एनेउप्लॉयडी के लिए प्रीमेंप्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग के लिए सेमीकंडक्टर अनुक्रमण

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Genetics

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Summary

यहाँ, हम कम टर्नअराउंड समय, कम लागत, और उच्च थ्रूपुट के लाभों के साथ एनिप्लॉयडी (पीजीटी-ए) के लिए आनुवंशिक परीक्षण के लिए एक अर्धचालक अनुक्रमण विधि पेश करते हैं।

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Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, Y. K. Y., Lui, W. T., Yeung, Q. S. Y., Kong, L., Xuan, L., Chung, J. P. W., Choy, K. W. Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy. J. Vis. Exp. (150), e59273, doi:10.3791/59273 (2019).

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Abstract

क्रोमोसोमल एनोभॉइडी, भ्रूण विकास गिरफ्तारी, प्रत्यारोपण विफलता, या गर्भावस्था के नुकसान के लिए अग्रणी मुख्य कारणों में से एक, मानव भ्रूण में अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है। एनोगुणिता (पीजीटी-ए) के लिए आनुवंशिक परीक्षण एक आनुवंशिक परीक्षण है जो भ्रूण की गुणसूत्र असामान्यताओं का पता लगाने के द्वारा प्रजनन परिणामों में काफी सुधार करता है। अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक उच्च थ्रूपुट और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है और पीजीटी-ए में नैदानिक प्रयोज्यता दिखाया गया है। यहाँ, हम भ्रूण में एउप्लॉयडी की स्क्रीनिंग के लिए एक तेजी से और कम लागत वाले अर्धचालक अनुक्रमण आधारित एनजीएस विधि प्रस्तुत करते हैं। कार्यप्रवाह का पहला चरण बायोप्सी भ्रूण नमूना के पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) है, जिसके बाद अनुक्रमण पुस्तकालय का निर्माण होता है, और बाद में अर्धचालक अनुक्रमण प्रणाली पर अनुक्रमण होता है। आम तौर पर, एक PGT-एक आवेदन के लिए, 24 नमूने लोड किया जा सकता है और प्रत्येक चिप पैदा करने पर अनुक्रम 60 -80 लाख 150 आधार जोड़े की एक औसत पढ़ने की लंबाई पर पढ़ता है. विधि टेम्पलेट प्रवर्धन और अनुक्रमण पुस्तकालय की समृद्धि के प्रदर्शन के लिए एक परिष्कृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, PGT-एक का पता लगाने reproduible, उच्च throughput, लागत कुशल, और timesaving बना रही है. इस अर्धचालक अनुक्रमक के चल रहे समय केवल 2 "4 घंटे है, 5 दिनों में रिपोर्ट जारी करने के लिए नमूने प्राप्त करने से बदलाव के समय को कम. इन सभी लाभों इस परख भ्रूण से गुणसूत्र anuploidies का पता लगाने के लिए एक आदर्श विधि बनाने के लिए और इस प्रकार, पीजीटी-ए में अपने व्यापक आवेदन की सुविधा.

Introduction

सामान्य गुणसूत्र प्रतिलिपि संख्या के साथ अच्छी गुणवत्ता व्यवहार्य भ्रूण का चयन (यूलॉयड) सहायता प्राप्त प्रजनन में हस्तांतरण के लिए गर्भावस्था के परिणामों में सुधार करने में मदद करता है. परंपरागत रूप से, अच्छी तरह से स्थापित रूपात्मक ग्रेडिंग प्रणाली व्यापक रूप से अपनी आसान उपलब्धता और गैर इनवेसिव प्रकृति के कारण भ्रूण मूल्यांकन के लिए प्रयोग किया जाता है। तथापि, यह दर्शाया गया है कि आकृतिक मूल्यांकन केवल भ्रूण की गुणवत्ता1 और प्रत्यारोपण क्षमता2के बारे में सीमित जानकारी प्रदान कर सकता है। इसका एक मूलभूत कारण भ्रूणों की गुणसूत्रीय संरचना का मूल्यांकन करने में असमर्थता है।

क्रोमोसोमल एनोभॉइडी (असामान्य प्रतिलिपि संख्या गुणसूत्रों की संख्या) भ्रूण विकास गिरफ्तारी, प्रत्यारोपण विफलता या गर्भावस्था के नुकसान के लिए अग्रणी मुख्य कारणों में से एक है। एनुगुणिता की घटना मानव भ्रूण ों में अच्छी तरह से प्रलेखित की गई है, जो ब्लास्टोसिस्ट्स5में क्लीवेज-स्टेज भ्रूण3,4 और 50% $60% में 60%$70% के लिए लेखांकन है। यह, कुछ हद तक, इन-विट्रो निषेचन (आईवीएफ) उपचार की गर्भावस्था दर में सुधार करने में बाधाओं में योगदान दिया है, जो लगभग 35% $40%6,7पर बनाए रखा गया है। इसलिए, हस्तांतरण के लिए सुगुणित भ्रूण का चयन गर्भावस्था के परिणामों में सुधार के लिए फायदेमंद माना जाता है। इस उद्देश्य के लिए, एनोगुणिता (पीजीटी-ए) के लिए आनुवंशिक परीक्षण को आनुवंशिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके भ्रूण व्यवहार्यता की जांच करने के लिए आगे विकसित किया गया है। पीजीटी-ए की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करने वाले यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षणों और सहगण अध्ययनों की संख्या बढ़ रही है। यह साबित हो गया है कि पीजीटी-ए के आवेदन से गर्भपात की दर कम हो जाती है और नैदानिक गर्भावस्था दर और प्रत्यारोपण दर8, चल रही गर्भावस्था दर और जीवित जन्म दर9में वृद्धि होती है।

ऐतिहासिक रूप से, पीजीटी-ए में विभिन्न तरीकों को लागू किया गया है, जैसे कि सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश), तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (सीजीएच), सरणी-सीजीएच, और एकल न्यूक्लिओटाइड बहुरूपता (एसएनपी)-माइक्रोरेरे में फ्लोरोसेंट। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि FISH द्वारा दरार चरण भ्रूण के लिए PGT-A परिणाम है कि खराब उन के साथ संगत blastcysts के अनुरूप गुणसूत्र स्क्रीनिंग (सीसीएस) द्वारा प्राप्त कर रहे हैं 59273array-CGH या का उपयोग कर परिणाम पैदावार एसएनपी-microarray5927310| इन विसंगतियों गुणसूत्र मोज़ेकवाद, FISH तकनीकी कलाकृतियों, या विकास11के दौरान गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों के भ्रूण आत्म सुधार के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि सरणी-आधारित पीजीटी-ए के लिए ब्लास्टोसिस्ट ट्रोफिक्टोडर (टीई) बायोप्सी का उपयोग करना जैसे सरणी-सीजीएच या एसएनपी-माइक्रोरे, भ्रूणों में गुणसूत्र असंतुलन की पहचान करने के लिए प्रभावी है10,12. हाल ही में, एकल सेल अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक उच्च थ्रूपुट और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है और पीजीटी-ए13,14,15में नैदानिक प्रयोज्यता दिखाया गया है , जो इसे एक वर्तमान में उपलब्ध तरीकों के लिए विकल्प का वादा.

यहाँ, हम मानव भ्रूण में anuploidy की जांच के लिए एक तेजी से, मजबूत, और कम लागत अर्धचालक अनुक्रमण आधारित NGS विधि प्रस्तुत करते हैं. कार्यप्रवाह का पहला चरण बायोप्सी भ्रूण नमूना के पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) है, एक एकल सेल WGA किट का उपयोग कर, अनुक्रमण पुस्तकालय के निर्माण के बाद, और अर्धचालक अनुक्रमण प्रणाली पर बाद अनुक्रमण.

डीएनए किनारा संश्लेषण के दौरान प्रत्येक deoxyribonucleoside ट्राइफॉस्फेट निगमन से जारी कर रहे हैं कि एच+ आयनों का पता लगाने के माध्यम से, प्रणाली रासायनिक संकेतों (पीएच परिवर्तन) अर्धचालक तत्वों द्वारा कब्जा कर लिया डिजिटल डेटा को निर्देशित करने के लिए स्थानान्तरण , जो आगे डीएनए अनुक्रम जानकारी में व्याख्या कर रहे हैं. महंगी ऑप्टिकल का पता लगाने और जटिल अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यकता को खत्म करने, इस सरल अनुक्रमण रसायन विज्ञान कुल अभिकर्मक लागत कम कर देता है और अनुक्रमण चल समय में shortens 2 $4 घंटे16. इससे भी महत्वपूर्ण बात, निर्माता के प्रदर्शन विनिर्देशों के आधार पर, अर्धचालक अनुक्रमण मंच अप करने के लिए उत्पन्न कर सकते हैं 15 जीबी अनुक्रमण डेटा (पुस्तकालय की गुणवत्ता पर निर्भर करता है) प्रति रन, जो अन्य seuencers में से कुछ की तुलना में काफी अधिक है केवल लगभग 3 "4 जीबी डेटा का उत्पादन (2 x 75 बीपी पढ़ने की लंबाई के साथ)17. पीजीटी-ए के नैदानिक अनुप्रयोगों में, इस मंच को 80 लाख तक पैदा चिप प्रति 24 नमूने प्राप्त कर सकते हैं पढ़ताहै 17 पढ़ता है और कम से कम एक लाख प्रत्येक नमूने के अद्वितीय पढ़ता है. पढ़ें गहराई सुनिश्चित कर सकते हैं कि प्रत्येक नमूना कम से कम 0.05x पूरे जीनोम कवरेज है. इस मंच के ऊपर लाभ यह एक आदर्श स्क्रीनिंग विधि बनाने के लिए और इस प्रकार, पीजीटी-ए18में अपने व्यापक अनुप्रयोगों की सुविधा.

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Protocol

हांगकांग के संयुक्त चीनी विश्वविद्यालय द्वारा नैतिक अनुमोदन प्रदान किया गया था-न्यू टेररियों पूर्व क्लस्टर नैदानिक अनुसंधान आचार समिति (संदर्भ संख्या: 2010.432). अनुसंधान लाइसेंस हांगकांग के मानव प्रजनन प्रौद्योगिकी पर परिषद द्वारा अनुमोदित किया गया था (नंबर R3004).

1. पूरे जीनोम प्रवर्धन

  1. प्रारंभ करने से पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक नमूने के लिए 135 डिग्री सेल्सियस (एक 20% अतिरिक्त के साथ) से कम नहीं है, चुंबकीय मोतियोंकीमात्रा की जांच करें। कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर चुंबकीय मोती रखें. प्रत्येक नमूने के लिए 70% इथेनॉल के 720 $L (एक 20% अतिरिक्त के साथ) तैयार करें। 105 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ढक्कन के साथ एक थर्मल चक्र (सामग्रीकीतालिका) से लैस।
    नोट: नव तैयार 70% इथेनॉल (सामग्री कीतालिका) 3 दिनों के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  2. नमूना तैयारी
    नोट: नियमित अभ्यास में, ब्लास्टोसिस्ट की 5 से 10 ट्रोफीक्टोडर कोशिकाओं को अभ्यास दिशानिर्देश19के अनुसार बायोप्सी किया जाता है।
    1. एक 0.2 एमएल पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) ट्यूब में 1x फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) के 2 डिग्री एल में बायोप्सी निलंबित करें।
    2. बूंदों को इकट्ठा करने के लिए 3 एस के लिए एक मिनी सेंट्रीफ्यूज पर ट्यूब को संक्षेप में स्पिन करें।
  3. सेल lysis और निष्कर्षण
    1. सेल निष्कर्षण बफर (सामग्री की तालिका) और निष्कर्षण एंजाइम कमजोर पड़ने बफर ( सामग्री कीतालिका)बर्फ पर, भंवर और संक्षेप में उपयोग करने से पहले 3 s के लिए एक मिनी सेंट्रीफ्यूज पर स्पिन।
    2. चरण 1.2.2 से प्रत्येक ट्यूब के लिए सेल निष्कर्षण बफर के 3 डिग्री एल जोड़ें।
    3. निष्कर्षण एंजाइम कमजोर पड़ने बफर और 0ण्2 एल सेल निष्कर्षण एंजाइम (सामग्री कीतालिका) के 4.8 डिग्री सेल्सियस जोड़कर प्रत्येक नमूने के लिए 5 डिग्री एल सेल lysis मास्टर मिश्रण तैयार करें। चरण 1.3.2 से प्रत्येक ट्यूब में अच्छी तरह से और एलिकोट मिलाएं। ट्यूब को धीरे से पलटें और संक्षेप में 3 s के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर स्पिन करें।
      नोट: युक्तियाँ मास्टर मिश्रण जोड़ने जब सेल नमूने युक्त तरल स्पर्श नहीं करना चाहिए.
    4. गर्म ढक्कन के साथ थर्मल साइकिलर में चरण 1.3.3 से ट्यूब को इनक्यूबेट करें। निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ कार्यक्रम चलाएँ: 75 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, 4 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  4. प्रीम्पलीकरण
    1. बर्फ, भंवर पर preamplification बफर (सामग्री कीतालिका) thaw और उपयोग करने से पहले 3 s के लिए एक मिनी centrifuge पर संक्षेप में स्पिन.
    2. प्रत्येक नमूने के लिए एक 5 डिग्री एल preamplification मास्टर मिश्रण preamplification बफर के 4.8 डिग्री सेल्सियस और preamplification एंजाइम के 0.2 डिग्री एल (सामग्रीकीतालिका) जोड़कर तैयार करें। चरण 1.3.4 से प्रत्येक ट्यूब में अच्छी तरह से और एलिकोट मिलाएं। ट्यूब को धीरे से पलटें और संक्षेप में 3 s के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर स्पिन करें।
      नोट: युक्तियाँ मास्टर मिश्रण जोड़ने जब डीएनए नमूने युक्त तरल स्पर्श नहीं करना चाहिए.
    3. गर्म ढक्कन के साथ थर्मल साइकिलर में ट्यूब इनक्यूबेट करें। बह सेटिंग्स के साथ कार्यक्रम चलाने के लिए: 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस के लिए 12 चक्र, 15 डिग्री सेल्सियस पर 50 एस, 25 डिग्री सेल्सियस पर 40 एस, 35 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, 65 डिग्री सेल्सियस पर 40 एस, 75 डिग्री सेल्सियस पर 40 एस; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  5. प्रवर्धन
    1. बर्फ, भंवर पर प्रवर्धन बफर (सामग्रीकीतालिका) को थपथपाएं और उपयोग करने से पहले 3 एस के लिए एक मिनी अपकेंद्रण पर संक्षेप में स्पिन करें।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए एक 60 डिग्री सेल्सियस प्रवर्धन मास्टर मिश्रण तैयार करके प्रवर्धन बफर के 25 डिग्री सेल्सियस, प्रवर्धन एंजाइम के 0.8 डिग्री सेल्सियस (सामग्री की मेज), और WGA के लिए nuclease मुक्त पानी के 34.2 $L ( सामग्री कीमेज) के लिए . चरण 1.4.3 से प्रत्येक ट्यूब में अच्छी तरह से और एलिकोट मिलाएं। ट्यूब को धीरे से पलटें और संक्षेप में 3 s के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर स्पिन करें।
    3. गर्म ढक्कन के साथ थर्मल साइकिलर में ट्यूब इनक्यूबेट करें। निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ कार्यक्रम चलाएँ: 2 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस पर; 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 s के लिए 14 चक्र, 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, 75 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
  6. की शुद्धि डब्ल्यूजीए उत्पाद
    1. प्रत्येक WGA उत्पाद कदम 1.5.3 से नए 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरण. प्रत्येक ट्यूब में चुंबकीय मोती के 112.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. भंवर और 5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
      नोट: पूरी तरह से उपयोग करने से पहले चुंबकीय मोती मिश्रण.
    2. जब तक सुपरनेट स्पष्ट न हो तब तक ट्यूबको चुंबकीय स्टैंड (सामग्री की सारणी) पर 3 मिनट के लिए रखें। मनकों को परेशान किए बिना सभी महादलितों को त्याग दें।
    3. प्रत्येक ट्यूब के लिए 70% इथेनॉल के 300 $L जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब 180 डिग्री घुमाएँ मोती इथेनॉल के माध्यम से चलाने के लिए और मूल स्थिति में वापस बारी बारी से जाने के लिए। मोती परेशान किए बिना बस गए हैं के बाद सभी supernatant छोड़ दें। इस चरण को एक बार दोहराएँ.
      नोट: ट्यूब क्षैतिज घूर्णन करते समय चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें।
    4. 3 s. के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर प्रत्येक ट्यूब स्पिन. अवशिष्ट supernatant स्पष्ट है जब तक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब रखें. मनकों को परेशान किए बिना सभी अवशिष्ट महादलितको त्याग दें। एयर लगभग 3 मिनट के लिए आरटी पर मोती सूखी.
    5. चुंबकीय स्टैंड से ट्यूब निकालें और कम Tris-EDTA (टीई) बफर (सामग्री कीतालिका)के 35 डिग्री एल जोड़कर सूखे मोती resuspend. 5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
    6. 3 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस जब तक supernatant स्पष्ट है. मोती परेशान किए बिना नए 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए eluted डीएनए युक्त सभी supernatant स्थानांतरण.

2. WGA उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण

  1. प्रारंभिक सामग्री के रूप में WGA उत्पाद के 1 $L का उपयोग कर निर्माता के मैनुअल के अनुसार एक fluorometer परख (सामग्री कीतालिका) द्वारा चरण 1.6.6 से प्रत्येक शुद्ध WGA उत्पाद की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: WGA उत्पाद की स्वीकृत एकाग्रता है $ 10 एनजी / इस थ्रेशोल्ड के नीचे किसी भी उत्पाद को अगले चरणों पर आगे बढ़ने के लिए अनुशंसित नहीं है।

3. WGA उत्पादों के विखंडन

  1. शुरू करने से पहले, एक सूखी ब्लॉक हीटर को 37 डिग्री सेल्सियस से पहले गरम करें। प्रत्येक नमूने के लिए 0.5 M EDTA के 6 $L (एक 20% अतिरिक्त के साथ) तैयार करें। एकाग्रता के आधार पर, कदम 1.6.6 में नए 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों के लिए प्रत्येक शुद्ध WGA उत्पाद से डीएनए के alicot 300 एनजी और प्रत्येक ट्यूब के लिए nuclease मुक्त पानी के साथ 16 डिग्री सेल्सियस के लिए मात्रा लाने के लिए।
  2. फ़्रेग्मेंटेशन
    1. प्रत्येक नमूने के लिए 4 डिग्री एल डबल फंसे डीएनए (डीएसडीए) विखंडन अभिक्रिया मिश्रण तैयार करें, जिसमें 2 डिग्री सेल्सियस डीडीएनए विखंडन अभिक्रिया बफर (सामग्री की तालिका) और 2 जेडएल डी डीएनए विखंडन एंजाइमों ( सामग्री कीसारणी) को जोड़कर । चरण 3.1 से प्रत्येक ट्यूब में अच्छी तरह से और एलिकोट मिलाएं। भंवर और संक्षेप में 3 s के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर स्पिन. गर्म ढक्कन के साथ एक थर्मल साइकिल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    2. प्रत्येक ट्यूब के लिए तुरंत 0.5 M EDTA के 5 डिग्री एल जोड़ें. भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिक्स और संक्षेप में 3 एस के लिए एक मिनी centrifuge पर स्पिन.
  3. शुद्धि और पुन: निलंबन
    1. कदम 3.2.2 से नए 1.5 एमएल ट्यूबों में प्रत्येक उत्पाद स्थानांतरण. प्रत्येक ट्यूब के लिए चुंबकीय मोती के 37.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. 5 मिनट के लिए आरटी में वर्टेक्सिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स करें।
    2. उत्पादों को शुद्ध करें जैसा कि चरण 1.6.2 से 1.6.4 चरण के लिए वर्णित है।
    3. प्रत्येक शुद्ध उत्पाद के रूप में कदम 1.6.5 और 1.6.6 में वर्णित कम टीई बफर के 32 $L जोड़कर.

4. पुस्तकालय निर्माण

  1. ब्लंट- एन डी epairment, आकार चयन और शुद्धि
    1. nuclease मुक्त पानी के 9.5 डिग्री सेल्सियस जोड़कर प्रत्येक नमूने के लिए एक 20 डिग्री एल कुंद अंत मरम्मत मिश्रण तैयार करें, 5x अंत मरम्मत बफर के 10 डिग्री एल (चरण 3.3 से सामग्री ट्यूबकीतालिका. भंवर और संक्षेप में 3 s के लिए एक मिनी centrifuge पर स्पिन.
    2. चरण 4.1.1 से प्रत्येक ट्यूब के लिए चुंबकीय मोती के 50 डिग्री एल जोड़ें. भंवर और 5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
      नोट: पूरी तरह से उपयोग करने से पहले चुंबकीय मोती मिश्रण.
    3. सुपरनेंट स्पष्ट है जब तक 3 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर प्रत्येक ट्यूब प्लेस. सभी supernatant नए 1.5 एमएल ट्यूबों जहां 25 डिग्री एल चुंबकीय मोती प्रत्येक के लिए जोड़ रहे हैं करने के लिए स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए आरटी में स्थानांतरित supernatant और इनक्यूबेट के साथ ट्यूब ों भंवर.
    4. इनक्यूबेट्ड ट्यूबों में उत्पादों को शुद्ध करें जैसा कि चरण 1.6.2 से 1.6.4 कदम तक वर्णित है।
    5. प्रत्येक शुद्ध उत्पाद के रूप में कदम 1.6.5 और 1.6.6 में वर्णित कम टीई बफर के 32 $L जोड़कर.
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है; इस कदम से शुद्ध डीएनए कोई अधिक से अधिक 24 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
  2. अनुकूलक एल इगेशन और पी मूत्रीकरण
    1. प्रत्येक नमूने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस न्यूक्लेस-मुक्त जल, 10x लिगेस बफर (सामग्री कीतालिका) के 5 डिग्री एल , पी 1 एडाप्टर के 1 डिग्री एल (सामग्री की तालिका) और डीएनए लिगाज़ ( सामग्री कीतालिका) जोड़कर प्रत्येक नमूने के लिए 17 डिग्री एल एडाप्टर लिगेशन मिश्रण तैयार करें। 5 s के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिक्स और 15 s के लिए एक मिनी centrifuge पर स्पिन, और कदम 4.1.5 से प्रत्येक ट्यूब में alicot.
    2. प्रत्येक ट्यूब में प्रतिदर्श पत्रक के अनुसार 1 $L एडेप्टर (सामग्री की तालिका) जोड़ें ( पूरकफाइल: एडाप्टर लिगेशन के लिए नमूना शीट) के अनुसार प्रत्येक ट्यूब में . भंवर और संक्षेप में 3 s. के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर स्पिन 20 मिनट के लिए आरटी (20 डिग्री 25 डिग्री सेल्सियस) पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    3. चरण 4ण्2-2 से प्रत्येक नली में चुंबकीय मनकों का 75 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 5 मिनट के लिए आरटी में वर्टेक्सिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स करें। फिर, 1.6.4 चरण से वर्णित उत्पादों को शुद्ध करें।
    4. प्रत्येक शुद्ध उत्पाद के रूप में कदम 1.6.5 और 1.6.6 में वर्णित के रूप में कम टीई बफर के 15 $L जोड़कर. नई 0.2 एमएल 8-ट्यूब स्ट्रिप्स के लिए eluted डीएनए युक्त सभी supernatant स्थानांतरण।
      नोट: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है; इस कदम से शुद्ध डीएनए कोई अधिक से अधिक 24 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।
  3. प्रवर्धन और शुद्धि
    1. प्रत्येक नमूने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस प्रवर्धन मास्टर मिश्रण तैयार करें, जिसमें सुपर मिक्स (सामग्री की तालिका) की 47.5 डिग्री सेल्सियस और प्राइमर मिश्रण का 2.5 डिग्री सेल्सियस ( सामग्री कीसारणी) जोड़कर मिश्रण किया जा सकता है । भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिक्स और संक्षेप में एक मिनी centrifuge पर स्पिन, और कदम 4.2.4 से 0.2 एमएल 8 ट्यूब स्ट्रिप्स में alicot.
    2. 30 s के लिए स्ट्रिप्स भंवर और संक्षेप में 3 s के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर स्पिन. गर्म ढक्कन के साथ थर्मल साइकिल में स्ट्रिप्स इनक्यूबेट करें। निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ कार्यक्रम चलाएँ: 72 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट; 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस के लिए 10 चक्र, 62 डिग्री सेल्सियस पर 15 एस, 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट; 70 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    3. प्रत्येक उत्पाद को चरण 4.3.2 से नए 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। प्रत्येक ट्यूब के लिए चुंबकीय मोती के 97.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. 5 मिनट के लिए आर टी पर भंवर और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स करें।
    4. उत्पादों को शुद्ध करें जैसा कि चरण 1.6.2 से 1.6.4 चरण के लिए वर्णित है।
    5. प्रत्येक शुद्ध उत्पाद के रूप में कदम 1.6.5 और 1.6.6 में वर्णित कम टीई बफर के 25 $L जोड़कर.

5. गुणवत्ता नियंत्रण और डीएनए पुस्तकालय के कमजोर पड़ने

  1. शुरुआतसामग्री के रूप में डीएनए लाइब्रेरी के 2 डिग्री एल का उपयोग कर के निर्माता के मैनुअल के अनुसार fluorometer परख द्वारा चरण 4.3.5 से प्रत्येक तैयार डीएनए पुस्तकालय की मात्रा निर्धारित करें।
  2. डीएनए पुस्तकालय की स्वीकृत सांद्रता है - 0.5 एनजी/जेडएल और धनात्मक नियंत्रण (सामग्री की सारणी) की है - 15 एनजी/जेडएल है। यदि धनात्मक नियंत्रण की सांद्रता 15 एनजी/जेडएल से बहुत अधिक भिन्न होती है, तो धनात्मक नियंत्रण के परिमाणीकरण को तब तक दोहराएँ जब तक सांद्रता 15 एनजी/जेडएल के निकट न हो जाए। यदि पुस्तकालय की सांद्रता 0.5 एनजी/जेडएल से कम है, तो विखंडन (खंड 3) से पुनः आरंभ करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सकारात्मक नियंत्रण की एकाग्रता डीएनए पुस्तकालय मात्रा निर्धारित करने से पहले स्वीकार किए जाते हैं मान तक पहुँच जाता है।
  3. न्यूक्लेस-मुक्त पानी जोड़कर प्रत्येक पुस्तकालय को 100 pmol तक विमुक्त करें। न्यूक्लेस-मुक्त जल के एन जेडएल में पुस्तकालय का 1 $L जोड़ें; नीचे समीकरण का उपयोग कर n की गणना:
    Equation
    जहां क्यू fluorometer परख द्वारा मापा प्रत्येक पुस्तकालय की एकाग्रता है और सी fluorometer परख द्वारा मापा सकारात्मक नियंत्रण की एकाग्रता है.

6. अनुक्रमण

  1. शुरू करने से पहले, प्रत्येक नमूने के लिए 1 एम NaOH के 48 $L (एक 20% अतिरिक्त के साथ) और एक nuclease मुक्त 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करते हैं. मास्टर मिश्रण पीसीआर बफर (सामग्रीकी तालिका) (2000 डिग्री एल मात्रा में) RT. क्षेत्र कणों ( सामग्रीकी तालिका) को आरटी में लाएँ।
  2. लाइब्रेरी पूलिंग
    1. भंवर कदम से प्रत्येक पतला पुस्तकालय 5.3 और संक्षेप में 3 s हर बार के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर 4x स्पिन. nuclease मुक्त 1.5 एमएल ट्यूब में पूल करने के लिए प्रत्येक पुस्तकालय के 5 डिग्री एल ले लो। भंवर मिश्रित पुस्तकालय और संक्षेप में 3 एस के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर स्पिन.
  3. पायस प्रणाली का उपयोग कर पायस पीसीआर
    1. 2 नई वसूली ट्यूबों ( सामग्री की तालिका ) के लिए तोड़ने समाधानके150 $L जोड़ें. नई वसूली ट्यूब, वसूली रूटर और प्रवर्धन प्लेट स्थापित करें।
    2. तेल की बोतल (सामग्रीकी तालिका) 3 बार उलटा करके मिक्स करें। सुनिश्चित करें कि तेल और वसूली समाधान (सामग्री की तालिका) दोनों कम से कम 2/
    3. भंवर मास्टर मिश्रण पीसीआर बफर के लिए 30 s और संक्षेप में 3 s. के लिए एक मिनी केन्द्रापसारक पर स्पिन क्षेत्र कणों और 1 मिनट के लिए कदम 6.2.1 से मिश्रित पुस्तकालय और संक्षेप में 3 s के लिए एक मिनी centrifuge पर स्पिन.
    4. न्यूक्लेस-मुक्त जल के 172 डिग्री सेल्सियस, 8 डिग्री सेल्सियस मिश्रित पुस्तकालय को चरण 6ण्3-3 से, 120 डिग्री सेल्सियस एंजाइम मिश्रण (सामग्रीकीतालिका) और 2000 डिग्री एल मास्टर मिश्रण पीसीआर बफर वाली ट्यूब में क्षेत्र कणों के 100एल को जोड़कर 2400 डिग्री सेल्सियस लिगिंग मिश्रण तैयार कीजिए।
    5. एक पिपेट को 800 $ल पर सेट करें। नमूना पोर्ट के माध्यम से प्रतिक्रिया फिल्टर (सामग्रीकीसारणी) के चरण 6ण्3-4 से लिगेशन मिश्रण को लोड करें। प्रतिक्रिया फिल्टर करने के लिए प्रतिक्रिया तेल के 200 डिग्री एल जोड़ने के लिए एक 1000P पिपेट का प्रयोग करें।
    6. कार्यक्रम Proton का चयन करें: आयन पीआई हाय-क्यू OT2 200किट, और फिर, डिवाइस मॉनिटर पर दिए गए निर्देशों का पालन करके सही ढंग से स्थापित किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए असिस्टेड बटन का चयन करें। उसके बाद, प्रोग्राम प्रारंभ करने के लिए अगला क्लिक करें।
  4. एक स्वत: संवर्धन प्रणाली द्वारा संवर्धन
    1. पायस PCR प्रोग्राम पूरा होने पर, अगलाक्लिक करें, और उसके बाद 10 मिनट के लिए स्पिन करने के लिए अंतिम स्पिन क्लिक करें। ओपन लीडपर क्लिक करने के बाद 2 वसूली ट्यूब बाहर ले लो .
    2. 2 वसूली ट्यूबों से supernatant छोड़ ें जब तक 100 $L प्रत्येक ट्यूब में रहता है, और तदनुसार लेबल. घोल को अच्छी तरह मिलाएं और एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. प्रत्येक वसूली ट्यूब के लिए nuclease मुक्त पानी के 200 $L जोड़ें, ऊपर और नीचे कई बार pipeting द्वारा धोने, और चरण 6.4.2 में 1.5 एमएल ट्यूब के लिए सभी समाधान हस्तांतरण. धोने के कदम को एक बार दोहराएँ.
    4. वसूली ट्यूबों में से एक के लिए nuclease मुक्त पानी के 200 $L जोड़ें और ऊपर और नीचे कई बार पाइपिंग द्वारा धो. अन्य वसूली ट्यूब के लिए सभी समाधान स्थानांतरण और ऊपर और नीचे कई बार pipeting द्वारा धोने. उसके बाद, चरण 6.4.3 से एक ही 1.5 एमएल ट्यूब के लिए सभी समाधान स्थानांतरित. भंवर 30 s के लिए 1.5 एमएल ट्यूब और 15,500 x gपर 8 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज .
      नोट: इस चरण में पायस PCR उत्पाद के अंतिम कुल मात्रा लगभग होना चाहिए 1200 $L.
    5. ट्यूब में supernatant छोड़ें और पायस पीसीआर उत्पाद के 20 डिग्री सेल्सियस रखें। ट्यूब में 80 डिग्री सेल्सियस के पुन:निलंबन विलयन (सामग्रीसारणी)को जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिक्स.
    6. प्रत्येक चिप के लिए 320 डिग्री सेल्सियस गलन-बंद समाधान तैयार करें, जिसमें पॉलीथीन ग्लाइकोल श्रोतीय मोनोलेरेट विलयन (सामग्रीकीसारणी) और 1 एम नाओह का 40 डिग्री सेल्सियस जोड़कर घोल तैयार करें।
      नोट: 1 एम NaOH 4 डिग्री सेल्सियस या ताजा तैयार पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। उपयोग करने से पहले भंवर.
    7. 30 s के लिए C1 मोती (सामग्री की तालिका) युक्त ट्यूब भंवर. एक नया 1.5 एमएल ट्यूब के लिए C1 मोती के 100 $L ले लो. 1.5 एमएल ट्यूब को आरटी में 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें। मोती के बिना ही सभी सुपरनेंट को छोड़ दें।
    8. 1 एमएल धोने के घोल C1 (सामग्री की तालिका) को चरण 6ण्4ण्7 से ट्यूब में जोड़ें। 30 एस के लिए भंवर ट्यूब को आरटी में 2 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें। मोती के बिना मोतियों को परेशान किए बिना सभी सुपरनेटेंट को छोड़ दें। मनका पर कब्जा समाधान (सामग्री की तालिका) के130 डिग्री एल जोड़कर मोती को पुन: निलंबित करें।
    9. समृद्धि प्रणाली (ES) स्थापना
      1. नमूना लोड (100 $L पायस पीसीआर उत्पाद) चरण 6.4.5 से, धोया मोती (130 $L) चरण से 6.4.8, ES धोने समाधान (300 $L) (सामग्री कीतालिका), और पिघल बंद समाधान (300 $L) कदम से 6.4.6 8 ट्यूब पट्टी में. लेआउट आदेश है: नमूना (ट्यूब 1), धोया मोती (ट्यूब 2), ES धोने समाधान (ट्यूब 3, 4, 5), और पिघल बंद समाधान (ट्यूब 7). ट्यूब 6 और 8 खाली रखें.
      2. ES पर चरण 6.4.9.1 से 8-ट्यूब पट्टी रखें। एक pippette टिप और एक नया 0.2 एमएल ट्यूब स्थापित करें और कार्यक्रम शुरू करते हैं.
        नोट: सुनिश्चित करें कि पाइपिंग सामान्य काम करता है।
    10. संवर्धन पूरा होने के बाद क्षेत्र के कणों को धो लें।
      1. सेंट्रीफ्यूज 0.2 एमएल ट्यूब चरण 6.4.9.2 से 5 मिनट के लिए 15,500 x gपर । सुपरनेंट को त्याग ें और संवर्धन उत्पाद के 10 डिग्री सेल्सियस रखें। ट्यूब में न्यूक्लीज-मुक्त जल का 200 डिग्री सेल्सियस मिलाइए। भंवर द्वारा मिक्स.
      2. सेंट्रीफ्यूज 0.2 एमएल ट्यूब से 5 मिनट के लिए 15,500 x gपर . सुपरनेंट को त्याग ें और संवर्धन उत्पाद के 10 डिग्री सेल्सियस रखें। ट्यूब में 90 डिग्री सेल्सियस न्यूक्लीज-मुक्त जल जोड़ें। भंवर द्वारा मिक्स.
  5. टेम्पलेट तैयारी
    1. सकारात्मक नियंत्रण भंवर और संक्षेप में स्पिन. 100 $L टेम्पलेट (चरण 6.4.10.2) से संवर्धन उत्पाद) में धनात्मक नियंत्रण का 5 $L जोड़ें. भंवर और अपकेंद्रण 5 मिनट के लिए 15,500 x ग्रामपर | सुपरनेंट को छोड़ दें और टेम्पलेट के 10 डिग्री सेल्सियस रखें।
    2. अनुक्रमण प्राइमर का 20 डिग्री सेल्सियस (सामग्री की तालिका) और चरण 6ण्5-1 से टेम्पलेट ट्यूब में अनीलन बफर ( सामग्री कीसारणी) का 15 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। ट्यूब भंवर और संक्षेप में 3 s के लिए एक मिनी अपकेंद्रित्र पर स्पिन.
    3. गर्म ढक्कन के साथ थर्मल साइकिलर में चरण 6.5.2 से ट्यूब को इनक्यूबेट करें। निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ कार्यक्रम चलाएँ: 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    4. चरण 6ण्5ण्3 से ट्यूब में बफर (सामग्री कीसारणी) को लोड करने का 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिक्स.
  6. अनुक्रमक प्रारंभिकीकरण
    1. नाइट्रोजन गैस के टैंक दबाव की जाँच करें (कुल दबाव - 500 साई, उत्पादन दबाव - 10 साई, इष्टतम 20-30 साई). ऊपर-ऊपर 100 एमएल deionized पानी (18.2 एमजेड) C1 और C2 ट्यूबों के लिए (सामग्री कीतालिका) और उन्हें अनुक्रमक पर इसी C1 और C2 पदों के लिए स्थापित करें।
    2. W1 (32 $ल 1 M NaOH) और W3 (40 डिग्री 50 एमएल का W3 बफर [सामग्री की तालिका]) समाधान तैयार करें। 1920 एमएल डियॉनाइज्ड जल (18.2 उ]), डब्लू 2 बफर की एक पूरी बोतल (सामग्रीकी सारणी) और 1 उ नाह की 8 डिग्री 12 डिग्री सेल्सियस जोड़कर तथा मिश्रण करने के लिए 4 डिग्री 8 बार प्रतितोषित करके W2 विलयन तैयार कीजिए।
      नोट: क्योंकि पानी की गुणवत्ता भूवैज्ञानिक रूप से भिन्न होता है, की मात्रा समायोजित 1 M NaOH की जरूरत के रूप में. W2 का प्रारंभिक pH है 5.9 "6.1, और समायोजन के बाद इष्टतम सीमा है 7.4 "7.6. बदलें और नए अभिकर्मक ट्यूब स्थापित करें और धोने के लिए हाल ही में इस्तेमाल किया चिप का उपयोग करें।
    3. अनुक्रमण पूरक किट से 4 नए खाली ट्यूब तैयार करें (सामग्री की तालिका) . 4 ट्यूबों को dGTP, dCTP, dATP, और dTTP के रूप में लेबल करें, और संबंधित ट्यूब के लिए dGTP, dCTP, dATP, या dTTP (सामग्री कीतालिका) के 70 $ एल जोड़ें (यानी, 70 डिग्री एल dGTP dGTP, आदि के रूप में लेबल ट्यूब के लिए). उपयोग करने से पहले ट्यूब ों को भंवर करें। ट्यूबों को अनुक्रमक पर निर्दिष्ट संगत स्थितियों में स्थापित करें (सामग्री की सारणी)।
  7. चिप धोने
    1. चिप (सामग्री कीतालिका) को एक बार चिप के लोडिंग कुएं में आइसोप्रोपेनोल के 100 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन लगाकर धो लें। बाहर निकाले गए तरल को विपरीत कुएं से निकालें।
    2. चिप के लोडिंग कुएं में 100 डिग्री सेल्सियस न्यूक्लीज-मुक्त जल का इंजेक्शन लगाकर दो बार चिप को धो लें। बाहर निकाले गए तरल को विपरीत कुएं से निकालें।
    3. चिप के लोडिंग कुएं में 0ण्1 एम नाओह के 100 डिग्री सेल्सियस का इंजेक्शन लगाकर एक बार चिप को धो लें। बाहर निकाले गए तरल को विपरीत कुएं से निकालें। 1 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
    4. चिप के लोडिंग कुएं में 100 डिग्री सेल्सियस न्यूक्लीज-मुक्त जल का इंजेक्शन लगाकर एक बार चिप को धो लें। बाहर निकाले गए तरल को विपरीत कुएं से निकालें।
    5. चिप के लोडिंग कुएं में आइसोप्रोपेनोल के 100 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन लगाकर दो बार चिप को धो लें। बाहर निकाले गए तरल को विपरीत कुएं से निकालें। चिप पर नाइट्रोजन उड़ाने से सूखी. प्रकाश से दूर रखें।
  8. नमूना लोडिंग और अनुक्रमण
    1. ऊपर और नीचे pipeting द्वारा चरण 6.5.4 से 55 डिग्री एल नमूना मिक्स और चिप की अच्छी तरह से लोड हो रहा है करने के लिए नमूना लोड.
      नोट: Pippette टिप और 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब इस चरण में इस्तेमाल रखें.
    2. चिप मिनी सेंट्रीफ्यूज (सामग्री की तालिका) पर चिप प्लेस जब
    3. अनीलन बफर और फ्लशिंग विलयन के लिए दो नए 1.5 एमएल ट्यूब तैयार कीजिए। अनीलन बफर के 500 डिग्री सेल्सियस और न्यूक्लेस-मुक्त जल के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़कर 50% अनीलन बफर तैयार की जा रही है। फ्लशिंग समाधान को अनीलन बफर के 500 डिग्री सेल्सियस और 100 % 2-प्रोपेनोल का 500 डिग्री सेल्सियस जोड़कर तैयार करें।
    4. दो नए 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें और दोनों ट्यूबों में 50% अनीलन बफर और फोमिंग विलयन (सामग्री की तालिका) के 49 डिग्री एल को मिलाकर फोमिंग मिश्रण तैयार करें।
    5. एक पिपेट को 100 $L पर सेट करें। कदम 6.8.4 से दो ट्यूबों में से एक से फोमिंग मिश्रण में हवा को पाइप करके बुलबुले बनाएं। बुलबुले के 120 डिग्री एल बनाओ और कोई बकाया दिखाई बुलबुले देखा जा सकता है जब तक pipeting रहते हैं। लोड हो रहा है अच्छी तरह से में बुलबुले के 120 $L लोड.
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोई उत्कृष्ट दृश्य बुलबुले हैं। अन्यथा, इसे शुरू करें।
    6. पाइपिंग द्वारा लोडिंग अच्छी तरह से करने के लिए चरण 6.8.5 से बाहर निकलने से अत्यधिक निष्कासित तरल स्थानांतरण। पिपेट बुलबुले मत करो। चिप मिनी सेंट्रीफ्यूज पर 30 एस के लिए चिप को सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. कदम 6.8.4 से foaming मिश्रण युक्त दूसरी ट्यूब का उपयोग करके कदम 6.8.5 दोहराएँ.
    8. चरण 6.8.1 में रखी 0.2 एमएल ट्यूब में 50% अनीलन बफर का 55 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। ऊपर और नीचे pippette करने के लिए कदम 6.8.1 में रखा पिपेट टिप का प्रयोग करें। लोडिंग के लिए सभी 55 डिग्री एल annealing बफर अच्छी तरह से लोड लोड. निर्दिष्ट चिप मिनी सेंट्रीफ्यूज पर 30 s के लिए चिप centrifuge.
    9. अच्छी तरह से लोड हो रहा है चिप में फ्लशिंग समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस लोड और बाहर निकलने के अच्छी तरह से से निष्कासित तरल त्याग दें। इस लोडिंग चरण को एक बार दोहराएँ.
      नोट: अगर चिप में बुलबुले हैं, तो बड़े बुलबुले से छोटे बुलबुले को निष्कासित करें और समाधान फ्लश करके फ्लश करें। यह फ्लशिंग समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस को पाइप द्वारा और फ्लशिंग समाधान के नीचे हवा के 5 डिग्री एल को छोड़कर प्राप्त किया जा सकता है। इसलिए, जब चिप में 105 डिग्री सेल्सियस पाइपिंग, हवा एक बड़ा बुलबुला है कि छोटे बुलबुले निष्कासित कर सकते हैं फार्म का होगा, और फिर, बड़ा बुलबुला निम्नलिखित फ्लशिंग समाधान द्वारा निष्कासित किया जा सकता है.
    10. अच्छी तरह से लोड हो रहा है चिप में 50% annealing बफर के 100 डिग्री एल लोड करें। कुल 3 बार के लिए इस लोडिंग चरण को दोहराएँ.
    11. अनुक्रमण एंजाइम के 6 डिग्री एल को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में 50% अनीलन बफर के 60 डिग्री एल में जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मिक्स. इस मिश्रित विलयन का 65 डिग्री सेल्सियस अच्छी तरह से लोड हो रहा है। पिपेट धीरे धीरे फोमिंग से बचने के लिए।
    12. चिप को प्रकाश से दूर रखें और आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    13. ऊष्मायन के बाद, तुरंत चिप को अनुक्रमक पर लोड करें और अनुक्रमण प्रारंभ करने के लिए स्क्रीन पर अनुक्रमण रन प्रारंभ करें क्लिक करें।
      नोट: अनुक्रमण कच्चे डेटा और गुणवत्ता नियंत्रण फ़ाइलों डेटा विश्लेषण के लिए कंपनी के लिए स्वचालित रूप से अपलोड किया जाएगा.

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Representative Results

इस संशोधित प्रोटोकॉल के आधार पर, अर्धचालक अनुक्रमण मंच पहली बार के लिए था, PGT-A के लिए आवेदन किया. हम दोनों दरार चरण blastomeres और blastcyst चरण भ्रूण से बायोप्सी पर परीक्षण किया. यह सुझाव दिया जाता है कि बायोप्सी कोशिकाओं डीएनए के किसी भी गिरावट को रोकने के लिए जितनी जल्दी हो सके WGA से गुजरना. पिछले एक अध्ययन में विभिन्न डब्ल्यूजीए विधियों के निष्पादन की तुलना की गई थी और यह संकेत दिया गया था कि हमने यहाँ वर्णित विधि में 100 KB20के बिन आकार में सर्वश्रेष्ठ एकरूपता थी . दोनों एकरूपता और औसत निरपेक्ष युग्मवार अंतर (MAPD)21के प्रदर्शन को ध्यान में रखते हुए, इस WGA विधि अर्धचालक अनुक्रमक का उपयोग कर PGT-A के लिए चुना गया था. 186 क्लीवेज चरण और 1135 ब्लास्टोसिस्ट चरण भ्रूणों पर पूर्वव्यापी सांख्यिकीय विश्लेषण के माध्यम से, हमने देखा कि डब्ल्यूजीए की सफलता दर ब्लास्टोमेयर नमूनों में 95.4% और ब्लास्टोसिस्ट नमूनों में 96.9% थी (चित्र 1)। एक आकार चयन प्रक्रिया के रूप में पुस्तकालय निर्माण से पहले शुद्धि कदम बड़े डीएनए टुकड़े पर कब्जा करके अनुक्रमण गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण था। इसके अतिरिक्त, यह पुस्तकालय निर्माण के लिए 300 एनजी की इनपुट राशि की सुविधा. एंजाइमी विखंडन विधि लगभग 160 बीपी में WGA उत्पादों की एक कुशल कतरनी सक्षम.

डेटा विश्लेषण यूक्लिडीय दूरी और परिपत्र द्विआधारी विभाजन (EDCBS) विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर आयोजित किया गया था. घर में सत्यापन इस bioinformatic एल्गोरिथ्म की मजबूती का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था. हमने 100 KB के बिन आकार का विश्लेषण करके ज्ञात karyotypes के साथ 66 सेल लाइनों से 379 WGA उत्पादों को अनुक्रमण के माध्यम से PGT-A के लिए अनन्य संदर्भ डेटाबेस स्थापित किया है। इस डेटाबेस से, प्रतिलिपि संख्या संस्करण (CNV) कॉलिंग के लिए थ्रेशोल्ड के रूप में एक संदर्भ श्रेणी वर्णन किया गया था और 10 MB का पता लगाने के स्तर के लिए कटऑफ़ के रूप में सेट किया गया था। संवेदनशीलता और विशिष्टता दोनों इस सीमा पर 99% से अधिक तक पहुँच (तालिका 1)। भ्रूण बायोप्सी पर पीजीटी-ए के लिए आवेदन में, खिड़की का आकार पर्याप्त पढ़ता तक पहुँचने के लिए एक फिसलने खिड़की दृष्टिकोण के साथ 400 KB करने के लिए सेट किया गया था। प्रत्येक नमूने की गुणवत्ता नियंत्रण (QC) अद्वितीय पढ़ता है, MAPD और प्रतिलिपि संख्या संस्करण के मानक विचलन द्वारा निर्धारित किया गया था (CNV]SD). तीन सूचकांकों में से एक से परे नमूना QC विफलता के रूप में परिभाषित किया गया था (चित्र 2C) . गुणसूत्र तितर बितर भूखंडों की व्याख्या (चित्र 2ए,बी, डी) एक कार्यप्रवाह के बाद योग्य आनुवंशिकीविदों द्वारा की गई पहचान CNV DECIPHER, DGV, या ClinGen डेटाबेस की तुलना द्वारा आयोजित किया गया था. व्यक्तिगत विसंगतियों एक विशेषज्ञ curation प्रक्रिया द्वारा नियंत्रित किया गया. क्रोमोसोमल असामान्यताओं को ब्लास्टोसिस्ट नमूनों में एउप्लॉयडी और मोज़ेकवाद में समूहीकृत किया गया था। 30% की सीमा के भीतर एक प्रतिलिपि संख्या लाभ या हानि को मोज़ेक गुणसूत्र संरचना ले जाने के रूप में वर्गीकृत किया गया था; अन्यथा, परिणाम या तो euploidy या anuploidy के रूप में व्याख्या की जाएगी. इस अध्ययन में, एयुलॉइड दर ब्लास्टोमर्स में 45.2% और ब्लास्टोसिस्टों में 52.3% थी, जो प्रकाशित आंकड़ों22,23से गूंजी थी।

Figure 1
चित्र 1: इस विधि द्वारा परीक्षण 1321 भ्रूण बायोप्सी के जनसांख्यिकीय आँकड़े. (ए) 186 क्लीवेज-स्टेज भ्रूणों का डेटा। () 1135 ब्लास्टोसिस्ट-अवस्था भ्रूणों के आंकड़े। WGA सफलता दर नमूनों के दोनों प्रकार में 95% से अधिक कर रहे हैं. गुणवत्ता नियंत्रण विफलता दर ों की कमी दरार चरण समूह में 3.4% और blastcyst-चरण समूह में केवल 1.9% हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: पीजीटी के प्रतिनिधि परिणाम- गुणसूत्रों के 23 जोड़े के लिए भ्रूण का एक नैदानिक अनुप्रयोग। के प्रतिनिधि परिणाम (एक) euploidy; () एनेउप्लाइडी (सेक[GRCh37] (2)x3, (21)x3); (सी) अनुक्रमण QC CNV के कारण नमूना विफल 0.6571 पर एसडी (स्वीकृति $ 0.4); (डी) खंडीय मोज़ेक विलोपन (55%) 4p16.3p15.1 (29.50 MB) की. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

CNV थ्रेशोल्ड मान
(-0.23, 0.20) (-0.32, 0.26) (-0.41, 0.32) (-0.51, 0.37) (-0.62, 0.43) (-0.73, 0.48)
संवेदनशीलता 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 98.30% 96.02%
विशिष्टता 72.41% 81.03% 91.38% 99.10% 99.54% 100.00%

तालिका 1: अर्धचालक अनुक्रमक द्वारा विभिन्न लॉग आर अनुपातों के बीच संवेदनशीलता और विशिष्टता। ज्ञात eupoid karyotype परिणामों के साथ कुल 240 नमूनों को इस विधि द्वारा परीक्षण किया गया और विभिन्न लॉग आर अनुपात में कहा जाता है.

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Discussion

अन्य अनुक्रमण रसायनज्ञों से भिन्न, यहाँ वर्णित अनुक्रमक न्यूक्लियोटाइडों का पता लगाने के लिए अर्धचालक का उपयोग करता है। चिप ही एक इलेक्ट्रॉनिक उपकरण है कि polymerase संचालित आधार निगमन17,जो Proton कार्यक्रम के 2 डिग्री 4 एच अनुक्रमण समय सक्षम बनाता है द्वारा हाइड्रोजन आयनों का पता लगाता है. इसके अलावा, चिप एक microwell चिप है कि एक लक्ष्य अणु के स्थानीयकरण की अनुमति देता है, जो प्रवाह सेल अनुक्रमण रसायन विज्ञान से अन्य seuencer प्रदाताओं द्वारा अलग है. इस प्रोटोकॉल PGT-A के आवेदन के लिए अनुकूलित एक संशोधित प्रोटोकॉल है. अनुकूलन संदूषण के साथ ही आकार चयन और कम लागत के साथ बेहतर प्रदर्शन के लिए पीसीआर प्रणाली की संभावना को कम करने के लिए sonication के बजाय एंजाइमी विधि द्वारा प्रवर्धित डीएनए के विखंडन भी शामिल है। साथ ही, नैदानिक सेटिंग में, हम संस्करण कॉलिंग के लिए एक मान्य इन-हाउस पाइपलाइन का उपयोग किया।

अभ्यास के दौरान के बारे में पता होना करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। शुद्धि के लिए इथेनॉल ताजा प्रयोग से पहले तैयार किया जाना चाहिए, इथेनॉल की एक उच्च एकाग्रता के रूप में दूषित डीएनए की अपर्याप्त धोने का कारण होगा, जबकि एक कम एकाग्रता लक्ष्य डीएनए की हानि का कारण होगा. फ्लोरोरोमीटर सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एक ज्ञात एकाग्रता के साथ सकारात्मक नियंत्रण द्वारा calibrated किया जाना है. इसके अलावा, अनुक्रमण के लिए टेम्पलेट की पर्याप्त लोडिंग महत्वपूर्ण है। सही आकार के बुलबुले microwells में गिर करने के लिए टेम्पलेट क्षेत्र पुश करने के लिए मदद करते हैं, लेकिन बहुत बड़े बुलबुले अपर्याप्त लोड हो रहा है कारण हो सकता है। उपयोगकर्ताओं को प्रत्येक रन के लिए अनुक्रम किया जा करने के लिए नमूने (आवश्यक रूप से 24) की संख्या को संशोधित कर सकते हैं। इस चिप के लिए डिज़ाइन किए गए 96 इंडेक्स हैं। लेकिन अनुक्रमण पढ़ें गहराई चिप प्रति नमूने में वृद्धि के साथ कम हो जाएगा. सबसे आम समस्याओं में से एक कम पुस्तकालय एकाग्रता है, जो अवशिष्ट इथेनॉल या चुंबकीय मोती, या मोती के खुर के कारण शुद्धि से एक कम या गरीब गुणवत्ता डीएनए उत्पादन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है के रूप में पहले उल्लेख किया है. एक suboptimal डीएनए उत्पादन भी पीसीआर की कम दक्षता से परिणाम हो सकता है, जो सटीक नमूना आदानों और थर्मल cyclers के तापमान की जांच के साथ मास्टर मिश्रण की सतर्क तैयारी से सही किया जा सकता है. अनुक्रमण QC-विफल नमूने के लिए, जैसे कि उच्च CNV]SD मानों के साथ उन लोगों के लिए (चित्र 2C),यह आकार वितरण विश्लेषण के लिए एक bioanalyzer पर नमूने को चलाने के लिए सिफारिश की है.

इस विधि की सीमाओं में से एक अन्य प्लेटफार्मों की तुलना में इसकी उच्च झूठी एकल न्यूक्लिओटाइड कॉलिंग दर है। त्रुटि दर 1% अन्य seuencers17द्वारा केवल 0.1% indel झूठी सकारात्मक दर की तुलना में है. हालांकि, यह CNV कॉलिंग या PGT-एक विश्लेषण के लिए एक निर्धारण कारक नहीं है. अन्य प्लेटफार्मों की तुलना में, पायस प्रणाली के आवेदन ऑपरेटिव विसंगतियों और पाइपिंग त्रुटियों को कम करता है, पुस्तकालय की गुणवत्ता में वृद्धि. यह अन्य प्लेटफार्मों की तुलना में हमारी विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ है क्योंकि dsDNA एकाग्रता बहुत कम है और एक सटीक परिमाणीकरण निम्नलिखित पुस्तकालय पूलिंग के लिए आवश्यक है. हमारी विधि का पता लगाने त्रुटि को नियंत्रित करने के लिए एक मानक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर fluorometer परिमाणीकरण के अंशांकन शुरू की.

कम बदलाव के समय के साथ एक उच्च थ्रूपुट मंच के रूप में, अर्धचालक अनुक्रमक पीजीटी-ए के लिए आदर्श है और व्यापक रूप से पीजीटी के साथ आईवीएफ रोगियों के लिए लागू किया जा सकता है-एक नैदानिक संकेत जैसे उन्नत मातृ उम्र24। डेली एट अल मानव ब्लास्टोसिस्टों के समानांतर अनुक्रमण का आयोजन किया अन्य seuencers25के साथ अर्धचालक अनुक्रमक के प्रदर्शन की तुलना करने के लिए. इसके अलावा, इस PGT-एक किट चीन खाद्य एवं औषधि प्रशासन से अभिनव चिकित्सा उपकरणों पर "विशेष अनुमोदन प्रक्रिया" प्राप्त किया है और चिकित्सकीय भ्रूण के हजारों के लिए इस्तेमाल किया गया है. लागत के संदर्भ में, इस मंच की कीमत पीजीटी-ए बाजार में एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया मंच की तुलना में गीगा ठिकानों प्रति कीमत आधी है। ट्रोफिक्टोडरम कोशिकाएं भ्रूण26के आनुवंशिक संविधान का विश्वसनीय रूप से प्रतिनिधित्व कर सकती हैं . इस विधि को संभावित रूप से मोनोजेनिक/एकल जीन रोगों (पीजीटी-एम) के लिए पीजीटी के लिए विकसित किया जा सकता है क्योंकि ट्रेफ एट अल ने27का प्रदर्शन किया है। अपने मॉडल में, उन्होंने 16 भ्रूण बायोप्सी के पीजीटी-एम पर 300 एमबी से 1 जीबी थ्रूपुट की सुविधा प्रदान की और परिणामों की तुलना दो पारंपरिक पीजीटी-एम विधियों से की। 16 नमूनों पर कब्जा करने और लोड करके, उनकी विधि लक्षित क्षेत्र की गहराई को कम से कम 100x तक पहुंच गई और इसके परिणामस्वरूप 100% विश्वसनीयता और पुनरुत्पादनीयता27हुई। हमारे प्रोटोकॉल द्वारा अर्धचालक अनुक्रमक के थ्रूपुट 15 जीबी तक पहुंच सकते हैं और डिजाइन किए गए 96 बारकोड हैं; इसलिए, यदि लक्षित पीजीटी-एम पर लागू किया जाता है, तो काफी संख्या में भ्रूण बायोप्सी को एक चिप द्वारा उच्च पठन गहराई पर अनुक्रमित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस अध्ययन को हांगकांग से जनरल रिसर्च फंड (रेफ नंबर 14162417) द्वारा समर्थित किया गया था, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (रेफ नंबर 81860272), प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन के प्रमुख अनुसंधान योजना गुआंगशी (रेफ नं. AB16380219), और चीन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन ग्रांट (रेफ नंबर 2018M630993) चीन से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR tubes, 0.2 mL Axygen PCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free ThermoFisher 10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solution SIGMA-ALDRICH S2567 For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 13-698-791
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or
Equivalent 18 MΩ water system
ThermoFisher 4474524
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
PicoPLEX WGA Amplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification Plate In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFisher 65001
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3 ThermoFisher A26771
Ion Chip Minifuge, 230 V ThermoFisher 4479673
Ion PI dATP ThermoFisher A26772
Ion PI dCTP ThermoFisher A26772
Ion PI dGTP ThermoFisher A26772
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ThermoQ–Temperature Dry Bath TAMAR HB-T2-A
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
Ion PI dTTP ThermoFisher A26772
Ion OneTouch 2 Instrument ThermoFisher INS1005527 ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion One Touch ES ThermoFisher 8441-22 ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
Ethanol SIGMA-ALDRICH 51976 This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216 This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kit ThermoFisher M2002-02
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Q32856
Ion PI Foaming Solution ThermoFisher A26772
Index for barcoding of libraries BaseCare this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading Buffer ThermoFisher A26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer ThermoFisher 4389764
Agencour AMPure XP Kit Beckman Coulter A63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) ThermoFisher 12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Micro 17 75002430
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Nuclease-free water ThermoFisher AM9922 This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free water Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottle Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standard This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer Mix ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction Filter Extended kit component in Sheet 5
Recovery Router Extended kit component in Sheet 5
Recovery Tubes Extended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion Proton ThermoFisher DA8600 This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase ThermoFisher A26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencer Lenovo T260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High Fidelity ThermoFisher 4471252
Nalgene 25mm Syringe Filters ThermoFisher 724-2045 Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 Solution ThermoFisher A26772
Ion PI 1X W3 Solution ThermoFisher A26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit ThermoFisher A30044 Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) ThermoFisher A26772 Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit ThermoFisher A26434 Extended kit component in Sheet 5

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References

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