Avanceret billedbehandling af lunge Homing humane lymfocytter i en eksperimenterende i Vivo Model af allergisk betændelse baseret på lys-ark mikroskopi

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her introducerede protokollen tillader karakterisering af primære humane lymfocytter under in vivo betændelsestilstande homing lunge-kapacitet. Pulmonal infiltration af adoptively overførte human immun celler i en musemodel af allergisk betændelse kan afbildet og kvantificeres ved lys-ark Fluorescens mikroskopi af kemisk ryddet lungevæv.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Overvældende væv akkumulering af stærkt aktiverede immunceller repræsenterer et adelsmærke for forskellige kroniske inflammatoriske sygdomme og fremstod som et attraktivt terapeutiske mål i den kliniske behandling af ramte patienter. For at optimere yderligere strategier sigter mod terapeutisk regulering af patologisk ude af balance væv infiltration af pro-inflammatoriske immunceller, vil det være af særlig betydning at opnå bedre indsigt i sygdoms - og orgel-specifikke homing egenskaber af perifere lymfocytter. Den her beskrevne eksperimentel protokol giver mulighed for at overvåge lunge ophobning af fluorescently mærket og adoptively overførte humane lymfocytter i forbindelse med papain-induceret lunge betændelse. I modsætning til standard in vitro-assays ofte anvendes til analyse af immun celle migration og chemotaxis, nu indført in vivo indstillingen tages hensyn lunge-specifikke aspekter af væv organisation og indflydelse af de komplekse inflammatoriske scenario finder sted i den levende murine organisme. Desuden tre-dimensionelle tværsnits lys-ark fluorescens mikroskopisk billeddannelse giver ikke kun kvantitative data på infiltrerer immunceller, men også skildrer mønster af immun celle lokalisering inden for den betændte lunge. Samlet set er vi kan indføre en innovativ teknik af høj værdi for immunologiske forskning vedrørende Kronisk inflammatorisk lungesygdomme, som let kan anvendes ved at følge den angivne trinvise protokol.

Introduction

Klassiske inflammatoriske sygdomme i lungerne, såsom allergisk astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), er kendt for at være drevet af et øget ansættelse af aktiverede lymfocytter i pulmonal væv1,2. Lymfocyt-udgivet cytokiner (fx, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ og TNF-α) yderligere fremme chemotaxis af medfødte og adaptive immunceller, fremkalde fibrotisk luftvejene remodeling eller direkte skader lungerne parenkym2. Hidtil har er de underliggende mekanismer er ansvarlige for patologisk ophobning af lymfocytter i lungevæv endnu ikke fuldt forstået. I analogi med væv-selektiv T celle prægning beskrevet for gut og hud homing, pulmonal dendritiske celler (DCs) er naturligvis stand til prime perifert T-celler til præferentiel lunge infiltration, i det mindste delvist via induktion af CCR4 udtryk på de overfladen af lymfocytter3. Udover CCR4, er luftvejs-infiltrerer T celler også kendetegnet ved en særlig øget ekspression af chemokine receptorer CCR5 og CXCR3 i forhold til T-celler i perifert blod1,4,5. Samlede, eksisterende data er i overensstemmelse med begrebet at lunge homing af T-lymfocytter fysiologiske eller inflammatoriske betingelser omfatter en række forskellige chemokine receptorer og deres respektive ligander og dermed afhænger en nøje kontrolleret samarbejde mellem medfødte og adaptive immunceller1. Især i den indledende fase af patogen eller allergen eksponering reagerer celler af den medfødte immunsystem TLR stimulation eller IgE-medieret cross-linking af øjeblikkelig løsladelse af forskellige chemoattractants, ligesom LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 og PGD21,6,7. Som et mønstereksempel, samspillet mellem PGD2 og chemoattractant receptor CRTh2 er kendt for at være af særlig betydning for chemotaxis Th2 celler og dermed syntes så lovende terapeutiske mål i den kliniske behandling af astma. Faktisk, patienter med moderat astma viste en forbedring af symptomer og en væsentlig forøgelse af den tvungen ekspirationsvolumen i ét sekund (FEV1) efter behandling med en selektiv CRTh2 antagonist sammenlignet med placebo-gruppen8 ,9. I en mere skred det inflammatoriske respons er allerede ansat T celler i stand til yderligere forstærke pulmonal lymfocyt ophobning via frigivelse af IL-4 og IL-13 som potent stimuli for pulmonal DCs. Efterfølgende er regulere disse myeloid-afledte medfødte celler op-udtryk for CCL17 og CCL22 i en STAT6-afhængige måde1,10,11.  Selv om kompleksiteten af det beskrevne scenario stadig hindrer en komplet forståelse af T celle lunge homing, tilbyder det et væld af molekylære mål for et potentielt optimeret terapeutisk kontrol af inflammatoriske eller allergisk lungesygdomme. Derfor er der et presserende behov for innovative eksperimentelle teknikker, som er i stand til yderligere at uddybe og supplere vores viden inden for T-celle chemotaxis og lunge målsøgende.

At lunge homing af lymfocytter i den menneskelige krop er påvirket af flere cellulære og humorale fysiske parametre1, er de fleste af de eksisterende eksperimentelle metoder ikke købedygtig model af denne immunologiske proces hele kompleksitet. I stedet, mange standardprotokoller til analyse af lunge homing selektivt fokusere på et specifikt aspekt, der er involveret i kaskade af lymfocyt tiltrækning, vedhæftning, migration og fastholdelse. Ud over en beskrivende bestemmelse af mRNA eller protein udtryk mønster af integriner og chemokine receptorer på perifere eller lunge-infiltrerer lymfocytter og supplerende måling af respektive chemokine niveauet i blodet, bronchoalveolar lavage (BAL) eller lunge væv12,13,14,15, veletablerede in vitro celle kultur assays tillade en funktionel karakterisering af lymfocyt vedhæftning eller chemotaxis ved defineret forsøgsbetingelser16,17,18. I princippet overvåge statiske in vitro-vedhæftning assays bindende kapacitet af kulturperler lymfocytter til en endotel éncellelag eller på glas dias belagt med rekombinant endotelial adhæsionsmolekyler (f.eks. MAdCAM-1, VCAM-1), mens standard in vitro- chemotaxis assays er normalt anvendes til at kvantificere lymfocytter evne til at overføre langs en chemokine forløb i et transwell system19. Både in vitro-indstillinger aktiverer en kontrolleret justering og graduering af forsøgsbetingelser, men på den anden side mangler vigtige variabler kendt til kritisk indvirkning på in vivo chemotaxis og vedhæftning af lymfocytter. Overvejende, statisk celle kultur assays se bort fra indflydelsen fra shear styrker forårsaget af permanent blod flow19 og forsømme potentielt inddragelse af omkringliggende immunologiske milieu og interagerende ikke-lymfocyt immunceller, begge til stede i en levende organisme. For at overvinde disse begrænsninger, fortolkning af resultaterne opnået i statisk in vitro-chemotaxis eller overholdelse af assays skal yderligere validering i dynamisk friktionskoefficient eksperimenter under flow betingelser20,21 og i i vivo modeller af inflammatoriske orgel patologi19. Faktisk vigtigt kunne drages konklusioner om regulering af T celle lunge homing inflammatoriske eller allergiske betingelser fra dyreforsøg analysere genetisk modificerede mus i definerede modeller af forskellige lungesygdomme3, 22 , 23. de kvantitative sammenligning af lunge infiltrerer lymfocytter mellem vildtype mus og mus med en mangel, for et bestemt gen af interesse udgør en veletableret og bredt anvendte redskab til at definere virkningen af særlige cellular veje eller receptorer på sygdom-drevne mønster af T celle distribution. Men i modsætning til før drøftet in vitro celle kultur assays, en undersøgelse design baseret på klassisk dyremodeller mangler evnen til at analysere og overvåge primære human T-celler direkte afledt af blod eller BAL af patienter, der lider af en inflammatorisk lunge sygdom. Således er er det stadig udfordrende at funktionelt validere om en diagnostisk angivne lungesygdom er købedygtig Kolofon humane lymfocytter til præferentiel lunge tropisme og hvor langt kliniske parametre kan have indflydelse på dette scenario. For nylig har blev en meget elegant in vivo tilgang indført i forbindelse med inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), som var i stand til at overvinde de fleste af disse begrænsninger og åbnet nye muligheder for avanceret translationel undersøgelser på intestinal lymfocyt homing24 . Drage fordel af protokoller for opløsningsmiddel-baserede væv clearing efterfulgt af tværsnits lys-ark Fluorescens mikroskopi som et kraftfuldt værktøj til afbildning, det var muligt at visualisere infiltration og distribution af adoptively overførte human T celler i tarmen af colitic immundefekte mus24. Især denne eksperimentelle indstilling gennemført to vigtigste nyskabelser: (1) primære menneskelige immunceller kan analyseres på eksperimentelt definerede in vivo betingelser; (2) en temmelig stor område af det syge organ (ca 1,5 cm x 1,5 cm) kan være afbildet i høj opløsning kvalitet, efterfulgt af 3D-genopbygning. Desuden etableret flere nyere undersøgelser med succes brug af opløsningsmiddel-baserede væv clearing og lys-ark Fluorescens mikroskopi som vigtige værktøjer til avanceret lunge imaging25,26. For at drage fordel af dette teknologiske fremskridt inden for pulmonal immunologi, vedtog vi nu system til analyse af lunge målsøgende.

Her præsenteres protokollen giver en trinvis Introduktion hvordan til at rense og fluorescently etiket primære menneskelige T celler for overførsel ind i musene med induceret lunge betændelse, og Derudover beskriver i detaljer den efterfølgende proces med lys-ark Fluorescens mikroskopisk billeddannelse, herunder orgel forberedelse og billedbehandling. Samlet set håber vi at støtte fremtidige translationel undersøgelser inden for inflammatoriske eller allergisk lungesygdomme ved at indføre en sofistikeret, men ikke desto mindre muligt, eksperimentelle model til overvågning af menneskelige lymfocyt lunge homing på in vivo betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af de relevante lokale myndigheder i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus har været opstaldet på specifikt patogenfrie betingelser. Indsamling af humant blod blev godkendt af de lokale etiske udvalg og institutionelle review board af universitetet i Erlangen-Nürnberg. Hver patient gav skriftlig informeret samtykke.

1. fremkalde allergiske lungebetændelse i mus

Bemærk: Som beskrevet i tidligere undersøgelser27, følgende forsøgsmetoden giver mulighed for overtalelse allergisk luftvejs inflammation i mus og derfor udløser ophobning af medfødte og adaptive immunceller i BAL. Den beskrevne protokol er blevet etableret i C57BL/6J mus, men vedtagelsen til andre standard indavlede stammer skulle være muligt.

Se figur 1A en oversigt over de in vivo eksperimentel procedure.

  1. Bedøver mus ved intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin.
    Bemærk:
    kun bruge C57BL/6J mus ældre end 6 uger og med en kropsvægt på mindst 16 g.
    1. Forberede ketamin/xylazin løsning i PBS (12 mg/mL ketamin, 1,6 mg/mL xylazin) og bestemme den nøjagtige vægt af mus.
    2. Injicere den første mus med 8 µL/g kropsvægt af ketamin/xylazin løsning intraperitoneal og bekræfte dyb anæstesi via mangel af pote knivspids refleks inden vi går videre til trin 1.3.
  2. Frisk forberede 5 mg/mL af papain i PBS. Langsomt afpipetteres 10 µL (50 µg) af papain løsning i næsebor. Nøje overvåge musen indtil opvågnen.
  3. Gentag trin 1.1 og 1.2 for alle mus inkluderes i eksperimentet. Udfør trin 1.1-1.3 på tre på hinanden følgende dage.

2. rense og Fluorescently etiket menneskelige perifere blod CD4+ T celler

Bemærk: Proces celler under sterile forhold.

  1. Indsamle 18 mL af fuldt humant blod fra en perifer vene. Udføre Ficoll-Hypaque gradient centrifugering for at vælge brøkdel af perifert blod mononukleære celler (PBMC).
    Bemærk: Indsamling og analyse af primære humant materiale skal godkendes af de lokale etiske myndigheder. Kun en person med en passende medicinsk kvalifikation er tilladt at indsamle blod fra en perifer vene.
    1. Indsamle blod i ethylendiamintetra syre (EDTA)-indeholdende monovettes (1,6 mg EDTA/mL blod) for at undgå Koagulering.
      Valgfri: Bruge buffy coat blod, et biprodukt af bloddonation beriget i leukocytter, i stedet for komplet venøse blod.
    2. Overføre blod ind i en konisk 50 mL rør og fortyndes 1:2 i fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Forsigtigt tilføje 10 mL af Ficoll-medium (tæthed 1.077 g/mL) som nederste lag under de fortyndede blod. Der centrifugeres prøve (800 x g i 15 min. ved stuetemperatur uden bremse).
    3. Forsigtigt fjerne røret fra centrifugen og overføre PBMC-holdige interfase til en ny konisk 50 mL tube. Kassér den øverste og nederste lag. Fyld PBMC-holdige røret med PBS og centrifuge (300 x g i 10 min. ved 4 ° C). Fjern supernatanten.
      Bemærk: Valgfrit, hvis det er nødvendigt, udføre lysering af resterende erytrocytter. Forsigtigt tilføje 3 mL af ammonium-chlorid-kalium (AVS) lysisbuffer (155 mM ammoniumklorid, 19 mM kalium hydrogen karbonat og 0,68 mM EDTA, pH 7,27) til den resuspenderede celle pellet og vortex prøven. Ryst rør i 3 min. For at fjerne ACP lysisbuffer, der tilsættes 40 mL PBS og centrifuge (300 x g i 10 min. ved 4 ° C). Kassér supernatanten.
  2. Rense CD4+ T-celler via CD4 microbeads.
    Bemærk: Generelt er der flere forhandlere af magnetiske microbeads til rensning af menneskelige CD4+ celler, som skal resultere i sammenlignelige niveauer af celle renhed. Produktvalg bør baseres på individuelle præferencer. De følgende trin i protokollen (2.2.2–2.2.7) er justeret til en defineret CD4 microbead produkt og respektive adskillelse kolonner som yderligere anført i Tabel af materialer. Nogle ændringer af protokollen kan være påkrævet i tilfælde at en alternativ CD4 microbead produkt er markeret.
    1. Resuspenderes PBMC i mindst 80 µL PBS indeholdende 0,5% føtal bovint serum (FBS) og 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-buffer) pr. 107 PBMC. Brug en start befolkning på omkring 30 x 106 PBMC for at ende op med ca 3 x 106 6 x 106 renset menneskelige CD4+ T celler.
    2. Tilføj 20 µL af CD4 microbeads pr. 107 PBMC, blandes forsigtigt og Ruger i 20 min. ved 4 ° C. Fyld glasset med PBS/FBS/EDTA-buffer (køles ned til 4 ° C), og der centrifugeres (300 x g i 10 min. ved 4 ° C). Fjern supernatanten.
    3. Placere en adskillelse kolonne i et magnetfelt. Skylles kolonnen med 3 mL PBS/FBS/EDTA-buffer. Resuspenderes celle i 500 µL af PBS/FBS/EDTA-buffer (køles ned til 4 ° C) og overføre cellesuspension på kolonnen skylles adskillelse placeres i et magnetfelt.
    4. Skylles kolonnen adskillelse tre gange med 3 mL PBS/FBS/EDTA-buffer (køles ned til 4 ° C) og skille sig af med spildevandet.
    5. Fjern kolonnen adskillelse fra magnetfeltet og læg det i en 15 mL tube. Elueres af CD4+ celle brøkdel i 5 mL PBS/FBS/EDTA-buffer ved at bruge stemplet.
    6. Fyld glasset med PBS og centrifuge (300 x g i 10 min. ved 4 ° C). Fjern supernatanten. Gentag trinnet vask to gange.
    7. Bestemme antallet af celler, givet af en standardmetode til valg (fx Neubauer afdeling).
  3. Label CD4+ T celler med en fluorescerende celle spredning farvestof.
    1. Resuspend CD4+ T-celler i PBS (op til 107 celler/mL, bruger ikke mindre end 500 µL af PBS).
    2. Forberede en 6 µM løsning af et rødt lys-overgearet celleproliferation farvestof (Se Tabel af materialer) i PBS (pre-hjertelig til stuetemperatur). Bland denne løsning 1:2 med den før forberedt cellesuspension og vortex grundigt (3 µM endelige koncentration).
    3. Der inkuberes i 10 min. ved 37 ° C (beskyttet mod lys). Bagefter, tilføje fem bind af RPMI medium indeholdende 10% FBS og Inkuber i 5 min på is (beskyttet mod lys).
    4. Vask mærket celler tre gange i RPMI medium indeholdende 10% FBS (centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C). Resuspend mærket celler i PBS, opbevares på is og beskytte mod lys indtil brug.
      Bemærk: Langvarig opbevaring af celler (> 60 min) kan have en negativ indvirkning på celle overlevelse.
      Valgfri: Bestemme renheden af CD4+ celle brøkdel og effektiviteten af proceduren for mærkning ved flowcytometri. Resuspend 0,5 x 106 til 1 x 106 CD4+ celler i 100 µL af buffer (1% FBS, 2 mM EDTA i PBS) og tilføje en anti-menneskelige CD4 antistof kombineret med et fluorescerende farvestof af valg. Inkuber i 30 min. ved 4 ° C. Tilsæt 1 mL buffer og centrifuge (300 x g i 10 min. ved 4 ° C). Kassér supernatanten. Fortsætte med cytometric flowmåling af prøven (repræsentant resultat er afbildet i figur 1B, C).

3. adoptively overføre menneskelige CD4+ T-celler i Papain-eksponerede modtager Mmice

Bemærk: Se figur 1A en oversigt over de in vivo udføres eksperimentel procedure. Udføre celle overførsel en dag efter den sidste intranasal administration af papain.

  1. Justere suspensionen af fluorescently mærket menneskelige CD4+ T celler (trin 2.3.4) til en koncentration på 1 x 107 celler/mL i PBS. Fylde 100 µL af cellesuspension i en 1 mL/30 G-sprøjte.
  2. Omhyggeligt placere den første papain-eksponerede C57BL/6J mus (trin 1.1-1.3) i en Fastspændingsanordningen til hale vene injektion. Bruge den forberedte sprøjte (trin 3.1) at punktere den hale vene og langsomt indsprøjtes 100 µL af cellesuspension indeholdende 1 x 106 mærket menneskelige CD4+ celler. Ikke straks trække ud nålen efter injektion, men vente på yderligere 5 sekunder for at undgå udledning af cellesuspension.
  3. Slip musen fra Fastspændingsanordningen til og fortsætte med det næste dyr. Holde mindst én papain-eksponerede dyr, der ikke undergår transfer med fluorescently mærkede celler til at tjene som negativ kontrol for lys-ark Fluorescens mikroskopi.

4. Forbered lungevæv til lys-ark Fluorescens mikroskopi

Bemærk: Følgende trin udføres 3 h efter overførsel af fluorescently mærket menneskelige celler (trin 3.2). De beskrevne eksperimentelle procedurer herunder høst af lungevæv, var fiksering og opløsningsmiddelbaseret væv clearing tilpasset fra i øjeblikket beskrevet protokoller24,28.

  1. Ofre musen ved kuldioxid (C02) indånding.
  2. Perfuse lunge på stedet med PBS, som indeholder 5 mM EDTA.
    1. Åbne brystkassen via skære langs brystbenet at eksponere hjertet. Punktformet højre hjertekammer med en 21 G kanyle tilsluttet et kateter.
    2. Åbn den venstre ventrikel ved at skære ned og dermed tillade blod og perfusion væsken at forlade. Langsomt perfuse lunge med 20 mL iskold PBS indeholdende 5 mM EDTA via kateteret.
  3. For at udføre in situ fiksering af lungen, ikke fjern kateteret fra højre hjertekammer. Langsomt perfuse lunge med 2 mL iskold 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) løst i PBS. Fjerne kateteret og kanylen.
    Bemærk: PFA-baserede in situ fiksering af lungevæv udgør en veletableret teknik for at forberede efterfølgende mikroskopisk analyse29,30murine lungevæv.
    Forsigtighed: PFA er giftigt og skal håndteres under en hætte med omhu.
  4. Fylde lungerne med 0,75% Agarosen på stedet.
    1. Forberede 0,75% Agarosen i PBS og holde det fast på 50 ° C i en thermo-shaker indtil brug. Fjerne spytkirtler af musen, skåret sternohyoid muskler og udsætte luftrøret ved at skubbe en pincet nedenunder.
    2. Punktformet udsatte luftrøret med 30 G nål og erstatte det med en stump 30 G kateter til at forhindre yderligere skade af luftrøret resulterer i uønskede lækage af agarosegelelektroforese. Forsegle krydset mellem den indsatte kateter og luftrøret ved hjælp af en nål holder.
      Valgfri: Kombiner her beskrevne procedure med BAL samling til at analysere infiltreret menneskelige celler i BAL, som for nylig beskrevet i detaljer31 (Se figur 2E for repræsentative resultater).
    3. Omhyggeligt fyld luftvejene med 0,75% Agarosen (køles ned til kropstemperatur) via kateteret indtil komplet udfoldning af lungen; Vent indtil fuldstændig størkning af agarosegelelektroforese. Fjerne kateteret og omhyggeligt høste lunge i et mørkelagt 2 mL rør fyldt med 4% PFA.
  5. For ekstra fiksering Inkuber prøven i 4% PFA løst i PBS i 2 timer ved 4 ° C under kontinuerlig rotation (31 rpm).
  6. Dehydrere væv af efterfølgende inkubere prøve under kontinuerlig rotation (31 rpm) ved 4 ° C 50% ethanol (pH 9), 70% ethanol (pH 9) og 100% ethanol; hvert trin i mindst 4 timer. I slutningen, skal du udføre en anden inkubation i frisk 100% ethanol til 4 h.
  7. Udføre opløsningsmiddel-baserede clearing af væv ved hjælp af ethyl cinnamate (HEV). Derfor, overføre prøven til kritisk EU-infrastruktur. Der inkuberes natten over ved stuetemperatur (under konstant rotation) indtil væv, der vises gennemsigtigt (Se figur 1D for repræsentative billeder).
    Bemærk: Prøverne opbevares i HEV ved stuetemperatur (beskyttet mod lys) er stabil over flere uger til måneder.

5. udføre lys-ark Fluorescens mikroskopi af Wwhole Murine lunge lapper

Bemærk: Se Tabel af materialer for detaljer om lys-ark fluorescens mikroskop og den tilsvarende software, som bygger på følgende trin. Sammenlignelige systemer fra andre producenter, dog kan bruges som godt med udvikleren-specifikke ændringer af følgende protokol. Før du starter, blive fortrolig med mikroskop-specifikke betjeningsvejledning og følg instruktionerne tekniske af de ansvarlige på stedet.

  1. Opsætning af lys-ark mikroskop.
    1. Tænde lys-ark mikroskop og åbne de tilsvarende imaging software på computeren. Fyld i prøve salen med filtreret HEV (100 µm filter) og placere den i sin position mellem laserstråler.
    2. Brug en lille dråbe af organisk opløsningsmiddel-stabil lim til at holde lunge til prøveholderen. For at holde de krævede indtrængningsdybde lys-ark så lille som muligt, angive den lunge lap oprejst. Placer prøveholderen i sit kammer.
    3. Indstil brydningsindekset af målet til 3,5, når du bruger HEV som clearing reagens.
  2. Justere indstillingerne på light-ark mikroskop for at opdage menneskelige celler i forbindelse med hele orglet.
    1. Vælg kræves lasere (filter til måling > aktivere afkrydsningsfelterne kræves lasere) og vælge passende intensiteter i kontrol software (laser transmission control > Brug skyderen til at indstille laser intensitet > anvende). Bruge en excitation boelgelaengden 488 nm (525/50 filter) til at detektere autofluorescent lungevæv og 640 nm (680/30 filter) at ophidse menneskeceller mærket med et fluorophore udsender i den røde spektrum.
    2. Fokusere på prøve spændt på 488 nm og tilpasse fokus via værktøjet 'kromatisk korrektion' ved excitation bølgelængde på 640 nm (bruge skyderen til at indstille kromatisk korrektion > anvende).
    3. Vælg en passende zoomfaktor; Brug en lav forstørrelse oversigt (fx 6,3 x) til at bestemme den samlede fordeling af mærket celler i lungevæv og forstørrede billeder (f.eks., 32 x) for detaljerede lokalisering.
    4. Vælg et ark bredde ensartet belyse hele orglet eller et bestemt afsnit af interesse (optik > Brug skyderen til at indstille ark bredde, normalt mellem 20-40%). Definere ark numerisk blænde (NA) med højere NA oprettelse skarpere billeder (optik > Brug skyderen til at indstille ark NA; ved en murine lunge lap udvidet til dens fysiologiske størrelse en NA 0.025% kan ofte bruges).
    5. Vælg antallet lys-ark skal anvendes under "indstillinger for avanceret måling". I tilfælde af tovejs belysning, flette venstre og højre lys-ark for at skabe en homogen måde belyst billede (Avanceret > Flet lightsheets > Vælg blend mode > Brug skyderne til at definere overlapning mellem begge lys-ark).
      Bemærk: Det anbefales at benytte tovejs belysningen af eksemplet med tre lys ark, hver.
      Valgfri: For at øge billedkvalitet, bruge dynamisk fokus operation. Dette giver mulighed for at flytte fokus i x-retning under image erhvervelse.
    6. Definere start- og slutpositioner af z-stakken til at blive målt og indstille størrelse for trin på 5 µm (xyz-tabel Z > Skan range).
      Bemærk: Start- og slutpositioner af en z-stak afhænger af størrelse og placering af lunge lap i prøve salen. Omkring 300 til 800 z-stakke er dog normalt erhvervet for en enkelt lunge lap (5 µm trin størrelse).
    7. Gemme filer ved hjælp af 'autosave indstillinger' og start måling for at tage billeder. Efter efterbehandling datafangst, ren HEV-forurenet prøveholderen og kammer under rindende vand.
      Bemærk: Bruge de samme indstillinger til at afbilde flere lunge lapper, der skulle sammenlignes bagefter.

6. efter billede behandling og kvantificering af lunge-akkumuleret humane celler

Bemærk: Se venligst Tabellen af materialer for oplysninger på post imaging software til 3D analyse, som bygger på følgende trin. Dog kan alternativ post imaging software bruges som godt.

  1. Indlæse det første billede af en z-stak (aktivere knappen overgå, fil > Åbn > Vælg billede) for at starte åbning af alle andre billeder af den valgte z-stakken og deres automatiske 3D rekonstruktion.
  2. For at sikre korrekt visning af x, y og z dimensioner, kontrollere voxel størrelser og eventuelt justere dem (edit > image egenskaber > Angiv voxel størrelse manuelt). Angiv den valgte trin-størrelse mellem to billeder (her 5 µm) under voxel størrelsen af z.
  3. Vise hver kanal i en tydelig farve (edit > Vis justeringen af skærmens). Klik på hver kanal ene efter den anden til at definere en farve valg (i figur 2A, B, C, D autofluorescence signal vises i grå og mærket menneskelige CD4+ celler i rød).
  4. Justere intensiteten, sortniveau og kontrast for hver kanal (edit > Vis justeringen af skærmens) ved hjælp af trekanter i kanal barer eller indtaste nøjagtige tal i Kanalindstillinger. For justering af intensitet, bruge den højre trekant. Sort niveau justering, brug venstre trekanten og for justering af kontrast, bruge den mellemste trekant.
    Bemærk: Brug lungen afledt af kontrol mus uden celle overførsel (trin 3.3) at skelne mellem specifikke humane celle-afledte signaler og uspecifik baggrund.
  5. For at kvantificere mærket celler i det pulmonale væv bruge 'Tilføj ny steder' på værktøjslinjen, og vælg 'springe automatisk oprettelse, redigere manuelt' til manuel celle optælling.
    Bemærk:
    alternativt bruge cellen automatisk tælle værktøj under 'steder'. Men manuel optælling tillader for at skelne mellem specifikke og uspecifikke signaler mere præcist.
    1. For at sammenligne ophobning af menneskelige celler på tværs af forskellige prøver, definere en lunge terning med en bestemt diskenhed ved hjælp af værktøjet 3D skæring (Rediger > Beskær 3D) (her 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. At tælle akkumulerede celler Vælg 640 nm kanalen og definere en radius skala på 10 µm. Klik på 'Rediger', check 'Vælg' i menuen pointer og markere hver celle med en prik via Skift-klikke med venstre museknap. Finde det samlede antal optalte celler vises i statistikken.
      Bemærk: Det anbefales stærkt at tælle flere kuber pr. lunge lap (her fem) at sikre resultaternes pålidelighed og kompensere for videnskabsmand-afhængige udvalg af optalte lunge-volumen (kvantificering strategi og repræsentative resultater er afbildet i Figur 2D).
  6. Hent en afbildning ved hjælp af snapshotværktøjet '' og/eller tage en video ved hjælp af værktøjet 'animation'. Gem justeret filer som .ims-filer (fil > Eksporter).
    Bemærk: Til repræsentative formål, vise eller skjule rammen ved at markere eller fjerne markeringen rammen i værktøjslinjen. Derudover display billeder enten som maksimal intensitet projektion (MIP) (værktøjslinje > lydstyrke > tilstand > kontrollere MIP) eller bruge tilstanden' overflade' (værktøjslinjen > tilføje nye overflader). Tilstanden' overflade' har skal aktiveres særskilt for hver kanal at fremhæve væv arkitektur og/eller celle organer (repræsentative billeder er vist i figur 2C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den præsenterede protokol beskriver en eksperimentel musemodel, som giver mulighed for overvågning og kvantificering af ophobning af adoptively overførte humane T lymfocytter i lunge via lys-ark Fluorescens mikroskopi. Figur 1 A giver en skematisk oversigt over de in vivo trin af den eksperimentelle tidsplan. For at garantere pålidelige resultater, er det af væsentlig betydning at sikre en god kvalitet af de isolerede og fluorescently mærket menneskelige CD4+ T celler, som overføres bagefter ind i musene. Som repræsentativt skildret i figur 1B, C, ovenfor beskrives proceduren for microbead-baserede celle berigelse og efterfølgende fluorescens-mærkning normalt resulterer i en flow cytometrically bestemmes CD4+ T-celle renhed > 95% og vellykket fluorescens-mærkning af alle CD4+ T celler. Kvalitet og penetration dybden af lys-ark Fluorescens mikroskopi afhænger kritisk en passende kvalitet af væv clearing. Som vist i figur 1D, var det her anvendt protokol for ECi-baserede væv clearing stand til at garantere et højt niveau af orgel gennemsigtighed, med angivelse af en vellykket brydningsindeks matchende. Endelig er en repræsentative samlede resultat af den beskrevet forsøgsplan i form af fuldt forarbejdet lys-ark Fluorescens mikroskopi billeder vist i figur 2B, C, D og Supplerende Video. Autofluorescent signal (vises med gråt) giver et nyttigt værktøj for imaging den anatomiske struktur af lungen. Røde signal repræsenterer lunge akkumuleret menneskelige CD4+ T celler. Kvantificering af lys-ark Fluorescens mikroskopi imaging giver mulighed for bestemmelse af samlet antal lunge akkumuleret menneskelige CD4+ T celler pr. afgrænset område af betændte lungevæv. En strategi for kvantificering af humane celle infiltration er illustreret i figur 2E. (Valgfri) flow cytometric påvisning af fluorescently mærket celler i BAL af modtagerens mus, som afbilledet i figur 2F, kan bruges som en supplerende teknik for at bekræfte den succesfulde væv migration af adoptively overført CD4+ T celler. Derudover præference af overførte human T-celler for selektiv ophobning i betændte lungevæv i her beskrevne eksperimentelle indstilling blev yderligere understøttet af faktum, at menneskelige CD4+ T celler kunne ikke hentes i tarmslimhinden modtager dyr som skildret i figur 2B (højre panel).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk oversigt over in vivo eksperimentelle arbejdsprocessen. (A) allergisk lungebetændelse er fremkaldt i C57BL/6J mus ved indånding af papain (50 µg/mus) på tre på hinanden følgende dage (d0, d1 og d2). Den næste dag (d3), frisk isoleret og fluorescently mærket menneskelige CD4+ T celler overført adoptively ind i musene via hale vene injektion. Efter yderligere tre timer, blev mus ofret, efterfulgt af in situ perfusion og fiksering af lungerne. Endelig, lungerne blev eksplanterede og yderligere analyseret ex vivo af lys-ark Fluorescens mikroskopi. Valgfrit, kan BAL indsamles før lunge explantation at udføre udvidet ex vivo analyser af held røde og overflyttede humane celler. (B) repræsentative histogram bekræfter renhed af den isolerede CD4+ T-celle brøk som bestemt ved flowcytometri. Celler farves af en anti-menneskelige CD4 antistof eller isotype kontrol vises i sort og grå, henholdsvis. (C) repræsentative histogram bekræfter effekten af fluorescens-mærkning af menneskelige CD4+ celler før adoptiv overførsel. (D) repræsentative billeder af en perfunderet murine lunge lap før og efter clearing med kritisk EU-infrastruktur. FI, fluorescens intensitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant analyse af pulmonal ophobning af menneskelige CD4+ celler i forbindelse med lungebetændelse in vivo. Menneskelige CD4+ celler blev isoleret fra perifert blod ved hjælp af tæthed gradient centrifugering efterfulgt af et magnetisk microbead-baserede rensning skridt. Menneskelige CD4+ celler var mærket ved hjælp af et rødt lys-overgearet celle spredning farvestof og indsprøjtes intravenøst i papain-eksponerede C57BL/6J mus. Efter tre timer, blev mus ofret for at indsamle og analysere yderligere lungevæv via lys-ark Fluorescens mikroskopi. (A) repræsentative oversigt over en 3D rekonstruktion af murine, papain-eksponerede lungevæv (grå) tre timer efter intravenøs injektion af mærket menneskelige CD4+ celler (red) som er registreret af lys-ark Fluorescens mikroskopi. (B) lungevæv modtager musen tre timer efter celle overførsel vises som en oversigt eller høj forstørrelse segment (venstre panel). Hentet menneskelige CD4+ celler kunne visualiseres som røde signaler og var enten afbildet i overlejring med autofluorescence signal af lungevæv eller som enkelt kanal billede. For at bekræfte specificiteten af det detekterede signals, kontrol lungevæv uden intravenøs celle overførsel fungerede som negativ kontrol (midterste panel). I modsætning til lungevæv, ingen mærket menneskelige CD4+ celler (rød) kunne påvises i ileum fra den samme recipient mus (højre panel). (C) Post billedbehandling giver mulighed for analyse af enkelt skiver af lungevæv samt generation af 3D rekonstruktioner af hele orgel segment, kan være enten repræsenteret som maksimal intensitet projektion (MIP) eller overflade tilstand. Repræsentative billeder er afbildet. (D) kvantificering strategi er illustreret eksemplarisk i den samme lunge som allerede afbildet i figur 2A. Definerede kuber af analyseret lunge segment blev udvalgt og antallet af menneskelige CD4+ celler (red) var kvantificeres for hver kube. Resultaterne af en efterfølgende udført kvantificering (begivenheder/813 µm x 813 µm x 1,000 µm terning) er angivet som gennemsnit ± SEM. (E) som en yderligere valgmulighed, flow cytometric påvisning af fluorescently mærket humant T-celler i BAL modtager dyr kan være udført for at bekræfte vellykket væv migration af akkumulerede menneskelige CD4+ T celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Video
Supplerende Video: Repræsentative videosekvens viser akkumuleret menneskelige CD4+ celler inden for murine lungevæv. 3D rekonstruktion af murine lunge vise akkumuleret menneskelige CD4+ celler (rød) inden for rammerne af det pulmonale væv (grå) tre timer efter intravenøs injektion i halen vene. Billeder vises som MIP i begyndelsen og i den overflade tilstand i sidste ende. Billeder blev erhvervet via lys-ark Fluorescens mikroskopi og behandles af post imaging software til 3D analyse. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her beskrevne eksperimentelle indstilling giver mulighed for at overvåge den homing lungekapacitet primære human immun celler under in vivo betændelsestilstande og dermed relevant supplerer klassisk udføres in vitro-vedhæftning og chemotaxis assays. For at tage hensyn særlige anatomiske orgel Karakteristik af lungen, vigtige aspekter af immun celle homing (herunder chemotaxis og celle fordeling inden for målorgan) samt klinisk relevans og overførsel af erhvervede data, vi tog fordel af tre tekniske nøglen egenskaber: (1) analyse af primære menneskelige celler i en levende murine organisme; (2) papain-medieret induktion af lunge betændelse; og (3) lys-ark Fluorescens mikroskopi af ryddet lungevæv.

Selv om funktionelle studier af adoptively overført human kan immun celler i en levende murine organisme være begrænset i nogle aspekter på grund af potentielt relevante inkompatibilitet i receptor-ligand-interaktioner mellem mus og mænd, det generelle koncept af humaniseret musemodeller har oprettet med succes som et vigtigt eksperimentelle redskab inden for Translationel medicin i løbet af de sidste årtier24,32,33,34,35 . I forhold til klassisk dyremodeller, giver studier i humaniseret mus fordelen at direkte analysere patient-afledte immun celler i en in vivo scenario og dermed identificere funktionelle ændringer præget af de særlige sygdom32, 36,37. Hvad angår relevansen af potentielle uoverensstemmelser mellem defineret receptorer på overfladen af menneskets immunceller og deres respektive murine ligander eller vice versa, tidligere undersøgelser allerede oplyst, at menneskelig CD4+ T celler er i stand til at kommunikere effektivt med murine adhæsionsmolekyler MAdCAM-1 og VCAM-1, der repræsenterer afgørende ligander til integrin-medieret lymfocyt homing32. Derfor kunne migration af intravascularly overførte human immun celler i murine gut væv med held blokeres in vivo ved behandling med klinisk anvendte α4β7 integrin antistof vedolizumab32. Men selv i tilfældet at en bestemt receptor-ligand-interaktion af relevans kunne vise en komplet menneskelige/murine uoverensstemmelse, det vil formentlig være muligt at overvinde denne begrænsning af genteknologi og eksempelvis af transgene overekspression af de respektive menneskelige ligand, vækstfaktor, cytokin eller receptor inden for murine organisme33,35.

Som en betydelig indflydelse på kronisk betændelse på den lokale sekretion af kemokiner, er i endothelial udtryk af adhæsionsmolekyler og efterfølgende ophobning af lymfocytter blevet beskrevet i adskillige publikationer38,39 ,40, valget af en passende eksperimentel model af lunge betændelse repræsenteret et kritisk skridt selv om oprettelse af den ovenfor beskrevne protokol og kan være tilpasset afhængig af den kliniske forbindelse med hver enkelt undersøgelse. Den her valgte indstilling af papain-induceret allergisk lungebetændelse repræsenterer en velbeskrevet eksperimentel model, som er baseret på lokalt administreret cystein protease papain kapacitet til at irritere luftvejene epitel og udløser den efterfølgende frigivelse af alarmins27,41,42. Interessant, er utilsigtet redegørelsen til papain kendt for at forårsage astma udvikling hos mennesker som godt43. Afhængig af den inhalerede dosis af papain, eksponerede mus viser en ophobning af medfødte og adaptive immunceller og forhøjede niveauer af type 2 cytokiner i lunge27. Mens dosis eskalering viste sig at medføre en udvidelse af luftrum (klassisk histologiske fænomen af KOL) og en ødelæggelse af blodkarrenes vægge med efterfølgende blødning, gik moderat dosering tidsplaner sammen med en fremtrædende pulmonal eosinofili og efterlignede dermed en vigtig histologiske funktion af menneskelige astma27. Da vores formål var at bruge denne eksperimentelle model til at generere en inflammatorisk baggrund for analyse af pulmonal immun celle homing, forsøgte vi omhyggeligt at undgå papain-induceret beskadigelse af blodkar, hvilket ellers kunne resultere i en unphysiological ekstravasation af human immun celler på grund af forstyrret endotel integritet. Derfor valgte vi en mellemliggende dosis af 50 µg af papain pr. mus pr. dag i den ovenfor beskrevne protokol. Selv om udviklingen af papain-induceret luftvejs inflammation opstår også, i mangel af B og T lymfocytter, lunge infiltrerer adaptive immunceller er kendt for at påvirke betydeligt i løbet af sygdommen27,42. For eksempel, kunne regulerende T-celler identificeres som potent regulatorer af papain-induceret luftvejs eosinofili27. I perspektiv, den aktive inddragelse af pulmonal lymfocytter i inflammatoriske patogenesen af papain-eksponerede mus implicerer at de ovenfor beskrevne protokol kan desuden aktivere til at analysere den funktionelle kapacitet af adoptively overført og med held lunge-akkumuleret menneskelige immunceller til at modulere lunge patologi (f.eks. via flow cytometric erhvervelse af eosinofil tæller i BAL). Desuden kan en desuden udført intranasal administration af udvalgte sygdomme-relevante menneskelige kemokiner lige før intravaskulær celle overførsel tillade for at analysere virkningen af disse humorale mæglere på lunge homing processen med særskilte menneskelige immun cellepopulationer i en in vivo indstilling. Ligeledes, effekten af hæmmere lunge homing processen og efterfølgende, inflammatoriske lunge patologi kan studeres.

En særlig fordel her indført eksperimentelle proceduren er præcis sporing og lokalisering af lunge infiltrerer human immun celler af high-end imaging kvaliteten af lys-ark Fluorescens mikroskopi. Nylige undersøgelser demonstreret allerede at teknik lys-ark Fluorescens mikroskopi repræsenterer en værdifuld eksperimentelle værktøj til analyse af intestinal immun celle homing i implementeringsforskning IBD og er i stand til at overvinde de vigtigste begrænsninger af konventionelle immunofluorescens mikroskopi og flow flowcytometri24,32. Mens analyser baseret på konventionelle mikroskopi er normalt begrænset til en meget lille og potentielt ikke repræsentative område af orgel og flow flowcytometri tager ikke hensyn til aspekt af væv organisation på alle lys-ark Fluorescens mikroskopi kemisk ryddet væv giver mulighed for en øget indtrængningsdybde uden større tab af opløsning og dermed muliggør en 3D rekonstruktion af temmelig store orgel sektioner (op til 1,5 cm x 1,5 cm)24,28,44. For sikker, afhængige kvaliteten og gyldigheden af erhvervede 3D rekonstruktioner kritisk af udførelsen af væv clearance. I den her beskrevne indstilling indgår vi en lidt vedtagne version af den nyligt offentliggjorte protokol for ECi-baserede væv clearing44. I forhold til andre veletablerede strategier for opløsningsmiddel-baserede væv clearing26,kombinerer45,46, HEV-baseret protokol fordelene ved fremragende clearing egenskaber, lav toksicitet af brugte reagenser og en moderat tid krav44. Som standard light-ark Fluorescens mikroskopi evne til at løse fineste strukturer som alveolær kapillærer er stadig begrænset selv under optimale clearing betingelser28, kan en eller anden måde det vanskeligt at pålideligt differentiere mellem intravaskulær og allerede røde immunceller. Inddragelse af en yderligere standard fluorescens-baserede blodkar farvning i den her beskrevne protokol ville sandsynligvis ikke kunne fuldt ud overvinde denne begrænsning. Således kan undersøgelser med særlig fokus på funktionen af immun celler inden for pulmonal mikrocirkulationen eller deres diapedesis fortrinsvis tage hensyn til en nyligt offentliggjort og meget elegant protokol for intravital lunge imaging baseret på 2-foton mikroskopi47. I denne eksperimentelle indstilling, en thorax vindue blev implanteret i bedøvede og ventileret mus, hvorigennem stabiliseret lungerne kan blive overvåget af en resonans-scanning 2-foton mikroskopi modul, tillader lang-dagsorden tænkelig i hele den respiratorisk cyklus på bevarede ventilation og perfusion47,48. Denne teknik har været anvendt med succes i forskellige undersøgelser og var i stand til at visualisere f.eks intrapulmonary trombocyt Biogenese og lunge indgangen af cirkulerende tumor celler49,50. Men ud over kravet om sofistikeret instrumental udstyr (f.eks. mus ventilationssystem) og behovet for omfattende invasive manipulationer i levende dyr (implantation af thorax vindue og intravital mikroskopi), den største begrænsning af denne levende lunge er mikroskopi system begrænset z-aksen penetration. Udført lunge overflade imaging kun tillader analysere de ydre 100 µm subpleural lunge væv47,48. Afhængig af den videnskabelige sammenhæng, det kan være en værdifuld mulighed for at implementere 2-foton mikroskopi af eksplanterede lungerne som en supplerende procedure i den ovenfor beskrevne protokol. Analysere den samme lunge først ved 2-foton mikroskopi og bagefter lys-ark Fluorescens mikroskopi kan repræsentere en strategi til at opnå et kvantitativt overblik over distributionen og lokalisering af human immun celler i murine lunge ( lys-ark Fluorescens mikroskopi) og på samme tid, få mere detaljeret indsigt i cellulære eller mikrovaskulære processer (2-foton mikroskopi). Ja, 2-foton mikroskopi af murine trakeale explants repræsenterer en etableret tænkelig værktøj til at analysere immun celle adfærd i forbindelse med eksperimentelt inducerede lunge betændelse51,52. I stedet for at visualisere lille pulmonal kapillærer, kan vellykket ekstravasation og lunge væv infiltration af de overførte human T-celler i vores eksperimentel model også bevist ved at afsløre fluorescently mærket menneskelige celler i BAL af modtageren dyr via flowcytometri så eksemplarisk afbildet i figur 2E. I almindelighed, repræsenterer analyser af cellulære BAL rum en veletableret metode til at karakterisere pulmonal immun celle tilstrømning i forbindelse med inflammatoriske luftvejssygdomme31. Endelig, en anden flow cytometric strategi for kvantificering ekstravasation af adoptively overførte immun celler i lungevæv blev beskrevet af Galkina et al. (2005)53 og potentielt kunne kombineres med den her beskrevne protokol. I studiet af Galkina et al., en enkelt intravenøs injektion af et fluorescens-konjugerede anti-CD8 antistof kort før resektion af lungen resulterede i en eksklusiv og fuldkommen mærkning af før overført CD8+ T-celler i lungen vaskulære rum, mens allerede røde CD8+ T celler inden for lunge interstitium forblev unstained. Efterfølgende analyser af in vivo mærket pulmonal immunceller blev udført flow cytometrically efter ex vivo fordøjelsen af lunge væv53. Processen med væv fordøjelsen betyder selvfølgelig, at den anatomiske adskillelse mellem intra- og ekstravaskulære lunge rum er ophævet, og der er således en generel risiko for falsk-positive mærkning af interstitiel immunceller på grund af antistof lækage mellem begge rum. Denne risiko kan kun blive minimeret ved at udføre væv fordøjelsen i overværelse af mætte mængder af umærket antistof53 eller potentielt, ved at erstatte flow cytometric analyse af lys-ark Fluorescens mikroskopi, som gør det muligt helt undgå ødelæggelse af væv struktur.

I sammendrag, her indført kombination af in vivo homing af fluorescently mærket primære immunceller og efterfølgende lys-ark Fluorescens mikroskopi er i stand til pålideligt identificere, kvantificere og lokalisere lunge akkumuleret human immun celler i en eksperimentelle musemodel af lunge betændelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MF Neurath har fungeret som rådgiver for Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda og Boehringer. De resterende forfattere videregiver ikke nogen konflikt.

Acknowledgments

Forfatterne parlamentsarbejdet, finansiering af DFG Collaborative Research Centre SFB 1181 og TRR 241. Optisk Imaging Center Erlangen (OICE) og i særlige Ralf Palmisano, Philipp Tripal og Tina Fraaß (projekt Z2 af DFG CRC 1181) er anerkendt for teknisk ekspertbistand til lys-ark fluorescens mikroskopisk billeddannelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/mL) anprotec AC-AF-0018
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 mL B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 mL Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 mL, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 mL Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14, (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210, (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179, (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254, (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190, (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79, (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112, (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42, (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182, (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70, (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171, (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35, (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69, (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166, (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9, (12), 114604 (2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158, (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57, (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14, (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294, (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23, (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186, (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8, (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153, (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43, (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72, (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65, (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25, (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8, (1), 707 (2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95, (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14, (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23, (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36, (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190, (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32, (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28, (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8, (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544, (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531, (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15, (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10, (3), 0118513 (2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115, (12), 3473-3483 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics