Malignant en Non-Malignant B cellen isoleren uit lck:eGFP zebravis

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Transgene lck:eGFP zebrafish express GFP zeer in T lymfocyten en zijn gebruikt voor het bestuderen van de T cel ontwikkeling en acute lymfatische leukemie. Deze regel kan worden gebruikt voor studie B-cellen, die lck op lagere niveaus uitdrukken. Dit protocol beschrijft zuivering van kwaadaardige en niet-kwaadaardige B-cellen uit lck:eGFP zebrafish.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish. J. Vis. Exp. (144), e59191, doi:10.3791/59191 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) zijn een krachtig model om te studeren lymfocyt ontwikkeling. Zoals zoogdieren bezitten D. rerio een adaptieve immuunsysteem waarin B en T-lymfocyten. Studies van zebravis lymphopoiesis zijn moeilijk, omdat de antistoffen herkennen D. rerio cel oppervlakte markeringen zijn doorgaans niet beschikbaar, complicerende isolatie en karakterisatie van verschillende lymfocyt bevolking, met inbegrip van B-geslacht cellen. Transgene lijnen met geslacht-specifieke fluorophore expressie worden vaak gebruikt voor het omzeilen van deze uitdaging. De transgene lck:eGFP lijn is gebruikt voor het bestuderen van D. rerio T cel ontwikkeling en is ook gebruikt voor model T cel ontwikkeling en acute lymfatische leukemie (T-ALL). Hoewel lck:eGFP vis wijd gebruikt zijn voor het analyseren van de T-bloedlijn, zijn ze niet gebruikt om te studeren van B-cellen. Onlangs ontdekten we dat veel zebrafish B-cellen ook express lck, weliswaar op lagere niveaus. Lck:eGFP B cellen express bijgevolg eveneens lage niveaus van GFP. Op basis van deze bevinding, ontwikkeld wij een protocol om te zuiveren van B-bloedlijn cellen uit lck:eGFP zebrafish, die wij hier rapporteren. Onze werkwijze wordt beschreven hoe u gebruik maken van een TL-geactiveerde cel sorter (FACS) om te zuiveren van B-cellen van de lck:eGFP vis of verwante lijnen, zoals dubbel-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP vis. In deze lijnen, B-cellen, zodat vooral onvolwassen B-cellen, uitdrukkelijke GFP op laag maar detecteerbare niveaus, ze kunnen worden onderscheiden van T-cellen, die zeer GFP uitdrukken. B cellen kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg, thymus, milt, bloed of andere weefsels. Dit protocol biedt een nieuwe methode om te zuiveren van D. rerio B-cellen, waardoor studies gericht op onderwerpen zoals B cel ontwikkeling en B-lymfocyt maligniteiten.

Introduction

Zebravis bieden krachtige kenmerken, zoals genetische oorlogsmachinerie, hoge vruchtbaarheid, optische translucentie en snelle ontwikkeling die studeren gewervelde ontwikkelen met behulp van genetische benaderingen te vergemakkelijken. Deze voordelen, samen met de gedeelde kenmerken van teleost en zoogdieren Haematopoiese, maken D. rerio ideaal voor in vivo analyses van lymphopoiesis en lymfocyt functie, vanaf hun vroegste verschijning in larven in de volwassenheid. Bloed ontwikkeling in zebrafish berust op goed geconserveerde genetische processen die worden gedeeld met zoogdieren, en deze uit te breiden naar het adaptieve immuunsysteem. Moleculaire mechanismen bestuur lymfoïde ontwikkeling zijn bovendien opmerkelijk bewaard tussen zebravis en zoogdieren1.

In de afgelopen 2 decennia, transgene D. rerio lijnen dat etiket specifieke bloed lineages en mutant lijnen tekort aan deze geslachten zijn2,3,4,5gemaakt. Een van deze, de transgene lijn van lck:eGFP , gebruikt de zebravis lymfocyt eiwit tyrosine kinase (lck) promotor voor GFP expressie6. Dit gen, die sterk wordt uitgedrukt door zowel T-bloedlijn precursoren en volwassen T-lymfocyten, kan in vivo bijhouden van de ontwikkeling van de serie T-cel en ex vivo zuivering van T-bloedlijn cellen door FACS7. Eerder, we gebruikten deze regel in een voorwaarts-genetische ENU mutagenese scherm te identificeren germline mutanten vatbaar voor T-ALL en te bestuderen somatically verworven genetische gebeurtenissen gekoppeld aan T cel oncogenese8,9.

Ons laboratorium verder breidden het nut van lck:eGFP zebrafish. In dubbel-transgene rag2:hMYC (menselijke MYC), lck:eGFP D. rerio waarvan bekend is dat het ontwikkelen van T-ALL 10, ontdekten we dat B-bloedlijn allemaal ook optreden11. In tegenstelling tot T-ALL in dit model, die lichten helder als gevolg van hoge GFP expressie, B-ALL zijn vaag-belichting fluorescerende als gevolg van lage GFP niveaus, waardoor vis met B-ALL te onderscheiden Grove van degenen met T-ALL door fluorescent microscopie. Deze differentiële GFP-expressie staat ook de scheiding van GFPlo B-ALL cellen van GFPHallo T-ALL cellen met behulp van FACS11. Bovendien, lage lck expressie is niet uniek voor zebrafish B-ALL, als menselijke B-ALL ook express lage niveaus van LCK11,12. Ook de normale B-bloedlijn cellen van D. rerio, muizen en mensen ook lage niveaus van lckexpress /Lck/LCK, met onrijpe B-cellen die de hoogste expressie11,13. Op basis van het per cel express B-bloedlijn cellen lckeGFP zebrafish of afgeleide regels 1-10% zoveel GFP als T-lymfocyten. Deze GFPlo cellen uitdrukkelijke karakteristiek B-cel mRNAs zoals pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, en anderen, en gezuiverd kan worden uit het beenmerg, thymus, milt of randapparaat bloed11. Daarom beide B - en T-bloedlijn cellen kunnen, geïsoleerd uit lckeGFP zebrafish, en in het geval van rag2hMYC, lckeGFP dieren, B - en T-ALL cellen ook11.

Hier presenteren we ons protocol naar efficiënt FACS-zuiveren niet-maligne B cellen van lck:eGFP zebrafish, en niet-kwaadaardige of kwaadaardige B-cellen van de rag2hMYC; lck:eGFP vis, met behulp van verschillende weefsels van de bron. Deze cellen kunnen eveneens worden gekwantificeerd door stroom cytometry zonder FACS isolatie, indien gewenst. Ontdekking van lage lck expressie- en dus lage GFP expressie-door B cellen opent nieuwe deuren voor experimentele mogelijkheden voor lckeGFP zebrafish, zoals in vivo B cel developmental studies. Dus, deze transgene lijn, eerst gemeld in 2004, heeft nieuw leven zoals we willen gebruiken om te achterhalen van de nieuwe inzichten inzake de zebravis adaptieve immuniteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures waarbij zebrafish werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center.

1. het isoleren van niet-kwaadaardige B en T-lymfocyten van transgene lck:eGFP vis

  1. Anesthetize de vis met behulp van 0,02% tricaïne (MS-222) in vis systeem water.
  2. Onderzoeken van 2 – 6 maand oud vis voor TL thymi, die zich bevinden op het aspect van de dorsomedial van de branchial holte van zebravis en andere teleosts14. Gebruik een epifluorescence Microscoop (470/40 excitatie golflengte en 525/50 emissie filter) te detecteren GFP.
  3. Bereiden in 50 mL filter-gesteriliseerde 1 x Roswell Park Memorial Instituut Medium (RPMI) met 1% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine (sorteren media). Ongebruikte sorteren media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.
  4. De vis euthanaseren door deze te plaatsen in een bekerglas van 0,2% tricaïne voor ongeveer 5 min, gevolgd door ijs bad onderdompeling. Bevestig dood door de beëindiging van de operculaire (gill) beweging.
  5. Plaats de euthanized vis in een petrischaal en ontleden van lymfoïde organen van belang, met behulp van de fluorescente microscoop te ontleden de GFP+ thymi14, en de lichte microscopie Veldinstellingen de nier merg en milt15ontleden. Resultaten die hier gepresenteerd werden verkregen met behulp van 3 maand-oude vis. Lymfocyt proporties en absolute aantallen variëren per leeftijd en genotype (zie bespreking voor verder detail).
  6. Plaats elke ontleed orgel in een tube van 1,5 mL met 500 µL van koude media sorteren.
  7. Meng het weefsel op het ijs met behulp van een stamper micro-buis homogenizer.
  8. Gehomogeniseerde weefsel passeren een 35 µm mesh filter voor het genereren van een enkel celsuspensie. Houd de cellen op het ijs tot analyse.

2. het isoleren van maligne lymfocyten van Double-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP zebravis

  1. Beginnen bij 2-4 maanden, microscopisch scherm rag2:hMYC; lck:eGFP vis voor abnormale GFP patronen.
    Opmerking:
    B cellen zijn GFPlo op de achtergrond van de lck:eGFP , dus B-ALL praktijk vereist te herkennen; T-ALL is duidelijk, omdat T-cellen GFPHallo zijn. Bijgevolg, het rag2:hMYC, lck:eGFP dual-transgene lijn heeft twee fenotypes: helder-belichting fluorescerende T-ALL, die meestal ontstaan uit de zwezerik en uit te breiden naar het lichaam, en vaag-TL B-ALL.
    1. De vis met behulp van de "lage" belichtingsinstellingen (200 ms, 2,4 x winst) om heldere T-ALL (figuur 1A) en "hoge blootstelling" te identificeren met behulp van een fluorescente microscoop, scherm (1.5 s, 3.4 x winst) om te identificeren dim B-ALL (figuur 1A). WT besturingselementen en vooraf leukemische vis hebben GFP gelokaliseerd alleen in de thymus (figuur 1B).
  2. Anesthetize en onderzoeken van de vis zoals beschreven in stappen 1.1-1.2.
  3. Categoriseren van de vis die op basis van de omvang van GFP fluorescentie, met behulp van een eenvoudig drie categorieënsysteem:
    Opmerking: Niveau 1: Fluorescentie blijkt als een serie tumor met slechts beperkte lokale verspreiding.
    Niveau 2: Fluorescentie blijkt dan de thymus, waarbij < 50% van het lichaam.
    Niveau 3: Fluorescentie overschrijdt 50% van het lichaam.
  4. Scheid de vis met allemaal van die zonder kanker. Toezicht vooraf leukemische vis (dat wil zeggen, de vis zonder GFP+ tumoren) eens maandelijks voor de ontwikkeling van nieuwe ALL. Door ~ 9 maanden, alle rag2:hMYC, lck:eGFP vis ontwikkelen T-ALL, B-ALL, of beide.
  5. Voor T - of B-ALL cel isolatie, selecteer niveau 3 vis (alle waarbij > 50% van het lichaam), die opbrengst meer dan 2 x 106 alle cellen, en meestal veel meer.
  6. Euthanaseren van de vis zoals in stap 1.4.
    Opmerking: Er zijn twee methoden voor het verkrijgen van alle cellen: hele lichaam homogenisering en een peritoneale wassen techniek16. De methoden verschillen in het absolute aantal cellen verzameld voor het sorteren, en dus de hoeveelheid FACS tijd vereist en kosten (zie bespreking voor verder detail).
  7. Voor beide methoden, eerst plaatst u de euthanized vis in een petrischaal en het hoofd met inbegrip van de serie regio met een scheermesje, verwijderen. Dit kan apart als gewenst, of voor histologisch kleuring gebruikt worden verwerkt.
  8. Peritoneale Wash methode
    1. Met behulp van een pipet P1000, wassen de vis peritoneale holte met 500 µL van koude sorteren van media, het verzamelen van de cellen en de media in een tube van 5 mL.
    2. Met behulp van een verse pipette uiteinde, injecteren een extra 200-300 µL van koude sorteren media in de lichaamsholte. Vervolgens met behulp van het uiteinde van de pipet, zachte druk uitoefenen op het lichaam van de vis te extruderen van de cellen uit de lichaamsholte. Het verzamelen van deze media en toevoegen aan de tube van 5 mL.
    3. Herhaal stap 2.8.2 2 tot 3 keer. Houd de verzamelde cellen sorteren van media op het ijs.
    4. Filter de celsuspensie al een maaswijdte van 35 µm filter voorafgaand aan stroom cytometry/FACS en houden van de cellen op het ijs tot analyse.
  9. Hele lichaam homogenisering
    1. Na het verwijderen van het hoofd van de vis, het lichaam in een tube van 1,5 mL met 200 µL van het sorteren van de media te plaatsen.
    2. Meng het lichaam met behulp van een stamper micro-buis homogenizer.
    3. Voeg een extra 300 µL van koude media sorteren. Filter de celsuspensie al een 35 µm mesh filter. Sorteer media toevoegen als nodig te wassen van alle cellen door het filter, totdat alleen weefsel puin op het filter blijft. Houd de cellen op het ijs tot analyse.

3. cytometrische analyse van normale of kwaadaardige B-lymfocyten

  1. Set flow cytometrische analyse en/of FACS parameters volgens fabrikant gids.
  2. Gewenste aantal gebeurtenissen te karakteriseren in eerste instantie het monster te verwerven. 1 x 10,4 , 5 x 104 gebeurtenissen vóór sorteren aan de hand van specifieke poorten voor latere sorteren stappen te analyseren.
    1. Poorten bepalen: Define lymfocyt en progenitor cel poorten met voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) parameters, met uitzondering van cellulaire puin (figuur 2A-C)17. FSC en SSC corresponderen met de cel grootte/diameter en granulariteit, respectievelijk.
      Opmerking: GFP-, GFPloen GFPHallo cellen verschillen 10-tot-100-Vouw in termen van de intensiteit van de fluorescentie GFP, maken van de scheiding van deze populaties eenvoudig (cijfers 2-5). Live-dode discriminatie kan worden beoordeeld op dit punt met behulp van propidium jodium (PI) of 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) levensvatbaarheid kleuring. Eerdere experimenten met PI typisch tonen > 95% levensvatbaarheid van cellen van het GFP+ na FACS.
    2. Het uitsluiten van de cel paren, volgens de parameters van de FACS machine wordt gebruikt.
    3. Binnen de lymfe en/of precursor poorten, bepaalt het aantal en percentage van GFP+ cellen.
  3. Gebruik phycoerythrin (PE) en GFP intensiteiten, gate definiëren voor GFP- vs. GFPlo vs. GFPHallo cellen.
    Opmerking: B cellen dim GFP fluorescentie vertonen en T-cellen in lck:eGFP lijnen helder GFP weergeven. Vele lymfoïde organen of tumor monsters bevatten beide populaties GFP+ . B-bloedlijn cellen/B-ALL GFPlo en T-bloedlijn cellen/T-ALL zijn GFPHallo. Gates onderscheid maken tussen GFP-, GFPloen GFPHallo cellen te definiëren en verzamelen van deze bevolkingsgroepen afzonderlijk (figuur 2A-C, figuur 3A-C, figuur 4A en figuur 5a).
  4. Sorteren van de bevolking van elke cel in verschillende 15 mL polypropyleen buizen met 2 mL media sorteren, of rechtstreeks in verschillende 1,5 mL tubes met een geschikte buffer voor verdere analyses (bijv. RNA, DNA of eiwit extractie, allo-transplantatie, enz.).
  5. Houd gezuiverde cellen op ijs voorafgaand aan verdere analyses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We gebruikten stroom cytometry te analyseren en FACS om GFPlo en GFPHallo cellen van zwezerik, beenmerg van de nier en milt van lck:eGFP transgene zebrafish te isoleren. Analyse van 3-maand-oude vis bleek dat de zwezerik bevatte meestal GFP+ lymfocyten. GFP+ cellen werden grotendeels beperkt tot de lymfoïde poort eerder beschreven door Traver et al.17. Twee verschillende populaties van GFP+ , GFPloen GFPhi,kunnen worden waargenomen in de thymus. GFPHallo lymfocyten vertegenwoordigd een hoger percentage, ~ 60%, terwijl GFPlo cellen minder overvloedig waren, ~ 40% van de totale serie lymfocyten (tabel 1). In tegenstelling tot zoogdieren, is vissen hematopoietische beenmerg gelokaliseerd binnen de nier, in plaats van binnen bot. Wij vastbesloten B-cellen die woonachtig zijn in de nier merg ook express lage niveaus van GFP (figuur 2B en figuur 3B). GFPlo cellen in het beenmerg waren overvloedig, terwijl GFPHallo cellen schaars waren (figuur 2B en figuur 3B)), die aangeeft dat slechts een klein percentage van T-lymfocyten waren aanwezig in beenmerg op 3 maanden oud. Milt monsters bleek ook hogere percentages van GFPlo dan GFPHallo cellen (figuur 2C en Figuur 3 c). Wij ook niet-maligne lymfocyten van zwezerik, beenmerg en milt van dubbel-transgene lck:eGFP; rag2:hMYC zebrafish, die gevoelig voor beide B - en T-ALL11. zijn geanalyseerd In vis die alle nog niet had ontwikkeld, waren resultaten van zwezerik, beenmerg en milt gelijk aan één-transgene lck:eGFP vis. Echter, het aantal lymfocyten per orgel waren toegenomen (Figuur 3), vermoedelijk als gevolg van MYC-gedreven expansie van onrijpe B en T-cel populaties waar de promotor rag2 actief is.

Wij ook double-transgene vis met B -, en/of T-ALL die fluorescerende kanker had ontwikkeld door 6 maanden geanalyseerd. Voorspelbaar, B-ALL vis met vaag-belichting fluorescerende kankers bevatte meestal GFPlo cellen (figuur 4A). In tegenstelling, helder-belichting fluorescerende vis kan haven of geïsoleerde T-ALL of gemengde bevolking van zowel GFPlo B-ALL en GFPHallo T-ALL cellen (Figuur 5). Een voorbeeld van gemengd alle, dat bevat verschillende B - en T-ALL, is hier weergegeven (Figuur 5). We geanalyseerd om te controleren de identiteit van GFPlo en GFPHallo cellen als B - en T-afstamming, respectievelijk, B - en T-cel-specifieke transcripties door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Onze resultaten tonen GFPlo cellen express hogere niveaus van B-cel afschriften en GFPHallo cellen express hogere niveaus van T cel genen (figuur 2D, figuur3D figuur4B en figuur 5B). Bovendien, uitdrukking van lck en GFP in GFPlo al overeen met de fluorescentie van GFP dim in vivo voor B-ALL (figuur 2D, figuur3D, figuur4B en figuur5B; qRT-PCR voorwaarden en inleidingen sequenties eerder beschreven door Borga et al.) 11.

Figure 1
Figuur 1: Verschillende fluorescentie patronen in transgene vis lck:eGFP . (A) Fluorescent microscopie beelden van rag2:hMYC, lck:eGFP vis met helder-belichting fluorescerende T-ALL (links) of vaag-TL B-ALL (rechts). T-ALL is zichtbaar met geringe blootstelling instellingen; B-ALL kan alleen gezien worden met behulp van hoge posities. (B) hoge belichtingsinstellingen vertonen zwakke serie fluorescentie (gele cirkels) wild-type lck:eGFP vis (links) en rag2:hMYC; lck:eGFP dubbel-transgene vis zonder alle (rechts). Schaal bars = 20 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Lymfocyt populaties in lck:eGFP zebrafish. Afbeeldingen boven tonen een 3 maanden oude WT, lck:eGFP vis met hoge belichtingsinstellingen of computer-verbetering (om visualisatie). Schaal bars = 20 mm. Flow cytometrische analyses van (A) zwezerik, beenmerg (B), en milt (C). Linker panelen tonen FSC (x-as) en SSC (y-as), met zwarte ovalen lymfocyt poorten aangeeft. Middelste panelen verbeelden fluorescentie gebaseerde gating met GFP (x-as) en PE (y-as). GFPhi (blauwe rechthoek), GFPlo (groene rechthoek) en GFP- (zwarte ovalen) populaties worden weergegeven. Rechts panelen weergeven histogrammen van GFPhi en GFPlo cellen Stippellijnen gating criteria in Midden panelen. (D) WT lck:eGFP thymi gesorteerd voor GFPhi (blauw) en GFPlo (groen). Expressie van B-cel gen (pax5), T (cd4) cel-specifieke genen)lck en GFP. Resultaten zijn genormaliseerd naar huishouden genen (β-actine en eef1a1l1) en weergegeven als vouw-change ± standaardafwijking (S.E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Lymfocyt populaties in vooraf leukemische rag2:hMYC; lck:eGFP zebrafish. Afbeeldingen boven tonen een 3-maand -oude rag2:hMYC; lck:eGFP vis met hoog en computer-enhanced belichtingen. Schaal bar = 20 mm. panelen van delen A-D zijn afgebeeld in Figuur 2identieke indeling. (D) uitdrukking van pax5, cd4en lck GFP in FACS-gezuiverd serie GFPlo (groen) GFPhi (blauw)-cel populaties van lck:eGFP vis. qRT-PCR-resultaten worden weergegeven als vouw-change ± S.E. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Analyse van B-ALL rag2:hMYC; lck:eGFP transgene vis. (A) boven: 6-maand-oude rag2:hMYC; lck:eGFP vis met B-ALL met hoge blootstelling instelling. Stroom cytometrische analyses van tumorcellen geïsoleerd uit vis lichaam zijn identieke indeling naar Figuur 2. (B) genexpressie in B-ALL GFPlo cellen (groene poort in figuur 4A), rag2:hMYC; lck:eGFP GFPhi thymocytes (blauwe poort in Figuur 3 bis) en T-ALL GFPHallo cellen (blauwe poort in figuur 5A ). Expressie van B (pax5, cd79a) en T (cd4) cel-specifieke genen, lcken GFP. Resultaten zijn genormaliseerd naar huishouden genen (β-actine en eef1a1l1) en weergegeven als vouw-change ± S.E. schaal bar = 20 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Analyse van gemengd alle rag2:hMYC; lck:eGFP transgene vis. (A) boven: 6 maand-oude rag2:hMYC; lck:eGFP vis met mixed-ALL met hoge blootstelling instelling. Stroom cytometrische analyses van tumorcellen geïsoleerd uit vis lichaam zijn identieke indeling naar Figuur 2. (B) GFPhi (blauw) en GFPlo (groen) FACS poorten. Expressie van B (pax5, cd79a) en T (cd4) cel-specifieke genen, lcken GFP. Resultaten zijn genormaliseerd naar huishouden genen (β-actine en eef1a1l1) en weergegeven als vouw-change ± S.E. schaal bar = 20 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij bieden een protocol om te isoleren van de B-cellen uit lck:eGFP transgene zebrafish, het toevoegen van deze tot andere D. rerio modellen met B-bloedlijn etiketten3,4en ontwikkeld. Enigszins verrassend, ging de identificatie van GFPlo B cellen in deze lijn onopgemerkt sinds de bijbehorende beschrijving in 2004. In het algemeen lck wordt beschouwd als T-cel-specifieke6, maar recente studies gevonden onverwachte lck expressie door natuurlijke killer en myeloïde cellen, zo goed als in de B-cellen zoals hier18,19. In overleg met onze ontdekking dat zebrafish B cellen GFPlo, pre-B, naïef, en oudere B express cellen bij de mens ook lage niveaus van LCK11,13.

Als gevolg van de verschillende niveaus van de GFP in B- en T-cellen van deze vissen kunnen cellen van beide geslachten nu geïsoleerd van deze lijn. Hoewel deze dieren klassiek gebruikt zijn voor het bestuderen van de ontwikkeling van de serie T-lymfocyten en tracking, we laten zien dat soortgelijke studies ook mogelijk met B-cellen zijn. Te dien einde identificeren we B cellen in zwezerik, beenmerg van de nier en milt, hier en in perifere bloed en elders in eerder werk11.

Herkennen van B-ALL in rag2:hMYC; lck:eGFP vis vereist een scherp oog, maar met de praktijk, is eenvoudig. Vervolgens kiezen welke methode moet worden gebruikt voor het zuiveren van alle cellen is van cruciaal belang. Hier presenteren we twee methoden: hele lichaam homogenisering en peritoneale wassen. Peritoneale wassen levert een veel lagere aantal totaal aantal cellen, maar een zeer hoog percentage van GFP+ cellen. Bijgevolg is weinig FACS tijd vereist, het minimaliseren van de kosten. Voor downstream toepassingen, waar de totale opbrengst minder belangrijk is (bijvoorbeeld qRT-PCR), dit is efficiënter. U kunt ook hele lichaam homogenisering resulteert in grotere eencellige suspensies met veel meer cellen, maar een lager percentage van cellen zullen GFP+. Dus, meer FACS tijd is vereist voor het verzamelen van hetzelfde aantal GFP+ cellen zoals met peritoneale wassen, maar miljoenen meer cellen gezuiverd kunnen worden. Voor downstream studies, waar hoge opbrengst belangrijk is (bijvoorbeeld Western blot), dit kan de compensatie van de extra kosten. Bovendien, bij alle onderzoeken vangt totale lichaam homogenisering de diversiteit van kankercellen aanwezig, meer nauwkeurig vertegenwoordigen tumor heterogeniteit. Hoewel niet vermeld in ons protocol, is het ook mogelijk om te ontleden enige GFP+ regio's / lichaamsorganen van vis met alles voor homogenisering door hakken in een petrischaal, dus dalende totale FACS tijd en kosten, verwant aan peritoneale Supermarket.

Serie GFP expressie in lck:eGFP vis toonde aan dat GFP detecteerbare zo spoedig 5 dpf6. Hier onze studies werden uitgevoerd in volwassen vis 3 maanden of ouder, en laten zien dat op deze leeftijd, B-cellen overvloedig in het merg van de nier en milt zijn, maar T-cellen zeldzaam zijn. Latere studies met vis van verschillende leeftijden zal worden vereist om te bepalen als T-cellen vaker op verschillende tijdstippen zijn. Ook op 3 maanden, T-cellen in de thymus zijn verrijkt, maar ook een aanzienlijk aantal serie B-cellen aanwezig zijn. Als deze lymfocyt bevolking variëren bij verschillende leeftijden is momenteel onbekend, maar algemeen, serie fluorescentie verdwijnt in lck:eGFP vis beginnen bij seksuele volwassenheid (~ 3 maanden), dus het is waarschijnlijk dat T cel aantallen afnemen met toenemende leeftijd, en B cellen kunnen ook. Evenzo, wanneer GFPlo B cellen koloniseren de zebravis zwezerik is momenteel niet bekend. Gebruik lck:eGFP vis, is het nu mogelijk om te controleren van serie B- en T cel ontwikkeling, toevloed, efflux en de specifieke kinetiek van deze gebeurtenissen. Dergelijke vragen zijn daarnaast ook relevant zijn voor andere anatomische sites waar B cellen zich bevinden, zoals de nieren, beenmerg, milt, bloed en darm (gegevens niet worden weergegeven).

Naast B-cel developmental studies vonden we onlangs B-ALL in lck:eGFP; rag2:hMYC dubbel-transgene vis11. Transgene rag2:hMYC stond bekend voor het opwekken van T-ALL10 maar B-ALL niet-herkende was gegaan. Als gevolg van de hoge doordringendheid van deze oncogen, beide typen van alle heersen in deze vis, en veel vis ontwikkelen eigenlijk zowel alle soorten gelijktijdig11. Aangezien B-ALL zijn GFPlo, terwijl T-ALL GFPHallo, toestaat variërend van GFP expressie dat deze twee entiteiten te worden geïsoleerd door FACS, zelfs wanneer die zich in hetzelfde dier (figuur 5A). Cruciaal, in zowel normale als maligne lymfocyten aantonen qRT-PCRresults dat GFPlo en GFPHallo cellen consequent komen overeen met op de B - en T-geslachten, respectievelijk (Figuur 2 en Figuur 3).

Het onbenutte potentieel van lck:eGFP vis werd centraal in dit werk, benadrukt het feit dat veel bestaande transgene regels waarschijnlijk nut buiten hun beoogde doel hebben. Hier presenteren we een nieuw protocol om te isoleren van de B- en T-cellen van D. rerio met transgene lck:eGFP, de deur openzetten voor nieuwe geneesmiddelen wegen over normale en kwaadaardige B-lymfocyten. De resultaten van deze studies zal ongetwijfeld opnieuw vitaliseren wat reeds een waardevolle bron aan de Haematopoiese, de lymphopoiesis, en de biologie van kanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

We zouden graag bedanken Megan Malone-Perez zebrafish ziekenverpleger, en de OUHSC stroom cytometry kern. Dit werk werd gesteund door subsidies van Hyundai Hope op wielen, het centrum van Oklahoma voor de vooruitgang van wetenschap en technologie (HRP-067), een pilot-project award van NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF houdt de E.L. & Thelma Gaylord begiftigd Chair in Pediatric hematologie-oncologie van het Children's Hospital Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 µm mesh Sefar Filter technology 7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap Falcon Corning Brand 352235
50 mL conical tube VWR international 525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope Nikon
Cytoflex Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 Sigma E-10521
FACSJazz BD Biosciences
Fetal bovine Serum Thermo Fisher 10437028
FlowJo v10.2 FlowJo, LLC
lck:eGFP See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software Nikon Version 4.13
Penicilin-Streptomycin Sigma P4333
Pestle micro-tube homogenizers Electron Microscopy Sciences 64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x Life Technologies 11835-030

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54, (6-7), 1127-1137 (2010).
  2. Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214, (12), 3519-3530 (2017).
  3. Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199, (5), 1706-1715 (2017).
  4. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, (8), e1-e11 (2013).
  5. Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177, (4), 2463-2476 (2006).
  6. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101, (19), 7369-7374 (2004).
  7. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, (4), 367-379 (2004).
  8. Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23, (10), 1825-1835 (2009).
  9. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30, (41), 4289-4296 (2011).
  10. Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208, (8), 1595-1603 (2011).
  11. Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. (2018).
  12. Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28, (15), 2529-2537 (2010).
  13. Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144, (2), 296-309 (2011).
  14. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39, (5), 759-775 (2011).
  15. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (2010).
  16. Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
  17. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4, (12), 1238-1246 (2003).
  18. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27, (3), 451-461 (2017).
  19. Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214, (10), 2875-2887 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics