶中加入1毫升的乙二胺四乙酸 (edta, 0.5%), 对细胞进行再利用3分钟。然后, 添加培养基来稀释胰蛋白酶。
    3. 将细胞悬浮液转移到15毫升的离心管和离心机中, 在 500 x克和室温下, 时间为5分钟。
    4. 用4毫升预热培养基去除上清液, 重新悬浮细胞。移液器一滴样品放在血细胞计上, 用于细胞计数, 以确定细胞浓度。将细胞稀释到适当的种子浓度 (例如, 3, 000 细胞)。
      注: 针对每条细胞线和每种类型的多井板 (96 井、384井或1536井) 优化球体的初始细胞浓度。
    5. 种子细胞进入一个超低附件 (ula) 圆底多孔板。在每口井中加入200μl 细胞悬浮液, 浓度为 3, 000 细胞, 使每口井约有600个细胞。
    6. 在 rt, 使用板适配器对整个板材进行7分钟的离心, 播种后, 以 350 x g或最低的速度进行。
      注: 离心机有助于将细胞聚集到井的中心, 以促进形成一个单一的、均匀的球体。离心机步骤在开始时只进行一次, 形成肿瘤球体。当肿瘤球体开始生长时, 这种情况不会重演。
    7. 将多井板保持在37°c 和 5% co2的培养器中, 每3天刷新一次培养基。
      注: 不同的3d 培养条件下, 生长时间可能会有所不同。在我们的研究中, 96 孔板中的 u-87 mg 和 hct 116 细胞系都使用了 3, 000个细胞, 因此, hct 116 细胞的球体在4207天内可以长到 ~ 500μm。考虑根据一般的3d 培养协议, 为不同的球体模型添加媒体补充和生长因子。
    8. 每3\u20124 对肿瘤球体进行一次 oct 成像, 对其生长进行纵向研究。
      注: oct 成像的建议时间点为第4天、第7天、第11天、第14天、第18天和第21天。

2. 高通量 oct 成像平台

注: 关于 oct 的原则和应用的全面审查,参见参考工作29303132、33、34 。见图 1和黄等人.42有关本研究中使用的自定义 oct 成像系统的详细信息。

  1. 为肿瘤球状成像的 oct 系统选择合适的宽带光源。
    注: 在这里, 一个中心波长约为 1, 320 纳米和 ~ 110 nm 带宽的超发光二极管 (sld, 1a, b) 被用作宽带光源。
  2. 按照原理图构建 oct 系统的参考臂和样本臂 (详见图 1a,b )。有关构建 oct 系统的光学元件列表, 请参阅材料表。确保参考臂和样品臂的光路长度非常匹配。
  3. 构建光谱仪, 包括准直仪、光栅、f-theta 透镜和线扫描相机 (有关 oct 的设置34, 请参见图 1c ). 或者, 选择一个与光源的中心波长。确保光谱仪正确对齐以覆盖整个激光带宽, 实现高光子采集效率, 并提供缓慢的干扰模式冲洗。
  4. 表征 oct 系统的性能, 包括以下指标, 如样品臂功率、总成像深度、深度相关灵敏度、轴向分辨率、焦点深度和横向分辨率。将弱反射器 (例如, 带有中性密度滤波器的反射镜) 作为样本, 以测量与深度相关的灵敏度、轴向分辨率和焦距。放置美国空军分辨率测试图目标作为样本, 以检查横向分辨率。
    注: 有关 oct 性能指标和协议的定义, 请参阅参考 3445 , 以描述这些指标45。有关我们研究中使用的自定义 oct 系统的测量参数列表, 请参见表 1
  5. 选择一个机动翻译阶段, 提供多井板的水平运动, 以成像不同井的肿瘤球体 (见图 1b)。使用行程范围大于 108 mm x 72 毫米的舞台, 以确保对多井板的所有井进行全面扫描。使用带有软件控制的2d 或3d 电动翻译阶段, 实现每口井的精确定位和 oct 系统的自动化, 实现高通量成像。
  6. 使用印版适配器或设计印版支架 (通过3d 打印) 将多孔板固定在固定位置。
  7. 使用安装在平移阶段的2d 倾斜阶段和旋转阶段 (参见图 1d) 纠正多井板的倾斜和旋转, 然后进行任何 oct 成像, 以最大限度地减少不同井的聚焦平面的变化。在监测 oct 图像中 d2、d11、b6、d6、g6 的相对位置时, 请使用 d2、d11、b6、d6、g6 作为指导井 (图 1 a)。
  8. 调整板材的旋转, 以确保板的边缘与舞台运动方向平行, 使井在 oct 图像中保持相同的水平位置 (图 1e)。调整板的倾斜使其与光学工作台平行, 使井保持在相同的垂直位置, 用于 oct 成像 (图 1f)。
    注: 调整倾斜角度和对焦有助于优化所有油井的 oct 图像质量。然而, 不同井培养基高度的变化可能会导致光路的变化, 从而导致球体图像的散焦。可实现自动对焦, 控制 oct 成像的焦平面, 实现图像质量的优化。调整步骤不能解决肿瘤球体的 oct 图像质量差的问题, 原因如下: 球体先转由于初始播种位置;在生物磨损的细胞外基质中嵌入球体高程时的球体高程;板材质量差, 井底高度变化较大。可以实现具有自动对焦或自对准功能的附加软件控制, 以优化 oct 成像系统的性能。
  9. 使用自定义计算机程序来控制 oct 图像采集和舞台移动, 以便按顺序从每个井收集数据。

3.肿瘤皮草的 oct 扫描与处理

  1. 在肿瘤球体的 oct 成像当天, 从孵化器中取出多孔板。在 oct 成像系统下传输多井板。将其放置在板适配器的顶部。
    注: 肿瘤球体的 oct 成像可以在聚苯乙烯板盖上或关闭时进行。然而, 由于井的蒸发, 盖子上的水凝结可能会影响光的传输和扭曲光的路径, 从而从球体产生不太理想的 oct 图像。
  2. 通过沿翻译阶段的 z 方向移动来调整板的高度。将焦面位置保持在每个球体顶部表面下方约100–200微米, 以最大限度地减少非均匀深度焦距轮廓的影响。
  3. 在定制软件中设置适当的 oct 扫描范围 (例如, 1 毫米 x 1 毫米), 以便根据肿瘤的发展阶段覆盖整个肿瘤球体。单击 "保存参数"保存设置。
  4. 使用自定义软件获取肿瘤球体的 3d oct 图像, 对于包含球体的板块的所有井一个接一个地获取。单击"预览"按钮以查看预览图像, 然后单击 "获取" 按钮以获取 oct 图像。
    注: 确保在阶段不运动时收集 oct 球体数据。球体通常位于 u-底部井的中心。然而, 当舞台由于培养基中球体的惯性而加速或减速时, 培养基中的球体可能会发生移动。
  5. 处理肿瘤球体的 3d oct 数据集, 使用自定义 c++ 处理代码生成 oct 结构图像。有关 oct 数据后处理的流程图, 请参见图 2 a
    注: 有关生成的 3d oct 结构图像, 请参见图 4 a。
    1. 见 drexler 和 fujimoto34和 jian 等人的第5章.46用于 oct 数据后处理步骤的详细说明。校准所有三个维度中的像素大小。在校正后的比例上重新缩放 oct 结构图像。
      注: oct 图像轴向 (z 方向) 的距离是指臂和样品臂之间光路差的度量。因此, 在轴向校准像素大小以重新缩放时, 需要考虑样品 (n) 的折射率。在我们的研究中, 我们使用 n = 1.37 作为肿瘤球体42的折射率.
  6. 在球体质心的三个横截面 xy、xz 和 yz 平面上, 使用二维 oct 图像生成球体图像的拼贴。有关球面图像拼贴的代表性输出, 请参见图 3c–e。使用 matlab 函数 dftregistration 47 对所有球体进行图像配准, 以确保所有球体的质心大致位于同一位置。
  7. 使用商业或自定义软件获取球体的3d 渲染。
    注: 以下步骤演示如何使用商业软件获得肿瘤球体的3d 渲染。
    1. 将 3d oct 数据加载到软件中。
    2. 单击 "超越"面板。然后, 单击 "添加新卷"。选择要用于3d 渲染的"混合" 模式。
    3. 通过使用鼠标指针拖动图像来调整视角。

4.三维肿瘤球体的形态定量

注: matlab 中的自定义编写的代码处理此量化。单击 "运行"按钮启动该进程。有关球体形态量化步骤的流程图, 请参见图 2b

  1. 量化球体直径、高度和基于直径的体积。
    1. 在跨越球体质心的三个横截面 xy、xz 和 yz 平面中选择二维 oct 图像。
    2. 分别测量 xy 和 xz 平面上球体的直径和高度。
    3. 计算基于直径的球体体积使用: Equation 1 , 具有肿瘤的球形形状的假设。
  2. 量化基于体素的球体体积。
    1. 在球体的 oct 结构数据上应用三维平均滤波器来去除斑点。
    2. 分段肿瘤球体采用 canny 边缘检测48滤镜, 逐帧, 具有适当的阈值将肿瘤球体区域与井底分离。
    3. 对3d 数据的连接体素组 (请参阅内置函数: bwconncomp)。
    4. 计算组中每个连接体素与每个组的球体质心 (手动选择) 之间的平均距离。将球体区域标识为具有最小平均距离的组。
    5. 计算球体区域内的体素数量, 然后乘以单个体素 (volume/体素) 的实际体积, 得出球体的总体积。

5. 三维肿瘤球体的死细胞区域检测

注: 在均匀介质中, oct 背散射强度检测为深度 (i(z)) 的函数, 可以用啤酒-兰伯特定律49Equation 2描述:, 其中z代表深度, μ是光学衰减系数,而 i0 是样品的入射强度。因此, 导出的光学衰减系数可以表示为: Equation 3 。由于 oct 图像通常绘制在对数刻度上, 因此可以检索 oct 强度剖面的斜率, 以获得光学衰减系数。有关光学衰减图生成的流程图, 请参见图 2c

  1. 执行分段以删除球体之外不需要的区域。执行3d 平均滤波器, 以抑制 oct 图像中固有的散斑噪声。
  2. 通过线性拟合在一定深度范围 (移动窗口) 上的对数尺度 oct 强度剖面获得像素化的光学衰减系数, 提取其斜率, 并将斜率乘以-半。
    注: 分段球体区域内每个体素的衰减系数是根据10点院舍深度窗口中 oct 强度分布的斜率计算的 (深度约为 40μm), 体素位于窗口的中间。
  3. 将上述方法 (步骤5.1 和 5.2) 应用于框架中的每个轴向扫描以及包含分段球体区域的3d 数据集中的每个帧, 直到计算分段球体区域的所有体素的光学衰减系数。
  4. 执行二进制阈值以突出显示高衰减区域。
    注: 见黄等人.42用于用直方图分析确定高衰减区的阈值。
  5. 在原始图像上突出显示二值化光学衰减贴图, 以标记死细胞区域 (混合)。生成混合衰减图的3d 渲染图像, 以可视化死细胞区域的3d 分布。

6. 组织学和免疫组化

注: 获得肿瘤球体的组织学和免疫组织化学 (ihc) 染色图像, 与相应的 oct 结果相关。

  1. 在选定的时间点, 从多孔板中选择1-2 个肿瘤球体进行组织学和 ihc 染色。使用带有1毫升移液器吸头的移液器将球体从井中转移到 1.5 ml 离心管。
    注: 在转移前切割1毫升移液器尖端, 以确保尖端的开口大于肿瘤球体的大小, 以避免损坏球体的结构。
  2. 收集每个肿瘤球体在一个 1.5 ml 微离心管充满10% 的甲醛, 并固定48小时。
  3. 使用标准石蜡嵌入技术, 对每个球体执行组织学和 ihc 过程。
    注: 抑制5微米厚的肿瘤球体切片, 用于血红素和 eosin (h & e) 和末端脱氧核苷酸转移酶 dutp 标记 (tunel) 凋亡检测。血红素的反染色应用于坦尼尔。采用数字幻灯片扫描仪对染色样品进行扫描, 获得高分辨率组织学和 ihc 图像。

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Representative Results

96孔板中球体的高通量光学相干层析成像

图 3显示了在第3天用 hct 116 肿瘤球体对96孔板进行 HT-OCT 扫描的结果。整个板块的顺序扫描从右下角井 (h12) 开始。图 3b显示了 HT-OCT 系统软件实现的流程图。在收集和处理了一个球体数据后, 板块会移动到下一个井, 等待 ~ 2秒才能让球体休息, 并收集下一个球体数据。oct 的每个数据由 400 x 400 x 1024 体素组成, 与 1.0 x 0.84 x 2.3 mm 3 的实际体积相对应图 3c显示了从处理数据中生成的 hct 116 球体的面对面 oct 图像的贴。其结果可与其他2d 高通量成像系统22的图像相比较。考虑到 oct 的三维成像能力, 我们还可以生成来自96口井 (图 3d) 的二维横截面球体图像拼贴, 以监测球体高度并在垂直方向上可视化球体不均匀性。从任何预定义的角度 (图 3e) 来看, 三维渲染球体图像的拼贴也是可行的, 可以对整体三维形状进行可视化, 并评估球体的圆度。请注意, 当线扫描摄像机以 92 khz 和 47 khz 的速度运行时, 整个96孔板的整体 oct 成像和处理时间将分别为 ~ 21分钟和 ~ 25分钟。有关示例, 请参阅视频 1

肿瘤球体的纵向形态和生理监测

在从钢板中获得多个时间点肿瘤球体的 oct 结构图像后, 我们可以通过量化肿瘤球体的形态和生理信息来进一步分析这些数据。图 4显示了不同的方法来描述肿瘤球体, 并从它们中获得纵向形态和生理信息。

图 4b显示了不同的肿瘤球体可视化方法。借助商业软件或自由软件, 我们可以将3d 数据加载到软件中, 并创建肿瘤球体 (3d 渲染) 的 "体积", 它显示了三维空间中肿瘤球体的整体结构。通过适当的阈值, 我们可以生成肿瘤球体的表面图 (图 4b), 该图可用于对球体进行分割和测量体积。我们还可以从不同的横截面平面 (图 4b、xz、yz 和 xy) 生成正交滑块 (正交滑块), 并从这些正滑块测量肿瘤球体的直径和高度。

从多个时间点采集同一球体的 oct 数据, 可以量化球体的形态信息, 生成球体的生长曲线, 以显示其纵向变化。图 4c显示了 hct 116 肿瘤球体被监测21天的代表性数据。从分割数据和正交幻灯片中, 我们测量了表中列出的所有时间点的球体直径、高度和基于体素的体积。我们还计算了基于直径的体积进行比较。分别绘制了尺寸和体积的生长曲线。从生长曲线中, 我们可以看到, 这个 hct 116 肿瘤球体在第11天之前呈线性生长模式。在这个时间点之前, 球体保持着相对均匀的形状。然而, 在第11天之后, 球体在第21天被破坏、扁平和完全塌陷。体素体积的增长曲线清楚地表明了这一趋势, 第11天之后体积逐渐下降。

根据 oct 数据, 通过分析二维横截面图像的像素像素光学衰减, 可以获得肿瘤球体内死细胞分布的生理信息。按照图 2和协议5中所述的方法, 我们可以定量地确定死细胞区域, 并监测这些区域作为时间函数的生长。图 4d显示了对肿瘤球体中死亡细胞面积增加的纵向跟踪的代表性结果。以红色突出显示的区域, 具有较高的光学衰减, 显示标记的坏死区域。从14天开发过程中的三维渲染光学衰减图, 我们可以看到红色扇区的扩大, 表明坏死区域的增加。随着坏死区比例的增加, 肿瘤球体无法保持其完美的形状。因此, 他们会倾向于破坏和崩溃, 这是在纵向监测的肿瘤形态在图 4c中看到的。

通过将 hct 116 肿瘤球体的 oct 光学衰减图与组织学和 ihc 获得的相应图像进行比较, 验证了所提出的非破坏性死组织区域检测技术。图 4d显示了与第14天 hct 116 球体的此类比较。通过分析 h & e 和 tuel 切片区域内的特征, 指出 oct 衰减图与相应的 h & e 和 tinel 切片匹配良好, 并通过等深线的特征, 得出了从 oct 高衰减的轮廓中获得的条带线地区。在 h & e 切片中, 死组织区域由位于虚线区域内的密度较低的聚集结构表示。在 tuel 切片中, 高衰减区与 tunel 标记的凋亡细胞区之间存在良好的匹配。

Figure 1
图 1: 构建用于肿瘤球体成像的高通量光学相干断层扫描 (HT-OCT) 系统.(a) HT-OCT 系统的原理图。在 oct 系统旁边绘制了96孔板的示意图。用黄色标记的五口井 (d2、d11、b6、d6、g6) 用于精细调整 (d) 中的阶段。(b) ht-oct 系统的实际配置。请参阅用于系统每个部分的光学元件的材料表。(c) HT-OCT 系统的光谱仪设计。(d) HT-OCT 系统的舞台设置。为了实现高通量成像, 需要正确对6轴级进行对齐, 并在 oct 采集和阶段移动之间进行同步。(e) 和 (f) 显示旋转和倾斜对不同井最终图像的影响。旋转会导致不同井的 oct 图像水平移动, 而倾斜会导致不同井的垂直移动。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 肿瘤球体 oct 图像的数据处理.(a) oct 数据一般后处理步骤流程图。(b) 肿瘤球体形态定量流程图。(c) 肿瘤球体死细胞区域检测流程图。刻度柱: 所有子图的100μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 对96孔板的 u-87 mg 肿瘤球体进行高通量 oct 扫描.(a) 在目标下与96孔板的实际设置。(b) HT-OCT 系统软件实现流程图。从处理的数据生成了96个表面 (c)、横截面 (d) 和三维渲染最大强度投影 (mip) (e) 第3天 oct 图像 hct 116 球体。刻度条: 所有子图200微米。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 利用三维 oct 数据对肿瘤皮草进行纵向形态和生理定量.(a) 在一般 oct 后处理后获得肿瘤球体的三维 oct 结构图像。从 oct 数据, 我们可以生成一个三维曲面图和 xz, yz 和 xy 正交切片, 以可视化肿瘤球体在任何方向 (b) 的结构。我们可以对单个肿瘤球体 (c) 进行纵向监测, 描述其直径、高度和体素体积 (见《材料表》), 并绘制21天内的生长曲线的大小和体积发展。在这个例子中, 随着球体的发展, 它在第11天就被破坏了, 在第21天完全崩溃了。我们可以根据光学固有衰减对比度 (d) 进一步监测肿瘤球体的生理状态。从第7天到第14天, 肿瘤球体的三维渲染图像显示了死亡细胞区域的外观和生长。红色高衰减标记的死细胞区与组织学和免疫组化 (ihc) 结果相匹配。图 4d中的 oct 衰减图、h & e 和 tinel 结果从参考42中修改。刻度柱: 所有子图的100微米。请点击这里查看此图的较大版本.

Video 1
视频 1: 肿瘤球体的高通量 oct 成像.视频中提出了一种 3d oct 成像、基本 oct 处理和舞台移动的工作流程, 速度为5倍。并对球体的 ct 结构图像进行了预测。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.

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Discussion

肿瘤活动与其形态结构高度相关。与监测二维细胞培养的特征生长曲线类似, 跟踪三维肿瘤球体的生长曲线也是描述不同细胞系长期球状生长行为的常规方法。值得注意的是, 我们可以通过分析直接反映在生长曲线上的肿瘤降解或肿瘤再生来描述药物反应。因此, 定量评价三维肿瘤球体, 包括大小和体积, 得出生长曲线, 对于肿瘤球体的表征和复合效果的评价具有重要意义。目前, 基于明亮场、相位对比或荧光成像的成像平台已经建立, 用于常规成像和分析三维肿瘤球体 8,9,18形态或功能. 22岁然而, 由于深度渗透有限以及低分辨率的深度溶解性, 它们无法解决整个大肿瘤结构。在具有代表性的结果中, 我们展示了 oct 对肿瘤球体随着时间的推移而发育的整个三维结构的可视化。3d oct 成像可以提供任何方向和任何截面上的球体视图, 具有较高的可解析性, 而这在缺乏沿深度的分辨率的传统成像模式中是不可用的。此外, 基于 3d oct 数据的体素体积量化可在不假定球体体积原始形状的情况下对其进行准确的定量。因此, 我们已经证明, oct 是一种强大的成像方式, 用于肿瘤球体的三维形态表征, 它确保准确测量不同细胞系的特征生长模式, 并有可能作为药物反应评估的替代方案。

使用荧光染色的可行性试验仍然是肿瘤球体功能分析的常用方法, 特别是用于药物筛选18。然而, 荧光染料的破坏性表明, 这些测试只适用于终点研究。在我们具有代表性的结果 (图 4d) 中, 我们演示了一种替代方法, 该方法可以表征整个球体中细胞的活力。我们的研究结果表明, oct 可以根据固有的光学衰减对比度来区分球体中的死细胞区域和活区。此外, 凭借3d 成像能力和 oct 系统的非破坏性, 对死细胞分布进行定量评估, 并对球体内死细胞区域的进展进行现场监测, 是可行的。可能提供更有价值的球体生长模式的信息。然而, 我们应该注意到, 在我们的代表性结果, 我们无法区分不同类型的细胞死亡模式, 如凋亡和坏死, 在二元 oct 衰减图。

由于药物化合物库可以是广泛的 (和 gt;10,000), 一个高通量和强大的系统来表征肿瘤球体在多井板在药物筛选是必不可少的。目前的高通量成像系统可以在二维扫描模式22下实现整个96孔板的筛选 & lt;5 分钟。oct 可在机动阶段的帮助下进行高通量筛选。您还可以获得一个商用 oct 系统 (有关商业 oct 系统列表的材料表), 该系统的性能与我们的定制 oct 系统相似, 并将机动阶段集成到系统中。但是, 必须努力修改商业 oct 系统, 以整合机动阶段。此外, 还需要自定义软件实现, 以实现 oct 采集触发器和阶段移动触发器之间的同步。对于我们的原型 ht-oct 系统, 根据相机速度的选择, 需要2-18秒的时间从单个肿瘤球体中获取一个 3d oct 数据。因此, 使用 ht-oct 系统96孔板的总采集时间可以短至约3.2 分钟。然而, 当前 ht-oct 系统的中间步骤, 包括数据处理、硬盘上的读写数据以及舞台移动, 仍然非常耗时。在最小数据采集时间约3.2分钟的基础上, 还需要额外的 ~ 18分钟。总成像时间可在几个方面进一步缩短: 使用配备高速可调谐激光源5051的最先进的 oct 系统;通过安排并行工作的关键步骤 (数据采集、数据处理、写入、舞台移动) 优化了工作流程;采用平行 oct 成像与空分复用设置52。通过系统优化, 高通量 oct 系统可用于癌症药物发现以及用于各种生物医学应用的其他3d 生物制造样品 (3d 组织有机) 的表征。

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Disclosures

作者没有透露相互竞争的利益。

Acknowledgments

这项工作得到了 nsf 的支持, 该基金提供了 idbr (dbi-1455613)、pfi/air-tt (iip-1640707)、nih 授予 r21ey0266380、r15eb019704 和 r01eb025209 和 le高兴大学启动基金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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