एस. ऑरियस बायोफिल्म में क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का वर्णमितीय विश्लेषण

Bioengineering

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Summary

इस पांडुलिपि में, हमने एक उच्च थ्रुपुट विधि की स्थापना की है जिसमें क्षारीय फॉस्फेट क्रियाकलाप को एस. ऑरेयस बायोफिल्म कल्चर में ९६-कूप ऊतक कल्चर प्लेट

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Danikowski, K. M., Cheng, T. Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm. J. Vis. Exp. (146), e59285, doi:10.3791/59285 (2019).

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Abstract

क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) एक सामान्य एंजाइम है जो प्रोक्योटिक और यूकार्योटिक कोशिकाओं दोनों में व्यक्त किया जाता है । यह बुनियादी पीएच पर कई अणुओं से फॉस्फेट monoesters के hydrolysis catalyzes और फॉस्फेट चयापचय में एक अपरिहार्य भूमिका निभाता है । मनुष्यों में, यूकेरियोटिक एएलपी विभिन्न रोगों, जैसे कि cholestasis और रिकेट्स के निदान में सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया एंजाइमी संकेतों में से एक है । में एस. ऑरियस, एएलपी कोशिका झिल्ली पर विशेष रूप से पाया जाता है; यह भी एक स्रावी रूप के रूप में अच्छी तरह से व्यक्त की है । फिर भी, थोड़ा biofilm गठन में अपने समारोह के बारे में जाना जाता है ।

इस पांडुलिपि के उद्देश्य के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय परख विकसित करने के लिए एस में ALP गतिविधि को मापने के aureus biofilm कि प्रोटीन अलगाव की आवश्यकता नहीं है । एक सब्सट्रेट के रूप में पी-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (pNPP) का उपयोग करना, हम एस में एएलपी गतिविधि मापा-९६ में बनाई गई biofilm-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें । गतिविधि ४०५ एनएम absorbance द्वारा मापा घुलनशील प्रतिक्रिया उत्पाद के गठन पर आधारित था । ९६ अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट विधि के उच्च थ्र्पुट प्रकृति एएलपी गतिविधि assays के लिए एक संवेदनशील और reproducible विधि प्रदान करता है । एक ही प्रयोगात्मक सेट अप भी अन्य extracellular आणविक मार्करों biofilm गठन से संबंधित उपाय करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Introduction

क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) को दोनों प्रोक्योटिक और यूक्योटिक कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है । यह विभिन्न अणुओं जैसे न्यूक्लियोटिड्स, प्रोटीन, एल्कलॉइड, फॉस्फेट एस्टर और फॉस्फोरिक अम्ल के एन्हाइड्राइडों से मोनोफॉस्फेट के जल अपघटन को उत्प्रेरित कर सकता है । मनुष्यों में, यूक्योटिक एएलपी जिगर, अस्थि, आंत और अपरा2सहित कई ऊतकों में मौजूद है । यह प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन, कोशिका वृद्धि, अपोप्टोसिस, स्टेम सेल प्रक्रियाओं के साथ-साथ सामान्य कंकाल खनिजीकरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यूकेयोटिक एएलपी हड्डी में रोगों की उपस्थिति के लिए एक महत्वपूर्ण सीरम संकेतक भी है, जिगर, और अन्य ऊतकों/

प्रोक्योटिक एएलपी में विभिन्न प्रकार के जीवाणु कोशिकाओं का पता लगाया गया है, जिनमें ई.कोलाई5, एस. ऑरियस6,7 और मिट्टी में कुछ सामान्य रूमेन बैक्टीरिया शामिल हैं । बैक्टीरियल alp गतिविधि कीटनाशकों का पता लगाने में एक बायोसेंसर के रूप में इस्तेमाल किया गया है, भारी धातुओं9 और बैक्टीरियल संदूषण10. एएलपी की संवैधानिक अभिव्यक्ति के लिए Staphylococci11 की पहचान और Enterobacter12से serratia अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह आगे सुझाव दिया है कि संवैधानिक एएलपी उत्पादन staphylococci13में रोगजनन के साथ सहसंबद्ध है । हालांकि alp अलग सेटिंग्स3,4में अध्ययन किया गया है, अभी तक कम अपनी गतिविधि और biofilms संस्कृतियों में समारोह के लिए सूचना दी है ।

एक biofilm के रूप में अपने मुक्त रहने वाले जीवाणु सेल समकक्ष14की तुलना में एक अलग कार्य बैक्टीरियल जीवन है प्रलेखित किया गया है । एस aureusमें, biofilm के गठन के नैदानिक शर्तों और एंटीबायोटिक प्रतिरोध और जीर्ण सूजन15,16के लिए खातों की एक किस्म में पहचान की गई है । कई अणुओं को एक biofilm मैट्रिक्स जैसे पॉलिसैकेराइड, प्रोटीन, न्यूकलिक एसिड, और लिपिड में पाया जाना सूचित किया गया था, लेकिन biofilm गठन की व्यवस्था पूरी तरह से14समझ में नहीं है । Biofilm गठन में एएलपी की भूमिका को समझने के लिए, हम ९६ में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में एस aureus biofilm और पैरा-nitrophenylphosphate (pnpp) का उपयोग कर alp गतिविधि मापा ।

अणु pnpp एएलपी के लिए एक तैयार करने के लिए उपयोग सब्सट्रेट है और व्यापक रूप से एएलपी गतिविधि6,17,18को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह वर्णमितीय परख पैरा-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (पीएनपीपी) के पैरा-नाइट्रोफीनॉल के रूपांतरण पर आधारित है जिसके परिणामस्वरूप ४०५ एनएम पर एक रंगीन उत्पाद है । इस तरह के रूप में अंय पारंपरिक एएलपी परख, agose जेल के रूप में19ट्रो, गेहूं रोगाणु agglutinin (wga) वर्षण, और wga-hplc20, इस परख अत्यधिक विशिष्ट है, संवेदनशील, प्रतिलिपि करने के लिए आसान है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, उच्च के लिए अनुमति देता है प्रवाह.

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Protocol

१. मध्यम तयारी

  1. तैयार 1 Tryptic सोया शोरबाट की एल (TSB): आसुत जल के 1 एल में, अग्नाशय के casein के पचाने के 15 ग्राम, सोयाबीन भोजन, सोडियम क्लोराइड के 3 ग्राम, डेक्सट्रोज के २.५ ग्राम, और dipotassium फॉस्फेट की २.५ ग्राम के 5 ग्राम जोड़ें । उपयोग करने से पहले ।
  2. Tryptic सोया आगर (TSA) के लिए, TSA, आटोक्लेव के 1 एल के लिए आगर के 15 ग्राम जोड़ें । तो यह कमरे के तापमान को शांत हो जाओ । इसके बाद, प्रति पेट्री डिश 20 मिलीलीटर (१०० मिमी x 15 मिमी) के अनुपात में डालें ।
  3. Biofilm संस्कृति मध्यम: autoclaved TSB के 1 एल के लिए ग्लूकोज की 10 ग्राम जोड़ें । एक ०.२ μm फिल्टर का उपयोग कर निस्पंदन द्वारा ।

२. एस. ऑरेयस बायोफिल्म का निर्माण ९६ में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट

नोट: . ऑरियस बायोफिल्म को पहले से वर्णित6,21के रूप में सुसंस्कृत किया जाता है ।

  1. TSA के 10 मिलीलीटर में टीएसए से एस औरेअस की एक व्यक्ति कॉलोनी Inoculate और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हो जाना ।
  2. 1:100 (v/v) अनुपात में रातोरात की संस्कृति को टीएसबी/ग्लूकोज (10 ग्राम/लीटर) के 10 मिलीलीटर में पतला करना । भंवर धीरे एक सुसंगत एकाग्रता के लिए मिश्रण करने के लिए ।
  3. 18 कुओं की कुल में पतला संस्कृति के २०० मिलीलीटर स्थानांतरण (प्रयोगात्मक समूहों के लिए और अधिक, इस तरह के एक गैर biofilm नियंत्रण के लिए एक संबंध का सुझाव देने के लिए ALP गतिविधि6) से १ ९६ अच्छी थाली । प्रत्येक समय बिंदु के लिए तीन का उपयोग करें: 0 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट, ४५ मिनट, ६० मिनट, और ७५ मिनट. चरण ३.२ देखें ।
  4. 6,21biofilm गठन के लिए 24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९६ कूप थाली सेते ।
  5. आकांक्षा द्वारा अधिनत्व को Decant.
  6. धोने के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 1x फॉस्फेट buffered समाधान (pbs, पीएच ७.४), 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज १५,००० एक्स जी पर और छानना आकांक्षा द्वारा supernatant.

3. एस ऑरियस बायोफिल्म में एएलपी गतिविधि की माप

नोट: Alp गतिविधि6,18वर्णित के रूप में मापा गया था ।

  1. २.६ कदम से प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध pNPP से मिलकर buffered ALP सब्सट्रेट की ७५ मिलीलीटर जोड़ें और समय रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं । रिकॉर्ड प्रत्येक बार triplicate में बिंदु ।
  2. एक विविध समय के लिए ऊष्मायन के बाद: 0 मिनट (नियंत्रण), 15 मिनट, 30 मिनट, ४५ मिनट, ६० मिनट, और ७५ मिनट क्रमशः, 5 मीटर NaOH के ७५ μL जोड़ें प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ।
  3. १५,००० एक्स जीपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज प्लेट
  4. वर्णमितीय माप के लिए एक नया ९६ कुआं थाली में supernatant के १०० μl स्थानांतरण ।
  5. एक ९६ अच्छी तरह से थाली रीडर का उपयोग ४०५ एनएम पर प्रत्येक अच्छी तरह के अवशोषण उपाय । का प्रयोग करें 0 ंयूनतम समय बिंदु कुओं ४०५ एनएम पृष्ठभूमि शोर के लिए नियंत्रित करने के लिए ।
  6. तीन व्यक्तिगत ९६ अच्छी तरह से प्लेटों में पूरे प्रयोग को दोहराएं ।

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Representative Results

चित्रा 1 एस के BIOFILM संस्कृतियों से एएलपी गतिविधि का एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है ९६ में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें । ७५ μL वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध pNPP समाधान प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा गया था और कमरे के तापमान पर इनसेबटेड । अलग समय के लिए ऊष्मायन के बाद (0 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट, ४५ मिनट, ६० मिनट, और ७५ मिनट, क्रमशः) ७५ μL 5 मीटर NaOH प्रतिक्रिया को रोकने के लिए जोड़ा गया था । उत्पाद तो ४०५ एनएम पर एक ९६ अच्छी तरह से थाली रीडर में मापा गया था । प्रत्येक समय बिंदु एक एकल ९६ अच्छी तरह से थाली से तीन में दोहराया गया था, और पूरे प्रयोग 3 व्यक्तिगत ९६ अच्छी तरह से प्लेटों में दोहराया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: एस aureus biofilm संस्कृतियों अलग समय के लिए pnpp सब्सट्रेट के साथ (0 मिनट, 15 मिनट, 30 मिनट, ४५ मिनट, ६० मिनट और ७५ मिनट) और उनके alp गतिविधि ४०५ एनएम पर मापा गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हमारी परख में, हम ALP सब्सट्रेट के रूप में pNPP का इस्तेमाल किया । यह एलिसा के लिए बनाया गया एक काम समाधान है और कोई कमजोर पड़ने की जरूरत नहीं है । एएलपी द्वारा hydrolysis के बाद, एक पीले उत्पाद विकसित करता है और ४०५ एनएम पर मापा जा सकता है । एंजाइमी प्रतिक्रिया के अंत में, हम संक्षेप में ९६ अच्छी तरह से थाली और एक नए ९६ अच्छी तरह से थाली के लिए supernatant हस्तांतरित प्लेट रीडर का उपयोग अवशोषण को मापने के लिए । हमने पाया है कि इस अतिरिक्त केंद्रापसारक कदम महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह ४०५ एनएम पर absorbance की निरंतरता बढ़ जाती है, शायद किसी भी संभव निलंबित एंजाइमी प्रतिक्रिया के दौरान किया कोशिकाओं को नष्ट करने से ।

Biofilm गठन के लिए, हम एक 1:100 के २०० μl का उपयोग करें (v/v) रातोंरात संस्कृति के लिए कमजोर पड़ने की रिपोर्ट के रूप में6,21। यह एस के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने के लिए अंय कमजोर पड़ने (डेटा नहीं दिखाया) की तुलना में biofilm फार्म । इस कागज के उद्देश्य के बाद से biofilm में एएलपी गतिविधि को मापने है, यह महत्वपूर्ण है कि हम इष्टतम biofilm संस्कृति की स्थिति बनाए रखा गया था । इसके अलावा इष्टतम जैव फिल्म विकास6के लिए 10 ग्राम/L में ग्लूकोस का उपयोग करने के विकल्प पर बल दिया गया । कमजोर कारक और ग्लूकोज एकाग्रता के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए अगर विभिन्न बैक्टीरिया की कोशिकाओं biofilm गठन के लिए उपयोग किया जाता है ।

PNPP सब्सट्रेट के साथ biofilm संस्कृति के ऊष्मायन के दौरान, यह रंग का उत्पाद विकसित करने के लिए समय लगेगा । हम 15 और 30 मिनट समय अंक जो है जब दिखाई पीला रंग मनाया जाता है के बाद ALP गतिविधि मापा । वर्तमान एकाग्रता के साथ, हम ७५ मिनट के लिए एक वृद्धि हुई एएलपी गतिविधि देखा के रूप में चित्रा 1में संकेत दिया । ७५ मिनट के बाद, एएलपी गतिविधि में कोई वृद्धि नहीं देखी गई ।

अंत में, के बाद से एस में एएलपी एक विशेष रूप से झिल्ली बाध्य प्रोटीन7, अपनी गतिविधि सेल lysis के बिना परीक्षण किया जा सकता है । वहां एक एंजाइम गतिविधि परख है कि पूरे सेल विनाश की आवश्यकता नहीं है के लिए लाभ कर रहे हैं । विशेष रूप से, प्रोटीन आइसोलेशन प्रक्रिया कभी-कभार कम सक्रिय एंजाइम मात्रा22उपज कर सकते हैं । हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग नहीं किया जा सकता है यदि एएलपी अपनी झिल्ली से बंधे रूप में नहीं है ।

जैसा कि पहले6रिपोर्ट, alp गतिविधि biofilm संस्कृति में अपने प्लेटो समकक्ष की तुलना में ऊंचा है । वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त प्रायोगिक सेटिंग्स को एस. ऑरियस बायोफिल्म में एएलपी गतिविधि को प्रभावित करने वाले कारकों/यौगिकों की जांच करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । इन अध्ययनों से निष्कर्ष कैसे बैक्टीरियल biofilm गठन को नियंत्रित करने में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम विलियम Rainey हार्पर कॉलेज और शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय की सुविधा के लिए इन प्रयोगों का संचालन करने के लिए धन्यवाद । हम भी उनके उदार समर्थन के लिए McGraw हिल फाउंडेशन धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar VWR 9002-18-0
Eppendorf Centrifuge Thomas Scientific 5810
Gluose VWR 50-99-7
NaOH pellets VWR SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)  Sigma P7998-100ML Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10x PBS, pH7.4.
173 mM NaCl,
2.7 mM KCl,
8 mM Na2HPO4,
2 mM KH2PO4
Sigma P3288-1VL
Plate Reader Biotek ELx808
S. aureus ATCC ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15 g/L TSB VWR 9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L
Pancreatic Digest of Casein............ 15.0
Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00
Sodium chloride.............................. 3.00
Dextrose........................................  2.50
Dipotassium phosphate..................2.50
VWR 90006-098
96 well tissue culture plates BD 6902D09 U shaped bottom

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References

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