Langsgående morfologiske og fysiologiske overvåking av tredimensjonale svulst Spheroids bruker Optical Coherence tomografi

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Optical coherence tomografi (OCT), tredimensjonale imaging teknologi, ble brukt til å overvåke og karakterisere vekst kinetics av flercellet svulst spheroids. Presis volumetriske kvantifisering av svulst spheroids bruker en voxel teller tilnærming og etikett-fri dødt vev påvisning i spheroids basert på indre optisk demping derimot ble vist.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Svulst spheroids har blitt utviklet som tredimensjonale (3D) celle kultur modell i kreft forskning og anti-kreft narkotika funnet. Men foreløpig høy gjennomstrømming imaging modaliteter utnytte lyse felt eller fluorescens oppdagelsen, er ikke klarer å løse generelle 3D strukturen i svulst-formet på grunn av begrenset lys penetrasjon, spredning av fluorescerende fargestoffer og dybde-resolvability. Nylig demonstrerte vår lab bruken av optical coherence tomografi (OCT), en etikett-fri og ikke-destruktiv 3D bildeprodukter modalitet, for å utføre langsgående karakteristikk av flercellet svulst spheroids i en 96-brønns plate. Oktober var i stand til å skaffe 3D morfologiske og fysiologiske informasjon av svulst spheroids vokser opp til 600 µm i høyden. I denne artikkelen viser vi en høy gjennomstrømming OCT (HT-oktober) tenkelig system som skanner hele multi godt platen og henter 3D OCT data av svulst spheroids automatisk. Vi beskriver detaljer om HT-oktober system og bygging retningslinjene i protokollen. Fra 3D OCT data, en kan visualisere den overordnede strukturen av spheroid med 3D gjengitt og ortogonale skiver, karakteriserer langsgående vekstkurven av svulst-formet basert på morfologiske informasjonen størrelse og volum, og overvåker veksten av regionene døde celler i svulst-formet basert på optiske iboende demping kontrast. Vi viser at HT-oktober kan brukes som en høy gjennomstrømming tenkelig modalitet for narkotika screening som karakteriserer biofabricated prøver.

Introduction

Kreft er den andre ledende dødsårsaken i verden1. Utvikle medisiner målretting kreft er av avgjørende betydning for pasienter. Imidlertid er det anslått at mer enn 90% av nye anti-kreft narkotika mislykkes i utviklingsfasen av effekt og uventet toksisitet i kliniske forsøk2. Noe av grunnen kan tilskrives bruken av enkel todimensjonal (2D) celle kultur modeller for sammensatte screening, som gir resultater begrenset normalverdier sammensatte effekt og toksisitet for følgende stadier av drug discovery2 , 3 , 4. nylig tredimensjonale (3D) svulst-formet modeller er utviklet for å gi klinisk relevante fysiologiske og farmakologiske data for anti-kreft narkotika discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Siden disse spheroids kan etterligne vev-spesifikke egenskaper av svulster i vivo, som næringsstoffer og oksygen kan gradient, hypoxic kjernen samt narkotika motstand19, bruk av disse modellene potensielt forkorte drug discovery tidslinjer, redusere kostnadene for investering og bringe nye medisiner til pasienter mer effektivt. En kritisk tilnærming til evaluering sammensatte effekt i 3D svulst spheroid utvikling er å overvåke spheroid vekst og Regelmessighet under behandlinger9,26. Dette er kvantitativ characterizations av svulst morfologi, med sin diameter og volum, med høy-resolution tenkelig modaliteter, viktig.

Konvensjonelle tenkelig modaliteter, for eksempel lys-feltet og fase kontrast7,9,22,24fluorescens mikroskopi8,9,16, 18,22 kan gi en måling av den spheroid diameter, men kan ikke løse den overordnede strukturen av formet i 3D-rom. Mange faktorer som bidrar til disse begrensningene, inkludert penetrasjon av undersøkelser lyset i spheroid; spredningen av fluorescerende fargestoffer i spheroid; emitting fluorescerende signaler fra glade fluorescerende fargestoffer i eller på det motsatte overflaten av spheroid sterk absorpsjon og spredning; og dybde-resolvability disse imaging modaliteter. Dette fører ofte til en unøyaktig volummåling. Utvikling av nekrotisk kjernen i spheroids etterligner nekrose i vivo svulster6,10,15,19,25. Denne patologisk funksjonen er usannsynlig gjengitt i 2D celle, kulturer,19,,25,,27,,28. Med en spheroid størrelse større enn 500 µm i diameter, en tre-lags konsentriske struktur, kan inkludert et ytre lag av voksende celler, et middels lag quiescent celler og en nekrotisk kjerne, observeres i spheroid6,10 ,15,19,25, på grunn av mangel på oksygen og næringsstoffer. Slaktede og levende celle fluorescens imaging er standard tilnærming til etiketten grensen nekrotisk kjernen. Men igjen, hindrer inntrenging av både disse fluorescerende fargestoffer og synlig lys potensial til å undersøke inn nekrotisk kjernen til å overvåke utviklingen i sin faktiske form.

En alternativ 3D bildeprodukter modalitet, er optical coherence tomografi (OCT) introdusert for å karakterisere svulst spheroids. OCT er en biomedisinsk bildebehandling teknikk som kan anskaffe etikett-fri, ikke-destruktiv 3D-data fra opptil 1-2 mm dyp biologisk vev29,30,31,32,33 ,34. OCT benytter lav-sammenheng interferometry å oppdage tilbake-spredt signaler fra forskjellige dyp prøven og gir rekonstruert dybde-løst bilder micron nivå romlig oppløsning i både laterale og vertikale retninger. OCT er allment vedtatt i Oftalmologi35,36,37 og angiography38,39. Tidligere studier har brukt OCT å observere morfologi av in vitro svulst spheroids i kjelleren membran matrix (f.eksMatrigel) og evaluere sine svar til Fotodynamisk terapi40,41. Nylig etablert vår gruppe en høy gjennomstrømming OCT tenkelig plattform for å systematisk overvåke og kvantifisere vekst kinetics av 3D svulst spheroids i flere bra plater42. Presis volumetriske kvantifisering av 3D svulst spheroids bruker en voxel telling tilnærming og etikett-fri nekrotisk vev gjenkjenning i spheroids basert på indre optisk demping kontrast ble vist. Dette dokumentet beskriver detaljer om hvordan OCT tenkelig plattformen ble konstruert og å få høyoppløselig 3D bilder av svulst spheroids. De trinnvise kvantitative analysene av vekst kinetics av 3D svulst spheroids, inkludert nøyaktige målinger av spheroid diameter og volumer er beskrevet. Også er metoden for ikke-destruktiv påvisning av nekrotisk vev regioner med oktober, basert på den iboende optisk demping kontrasten presentert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av celler

  1. Få linjer fra kvalifisert leverandør.
    Merk: Bekreft at celler fra cellelinjer rundt kan danne spheroid kultur media eller ved hjelp av et substrat (kjelleren membran matrise som Matrigel). Se på litteratur9 eller utføre en runde med en pre eksperiment for en sjekk.
  2. Tine frossen cellene etter bestemte fremgangsmåten i celle-leverandør. En generell prosedyre kan finnes andre steder43.
  3. Kultur celler for 1-2 passasjer i 25 cm2 kultur flasker. Cellene er da klar til bruk for 3D cellekultur.
  4. Overvåke helsetilstanden til cellene hver dag og opprettholde dem i en inkubator under standard betingelser (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet). Oppdater media behov.
    Merk: Kultur medium består av DMEM (4,5 finans glukose), 1% antibiotika-antimycotic, 10% fosterets bovin serum. Subkultur celler før de når samløpet i kultur kolbe. Følg celle kultur retningslinjen leveres av leverandøren. En generell prosedyre finner elsehwhere44.
  5. Utføre 3D cellekultur i flere bra plater basert på følgende generelle protokollen9.
    1. Fjerne kultur media fra kultur kolbe og vask det med sterilisert fosfat bufret saltvann (PBS, oppvarmet til 37 ° C).
    2. Resuspend cellene ved å legge til 1 mL av trypsin ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA, 0,5%) i flasken i 3 minutter. Legg deretter til kultur medier å fortynne trypsin.
    3. Overføre celle suspensjon i en 15 mL sentrifuge rør og sentrifuge for 5 min på 500 x g og romtemperatur.
    4. Fjern nedbryting og resuspend celler med 4 mL forvarmes kultur medium. Pipetter en dråpe eksempel på en hemocytometer for celle opptelling for å finne celle konsentrasjon. Fortynne cellene til riktig konsentrasjonen for såing (f.eks3000 celler/mL).
      Merk: Optimalisere den første celle konsentrasjonen av formet for hver celle-linje og hver type multi godt plate (96-brønnen, 384-godt eller 1536-vel).
    5. Frø celler i en svært lav vedlegg (ULA) rund bunn flere godt plate. Legge til 200 µL av celler suspensjon i hver brønn på konsentrasjonen av 3000 celler/mL slik at hver godt har 600 celler.
    6. På RT, sentrifuge hele platen med en plate adapter for 7 min, rett etter seeding, en hastighet på 350 x g eller laveste hastighet tilgjengelig.
      Merk: Sentrifuge hjelper samle celler til midten av brønnen til rette danner en enkelt, enhetlig formet. Sentrifuger trinnet utføres én gang i begynnelsen til tumor spheroids. Det vil ikke bli gjentatt når spheroids svulsten begynner å vokse.
    7. Opprettholde flere godt platen på 37 ° C og 5% CO2 i en kultur inkubator og oppdatere kultur media hver tredje dag.
      Merk: Vekst kan variere for ulike 3D kultur forhold. I vår studie brukes 3000 celler/mL for både U-87 MG og HCT 116 cellelinjer i 96-brønnen platene, slik at spheroid kan vokse til ~ 500 μm i 4\u20127 dager for HCT 116 celler. Vurder å legge til medier kosttilskudd og vekstfaktorer for forskjellige formet modeller, basert på generelt 3D kultur-protokollen.
    8. Utføre OCT avbilding av svulst spheroids hver 3\u20124 dager for en langtidsstudie deres vekst.
      Merk: Anbefalt tidspunkt for OCT bildebehandling ville være dag 4, dag 7, dag 11, dag 14, dag 18 og dag 21.

2. høy gjennomstrømming oktober Imaging plattform

Merk: Se referert arbeid29,30,31,32,33,34 for en grundig vurdering av prinsipper og applikasjoner på OCT. Se figur 1 og Huang et al. 42 for detaljer om egendefinerte Tilpasningsverktøy tenkelig system brukt i denne studien.

  1. Velg en passende bredbånd lyskilde for OCT systemet for svulst spheroid bildebehandling.
    Merk: Her, en superluminescent diode (SLD, figur 1A,B) med en sentral bølgelengde på ~ 1,320 nm og ~ 110 nm båndbredde ble brukt som en bredbånd lyskilde.
  2. Konstruere referanse armen og prøve arm av OCT systemet etter schematics (se figur 1A,B for detaljer). Se Tabellen for materiale for over optisk komponenter å konstruere OCT systemet. Kontroller at hvor optisk bane referanse armen og prøve arm er tett samsvar.
  3. Konstruere spektrometer, inkludert en collimator, en rist, en F-theta linse og et linje-scan kamera (se figur 1 c for installasjonsprogrammet34) for detaljer om spectrometer utformingen av oktober alternativt velge en kommersiell spectrometer som samsvarer med det Center bølgelengde på lyskilden. Kontroller at spectrometer er justert riktig for å dekke hele laser båndbredden, å oppnå høy Foton samling effektivitet og gi langsom vask ut av Forstyrrelsen mønsteret.
  4. Karakterisere ytelsen til OCT systemet, inkludert de følgende beregningene som utvalget arm makt, totalt imaging dybde, dybde-avhengige følsomhet, aksial oppløsning, dybde av fokus og lateral oppløsning. Plass en svak reflektor (f.eks, et speil med en Nøytralfilter) som et eksempel å måle dybde-avhengige følsomhet, aksial oppløsning og dybde av fokus. Plass en USAF oppløsning test diagram mål som prøven å kontrollere sideveis oppløsningen.
    Merk: Se referanser34,45 definisjoner av beregninger OCT ytelse og protokoller å karakterisere disse beregningene45. Se tabell 1 for en liste over målte parametere for egendefinerte OCT systemet brukes i vår undersøkelse.
  5. Velg en motorisert oversettelse scene å gi horisontal bevegelse av flere godt platen til bildet svulst spheroids i forskjellige brønner (se figur 1B). Bruke en scene med mange reise større enn 108 x 72 mm for å sikre en full skanning av alle brønnene av flere godt plate. Bruke en 2D eller 3D motorisert oversettelse scene med programvarekontroll slik nøyaktige plasseringen av hver brønn og automatisering av OCT systemet for høy gjennomstrømming bildebehandling.
  6. Bruke en plate-adapter eller design en plate holder (av 3D-utskrift) for å holde flere godt platen i en fast stilling.
  7. Korriger vipping og rotering av flere godt platen bruker et 2D vippe scenen og en rotasjon scene montert på translasjonsforskning scenen (se figur 1 D), før du gjennomfører noen OCT imaging for å minimere variant av fokus flyet fra forskjellige brønner. Bruke D2, D11, B6, D6, G6 som veiledende brønnene når du overvåker deres relative posisjoner i OCT bilder (figur 1A).
  8. Justere rotasjon av platen å sikre kantene på platen er parallelle med scenen bevegelse slik at brønnene forblir på samme horisontale posisjoner i OCT bilder (figur 1E). Justere vippe av platen være parallell til tabellen optisk slik at brønnene forbli på samme loddrette plasseringer for OCT imaging (figur 1F).
    Merk: Justering av tilting vinkel og fokus å optimalisere OCT bildekvalitet for alle brønnene. Varianter av høyden på kultur medier i forskjellige brønner kan imidlertid forårsake endringer i optiske baner som kan føre til defocusing av spheroid bildet. Autofokus kan iverksettes for å kontrollere fokalplanet OCT Imaging for å oppnå optimal bildekvalitet. Justering-trinnet ikke løser dårlig OCT bildekvalitet av svulst-formet på grunn av følgende: spheroid decentering innledende seeding beliggenhet; spheroid høyde når innebygd i biofabricated ekstracellulære matriser; dårlig plate kvaliteten med store variasjoner av høyden på godt bunner. Ekstra programvarekontroll med autofokus eller selv justering funksjoner kan implementeres for å optimere ytelsen i Tilpasningsverktøy for Office tenkelig system.
  9. Bruke et egendefinert program for å kontrollere OCT bilde oppkjøpet og scenen bevegelse for å samle inn data fra hver godt sekvensielt.

3. oktober skanning og behandling av svulst Spheroids

  1. Ved OCT avbilding av svulst spheroids, ta flere godt platen fra inkubator. Overføre flere godt platen under Tilpasningsverktøy tenkelig system. Plass den oppå plate kortet.
    Merk: OCT avbilding av svulst spheroids kan utføres med polystyren plate lokket på eller av. Vann kondensasjoner på lokket på grunn av fordamping fra brønnene kan imidlertid påvirke lystransmisjon og forvrenge lys banen, gir mindre optimal OCT bilder fra spheroids.
  2. Juste høyden på platen ved å flytte z-retning oversettelse scenen. Opprettholde fokalplanet posisjon ~ 100-200 μm under overflaten av hver spheroid, minimere effekten av ikke-uniform depth-wise fokal profil.
  3. Angi en riktig OCT skanning (f.eks, 1 x 1 mm) i tilpasset programvare for å dekke hele svulst-formet etter sin utviklingstrinn. Klikk Lagre parametere for å lagre innstillingen.
  4. Bruke egendefinerte programvaren hente 3D OCT bilder av svulst spheroids enkeltvis for alle brønnene av platen som inneholder spheroids. Klikk Forhåndsvisning for å vise forhåndsvisningsbildet og klikk på Hent for å erverve OCT bildet.
    Merk: Kontroller at OCT spheroid dataene samles når scenen ikke er i bevegelse. Spheroid er vanligvis plassert i sentrum av U-bunnen godt. Men kan spheroid bli forskjøvet i kultur media når scenen er akselererende eller seg grunnet treghet av formet i kultur media.
  5. Behandle 3D OCT datasett av svulst spheroids å generere OCT strukturelle bilder med et tilpasset C++ behandling. Se figur 2A for et flytskjema for etterbehandling OCT data.
    Merk: Se figur 4A for genererte 3D OCT strukturelle bilder.
    1. Se kapittel 5 i Drexler og Fujimoto34 og Jian et al. 46 detaljerte beskrivelser av etterbehandling trinnene OCT data. Kalibrere pikselstørrelsen i alle tre dimensjoner. Å skalere OCT strukturelle bildene på korrigert skalaer.
      Merk: Avstanden i aksial retning (z-retningen) OCT bilder er et mål på den optiske bane forskjellen mellom referanse armen og prøve arm. Dermed må brytningsindeks av prøven (n) tas i betraktning når kalibrering pikselstørrelsen i aksial retning for rescaling. I vår studie, bruker vi n = 1.37 som brytningsindeks av svulst spheroid42.
  6. Generere collage spheroid bilder bruker 2D OCT-bilder i tre cross-sectional XY-, XZ- og YZ fly over centroid av formet. Se Figur 3 c-E for representant ut av collager spheroid bilder. Utføre bilde registrering for alle spheroids, bruker MATLAB funksjon dftregistration47, slik at centroids av alle spheroid ligger omtrent på samme sted.
  7. Få 3D-gjengivelse av formet med en kommersiell eller egendefinert.
    Merk: Følgende viser hvordan å få 3D-gjengivelse av svulst spheroids ved hjelp av en kommersiell programvare.
    1. Laste 3D OCT dataene inn i programvaren.
    2. Klikk overgå panelet. Klikk Legg til nytt volum. Velg blanding modus til bruk for 3D-gjengivelse.
    3. Justere visningsvinkelen ved å dra bildet med musepekeren.

4. morfologiske kvantifisering av 3D svulst Spheroids

Merk: En egendefinert skrevet kode i MATLAB behandler denne kvantifisering. Klikk Kjør for å starte prosessen. Se figur 2B for flytskjemaet trinnene av morfologiske kvantifisering av spheroids.

  1. Kvantifisere spheroid diameter, høyde og diameter-basert kvantum.
    1. Velg 2D OCT bilder i tre cross-sectional XY-, XZ- og YZ fly som krysser centroid av formet.
    2. Måle diameteren og høyden på spheroid i Punktdiagrammer og XZ fly, henholdsvis.
    3. Beregne diameter-baserte spheroid volum med: Equation 1 , med en antagelse av sfærisk form av svulst.
  2. Kvantifisere voxel-baserte spheroid volum.
    1. Bruke et 3D-gjennomsnitt filter på OCT strukturelle data spheroid fjerne flekker.
    2. Segmentere svulst spheroids bruker skarpsindig kanten oppdagelsen48 filteret, bilde for bilde, med en skikkelig terskel skille regionen svulst spheroid godt nederst.
    3. Gruppere connective voxels for 3D-data (innebygd funksjon: bwconncomp).
    4. Beregne mellom hver connective voxel i gruppen og formet centroid (manuelt valgt), for hver gruppe. Identifisere regionen formet som gruppen med mener minsteavstand.
    5. Antall voxels i regionen formet og deretter multiplisere med det faktiske volumet for en individuelle voxel (volum/voxel), gir det totale volumet av formet.

5. døde celler regionen påvisning av 3D svulst Spheroids

Merk: I en homogen medium,-OCT tilbake-spredt intensitet oppdaget som en funksjon av dybde (jeg(z)), kan beskrives ved Beer-Lambert lov49: Equation 2 , der z angir dybden, μ er optisk demping koeffisient, og jeg0 er hendelsen intensiteten til prøven. Derav den avledede optiske demping koeffisienten kan uttrykkes som: Equation 3 . Siden OCT bilder tegnes ofte en logaritmisk skala, kan skråningen av OCT intensitet profilen hentes for å utlede optisk demping koeffisient. Se figur 2C for et flytskjema for generering av optisk demping kartene.

  1. Utføre segmentering for å fjerne uønskede områder utenfor formet. Utføre 3D filteret for å undertrykke speckle støyen som er iboende i OCT bilder.
  2. Få pixel-wise optisk demping koeffisientene av lineær passende log skala OCT intensitet profilen over en viss dybde rekkevidde (flytte vindu), ekstra skråningen, og multiplisere skråningen av -1/2.
    Merk: Demping koeffisient på hver voxel i regionen segmentert spheroid beregnes basert på av OCT intensitet profil i 10-voxel dybde vindu (~ 40 μm i dybden), med voxel ligger midt i vinduet.
  3. Bruke metodene ovenfor (trinn 5.1 og 5.2) på hver aksial skanning i en ramme og hver ramme i 3D dataset som inneholder regionen segmentert formet til optiske demping koeffisientene for alle voxels i regionen segmentert spheroid beregnes.
  4. Utføre den binære terskelverdi for å markere regionen høy-demping.
    Merk: Se Huang et al. 42 for fastsettelse av terskelen for høy-demping ved hjelp histogramanalysen.
  5. Merk binarized optisk demping kartet på det opprinnelige bildet å merke døde celler regionen (blanding). Generere gjengitt i 3D-bilde av blandet demping visualisere 3D fordelingen av regionen døde celler.

6. histologi og Immunohistochemistry

Merk: Histology og immunohistochemistry (IHC) farget bilder av svulst spheroids er hentet for å korrelere med tilsvarende OCT resultater.

  1. På valgt tidspunkt, velger du 1-2 svulst spheroids fra flere godt platen i histologi og IHC flekker. Bruke en pipette med 1 mL pipette tips for å overføre spheroid fra brønnen slik 1,5 mL sentrifuge.
    Merk: Klipp 1 mL pipette spissen før slik at åpningen av spissen er større enn størrelsen på tumor-formet å unngå å skade strukturen i formet.
  2. Samle hver svulst-formet i en enkelt 1,5 mL microcentrifuge rør fylt med 10% formaldehyd og fastsette for 48 timer.
  3. Utføre histologi og IHC prosesser for hver spheroid, bruker standard parafin innebygging teknikker.
    Merk: Stain 5 μm tykk deler av svulst spheroids for hematoxylin og eosin (H & E) og terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick slutten merking (tunnel) apoptose gjenkjenning. En counterstaining av hematoxylin brukes tunnel. En digital slide skanner ble brukt til å skanne farget prøven og få høyoppløselige histologiske og IHC bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Høy gjennomstrømning Optical Coherence tomografi avbildning av Spheroids i en 96-brønns Plate

Figur 3 viser resultatet av HT-oktober skanning av en 96-brønns plate med HCT 116 svulst spheroids på dag 3. Den sekvensielle skanningen av hele platen starter fra nederste høyre brønnen (H12). Figur 3B viser flytdiagram for programvare gjennomføringen av HT-oktober. Etter en spheroid data ble samlet inn og behandlet, platen vil flytte til neste Vel, venter ~ 2 s tillate spheroid å hvile og samle neste spheroid data. Hver OCT data består av 400 x 400 x 1024 voxels, noe som tilsvarte i et faktiske mengden 1.0 x 0.84 x 2.3 mm3. Figur 3 c viser en collage av no-ansikt OCT bilder av HCT 116 spheroids generert fra behandlet. Resultatet er sammenlignbare med bilder fra andre 2D høy gjennomstrømming tenkelig system22. Gitt 3D bildebehandling evne i Tilpasningsverktøy for Office, kan vi også generere collage av 2D cross-sectional spheroid bilder fra 96 brønner (figur 3D) å overvåke spheroid høyder og visualisere spheroid inhomogeneity i vertikal retning. Collage av gjengitt i 3D-formet bilder er også mulig fra en forhåndsdefinert vinkel (figur 3E) å visualisere generell 3D form og evaluere rundheten på formet. Merk at den totale OCT bildebehandling og prosessen gang for hele 96-brønns platen ville være ~ 21 min og ~ 25 minutter når linje-scan kameraet kjører med en hastighet på 92 kHz og 47 kHz, henholdsvis. Se Video 1 for eksempel.

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvåking av svulst-formet

Etter at vi fikk OCT strukturelle bilder av svulst spheroids fra platen i flere tidspunkt, kan vi analysere disse dataene ved å kvantifisere morfologiske og fysiologiske informasjon av svulst spheroids. Figur 4 viser de ulike tilnærmingene til karakterisere svulst spheroids og få langsgående morfologiske og fysiologiske informasjon fra dem.

Figur 4B viser forskjellige måter å visualisere svulst-formet. Ved hjelp av enten kommersielle eller gratis programvare, vi kunne belaste 3D-data i programmet og opprette en "volum" av svulst-formet (3D-gjengivelse), som viser den overordnede strukturen av svulst spheroid i 3D-rom. Med riktig terskelverdi, kan vi generere en overflate tomt svulst-formet (figur 4B), som kan brukes til å segmentere formet og måle volumet. Vi kan også generere ortogonale lysbildene (Orto lysbilder) fra forskjellige tverrsnitt fly i forskjellige retninger (figur 4B, XZ, YZ og XY) og måle diameter og høyden av svulst-formet fra disse Orto lysbilder.

Samle OCT data i den samme spheroid fra flere tidspunkt, kunne vi tallfeste morfologiske informasjonen og generere vekstkurve av spheroid vise sin langsgående. Figur 4C viser representant data av en HCT 116 svulst spheroid overvåkes for 21 dager. Fra segmenterte dataene og Orto lysbilder målt vi diameter, høyde og voxel-basert kvantum av spheroid for alle tidspunktet, som ble oppført i tabellen. Vi har også beregnet diameter-baserte volumet for en sammenligning. Vekst kurvene i størrelse og volum var plottet, henholdsvis. Fra vekst kurvene, kunne vi se at dette HCT 116 svulst spheroid fulgt et lineært vekstmønster i volum før 11. Før dette tidspunkt, spheroid holdt økende og opprettholdt en relativt uniform figur. Men etter dag 11, ble spheroid forstyrret, flat og fullt kollapset på dag 21. Vekstkurven voxel-baserte volumer viser tydelig trend, med en gradvis redusert volumer etter dag 11.

Basert på OCT, kan vi også få fysiologiske informasjon om distribusjon av døde celler i svulst spheroids ved å analysere piksel for piksel optisk demping fra 2D cross-sectional bilder. Etter metoder illustrert i figur 2 og protokollen 5, vi kunne kvantitativt bestemme regionene døde celler og overvåke veksten i disse regionene som en funksjon av tid. Figur 4 d viser et representativt resultat av langsgående sporing av økningen av døde celler områder i svulst-formet. Områder som er markert med rødt, som hadde høy optisk demping, viser merket nekrotisk områdene. Fra 3D gjengitt optisk demping kart under 14 dagers utvikling, kunne vi se den røde delen utvider, som angir økningen av regionene nekrose. Som prosent nekrotisk områdene økte, kunne tumor-formet ikke holde formen perfekt. Derfor ville de pleier å avbryte og kollaps, som ble sett i langsgående overvåking av svulst morfologi i figur 4C.

Den foreslåtte destruktive dødt vev regionen oppdagelsen teknikken ble bekreftet ved å sammenligne OCT optisk demping kart over HCT 116 svulst spheroid med tilsvarende bilder ved histologi og IHC. Figur 4 d gir en slik en dag 14 HCT 116-formet. Matche OCT demping kart og tilsvarende H & E og tunnel skiver funnet, som ble vist ved å analysere funksjonene i regionene i H & E og tunnel skiver preget av dash linjer fra konturene av OCT høy demping regioner. I H & E skiver, ble regionene dødt vev angitt med mindre tett og samlede strukturen ligger i regionen stiplet linje. I tunnel skiver, ble en god kamp observert mellom høy demping regionen og tunnel-merket apoptotisk mobilnettet regionen.

Figure 1
Figur 1: byggingen av en høy gjennomstrømming optical coherence tomografi (HT-oktober) system for svulst spheroid bildebehandling. (A) skjematisk av HT-oktober. Et diagram over 96-brønns platen tegnes ved OCT systemet. Fem brønner (D2, D11, B6, D6, G6) merket med gult brukes for finjustering av stadiene i (D). (B) den faktiske konfigurasjonen av HT-oktober. Se Tabellen for materiale for optisk komponentene som brukes for hver del av systemet. (C) Spectrometer design for HT-oktober systemet. (D) scenen oppsett for HT-oktober systemet. Riktig justering av 6-akse scenen og synkronisering mellom OCT oppkjøpet og scenen bevegelse kreves for høy gjennomstrømming bildebehandling. (E) og (F) viser effekten av rotasjon og vippe på siste bildet av forskjellige brønner. Rotasjon forårsaker OCT bilder av forskjellige brønner å skifte vannrett mens vippe vil føre til loddrett forskyvning av forskjellige brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: databehandling for OCT bilder av svulst spheroids. (A) flytskjema for etterbehandling hovedsteg OCT data. (B) flytskjema for morfologiske kvantifisering av svulst-formet. (C) flytskjema av død celle regionen deteksjon av svulst-formet. Skala bar: 100 µm for alle subfigures. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: høy gjennomstrømming OCT skanning av en 96 godt plate inneholder U-87 MG svulst spheroids. (A) det faktiske oppsettet med 96-vel plate mål. (B) flytdiagram for programvare gjennomføringen av HT-oktober. Fotomontasjer 96 no møte (C), cross-sectional (D) og 3D gjengitt maksimale intensitet projeksjon (MIP) (E) OCT bilder av dag 3 HCT 116 spheroids ble generert fra behandlet. Skala Bar: 200 µm for alle subfigures. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: langsgående morfologiske og fysiologiske kvantifisering av svulst Spheroids med 3D OCT data. (A) innhentes 3D OCT strukturelle bilder av en svulst-formet etter de generelle OCT etterbehandling. Fra OCT data, kan vi generere en 3D overflaten plot og XZ, YZ og XY ortogonale skiver for å visualisere strukturen i svulst-formet i alle retninger (B). Vi kan utføre langsgående overvåking av en enkelt svulst-formet (C), karakteriserer diameter, høyde og voxel-basert kvantum (vist i Tabellen for materiale) og plotte vekst kurvene i størrelse og volum under 21-dagers utvikling. I eksemplet som formet utviklet, ble den avbrutt på dag 11 og fullt kollapset på dag 21. Vi kan ytterligere overvåke fysiologiske status for en svulst spheroid langs basert på optiske iboende demping kontrasten (D). 3D gjengitt bilder av en svulst spheroid viste utseendet og vekst av døde celler regioner fra dag 7 dag 14. Høy-demping-merket døde celler områdene i rødt ble matchet med histologiske og immunohistochemical (IHC) resultater. OCT demping kart, H & E og tunnel resultatet i Figur 4 d endres fra Ref. 42. Skalere barer: 100 µm for alle subfigures. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: høy gjennomstrømming OCT avbilding av svulst spheroids. En arbeidsflyt 3D OCT-bildebehandling, grunnleggende OCT behandling og scenen bevegelse ble presentert i videoen med en 5 x hastighet. Forhåndsvisninger av behandlet OCT strukturelle bilder av spheroids ble også presentert. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Svulst aktivitet er svært relevant for morfologiske strukturen. Lik overvåking karakteristiske vekstkurve for 2D cellekulturer, sporing vekstkurven for 3D svulst spheroids er også en konvensjonell tilnærming som karakteriserer langsiktige spheroid vekst virkemåten for forskjellige linjer. Spesielt, kan vi beskrive narkotika-respons ved å analysere svulst degradering eller svulst gjenvekst direkte gjenspeilet i vekstkurve. Derfor er kvantitativ vurdering av 3D svulst spheroids, inkludert størrelse og volum, å utlede vekstkurven, av stor betydning for karakterisering av svulst spheroids og evaluering av sammensatte effekt. Foreløpig imaging plattformer basert på lyse, kontrast eller fluorescerende bildebehandling har blitt etablert for rutinemessig bildebehandling og analyse av morfologi eller funksjoner i 3D svulst spheroids8,9,18, 22. Men er de ikke klarer å løse hele, stor svulst strukturen på grunn av begrenset dyp gjennomtrenging samt lav dybde-resolvability. Representant treff, har vi vist OCT å visualisere hele 3D strukturen av svulst-formet utvikling over tid. 3D OCT-bildebehandling kan gi visningen av formet i en orientering og noen tverrsnitt med høy-resolvability, som ikke var tilgjengelig i konvensjonelle tenkelig modaliteter som mangler oppløsningen langs dybden. Videre gitt voxel-basert kvantum kvantifisering basert på 3D OCT-data en nøyaktig kvantifisering av spheroid volumer uten antar deres opprinnelige figurene. Derfor har vi vist at OCT er en robust tenkelig modaliteten for 3D morfologi karakteristikk av svulst spheroids, som sikrer nøyaktig måling av karakteristiske vekst mønstrene for forskjellige linjer og potensielt kan tjene som en alternativ for narkotika svar evaluering.

Levedyktighet tester med fluorescerende flekker forblir en populær metode for funksjonell analyser av svulst spheroids, spesielt for narkotikarelaterte screening18. Forstyrrende natur fluorescerende fargestoffer angir imidlertid at disse testene er kun egnet for sluttpunktet studier. I vår representant resultater (Figur 4 d) viste vi en alternativ metode som kan beskrive celle levedyktighet i hele-formet. Resultatene har vist at OCT kunne skille regionen døde celler fra levedyktig regionen i spheroid basert på indre optisk demping kontrast. I tillegg med 3D bildebehandling evne og ikke-destruktive natur av OCT, kvantitativ vurdering av den døde celler distribusjonen og i situ overvåking av utviklingen av døde celler regioner i spheroid er mulig, som potensielt gi mer verdifull informasjon av spheroid vekstmønster. Vi bør imidlertid merke at i vår representant resultater, vi ikke er kjøpedyktig skille ut forskjellige typer celle død moduser, slik som apoptose og nekrose, binære OCT demping kart.

Siden et stoff sammensatt bibliotek kan være omfattende (> 10 000), en høy gjennomstrømming og robust system å karakterisere svulst spheroids i flere bra plater under narkotikarelaterte screening er viktig. Dagens høy gjennomstrømming tenkelig system kan oppnå en screening av hele 96-brønns platen i < 5 min i 2D skanne modus22. OCT kan tilpasses for høy gjennomstrømming screening formål, ved hjelp av en motorisert scene. Også kan få en kommersielt tilgjengelig OCT system (se Tabell for materiale for en liste over handelssystemer på OCT) med en lignende ytelse til egendefinerte OCT systemet, og innlemme en motorisert scene i systemet. Innsats må imidlertid tas endre kommersielle OCT systemet å integrere motorisert scenen. Også kreves egendefinerte programvareimplementeringen innse synkroniseringen mellom OCT oppkjøpet utløser og scene bevegelse utløse. For vår prototyp HT-oktober system tok det 2-18 sekunder å erverve en 3D OCT-data fra en enkelt svulst spheroid, avhengig av valg av Kamerahastighet. Dermed kan den totale anskaffelseskosten tid være så kort som ~3.2 min for en 96-brønns plate med HT-oktober system. Imidlertid forble mellomliggende trinnene for gjeldende HT-oktober systemet, inkludert databehandling leser og skriver data på harddisker og scenen bevegelser, tidkrevende. Ytterligere ~ 18 min ville være nødvendig på ~3.2 min minst mulig oppkjøpet tid. Totalen imaging tid kan reduseres ytterligere i flere aspekter: bruke state-of-the-art OCT-systemer som er utstyrt med en høyhastighets tunable laser kilde50,51; optimalisert arbeidsflyten ved å arrangere avgjørende skritt (datainnsamling, databehandling, skriving, scenen bevegelse) arbeider parallelt; ansette en parallell OCT bildebehandling med en plass-divisjonen multipleksing installasjonsprogrammet52. Med system optimering, høy gjennomstrømming OCT systemet kan benyttes i kreft stoffet funnet samt karakteristikk av andre 3D bio-fabrikkert prøver (f.eks., 3D vev organoids) for ulike biomedisinsk applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne avsløre noen konkurrerende interesse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NSF gir IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (via-1640707), NIH tilskudd R21EY026380, R15EB019704 og R01EB025209 og Lehigh University oppstart fond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Cancer. Available from: http://www.who.int/cancer/en/ (2018).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, (8), 711-716 (2004).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9, (9), 1115-1128 (2014).
  5. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, (4849), 177-184 (1988).
  6. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  7. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4, (3), 309-324 (2009).
  8. Tung, Y. -C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136, (3), 473-478 (2011).
  9. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
  10. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  11. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  12. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11, (7), 435-448 (2013).
  13. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323, (1), 131-143 (2014).
  14. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  15. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12, (4), 207-218 (2014).
  16. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10, (6), e0130348 (2015).
  17. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  18. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  19. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  20. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  21. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241, (9), 939-954 (2016).
  22. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. 2211068216652846 (2016).
  23. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
  24. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13, (11), 3724-3735 (2016).
  25. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  26. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118, (2), 95-106 (2015).
  27. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  28. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5, (9), 675-688 (2005).
  29. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, (5035), 1178-1181 (1991).
  30. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19, (7), 071412 (2014).
  31. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57, (9), OCT1-OCT13 (2016).
  32. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12, (5), 363-368 (2012).
  33. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49, (16), D30-D61 (2010).
  34. Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography: technology and applications. Springer Science, Business Media. (2008).
  35. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95, (2), 171 (2011).
  36. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve - a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37, (1), 90-99 (2009).
  37. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26, (1), 57-77 (2007).
  38. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  39. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1, (1), 5 (2015).
  40. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29, (2), 273-278 (2006).
  41. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52, (8-9), 728-744 (2012).
  42. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77, (21), 6011-6020 (2017).
  43. Spalteholz, W. Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. Verlag von S. Hirzel. (1911).
  44. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4, (4), 331 (2007).
  45. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11, (8), 889-894 (2003).
  46. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. International Society for Optics and Photonics. 85710Z (2013).
  47. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33, (2), 156-158 (2008).
  48. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  49. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5, (1), 322-337 (2014).
  50. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  51. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8, (2), 828-859 (2017).
  52. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics