Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dans ce manuscrit, nous avons mis en place une méthode de haut débit afin de quantifier l’activité de la phosphatase alcaline dans la culture de biofilm de S. aureus de plaque 96 puits vitroplants

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Danikowski, K. M., Cheng, T. Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm. J. Vis. Exp. (146), e59285, doi:10.3791/59285 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Phosphatase alcaline (ALP) est une enzyme commune exprimée dans les cellules procaryotes et eucaryotes. Elle catalyse l’hydrolyse des monoesters de phosphate de nombreuses molécules à pH basique et joue un rôle indispensable dans le métabolisme du phosphate. Chez l’homme, ALP eucaryote est l’un des signaux enzymatiques le plus souvent utilisés dans le diagnostic des maladies diverses, telles que la cholestase et le rachitisme. Dans S. aureus, ALP est détectée exclusivement sur la membrane cellulaire ; Elle est également exprimée en une forme sécrétoire ainsi. Pourtant, on connaît mal son rôle dans la formation de biofilm.

Le but de ce manuscrit est de développer un test rapide et fiable pour mesurer l’activité ALP en biofilm de S. aureus ne nécessitant pas l’isolement de la protéine. À l’aide de p-nitrophényl phosphate (pNPP) comme substrat, nous avons mesuré l’activité ALP dans S. aureus biofilm formé en plaques 96 puits vitroplants. L’activité était basée sur la formation du produit soluble réaction mesurée par 405 absorbance nm. La nature à haut rendement de la méthode de plaque 96 puits vitroplants fournit une méthode sensible et reproductible pour les tests d’activité ALP. Les mêmes expérimental mis en place peuvent être étendus pour mesurer les autres extracellulaires marqueurs moléculaires associés à la formation de biofilm.

Introduction

Phosphatase alcaline (ALP) est partout exprimée dans les deux cellules procaryotes et eucaryotes1. Il peut catalyser l’hydrolyse de monophosphate de différentes molécules telles que les nucléotides, les protéines, les alcaloïdes, les esters de phosphate et anhydrides d’acide phosphorique. Chez l’homme, ALP eucaryote est présent dans de nombreux tissus, y compris le foie, les os, les intestins et placenta2. Il joue un rôle important dans la phosphorylation des protéines, la croissance cellulaire, l’apoptose, cellules souches processus ainsi que la minéralisation squelettique normale. ALP eucaryote est également un indicateur clé de sérum pour la présence de maladies dans les os, le foie et autres tissus/organes lorsque élevé3,4.

Procaryote ALP a été détectée dans une variété de cellules bactériennes, y compris e. coli5,6,de S. aureus7 et certaines bactéries du rumen commune dans les sols8. L’activité bactérienne ALP a été utilisée comme un biocapteur dans la détection des pesticides, métaux lourds,9 et10de la contamination bactérienne. L’expression constitutive de l’ALP a été utilisée pour identifier des staphylocoques11 et pour différencier Serratia Enterobacter12. Il est également suggéré que constitutive production ALP est corrélée à la pathogénicité à staphylocoques13. Bien que l’ALP a été étudiée dans différents contextes3,4, encore peu est inédite pour son activité et sa fonction dans les cultures de biofilms.

Un biofilm a été documenté pour avoir une vie bactérienne fonctionne différemment par rapport à son homologue de cellule bactérienne libres14. Chez S. aureus, la formation de biofilm a été identifiée dans une variété de conditions cliniques et représente la résistance aux antibiotique et l’inflammation chronique15,16. De nombreuses molécules avaient été signalés dans une matrice de biofilm tels que les polysaccharides, protéines, acides nucléiques et les lipides, mais le mécanisme de formation de biofilm n’est pas entièrement compris14. Pour comprendre le rôle de l’ALP dans la formation de biofilm, nous cultivées biofilms de Staphylococcus aureus dans les plaques de 96 puits de culture tissulaire et mesuré l’activité ALP à l’aide de para-nitrophénylphosphate (pNPP).

La molécule pNPP est un substrat prêt à l’emploi pour ALP et a été largement utilisé pour mesurer l’activité ALP6,17,18. Ce dosage colorimétrique est basé sur la conversion de para-nitrophényl phosphate (pNPP) en para-nitrophénol aboutissant à un produit coloré à 405 nm. Par rapport aux autre essai ALP classique, tels que l’agarose gel électrophorèse19, précipitations agglutinine (WGA) de germe de blé, et WGA-HPLC20, ce test est très spécifique, sensible, facile à reproduire et la plupart important, permet pour la grande débit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. préparation moyenne

  1. Préparer 1 L de bouillon de soja tryptique (BST) : dans 1 L d’eau distillée, ajouter 15 g de hydrolysât de caséine, 5 g de papaique de farine de soja, 3 g de chlorure de sodium, 2,5 g de dextrose et 2,5 g de phosphate dipotassique. Stériliser avant usage.
  2. Pour Trypticase Soy Agar (TSA), ajouter 15 g d’agar à 1 L de TSB, autoclave. Puis laissez-le refroidir à température ambiante. Ensuite, verser à un ratio de 20 mL par boîte de pétri (100 x 15 mm).
  3. Milieu de culture de biofilm : ajouter 10 g de glucose dans 1 L de BST autoclavé. Stériliser par filtration à l’aide d’un filtre de 0,2 µm.

2. Formation de Biofilm de S. aureus dans la plaque de Culture tissulaire bien 96

Remarque : Le biofilm de S. aureus est cultivé comme décrit précédemment6,21.

  1. Ensemencer une colonie individuelle S. aureus de TSA dans 10 mL de TSB et croître une nuit à 37 ° C.
  2. Diluer la culture au jour le jour dans 10 mL de TSB/glucose (10 g/L) à un ratio de 1 : 100 (v/v). Vortex doucement pour mélanger pendant une concentration uniforme.
  3. Transférer 200 mL de culture diluée dans un total de 18 puits (plus pour les groupes expérimentaux, un tel contrôle non-biofilm pour suggérer une relation avec l’activité de l’ALP6) d’une 96 plaque bien. Utiliser des triplés pour chaque point dans le temps : 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min. Reportez-vous à l’étape 3.2.
  4. Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C pendant 24 h pour la formation de biofilm6,21.
  5. Décanter le liquide surnageant par aspiration.
  6. Laver chaque bien avec 1 x solution tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4), centrifuger pendant 5 min à 15 000 x g et éliminer le surnageant par aspiration.

3. mesure de l’activité ALP en Biofilm de S. aureus

Remarque : Activité de l’ALP a été mesurée comme décrit6,18.

  1. Ajouter 75 mL de substrat tamponné de ALP consistant pNPP commercialement disponible dans chaque puits de l’étape 2.6 et commencer l’enregistrement de l’époque. Enregistrer chaque point dans le temps en trois exemplaires.
  2. Après incubation pendant un temps varié : 0 min (contrôle), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min respectivement, ajoutent 75 µL de 5 M de NaOH pour arrêter la réaction.
  3. Centrifuger la plaque pendant 5 min à 15 000 x g.
  4. Transférer 100 µL de liquide surnageant dans une nouvelle plaque 96 puits pour mesure colorimétrique.
  5. Mesurer l’absorbance de chaque bien à 405 nm en utilisant un 96 plaque bien lecteur. Utiliser le temps min 0 point puits à contrôler pour le bruit de fond 405 nm.
  6. Répétez l’expérience entière dans trois assiettes bien 96 individuelles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1 montre un résultat représentatif de l’activité ALP de biofilm cultures de S. aureus en plaques de 96 puits de culture tissulaire. 75 μl de solution de pNPP disponibles dans le commerce a été ajouté à chaque puits et incubé à température ambiante. Après une incubation de différentes époques (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min, respectivement) 75 μL de 5 M NaOH a été ajouté pour arrêter la réaction. Le produit a été ensuite mesuré dans un lecteur bien 96 à 405 nm. Chaque instant a été répétée en triolets d’une seule plaque de 96 puits, et l’expérience entière a été répétée en 3 plats individuels 96.

Figure 1
Figure 1 : S. aureus biofilm cultures ont été incubées avec substrat pNPP pour différents temps (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min) et leur activité ALP a été mesurée à 405 nm. Barres d’erreur représentent déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dans notre test, nous avons utilisé des pNPP comme le substrat de l’ALP. Il s’agit d’une solution de travail conçue pour ELISA et aucune dilution n’est nécessaire. Après hydrolyse par ALP, un produit jaune se développe et peut être mesuré à 405 nm. À la fin de la réaction enzymatique, nous avons brièvement centrifugé la plaque 96 puits et transféré le surnageant sur une plaque bien 96 fraîches pour mesurer l’absorbance à l’aide du lecteur de plaques. Nous avons constaté que cette étape supplémentaire de centrifugation est essentielle, car il augmente la cohérence de l’absorbance à 405 nm, probablement en éliminant les cellules suspension possibles engagés au cours de la réaction enzymatique.

Pour la formation de biofilm, nous utilisons 200 μL d’une dilution au 1/100 (v/v) pour culture nuitée comme signalé6,21. Il s’agit de la dilution optimale pour S. aureus former des biofilms par rapport aux autres dilutions (données non présentées). Étant donné que le but de cette étude est de mesurer l’activité ALP en biofilm, il était essentiel que nous avons maintenu les conditions de culture optimales biofilm. Cela a été accentué par le choix en utilisant le glucose à 10 g/L pour la croissance de biofilm optimal6. La concentration de glucose et le facteur de dilution doivent être optimisées si différentes cellules bactériennes sont utilisés pour la formation de biofilm.

Durant l’incubation de la culture de biofilm avec substrat pNPP, il faudra de temps pour le produit coloré à développer. Nous avons mesuré l’activité ALP après 15 à 30 min points dans le temps lorsque la couleur jaune visible est observée. Avec la concentration actuelle, nous avons remarqué une augmentation de l’activité ALP jusqu'à 75 min comme indiqué dans la Figure 1. Après 75 min, on a observé aucune augmentation de l’activité de l’ALP.

Enfin, étant donné que ALP chez S. aureus est une membrane exclusivement lié protéine7, son activité peut être testée sans lyse cellulaire. Il y a des avantages à un test d’activité enzymatique ne nécessitant pas de destruction des cellules entières. Notamment, le processus d’isolement de protéine peut parfois donner un inférieur de quantité d’enzyme active22. Cependant, ce protocole ne peut pas être utilisé si ALP n’est pas dans sa forme liée de membrane.

Comme indiqué précédemment6, l’activité ALP est élevée dans la culture du biofilm par rapport à son homologue platonique. Les paramètres expérimentaux utilisés dans l’étude actuelle peuvent être étendues afin d’étudier les facteurs/composés qui affecte l’activité de l’ALP dans le biofilm de S. aureus . Les résultats de ces études fournira un aperçu supplémentaire dans la façon de contrôler la formation de biofilm bactérien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions William Rainey Harper College et l’Université de l’Illinois à Chicago pour l’installation de procéder à ces expériences. Nous remercions également McGraw Hill Foundation pour leur soutien généreux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar VWR 9002-18-0
Eppendorf Centrifuge Thomas Scientific 5810
Gluose VWR 50-99-7
NaOH pellets VWR SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)  Sigma P7998-100ML Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10x PBS, pH7.4.
173 mM NaCl,
2.7 mM KCl,
8 mM Na2HPO4,
2 mM KH2PO4
Sigma P3288-1VL
Plate Reader Biotek ELx808
S. aureus ATCC ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15 g/L TSB VWR 9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L
Pancreatic Digest of Casein............ 15.0
Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00
Sodium chloride.............................. 3.00
Dextrose........................................  2.50
Dipotassium phosphate..................2.50
VWR 90006-098
96 well tissue culture plates BD 6902D09 U shaped bottom

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  2. Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. Alkaline Phosphatase: An Overview. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29, (3), July-Sept 269-278 (2014).
  3. Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
  4. Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202, (1), 225-234 (2016).
  5. Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177, (13), 3764-3770 (1995).
  6. Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
  7. Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18, (4), 287-294 (1974).
  8. Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 586-590 (1997).
  9. Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29, (2-3), 136-140 (2008).
  10. Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73, (5), M236-M238 (2008).
  11. Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
  12. Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
  13. Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
  14. Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
  15. Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).
  16. Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
  17. Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44, (6), Nov/Dec (2016).
  18. Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
  19. Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23, (3), 98-102 (1994).
  20. Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40, (9), 1749-1756 (1994).
  21. O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. (2011).
  22. Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52, (7), 1643-1647 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics