मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके इन विट्रो माइक्रोन्यूक्लियस परख करने के लिए एक स्वचालित विधि

Bioengineering
 

Summary

इन विट्रो माइक्रोन्यूक्लियस परख जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है, लेकिन मैनुअल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परख स्कोरिंग कठिन है और विषयपरकता और अंतर-स्कोर परिवर्तनशीलता से ग्रस्त है। यह कागज बहुस्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके परख का एक पूर्ण स्वचालित संस्करण करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

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Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).

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Abstract

इन विट्रो माइक्रोन्यूक्लियस (MN) परख अक्सर cytotoxicity और जीनोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन मैनुअल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से परख स्कोरिंग कठिन है और स्कोरर के बीच परिवर्तनशीलता के कारण परिणामों में अनिश्चितता का परिचय. इसे ठीक करने के लिए, स्कोरर पूर्वाग्रह को दूर करने और थ्रूपुट में सुधार करने के प्रयास में स्वचालित स्लाइड-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ-साथ पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री विधियों को पेश किया गया है। हालांकि, इन विधियों की अपनी अंतर्निहित सीमाएं हैं जैसे सेल के कोशिकाद्रव्य की कल्पना करने में असमर्थता और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ दृश्य MN सत्यापन या छवि डेटा संग्रहण की कमी। मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (एमआईएफसी) में इन सीमाओं को दूर करने की क्षमता है। MIFC सांख्यिकीय मजबूती और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की गति के साथ माइक्रोस्कोपी के उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट कल्पना को जोड़ती है। इसके अतिरिक्त, सभी संग्रहीत इमेजरी को खुराक-विशिष्ट फ़ाइलों में संग्रहीत किया जा सकता है. यह काग़ज़ MIFC पर MN परख का एक पूरी तरह से स्वचालित संस्करण करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। मानव लिम्फोब्लास्टोबाइड TK6 कोशिकाओं एक hypotonic समाधान (75 एमएम KCl) का उपयोग कर बढ़े थे, 4% formalin के साथ तय की और परमाणु सामग्री Hoechst 33342 के साथ दाग था. सभी नमूने MIFC पर निलंबन में चला रहे थे, परख के लिए आवश्यक सभी प्रमुख घटनाओं के उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण की अनुमति (जैसे binucleated कोशिकाओं के साथ और एमएन के बिना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mononucleated और polynucleated कोशिकाओं). छवियाँ स्वचालित रूप से पहचान की गई, वर्गीकृत और MIFC डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में गणना, दोनों cytotoxicity और genotoxicity के स्वचालित स्कोरिंग के लिए अनुमति देता है. परिणाम प्रदर्शित करता है कि MIFC का उपयोग करने में इन विट्रो MN परख प्रदर्शन करने के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि की अनुमति देता है MN आवृत्ति में cytotoxicity के कई विभिन्न स्तरों पर पता लगाया जा करने के लिए जब विलायक नियंत्रण TK6 कोशिकाओं के जोखिम के बाद की तुलना में Mitomycin सी और Colchicine, और है कि MN आवृत्ति में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि मैनिटॉल के संपर्क के बाद मनाया जाता है.

Introduction

इन विट्रो माइक्रोन्यूक्लियस (MN) परख एक आमतौर पर इस्तेमाल किया परीक्षण के लिए इस तरह के रासायनिक और दवा के विकास के रूप में अध्ययन के कई क्षेत्रों में एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में cytotoxicity और जीनोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिन्न व्यक्तियों के संपर्क में मानव biomonitoring है पर्यावरण, व्यावसायिक या जीवन शैली कारक1,2,3. एम.एन. में कोशिका विभाजन के दौरान उत्पन्न गुणसूत्र के टुकड़े या संपूर्ण गुणसूत्र होते हैं जो दो मुख्य पुत्री नाभिकों में से किसी एक में समाविष् ट नहीं होते हैं। टेलोफेज के बाद, यह गुणसूत्र सामग्री कोशिका द्रव्य के अंदर एक व्यक्ति, गोल शरीर में होती है जो मुख्य नाभिक2में से किसी से अलग होती है। इसलिए, MN डीएनए क्षति के प्रतिनिधि हैं और जीनोटॉक्सिसिटी परीक्षण4में एक समापन बिंदु के रूप में कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है। MN को मापने के लिए सबसे उपयुक्त विधि साइटोकिनेसिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लियस (सीबीएमएन) परख है। CBMN परख का उपयोग करना, binucleated कोशिकाओं में MN की आवृत्ति (BNCs) नमूने में Cytochalasin बी (Cyt-B) को शामिल करके रन बनाए जा सकते हैं. Cyt-B परमाणु विभाजन की अनुमति देता है, लेकिन सेलुलर विभाजन को रोकता है और इस प्रकार, MN के स्कोरिंग BNCs है कि केवल एक बार5विभाजित किया है करने के लिए प्रतिबंधित करता है.

माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री दोनों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं और उन्हें मान्य किया गया है और इन विट्रो एम एन परख6,7,8,9 ,10, 11,12,13,14. माइक्रोस्कोपी लाभ नेत्रहीन पुष्टि करने में सक्षम होने से कि MN वैध हैं, लेकिन समय लगता है और स्कोरर15के बीच परिवर्तनशीलता के लिए प्रवण है. इसका समाधान करने के लिए, स्लाइडकोस्कैन को स्कैन करने और नाभिक ों की छवियों को कैप्चर करने के लिए स्वचालित माइक्रोस्कोपी विधियों को विकसित किया गया था ,17,18,19, लेकिन कोशिकाद्रव्य की कल्पना नहीं की जा सकती है, जिससे इसे बनाया जा सकता है यह निर्धारित करना कठिन है कि क्या कोई MN वास्तव में किसी विशिष्ट कक्ष से संबद्ध है. इसके अलावा, इन विधियों में पॉलीन्यूक्लिएट (पाली) कोशिकाओं (त्रि-तथा चतुष्कोणीय कोशिकाओं सहित) की पहचान करने में कठिनाई होती है जो साइट-बी9का उपयोग करते समय साइटोटॉक्सिसिटी की गणना के लिए आवश्यक होती हैं। एम एन परख करने के लिए विकसित प्रवाह साइटोमेट्री विधियों में फ्लोरोसेंट के साथ-साथ आगे और साइड स्कैटर तीव्रता को रोजगार दिया जाता है ताकि न्यूक्लियस और एमएन दोनों की आबादी की पहचान की जा सके जिन्हें लाइसिस20,21 के बाद सेल से मुक्त किया गया है। ,22. यह डेटा कुछ ही मिनटों में कई हजार कोशिकाओं से प्राप्त किया जा करने के लिए अनुमति देता है और स्वचालित विश्लेषण23परमिट; हालांकि, कोशिकाओं कल्पना करने में असमर्थता यह असंभव है कि रन बनाए घटनाओं वास्तविक हैं की पुष्टि करने के लिए बनाता है. इसके अतिरिक्त, कोशिका झिल्ली lysing Cyt-B के उपयोग को रोकता है और साथ ही एक निलंबन है कि इस तरह के गुणसूत्र समुच्चय या apoptotic निकायों के रूप में अन्य मलबे शामिल है बनाने और MN24से इन अंतर करने के लिए कोई रास्ता नहीं है.

इन सीमाओं के प्रकाश में, Multispectral इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (MIFC) MN परख प्रदर्शन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है क्योंकि यह सांख्यिकीय मजबूती और पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की गति के साथ माइक्रोस्कोपी के उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट कल्पना को जोड़ती है. MIFC में, सभी कोशिकाओं को एक fluidics प्रणाली में पेश कर रहे हैं और फिर hydrodynamicly एक प्रवाह सेल cuvette के केंद्र में ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. सभी कोशिकाओं के Orthogonal रोशनी एक brightfield के उपयोग के माध्यम से पूरा किया है (BF) प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी), एक पक्ष तितर बितर लेजर और (कम से कम) एक फ्लोरोसेंट लेजर. फ्लोरोसेंट फोटॉनों तीन में से एक (20x, 40x या 60x) उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य लेंस द्वारा कब्जा कर रहे हैं और फिर एक वर्णक्रमीय अपघटन तत्व के माध्यम से गुजरती हैं. फोटॉनों तो प्रवाह सेल के माध्यम से पारित है कि सभी कोशिकाओं के उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए एक चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। धुंधला या लकीर से बचने के लिए, सीसीडी समय देरी एकीकरण (TDI) मोड जो पंक्ति से पिक्सेल सामग्री को प्रवाह में सेल के वेग के साथ सिंक्रोनी में सीसीडी नीचे पंक्ति को स्थानांतरित करके पटरियों में चल रही है. पिक्सेल जानकारी तो पिक्सेल की अंतिम पंक्ति से एकत्र की है. TDI इमेजिंग वर्णक्रमीय अपघटन के साथ संयुक्त अप करने के लिए अनुमति देता है 12 छवियों (2 BF, 10 फ्लोरोसेंट) प्रवाह सेल के माध्यम से गुजर सभी कोशिकाओं से एक साथ कब्जा कर लिया. सभी पर कब्जा कर लिया इमेजरी नमूना-विशिष्ट डेटा फ़ाइलों में संग्रहीत की जाती है, जिससे एमआईएफसी डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किसी भी समय विश्लेषण करने की अनुमति दी जाती है. अंत में, डेटा फ़ाइलें सभी द्विचर भूखंडों पर सेलुलर छवियों और डॉट्स के बीच लिंक बनाए रखने. इसका मतलब यह है कि एक पारंपरिक द्विचर साजिश पर किसी भी डॉट पर प्रकाश डाला जा सकता है और इसकी इसी BF और फ्लोरोसेंट कल्पना25प्रदर्शित किया जाएगा .

हाल ही में, MIFC आधारित तरीकों दोनों triage विकिरण biodosimetry26,27,28,29,30,31 और आनुवंशिक के लिए MN परख प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया गया है विष विज्ञान32,33 परीक्षण. इस कार्य से यह पता चला है कि मुख्य नाभिक, एम एन और कोशिकाद्रव्य की कोशिकीय छवियों को अन्य विधियोंकीतुलना में अधिक थ्रूपुट के साथ छविित किया जा सकता है। विश्लेषण के लिए आवश्यक सभी सेल प्रकार, MONO कोशिकाओं सहित, BNCs (के साथ और MN के बिना), और POLY कोशिकाओं, स्वचालित रूप से MIFC डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पहचाना जा सकता है, और Fenech एट अल द्वारा विकसित स्कोरिंग मापदंड के कार्यान्वयन के माध्यम से पूरा किया है विभिन्न गणितीय एल्गोरिदम6,34का उपयोग करें। बायोडोसिमेट्री के परिणामों से पता चला है कि खुराक अनुक्रिया अंशांकन वक्र साहित्य में अन्य स्वचालित विधियों से प्राप्त किए गए वक्रों के परिमाण में समान थे जब बी एन सी29प्रति एम एन की दर की मात्रा निर्धारित की गई थी . इसके अतिरिक्त, toxicology में हाल ही में काम से पता चला है कि MONO कोशिकाओं की छवियों, BNCs (के साथ और MN के बिना) और POLY कोशिकाओं को स्वचालित रूप से कब्जा कर लिया जा सकता है, की पहचान की, वर्गीकृत और MIFC का उपयोग कर गणना. प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण ने टी के 6 कोशिकाओं को कई क्लैस्टोजन और एन्युजेन्स32में उजागर करने के बाद साइटोटॉक्सिसिटी और जीनोटॉक्सिसिटी की गणना को सक्षम किया .

इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल MIFC का उपयोग करइन विट्रो MN परख करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इस काम में इस्तेमाल नमूना प्रसंस्करण तकनीक एक एकल नमूना प्रक्रिया करने के लिए कम से कम 2 एच की आवश्यकता है और अपेक्षाकृत अन्य तरीकों की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए आसान है। MIFC विश्लेषण सॉफ्टवेयर में डेटा विश्लेषण जटिल है, लेकिन विश्लेषण टेम्पलेट का निर्माण इस कागज में उल्लिखित चरणों का पालन कुछ ही घंटों में पूरा किया जा सकता है. इसके अलावा, एक बार टेम्पलेट बनाया गया है, यह स्वचालित रूप से किसी भी आगे के काम के बिना सभी एकत्र डेटा के लिए लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल Clastogens और aneugens के लिए TK6 कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए आवश्यक सभी चरणों की रूपरेखा, संस्कृति, प्रक्रिया और कोशिकाओं को दाग करने के लिए कैसे का वर्णन करता है, और दर्शाता है कि कैसे उच्च संकल्प कल्पना MIFC का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, इस कागज MIFC सॉफ्टवेयर में डेटा का विश्लेषण करने के लिए स्वचालित रूप से पहचान और MONO कोशिकाओं, BNCs, और POLY कोशिकाओं दोनों cytotoxicity और जीनोटॉक्सिसिटी की गणना के प्रयोजनों के लिए स्कोर करने के लिए वर्तमान सर्वोत्तम प्रथाओं दिखाता है.

Protocol

1. संस्कृति माध्यम और TK6 कोशिकाओं की खेती की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कुछ रसायनों विषाक्त कर रहे हैं. साइटोचलसिन बी के साथ त्वचा को निगलना, निगलना या संपर्क करना घातक हो सकता है। एक प्रयोगशाला कोट और नाइट्रिल दस्ताने के दो जोड़े सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें. संभालने के बाद हाथों को अच्छी तरह से धो लें। Formalin/formaldehyde विषाक्त है अगर साँस या निगल लिया; आंखों, श्वसन प्रणाली, और त्वचा के लिए परेशान है; और साँस लेना या त्वचा से संपर्क द्वारा संवेदीकरण का कारण हो सकता है. आंखों को गंभीर क्षति का खतरा है। यह एक संभावित कासिफ्यहैन है।

  1. 1x RPMI संस्कृति माध्यम के 565 एमएल तैयार करें। एमईएम गैर-जरूरी अमीनो एसिड (100x), सोडियम पाइरुटेट (100 एमएल), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन (100x) के 5 एमएल और भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 50 एमएल को 500 एमएल 1x RPMI 1640 माध्यम की 500 एमएल बोतल में जोड़ें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में माध्यम तैयार है और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर दुकान. TK6 कोशिकाओं में जोड़ने से पहले मध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें (सामग्री की तालिकादेखें ) ।
  2. TK6 कोशिकाओं के 1एमएल (DMSO में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) मध्यम के 10 एमएल में था. 8 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को प्रेरित करें। कोशिकाओं को मीडिया के 50 एमएल में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% ब्व्2पर इनक्यूबेट करें। TK6 कोशिकाओं के दोहरीकरण समय से भिन्न होता है $12-18 ज और कुछ (3 या 4) मार्ग कोशिकाओं को अपनी अधिकतम प्रसार दर तक पहुँचने के लिए आवश्यक हो जाएगा (सामग्री की तालिकादेखें).
  3. संस्कृति 100 एमएल कोशिकाओं की एक एकाग्रता के लिए $ 7-8 x 105 कोशिकाओं /

2. क्लैस्टोजेन ्स्ड एन्युजेन्स और/

  1. वांछित clastogens और aneugens के उचित शेयर सांद्रता तैयार करें. उदाहरण के लिए, Mitomycin C के लिए, बाँझ पानी के 10 एमएल में एक पूर्ण 2 मिलीग्राम बोतल भंग करने के लिए 200 g/mL के एक अंतिम स्टॉक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए. मिटोमाइसिन सी को तीन महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है (सामग्री की सारणीदेखें )।
  2. प्रयोग के दिन, वांछित रसायनों है कि या तो 10 गुना या 100 गुना वांछित जोखिम सांद्रता से अधिक कर रहे हैं अगर बाँझ पानी या DMSO में कम, क्रमशः कमजोर कर रहे हैं की कमजोर पड़ने तैयार करते हैं.
  3. Mitomycin C के लिए, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, और 5.0 ग्राम/एमएल के बाँझ पानी में 3 एमएल कमजोर पड़ने तैयार करें। कोल्किसिन के लिए, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, और 0.5 ग्राम/ अंत में, मैनिटोल के लिए, 5, 10, 20, 30, 40, और 50 मिलीग्राम/एमएल के बाँझ पानी में 3 एमएल कमजोर पड़ने तैयार करें।
  4. एक 5 मिलीग्राम की बोतल को DMSO के 25 एमएल में भंग करके Cytochalasin B की 200 ग्राम/एमएल स्टॉक सांद्रता तैयार करें। Cytochalasin बी कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. क्लैस्टोजेन्स और/या एनेजेन्स के लिए कोशिकाओं का एक्सपोजर

  1. T25 फ्लास्क में $7-8x105 कोशिकाओं/एमएल पर 9 एमएल कोशिकाओं में वांछित रासायनिक (उदा. Mitomycin C) का 1 एमएल जोड़ें। नियंत्रण के नमूनों के लिए, बाँझ पानी के 1 एमएल जोड़ें. फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस में रखें, 3 ज के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर।
    नोट: यदि रसायन ों को DMSO में पतला कर रहे हैं, प्रत्येक फ्लास्क के लिए रासायनिक के केवल 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और नियंत्रण करने के लिए DMSO के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. प्रत्येक फ्लास्क में 9.900 एमएल कोशिकाएं होनी चाहिए।
  2. 3 ज के बाद, इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें और कोशिकाओं को 15 एमएल पॉलीप्रोपीलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 8 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेंट और स्थानांतरण कोशिकाओं को नए टी 25 फ्लास्क पर स्थानांतरित करें जिसमें ताजा संस्कृति माध्यम के कुल 10 एमएल होते हैं। 3 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक फ्लास्क में Cytochalasin B के स्टॉक सांद्रता (200 g/mL) का 150 $L जोड़ें।
  3. ओईसीडी के दिशा-निर्देशों 9 की सिफारिश के अनुसार फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर को 1.5-2.0 दोहरीकरण समय के बराबर वसूली समय के लिए वापस करें। TK6 इस काम में इस्तेमाल कोशिकाओं के लिए, वसूली समय 24 ज था.
    नोट: TK6 कोशिकाओं के दोहरीकरण समय यहाँ इस्तेमाल किया गया था 15 ज और 24 एच (1.6 दोहरीकरण बार) की वसूली समय इस्तेमाल किया गया था. वसूली बार कम से कम 1.5 दोहरीकरण बार BNCs की संख्या को प्रभावित उच्च खुराक के संपर्क में नमूनों में प्रसार कम हो जाएगा. इसके विपरीत, 2.0 से अधिक की वसूली बार नियंत्रण नमूनों में polynucleated कोशिकाओं की एक अनुपातहीन संख्या का उत्पादन होगा, विषम साइटोटॉक्सिसिटी गणना।

4. डीएनए सामग्री के निर्धारण और लेबलिंग के लिए बफर तैयार करना (सामग्री की तालिका देखें)

  1. 500 एमएल अल्ट्राप्यूर पानी में 2.79 ग्राम जोड़कर 75 एम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) तैयार करें। एक 200 डिग्री फिल्टर के माध्यम से एक चुंबकीय उत्तेजक और बाँझ फिल्टर का उपयोग कर 5 मिनट के लिए समाधान हिलाओ। 75 एम एम केसीएल समाधान को कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. प्रयोग के लिए पर्याप्त मात्रा में 4% फॉर्मेलिन तैयार करें, यह आशंका करते हुए कि प्रत्येक नमूने में कुल 2.1 एमएल जोड़ा जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, 4% फॉर्मलिन के 10 एमएल तैयार करने के लिए, Ca2+ या Mg2+ (PBS) के बिना 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफर नमकीन समाधान के 6 एमएल में 10% फॉर्मेलिन स्टॉक का 4 एमएल जोड़ें। यह 4% formalin कई हफ्तों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  3. 1x पीबीएस की 500 एमएल बोतल में FBS के 10 एमएल जोड़कर 510 एमएल वॉश बफर (2% FBS इन 1X पीबीएस) तैयार करें।
  4. 1X PBS के 9,900 डिग्री सेल्सियस में स्टॉक सांद्रता (1 मिलीग्राम/एमएल) के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़कर होचस्ट 33342 की 10 एमएल की 10 एमएल की 10 एमएल तैयार कीजिये। Hoechst 33342 समाधान कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. नमूना प्रसंस्करण: hypotonic सूजन, निर्धारण, सेल गिनती और लेबलिंग डीएनए सामग्री

  1. वसूली अवधि के अंत में, इनक्यूबेटर से सभी फ्लास्क को हटा दें और सभी नमूनों को 15 एमएल पॉलीप्रोपीलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 8 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सभी नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. सुपरनेटेंट को प्रेरित करें, कोशिकाओं को पुन: तैयार करें और 75 एम एम केसीएल के 5 एमएल को तीन बार व्युत्क्रम से धीरे-धीरे मिलाएं और 7 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए 4% फॉर्मलिन का 2 एमएल जोड़ें, तीन बार व्युत्क्रम से धीरे मिश्रण करें और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यह चरण एक "सॉफ्ट निर्धारण" के रूप में कार्य करता है।
  4. 8 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सभी नमूनों को सेंट्रीफ्यूज सुपरनेंट को एस्पेरेट करें और 20 मिनट के लिए 4% फॉर्मेलिन के 100 डिग्री एल में पुन: असाइन करें। यह चरण एक "हार्ड निर्धारण" के रूप में कार्य करता है।
  5. 8 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर 5 एमएल वॉश बफर और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सुपरनेंट को एस्पायर करें और वॉश बफर के 100 डिग्री एल में फिर से तैयार करें।
  6. सभी नमूनों को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  7. प्रति प्रति नमूना कक्षों की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूने पर कक्ष संख्या निष्पादित करें. नमूने अत्यधिक ध्यान केंद्रित किया जाएगा तो 1x पीबीएस में एक 1:100 कमजोर पड़ने (10 पीबीएस के 990 $L में नमूने के $L) की संभावना एक सटीक गिनती प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
    नोट: इस बिंदु पर यह एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर सेल मायने रखता है प्रदर्शन करने के लिए सबसे अच्छा है. केसीएल जोड़ना कोशिकाद्रव्य एक पारदर्शी उपस्थिति देता है, जिससे स्वचालित सेल काउंटरों के लिए उन्हें पहचानना मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, स्वचालित काउंटरों को उनके आकार के कारण पॉलीन्यूक्लिएटेड कोशिकाओं को स्कोर करने में कठिनाई होती है।
  8. यदि तुरंत MIFC पर नमूने नहीं चल रहा है, वे कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है. जब नमूने चलाने के लिए तैयार हो, तो प्रत्येक नमूने के लिए 1x106 कोशिकाओं/एमएल के अनुसार 100 g/mL का 5 $L जोड़ें। इसके अलावा 50 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए प्रति 100 डिग्री सेल्सियस प्रति आरNase के 50 डिग्री एल के 10 $ल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  9. माइक्रो-अपकेंद्रण सभी नमूनों पर 200 x ग्राम के लिए 8 मिनट और एक pippette का उपयोग करने के लिए supernatant छोड़ने $ 30 $L को दूर. यह सुनिश्चित करने के लिए कि ट्यूब में कोई बुलबुले हैं MIFC पर चलने से पहले सभी नमूनों को फिर से निलंबित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। भंवर मत करो.

6. शुरू करने और MIFC कैलिब्रेट करना

  1. म्यान सुनिश्चित करें, सिस्टम अंशांकन अभिकर्मक, debubbler, cleanser और स्टरलाइज़र कंटेनर भरे हुए हैं और अपशिष्ट टैंक खाली है। सिस्टम को पावर और MIFC सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल क्लिक करें. स्टार्टअप बटन क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि सभी अंशांकन प्रारंभ करें और परीक्षण चेक बॉक्स चेक बॉक्स चेक किया गया है। यह प्रणाली, लोड म्यान और सिस्टम अंशांकन अभिकर्मकों फ्लश, और प्रणाली जांचना होगा (सामग्री की तालिकादेखें).

7. MIFC पर नमूने चल रहा है

नोट: यह खंड एक 2 कैमरा MIFC का उपयोग मानता है। यदि 1 कैमरा MIFC का उपयोग कर रहे हैं, तो कृपया देखें अनुपूरक 1 - पूर्ण प्रोटोकॉल, अनुभाग 7 अधिग्रहण के दौरान भूखंडों के निर्माण के लिए

  1. MIFC डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर लॉन्च (सामग्री की तालिका देखें). चित्र 1 साधन सेटिंग्स दिखाता है। 405 एनएम लेजर चालू करें और लेजर शक्ति को10 mW (A ) पर सेट करें। अन्य सभी लेज़रों को अक्षम करें (एसएससी सहित)और चैनल ों के लिए BF सेट 1 और 9 (बी).। पुष्टि करें कि आवर्धन स्लाइडर 60x (C), उच्च संवेदनशीलता मोड चयनित है (D) पर सेट है, और यह कि केवल चैनल 1, 7, और 9 छवि गैलरी में दिखा रहे हैं।
  2. स्कैटरप्लॉट आइकन पर क्लिक करें. सभी जनसंख्या का चयन करें और Y-अक्ष पर X-अक्ष और पहलू अनुपात M01 पर क्षेत्र M01 का चयन करें. स्क्वायर क्षेत्र आइकन पर क्लिक करें और एकल कोशिकाओं के आसपास एक क्षेत्र आकर्षित. इस क्षेत्र एकल कक्षोंको नाम दें. भूखंड पर राइट क्लिक करें और क्षेत्रका चयन करें। एकल कक्ष क्षेत्र को हाइलाइट करें और x-निर्देशांकों को 100 और 900 में परिवर्तित करें और y-निर्देशांकों को 0ण्75 और 1 (चित्र 1I)में परिवर्तित करें.
  3. स्कैटरप्लॉट आइकन पर क्लिक करें. पैरेंट जनसंख्या के रूप में एकल कक्षों का चयन करें, X-अक्ष पर ग्रेडिएंट RMS M01 और Y-अक्ष पर ग्रेडिएंट RMS M07 का चयन करें. स्क्वायर क्षेत्र आइकन पर क्लिक करें और कोशिकाओं के बहुमत के आसपास एक क्षेत्र आकर्षित. इस क्षेत्र केंद्रित कक्षोंको नाम दें. भूखंड पर राइट क्लिक करें और क्षेत्रका चयन करें। केंद्रित कक्ष क्षेत्र को हाइलाइट करें और x-निर्देशांकों को 55 और 75 में परिवर्तित करें तथा y-निर्देशांकों को 9.5 और 20 में परिवर्तित करें (चित्र 1J).
  4. हिस्टोग्राम आइकन पर क्लिक करें. फ़ोकेड्ड सेल जनसंख्या का चयन करें और सुविधा के रूप में तीव्रता M07 का चयन करें. रैखिक क्षेत्र आइकन पर क्लिक करें और हिस्टोग्राम में मुख्य चोटी भर में एक क्षेत्र आकर्षित. इस क्षेत्र का नाम DNA-सकारात्मकहै। भूखंड पर राइट क्लिक करें और क्षेत्रका चयन करें। डीएनए-सकारात्मक क्षेत्र को हाइलाइट करें और निर्देशांकों को 2 x 105 और 2 x 106में बदलें। हिस्टोग्राम पर तीव्रता शिखर के आधार पर श्रेणी को समायोजित करना हो सकता है (चित्र 1)
  5. अधिग्रहण पैरामीटर सेट करें (चित्र 1E). फ़ाइल नाम और गंतव्य फ़ोल्डर निर्दिष्ट करें, घटनाओं की संख्या को 20,000 में बदलें, और DNA-सकारात्मक जनसंख्या का चयन करें.
  6. लोड (चित्र 1F) क्लिक करें और नियंत्रण नमूना MIFC में रखें। डेटा एकत्रित करने के लिए प्राप्त करें बटन क्लिक करें (चित्र 1G). प्राप्ति के पूरा हो जाने के बाद, नमूना वापस करने के लिए वापसी बटन क्लिक करें (चित्र 1H). साधन से नमूना ट्यूब निकालें. प्रयोग में शेष सभी नमूनों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.

8. IDEAS में एक डेटा फ़ाइल खोलना

  1. MIFC विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज लॉन्च (सामग्री की तालिकादेखें). फ़ाइल खोलें विज़ार्डप्रारंभ करने के लिए विश्लेषण प्रारंभ करें पर क्लिक करें. इच्छित अपरिष्कृत छवि फ़ाइल (.rif) पर ब्राउज़ करके किसी डेटा फ़ाइल का चयन करें. खोलें बटन क्लिक करें और अगलाक्लिक करें.
  2. चूंकि यह एक एकल रंग परख है, मुआवजा आवश्यक नहीं है इसलिए मुआवजा चरण को बायपास करने के लिए अगला क्लिक करें। इस स्तर पर लागू करने के लिए कोई विश्लेषण टेम्पलेट नहीं है, इसलिए अगला फिर से क्लिक करें. यदि विश्लेषण टेम्पलेट अनुपूरक सामग्री से डाउनलोड किया गया है, तो अभी इसका चयन करें. ये टेम्पलेट केवल अधिग्रहण के दौरान चैनल 7 में 1 और 9 और परमाणु इमेजरी के लिए BF सेट के साथ 2 कैमरा MIFC के साथ काम करते हैं।
  3. डिफ़ॉल्ट रूप से, .cif और .daf फ़ाइल नाम स्वचालित रूप से .rif से मेल करने के लिए जनरेट किया गया है। .cif और .daf के नाम बदलने की सिफारिश नहीं की जातीहै . अगलाक्लिक करें. 01 और 07का चयन करके छवि प्रदर्शन गुण सेट करें। अगलाक्लिक करें. इस अनुप्रयोग के लिए कोई विज़ार्ड नहीं है, इसलिए समाप्त करेंक्लिक करें. यह डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.daf) और विश्लेषण टेम्पलेट (.ast) अक्सर वर्गों 9-14 के दौरान प्रगति की हानि से बचने के लिए बचाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

9. मास्क और सुविधाओं का निर्माण BNCs की पहचान करने के लिए

  1. छवि गैलरी गुण आइकन (नीले/ गुण प्रदर्शित करें टैब में श्रेणी को पिक्सेल डेटा में सेट करें क्लिक करें और फिर रंग को पीले रंग में बदलें. ठीकक्लिक करें. Hoechst छवियों अब काले रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ देखने के लिए आसान कर रहे हैं.
  2. गैर-एपोटोटिक कोशिकाओं साजिश बनाएँ.
    1. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, फिर मास्कक्लिक करें. नया क्लिक करें फिर फ़ंक्शनक्लिक करें. फ़ंक्शन थ्रेशहोल्डचुनें के अंतर्गत, मास्क के अंतर्गत M07 चुनें और तीव्रता प्रतिशत को 50 पर सेट करें. ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो. बंदकरें क्लिक करें.
    2. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, सुविधाएँक्लिक करें, फिर नयाक्लिक करें. सुविधा प्रकार के लिए क्षेत्रका चयन करें. मास्क के लिए थ्रेशहोल्ड (M07,Ch07,50)का चयन करें। डिफ़ॉल्ट नाम सेट करें क्लिक करें और ठीकक्लिक करें. सुविधा मानों का परिकलन प्रारंभ करने के लिए बंद करें क्लिक करें.
    3. डॉट प्लॉट आइकन पर क्लिक करें. सभी जनसंख्या का चयन करें. X-अक्ष सुविधा के लिए Contrast[M01]Ch01 सुविधा चुनें और Y-अक्ष सुविधा के लिए Area$Threshold(M07,Ch07,50)चुनें. ठीकक्लिक करें.
    4. स्क्वायर क्षेत्र बटन पर क्लिक करें और कोशिकाओं के बहुमत के आसपास एक क्षेत्र आकर्षित. इस क्षेत्र को गैर-एपोटोटिककहते हैं। प्लॉट पर राइट क्लिक करें और क्षेत्रक्लिक करें. गैर-एपोटोटिक क्षेत्र पर प्रकाश डाला। x-निर्देशांकों को 0 और 15 पर सेट करें और y-निर्देशांकों को 50 और 300 पर सेट करें. बंदकरें क्लिक करें.
  3. केवल दो नाभिक वाले कक्षों की पहचान करने के लिए BNC मास्क (चरण 9.3.1-9.3.5) बनाएँ.
    1. छवि गैलरी में एक BNC के लिए ब्राउज़ करें और उस पर क्लिक करें. यह Hoechst चैनल में मुखौटा के निर्माण कल्पना है.
    2. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, फिर मास्कक्लिक करें. नया क्लिक करें फिर फ़ंक्शनक्लिक करें. फ़ंक्शन के अंतर्गत LevelSetचुनें, मास्क के अंतर्गत M07चुनें, मध्य स्तर मास्क रेडियो बटन का चयन करें, और कॉन्टूर विवरण स्केल को 3.00 पर सेट करें. ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो.
    3. नया क्लिक करें फिर फ़ंक्शनक्लिक करें. फ़ंक्शनके अंतर्गत, डिलेटचुनें, और मास्क के अंतर्गत LevelSet(M07,Ch07,मध्य,3)चुनें. छवि को Ch07 पर प्रदर्शित करने के लिए सेट करें, और पिक्सेल की संख्या को 2 पर सेट करें. ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो.
    4. नया क्लिक करें फिर फ़ंक्शनक्लिक करें. समारोह के तहत वाटरशेडचुनें , और मास्क के तहत डिलेट (LevelSet(M07,Ch07,मध्य,3)2)चुनें। छवि Ch07 को प्रदर्शित करने के लिए सेट करें, और 1 करने के लिए लाइन मोटाई सेट. ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो.
    5. नया क्लिक करें फिर फ़ंक्शनक्लिक करें. Function Choose Rangeके अंतर्गत, मास्क के अंतर्गत वाटरशेड चुनें (Dilate(LevelSet(M07,Ch07,मध्य,3)))| छवि को प्रदर्शित करने के लिए सेट करें Ch07. न्यूनतम और अधिकतम क्षेत्र मानों को क्रमशः 115 और 5000 पर सेट करें. न्यूनतम और अधिकतम पक्ष अनुपात मानों को क्रमशः 0.4 और 1 पर सेट करें. ठीक क्लिक करें. नाम फ़ील्ड में BNC पढ़ने के लिए पाठ परिवर्तित करें फिर ठीकक्लिक करें.
  4. अंतिम BNC जनसंख्या प्राप्त करने के लिए सुविधाओं और भूखंडों बनाएँ
    1. स्पॉट गणना BNC सुविधा: विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, तो सुविधाएँ,तो नई| सुविधा प्रकार के लिए स्पॉट गणनाका चयन करें | मास्कके लिए, 9.3.5 में बनाए गए अंतिम BNC मास्क का चयन करें. कनेक्टेडनेस को चार सेट करें और नाम बदलकर स्पॉट काउंट BNCमें बदलें. ठीक क्लिक करें फिर सुविधा मानों की गणना करने के लिए बंद करें.
    2. स्पॉट गणना BNC हिस्टोग्राम. हिस्टोग्राम चिह्न क्लिक करें. पैरेंट जनसंख्या के रूप में गैर-एपोप्टोटिक का चयन करें. X-अक्ष सुविधा के लिए स्पॉट गणना BNC सुविधा चुनें. ठीकक्लिक करें. रैखिक क्षेत्र आइकन पर क्लिक करें. बिन 2भर में एक क्षेत्र ड्रा . इस क्षेत्र 2Nको बुलाओ .
      नोट: अंतिम BNC जनसंख्या की पहचान करने के लिए शेष मास्क, सुविधाओं और भूखंडों को बनाने के लिए अनुपूरक 1 में अनुभाग 9 देखें - पूर्ण प्रोटोकॉल

10. BNC आबादी के भीतर MN की पहचान करने के लिए मास्क और सुविधाओं का निर्माण

  1. MN मास्क बनाएँ। एक BNC कि छवि गैलरी में एक MN शामिल हैं के लिए ब्राउज़ करें और उस पर क्लिक करें. यह Hoechst चैनल में MN मुखौटा के निर्माण की कल्पना है. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, फिर मास्कक्लिक करें.
    1. स्पॉट पहचान मास्क बनाएँ 1:
      1. नया क्लिक करें फिर फ़ंक्शनक्लिक करें. समारोह के तहत स्पॉट का चयन करें और उज्ज्वल रेडियो बटन का चयन किया जाता है सुनिश्चित करते हैं। मास्क चुनें M07के तहत , सेल पृष्ठभूमि अनुपात के लिए स्पॉट 2.00पर सेट . न्यूनतम त्रिज्या को 2 और अधिकतम त्रिज्या को 6पर सेट करें. ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो.
      2. नया क्लिक करें फिर फ़ंक्शनक्लिक करें. फ़ंक्शन के अंतर्गत श्रेणीचुनें, और मास्क के अंतर्गत LevelSet(M07,Ch07,मध्य,3)चुनें. छवि को प्रदर्शित करने के लिए Ch07सेट करें. न्यूनतम और अधिकतम क्षेत्र को क्रमशः 80 और 5000 पर सेट करें. न्यूनतम और अधिकतम पहलू अनुपात को क्रमशः 0 और 1 पर सेट करें. ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो.
      3. नया क्लिक करें फिर फ़ंक्शनक्लिक करें. फ़ंक्शन के अंतर्गत Dilateचुनें, मास्क चुनें Range(LevelSet(M07,Ch07,मध्य,3),80-5000,0-1)के अंतर्गत. छवि को प्रदर्शित करने के लिए Ch07सेट करें. पिक्सेल की संख्या को 2पर सेट करें. ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो.
      4. नयाक्लिक करें. स्पॉट पर डबल क्लिक करें (M07, Ch07, उज्ज्वल, 2, 6, 2) मुखौटा मुखौटा यह मुखौटा परिभाषा करने के लिए जोड़ने के लिए. और ऑपरेटर और उसके बाद नहीं ऑपरेटर क्लिक करें। डबल क्लिक करें Dilate (रेंज(LevelSet(M07, Ch07, मध्य, 3), 80-5000, 0-1), 2) मुखौटा मुखौटा इसे मुखौटा परिभाषा में जोड़ने के लिए. ठीकक्लिक करें.
      5. नयाक्लिक करें, फिर फ़ंक्शन. फ़ंक्शन के अंतर्गत श्रेणी का चयन करें और मास्क के अंतर्गत 10.1.1.4 में बनाया गया मास्क चुनें:
        1. स्पॉट (M07, Ch07, उज्ज्वल, 2, 6, 2) और नहीं Dilate (रेंज (LevelSet(M07, Ch07, मध्य, 3), 80-5000, 0-1, 2)का चयन करें।
        2. छवि को Ch07 पर प्रदर्शित करने के लिए सेट करें. न्यूनतम और अधिकतम क्षेत्र को क्रमशः 10 और 80 पर सेट करें. न्यूनतम और अधिकतम पहलू अनुपात को क्रमशः 0.4 और 1 पर सेट करें। ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो. स्पॉट पहचान मुखौटा 1 पूरा हो गया है.
          नोट: अंतिम MN जनसंख्या की पहचान करने के लिए मास्क, सुविधाओं और भूखंडों बनाने के लिए अनुपूरक 1 में अनुभाग 10 देखें - पूर्ण प्रोटोकॉल

11. मोनोन्यूक्लिएट और पॉलीन्यूक्लिएट आबादी की पहचान करने के लिए मास्क, सुविधाओं और भूखंडों का निर्माण करें

  1. POLY मास्क बनाएँ। क्लिकविश्लेषण , तो मास्क, तो नया तो समारोह. समारोह के तहत चुनेंरेंज, मास्क चुनें वाटरशेड (Dilate(LevelSet(M07, Ch07, मध्य, 3), 2))| छवि को प्रदर्शित करने के लिए सेट करें Ch07. न्यूनतम और अधिकतम क्षेत्र मानों को क्रमशः 135 और 5000 पर सेट करें. न्यूनतम और अधिकतम पहलू अनुपात मानों को क्रमशः 0.4 और 1 पर सेट करें. ठीकक्लिक करें. नाम फ़ील्ड में, POLY पढ़ने के लिए पाठ परिवर्तित करें फिर ठीक क्लिक करें फिर बंदकरें. बहुकेंद्रकी सेल मास्क पूरा हो गया है.
  2. POLY घटक मास्क बनाएँ.
    1. POLY घटक मास्क 1: विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, फिर मास्क,फिर नई,फिर फ़ंक्शन. फ़ंक्शन के अंतर्गत घटकका चयन करें, और मास्क के अंतर्गत POLY मास्क का चयन करें. रैंकिंग फ़ीचर के लिए क्षेत्रका चयन करें, और क्रम सॉर्ट करने के लिए अवरोही रेडियो बटन क्लिक करें. 1के लिए रैंक सेट करें. ठीक क्लिक करें फिर ठीक हो.
    2. POLY घटक मास्क 2, 3 और 4: व्यक्तिगत घटक मास्क बनाने के लिए 2, 3 और 4 के लिए सेट रैंक को छोड़कर 11.2.1 में सभी चरणों को दोहराएँ।
  3. पाली मुखौटा का उपयोग कर स्पॉट गणना.
    1. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, फिर सुविधाएँ,फिर नई. फ़ीचर प्रकारके लिए, स्पॉट गणनाका चयन करें. मास्क के लिए POLY मुखौटा चुनें और कनेक्टेस को 4पर सेट करें. डिफ़ॉल्ट नाम सेट करें क्लिक करें और ठीक क्लिक करें फिर सुविधा मानों की गणना करने के लिए बंद करें.
    2. हिस्टोग्राम चिह्न क्लिक करें. गैर-एपोटोटिक जनसंख्या का चयन करें। X-अक्ष सुविधा के लिए स्पॉट Count$POLI$4 सुविधा चुनें.
    3. मोनो स्पॉट गिनती क्षेत्र. रैखिक क्षेत्र आइकन पर क्लिक करें. 11.3.2 में बनाया हिस्टोग्राम पर बिन 1 भर में एक क्षेत्र ड्रा. इस क्षेत्र 1Nको बुलाओ .
    4. TRI स्पॉट गिनती क्षेत्र. रैखिक क्षेत्र आइकन पर क्लिक करें. 11.3.2 में बनाया हिस्टोग्राम पर बिन 3 भर में एक क्षेत्र ड्रा. इस क्षेत्र 3Nको बुलाओ .
    5. QUAD MONO स्पॉट गिनती क्षेत्र. रैखिक क्षेत्र आइकन पर क्लिक करें. 11.3.2 में बनाया हिस्टोग्राम पर बिन 4 भर में एक क्षेत्र ड्रा. इस क्षेत्र 4Nको बुलाओ .
  4. मोनो जनसंख्या की पहचान करें।
    1. MONO पहलू अनुपात सुविधा बनाएँ. विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, फिर सुविधाएँ,फिर नई. सुविधा प्रकार केअंतर्गत, पहलू अनुपात सुविधा का चयन करें और मास्क चयन घटक(1, क्षेत्र, पाली, अवरोही)के अंतर्गत. डिफ़ॉल्ट नाम सेट करें क्लिक करें फिर ठीकक्लिक करें.
    2. MONO परिपत्र सुविधा बनाएँ। सुविधा प्रबंधक विंडो अभी भी खुली के साथ, नयाक्लिक करें. फ़ीचर प्रकार केअंतर्गत, सर्कुलरता सुविधा का चयन करें और मास्क चयन घटक(1, क्षेत्र, पाली, अवरोही)के अंतर्गत. डिफ़ॉल्ट नाम सेट करें क्लिक करें और फिर ठीक क्लिक करें और फिर सुविधा मानों की गणना करने के लिए बंद करें क्लिक करें.
    3. वृत्ताकार MONO कोशिकाओं डॉट प्लॉट के लिए, डॉट प्लॉट चिह्न क्लिक करें. पैरेंट जनसंख्या के रूप में 1N का चयन करें. X अक्ष फ़ीचर के लिए Circularity-Component(1, क्षेत्र, पाली, अवरोही) का चयन करें और Y अक्ष फ़ीचर के लिए Aspect Ratio$Component(1, Area, POLY, Descending)चुनें. ठीकक्लिक करें. स्क्वायर क्षेत्र बटन पर क्लिक करें और प्लॉट के ऊपरी दाएँ भाग की ओर सेल जनसंख्या के आस-पास का क्षेत्र आरेखित करें. इस क्षेत्र को नाम दें परिपत्र]1N. प्लॉट पर राइट क्लिक करें और क्षेत्रक्लिक करें. परिपत्र $1N क्षेत्र को हाइलाइट करें. X निर्देशांकों को 20 और 55 में बदलें और Y निर्देशांकों को 0.85 और 1.0 में परिवर्तित करें. बंदकरें क्लिक करें.
    4. क्षेत्र POLY/Area$M07 सुविधा बनाएँ। विश्लेषण टैब पर क्लिक करें, फिर सुविधाएँ,फिर नई. सुविधा प्रकार केअंतर्गत, क्षेत्र सुविधा का चयन करें और मास्क चयन घटक(1, क्षेत्र, पाली, अवरोही)के अंतर्गत. डिफ़ॉल्ट नाम सेट करें क्लिक करें फिर ठीकक्लिक करें.
    5. सुविधा प्रबंधक विंडो अभी भी खुली के साथ, नया क्लिक करें तो सुविधा प्रकार के अंतर्गत संयुक्त रेडियो बटन क्लिक करें। सुविधाओं की सूची से, Area$Component(1, Area, POLY, Descending) को हाइलाइट करें और सुविधा परिभाषा में जोड़ने के लिए नीचे तीर क्लिक करें. विभाजन प्रतीक (/) क्लिक करें. Area$M07 सुविधा का चयन करें और सुविधा परिभाषा में जोड़ने के लिए नीचे तीर क्लिक करें. डिफ़ॉल्ट नाम सेट करें क्लिक करें और ठीकक्लिक करें. सुविधा मानों का परिकलन प्रारंभ करने के लिए बंद करें क्लिक करें.
    6. अंतिम MONO जनसंख्या डॉट प्लॉट के लिए, डॉट प्लॉट चिह्न क्लिक करें. पैरेंट जनसंख्या के रूप में Circular$1N का चयन करें. X अक्ष फ़ीचर के लिए Aspect Ratio$M07 चुनें और Y अक्ष फ़ीचर के लिए Area$Component(1, Area, POLY, Descending) / ठीकक्लिक करें. स्क्वायर क्षेत्र बटन पर क्लिक करें और कोशिकाओं के बहुमत के आसपास एक क्षेत्र आकर्षित. इस क्षेत्र को एकानुवेष् स्थितनाम दें. प्लॉट पर राइट क्लिक करें और क्षेत्रक्लिक करें. एकानुकेंद्रित क्षेत्र पर प्रकाश डाला। X निर्देशांकों को 0.85 और 1.0 में बदलें और Y निर्देशांकों को 0.55 और 1.0 में बदलें. बंदकरें क्लिक करें.
      नोट: अंतिम trinucleated और polynucleated आबादी की पहचान करने के लिए मास्क, सुविधाओं और भूखंडों बनाने के लिए पूरक 1 में धारा 11 को देखें।

12. BNC और MN मास्क की जांच करने के लिए एक कस्टम दृश्य बनाएँ

  1. छवि गैलरी गुण बटन पर क्लिक करें फिर दृश्य टैब पर क्लिक करें. कंपोजिट टैब पर क्लिक करें फिर नयाक्लिक करें. के तहत नाम प्रकार Ch01/ छवि जोड़ें क्लिक करें. छवि के अंतर्गत Ch01 चुनें और 100 करने के लिए प्रतिशत सेट करें। छवि फिर से जोड़ें क्लिक करें, छवि के अंतर्गत Ch07 चुनें और 100 पर प्रतिशत सेट करें.
  2. नया क्लिक करें और नाम प्रकार BNC और MN मास्क के अंतर्गत
  3. स्तंभ जोड़ेंक्लिक करें. छवि प्रकार के अंतर्गत Ch01 चुनें और मास्क के अंतर्गत कोई नहीं चुनें
  4. स्तंभ जोड़ेंक्लिक करें. छवि प्रकार के अंतर्गत Ch07 चुनें और मास्क के अंतर्गत कोई नहीं चुनें
  5. स्तंभ जोड़ेंक्लिक करें. छवि प्रकार के अंतर्गत Ch07 चुनें और मास्क के अंतर्गत BNC चुनें
  6. स्तंभ जोड़ेंक्लिक करें. छवि प्रकार के तहत Ch07 चुनें और मास्क के तहत MN मुखौटा चुनें
  7. स्तंभ जोड़ेंक्लिक करें. छवि प्रकार के अंतर्गत कम्पोजिट रेडियो बटन क्लिक करें. Ch01/Ch07 समग्र छवि स्वचालित रूप से दृश्य में जोड़ा जाना चाहिए। छवि गैलरी गुण विंडो बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें.

13. POLY मास्क की जाँच करने के लिए कोई कस्टम दृश्य बनाएँ

  1. अनुभाग 13 को Supplement 1 में देखें - POLY मास्क की जाँच करने के लिए कोई कस्टम दृश्य बनाने के लिए पूर्ण प्रोटोकॉल

14. मुख्य घटनाओं की गणना करने के लिए एक आँकड़े तालिका बनाएँ

  1. रिपोर्ट टैब पर क्लिक करें फिर सांख्यिकी रिपोर्ट निर्धारितकरें क्लिक करें. नई विंडो में, स्तंभजोड़ें क्लिक करें.
  2. BNC गणना आंकड़ा जोड़ें. सांख्यिकी के अंतर्गत गणना का चयन करें और चयनित जनसंख्या के अंतर्गत BNCs जनसंख्या चुनें. सूची में आँकड़ों को जोड़ने के लिए आँकड़े जोड़ें क्लिक करें.
  3. MN BNCs, MONO, TRI और POLY जनसंख्या के लिए अलग-अलग स्तंभ बनाने के लिए चरण 14-2 दोहराएँ. बंद करें क्लिक करें फिर ठीकक्लिक करें.
  4. डेटा विश्लेषण टेम्पलेट पूर्ण है (चित्र 2) . टेम्पलेट सहेजें (फ़ाइल, टेम्पलेट के रूप में सहेजें). पूर्ण मुखौटा सूची पूरक 2 - मास्क सूचीमें पाया जा सकता है .

15. बैच प्रक्रिया प्रयोग फ़ाइलें डेटा विश्लेषण टेम्पलेट का उपयोग कर

  1. उपकरण मेनू के अंतर्गत बैच डेटा फ़ाइलें क्लिक करें फिर नई विंडो में बैच जोड़ें क्लिक करें.
  2. नई विंडो में बैच में जोड़ने के लिए प्रयोग फ़ाइलें (.rif) चुनने के लिए फ़ाइलें जोड़ें पर क्लिक करें. किसी टेम्पलेट या डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.ast, .daf) का चयन करें विकल्प के अंतर्गत, चरण 14.4 में सहेजे गए डेटा विश्लेषण टेम्पलेट (.ast फ़ाइल) को ब्राउज़ करने और खोलने के लिए फ़ोल्डर चिह्न क्लिक करें.
  3. आंकड़ा तालिका का पूर्वावलोकन करने के लिए सांख्यिकी रिपोर्ट का पूर्वावलोकन करें बटन क्लिक करें. कोई मान यहाँ प्रदर्शित नहीं किया जाएगा क्योंकि वे अभी तक गणना नहीं की गई है. हालांकि, यह चरण बैच चलाने से पहले उचित विश्लेषण टेम्पलेट का चयन किया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए एक जाँच के रूप में कार्य करता है।
  4. वर्तमान विंडो को बंद करने के लिए ठीक क्लिक करें. फिर सभी फ़ाइलों के बैच संसाधन प्रारंभ करने के लिए बैच सबमिट करें क्लिक करें।
  5. बैच संसाधन पूर्ण होने पर, सभी .rif फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर में .txt फ़ाइल उपलब्ध होगी. जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी की गणना करने के लिए इन आँकड़ों का उपयोग करें।

16. जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी पैरामीटर की गणना करना

  1. जीनोटॉक्सिसिटी की गणना: जीनोटॉक्सिसिटी की गणना करने के लिए, 15.5 में बनाई गई सांख्यिकी तालिका का उपयोग करें। MN BNCs जनसंख्या में कोशिकाओं की संख्या BNCs जनसंख्या में कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करें तो 100 से गुणा:
    Equation 1
  2. cytotoxicity की गणना: TRI और QUAD कोशिकाओं की संख्या संक्षेप में POLY कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करें.
    1. MONO, BNCs और POLY में कोशिकाओं की संख्या का उपयोग करके Cytokinesis-ब्लॉक प्रसार सूचकांक (CBPI) की गणना निम्नानुसार:
      Equation 2
    2. अंत में, नियंत्रण संस्कृतियों (सी) और रासायनिक उजागर संस्कृति (टी) से CBPI मूल्यों का उपयोग करके प्रत्येक संस्कृति के cytotoxicity की गणना इस प्रकार है:
      Equation 3

Representative Results

इस पत्र में उल्लिखित विश्लेषण विधि जीनोटॉक्सिसिटी की गणना करने के लिए, बीएनसी की स्वचालित पहचान और स्कोरिंग के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, मोनो और पाली कोशिकाओं को भी स्वचालित रूप से पहचान कर रहे हैं और cytotoxicity की गणना करने के लिए रन बनाए. प्रकाशित स्कोरिंग मापदंड6,34 कि जब इन घटनाओं स्कोरिंग MIFC डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लागू कर रहे हैं का पालन किया जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत परिणामों से संकेत मिलता है कि कोशिका विषाक् तता में वृद्धि के साथ एम एन आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि मानव लिम्फोब्लास्टोइड TK6 कोशिकाओं के प्रदर्शन के बाद प्रसिद्ध MN रसायनों को प्रेरित करने के लिए पता लगाया जा सकता है (Mitomycin सी और Colchicine). परीक्षण किए गए अतिरिक्त रसायनों के समान परिणाम एक अलग प्रकाशन32में प्रदर्शित किए गए हैं . इसके अलावा, मैनिटॉल के उपयोग से परिणाम बताते हैं कि गैर-MN inducing रसायनों भी सही ढंग से MIFC विधि यहाँ उल्लिखित का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. प्रोटोकॉल में वर्णित मानकों सभी मास्क बनाने के लिए, सुविधाओं और क्षेत्र की सीमाओं की संभावना समायोजित किया जाना होगा अगर विभिन्न सेल प्रकार (जैसे चीनी Hamster कोशिकाओं) परख प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया जाता है.

चित्र 3 BNCs की पहचान करने के लिए चार चयनित पैनलों को दर्शाता है (चित्र 3ए-3डी) । यहाँ दिखाया गया एक हिस्टोग्राम है जो दो नाभिकों के साथ कोशिकाओं के चयन को सक्षम बनाता है (चित्र 3 क) और द्विचर भूखंडों जो समान परिपत्र के साथ BNCs के चयन को सक्षम करते हैं ( चित्र3), समान क्षेत्र और तीव्रता ( चित्र3ब् ) ) और बीएनसी जो अच्छी तरह से अलग है , गैर-ओवरलैपिंग नाभिक (चित्र 3डी) स्कोर क्रिटिरिया6,34के अनुसार . चित्र 3 BF और Hoechst छवियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से BNC और MN मास्क से पता चलता है कि एक या एकाधिक MN के साथ BNCs की पहचान की और गणना की जा सकती है. यह अंतिम BNC जनसंख्या में micronucleated BNCs की दर का निर्धारण करके genotoxicity की गणना करने की अनुमति देता है. चित्र 4 MONO, TRI और QUAD कोशिकाओं की पहचान करने के लिए पाली मास्क का उपयोग करके स्पॉट गणना सुविधा के अनुप्रयोग को दर्शाता है। तब TRI और QUAD कक्षों की संख्या को POLY (तालिका1) की अंतिम संख्या प्राप्त करने के लिए अभिव्यक्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल में दिखाए गए सूत्र का उपयोग करके cytotoxicity की गणना करने में सक्षम बनाता है। इसलिए, प्रयोग में प्रत्येक खुराक बिंदु दोनों जीनोटॉक्सिसिटी और cytotoxicity मापदंडों द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.

चित्र 5 में एनुजेन कोलचिसिन, क्लैस्टोजेन माइटोमाइसिन सी और एक नकारात्मक नियंत्रण, मैनिटॉल के लिए जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यों को दर्शाता है। कोल्चिसिनके लिए( चित्र 5) 0.02 से 0.05 ग्राम/एमएल खुराकों का उत्पादन एम एन आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि करता है, जो विलायक नियंत्रण (सारणी 1) पर क्रमश 1.28% से 2.44% तक है । मिटोमाइसिन सी ( चित्र5बी) के मामले में विलायक नियंत्रणों की तुलना में 0ण्4 और 0ण्5 ग्राम/एमएल की दो शीर्ष खुराकें सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण एम एन आवृत्तियों का उत्पादन करती हैं। ये एमएन आवृत्तियों 0.4 g/mL पर 0.93% और 0.5 g/mL (तालिका 2) पर 1.02% थे। अंत में, मैनिटॉल के लिए (चित्र 5ब्) कोई खुराक परीक्षण 30% से अधिक एक साइटोटॉक्सिसिटी प्रेरित, और न ही वे विलायक नियंत्रण की तुलना में एम एन आवृत्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि का उत्पादन किया, के रूप में की उम्मीद (तालिका 3) .

Figure 1
चित्र 1 : MIFC साधन सेटिंग्स। प्रोटोकॉल के अनुभाग चरण 7 में वर्णित के रूप में MIFC सेटिंग्स का एक स्क्रीनशॉट। () 10 mW करने के लिए 405 एनएम लेजर शक्ति की स्थापना. (बी) BF चैनलों 1 और 9 की स्थापना. () 60x आवर्धन उद्देश्य लेंस का चयन. (D) सबसे धीमी प्रवाह गति का चयन करना जो उच्चतम रिज़ॉल्यूशन के साथ इमेजरी उत्पन्न करता है. () 20,000 तक एकत्र किए जाने वाले ईवेंट की संख्या निर्दिष्ट करता है. (F) नमूना लोड प्रक्रिया शुरू करने के लिए लोड बटन पर क्लिक करके। (जी) इमेजरी प्राप्त करना शुरू करने के लिए अधिग्रहण बटन पर क्लिक करना. (एच) किसी भी अप्रयुक्त नमूना वापस करने के लिए वापसी बटन पर क्लिक करके। (I) एकल कोशिकाओं के चयन के लिए बीएफ आस्पेक्ट अनुपात बनाम बीएफ क्षेत्र का स्कैटरप्लॉट। (जे) केंद्रित कोशिकाओं के चयन के लिए होचस्ट ग्रेडिएंट आरएमएस बनाम बीएफ ग्रेडिएंट आरएमएस का स्कैटरप्लॉट। (K) डीएनए सकारात्मक कोशिकाओं के चयन के लिए होइक्स्ट तीव्रता का हिस्टोग्राम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : विश्लेषण सॉफ्टवेयर gating रणनीति. प्रोटोकॉल के अनुभाग 9 में वर्णित gating रणनीति का एक स्क्रीनशॉट. क्षेत्र द्विकेंद्रीय कोशिकाओं (लाल बॉक्स), माइक्रोन्यूक्लिई (पीला बॉक्स), और मोनो और पॉलीन्यूक्लिएड कोशिकाओं (नीले बॉक्स) की पहचान के लिए अनुक्रमिक क्रम में दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : पहचान और MN के बिना और बिना BNCsके स्कोरिंग . (क) दो अलग-अलग नाभिक ों वाले कोशिकाओं का चयन। (ख) द्विकेंद्रित कोशिकाओं की पहचान (बीएनसी) जिनमें पहलू अनुपात तीव्रता सुविधा के उपयोग के माध्यम से दो उच्च वृत्ताकार नाभिक होते हैं। (ग) बीएनसी का चयन, जिनमें नाभिक समान क्षेत्रों और तीव्रताओं के साथ होता है। यह नाभिक के क्षेत्रफल के अनुपात तथा दोनों नाभिकों के पक्ष अनुपात के अनुपात की गणना करके पूरा किया जाता है। (घ) दो सुविकल नाभिक वाले बीएनसी की पहचान करने के लिए आकृति अनुपात और पहलू अनुपात विशेषताओं का उपयोग। () माइक्रोन्यूक्लियस (एमएन) मास्क का उपयोग करके स्पॉट काउंट सुविधा का प्रदर्शन करता है कि एक या एकाधिक एम एन के साथ बीएनसी की पहचान की जा सकती है और उनकी गणना की जा सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : पहचान और मोनो और पाली कोशिकाओं कीस्कोरिंग। मोनो-, ट्राइ और क्वान्यूक्लियड कोशिकाओं की पहचान करने और गणना करने के लिए स्पॉट काउंट सुविधा का उपयोग। घटक मुखौटा 1 मोनोन्यूक्लिएयट कोशिकाओं (शीर्ष छवि) की पहचान की अनुमति देता है। घटक मास्क 1 से 3 trinucleated कोशिकाओं (मध्य छवि) की पहचान की अनुमति देता है. घटक मास्क 1 से 4 के माध्यम से क्वार्न्यूक्लियड कोशिकाओं (नीचे छवि) की पहचान की अनुमति देता है। यह आंकड़ा रोड्रिगेज 201832से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : साइटोटॉक्सिसिटी का परिमाणीकरण। साइटोकिनेसिस ब्लॉक प्रसार सूचकांक (ब्लैक सर्कल) और जीनोटॉक्सिसिटी का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई है, जिसमें एम एन (क्लियर बार) के प्रतिशत का उपयोग करते हुए 3 एच जोखिम और 24 एच वसूली के बाद () कोल्किसिन , (बी) मिटोमाइसिन सी और ( सी) मैनिटॉल। नियंत्रण की तुलना में एमएन आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि सितारों द्वारा संकेत दिया जाता है (ची-वर्ग परीक्षण; *पी और एलटी; 0.05, *पी और lt; 0.01, * *p और lt; 0.001)। सभी मात्राएं प्रत्येक खुराक बिंदु पर दो प्रतिकृतियों का औसत हैं। यह आंकड़ा रोड्रिगेज 201832से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1: Cytotoxicity की गणना करने के लिए आवश्यक पैरामीटर (एकाकी की संख्या, द्वि और polynucleated कोशिकाओं) और genotoxicity (संख्या और micronucleated binucleated कोशिकाओं का प्रतिशत) Colchicine के लिए. सभी परिकलित मात्राएँ प्रत्येक खुराक बिंदु पर दो प्रतिकृतियों का औसत हैं.

Table 2
तालिका 2: Tवह मानकों साइटोटॉक्सिसिटी की गणना करने के लिए आवश्यक (एकाकी की संख्या, द्वि और polynucleated कोशिकाओं) और जीनोटॉक्सिसिटी (संख्या और micronucleated binucleated कोशिकाओं का प्रतिशत) Mitomycin सी के लिए. सभी परिकलित मात्राएँ प्रत्येक खुराक बिंदु पर दो प्रतिकृतियों का औसत हैं.

Table 3
तालिका 3: साइटोटॉक्सिसिटी की गणना करने के लिए आवश्यक पैरामीटर (एकाकी की संख्या, द्वि-और बहुकेंद्रकी कोशिकाओं) और जीनोटॉक्सिसिटी (माइक्रोन्यूक्लिएयड द्विकेंद्रकी कोशिकाओं की संख्या और प्रतिशत) मैनिटॉल के लिए। सभी परिकलित मात्राएँ प्रत्येक खुराक बिंदु पर दो प्रतिकृतियों का औसत हैं.

Supplement 1: पूर्ण प्रोटोकॉल. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक 2: सूची मास्क. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हाल ही में एक प्रकाशन में वर्मा एट अल एक प्रणाली है कि डेटा और छवि विश्लेषण35के छवि भंडारण लाभ के साथ प्रवाह साइटोमेट्री के उच्च थ्रूपुट लाभ को जोड़ती है विकसित करने के महत्व को रेखांकित किया. इस पत्र में वर्णित इन विट्रो एम एन परख में एमआईएफसी इस उद्धरण को हल करता है और माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री विधियों में ऊपर उल्लिखित कई चुनौतियों को दूर करने की क्षमता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल दर्शाता है कि दोनों cytotoxicity और genotoxicity MIFC का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. नमूना तैयारी, सेलुलर धुंधला और डेटा संग्रह सीधा कर रहे हैं, लेकिन वहाँ प्रोटोकॉल है कि हमेशा लागू किया जाना चाहिए में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं. कोशिकाओं में पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) के अलावा कोशिकाओं को प्रफुल्लित करने के लिए महत्वपूर्ण है, मुख्य नाभिक के बीच जुदाई पैदा. यह सुनिश्चित करता है कि मास्किंग एल्गोरिथ्म BNCs और पाली कोशिकाओं (पाली कोशिकाओं) जो उनके गणना के लिए आवश्यक है में सभी व्यक्तिगत नाभिक की पहचान कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, केसीएल नाभिक और एमएन के बीच पृथक्करण प्रदान करता है, जो सटीक एमएन मास्किंग और परिमाणीकरण के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, केसीएल के अलावा के बाद Formalin का उपयोग centrifugation के दौरान lysing से कोशिकाओं को रोकता है. Cytochalasin बी के अलावा TK6 कोशिकाओं है कि एक से अधिक परमाणु विभाजन आया है काफी बड़ी होने का कारण बनता है. एक परिणाम के रूप में, कोशिका द्रव्य नाजुक हो जाता है और lyse कर सकते हैं अगर centrifugation के तुरंत बाद KCl के अलावा किया जाता है. इसके अलावा, यह नमूने में कोशिकाओं की संख्या के अनुसार नमूना करने के लिए Hoechst परिचय और एक अंतिम एकाग्रता के अनुसार नहीं बहुत महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, Hoechst के 10 g/mL की एक अंतिम एकाग्रता समान रूप से 1 x 106 कोशिकाओं का एक नमूना दाग होगा, लेकिन पर्याप्त रूप से एक नमूना युक्त दाग नहीं हो सकता है 5 x 106 कोशिकाओं और dimly दाग नाभिक के साथ कई कोशिकाओं में परिणाम कर सकते हैं, विश्लेषण मुश्किल बना रही है. यह भी ध्यान दें कि Hoechst ऐसे DAPI के रूप में एक और डीएनए डाई के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है अगर MIFC 405 एनएम उत्तेजना लेजर या DRAQ5 के साथ सुसज्जित है अगर MIFC 488 एनएम और / यदि परमाणु दाग को संशोधित करने, यह आवश्यक / वांछित लेजर शक्ति के लिए उपयुक्त एकाग्रता खोजने के लिए दाग titrate करने के लिए महत्वपूर्ण है।

MIFC पर डेटा एकत्रित करते समय यह ग्रेडिएंट RMS सुविधाओं के लिए इष्टतम क्षेत्र सीमाओं का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सीमाओं MIFC उपकरणों के बीच कुछ मामूली बदलाव के कारण समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. डेटा संग्रह के दौरान इस सुविधा का अनुप्रयोग यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि अत्यधिक केंद्रित इमेजरी कैप्चर की गई है. डेटा फ़ाइलों में कई धुंधला या uncentriced छवियों होते हैं, यह संभव है कि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में मास्किंग एल्गोरिदम गलत तरीके से धुंधला क्षेत्रों में धुंधला कलाकृतियों पर प्रकाश डाला जाएगा, झूठी सकारात्मक कलाकृतियों की एक उच्च संख्या के लिए अग्रणी MN के रूप में रन बनाए जा रहा है. हालांकि यहाँ वर्णित छवि प्रसंस्करण तकनीक मुश्किल हो सकता है, एक बार एक विश्लेषण टेम्पलेट MIFC सॉफ्टवेयर में विकसित किया गया है, बैच प्रसंस्करण डेटा फ़ाइलों के लिए स्वचालित रूप से विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देता है, उपयोगकर्ता हस्तक्षेप को नष्ट करने और इसलिए, स्कोरर पूर्वाग्रह. इसके अलावा, अगर TK6 कोशिकाओं के अलावा किसी अन्य सेल लाइन परख करने के लिए उपयोग किया जाता है, यह मास्क और क्षेत्र सीमाओं को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा के रूप में morphological गुण (जैसे, आकार) कोशिकाओं के TK6 कोशिकाओं के उन लोगों से अलग होगा.

यहाँ प्रस्तुत परिणाम (चित्र 5) एम एन प्रेरण में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाने के लिए जब Mitomycin सी और Colchicine की विभिन्न खुराक के लिए TK6 कोशिकाओं को उजागर. विलायक नियंत्रण की तुलना में एम एन की आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि दोनों रसायनों में कई खुराकों के लिए मनाया गया. इसके अलावा, मैनिटॉल की कोई खुराक 30% से अधिक एक साइटोटॉक्सिसिटी प्रेरित, और न ही विलायक नियंत्रण की तुलना में एम एन की आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि, जैसा कि उम्मीद थी। इन विट्रो MN परख प्रदर्शन करने के लिए MIFC का उपयोग कर इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल दोनों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण रसायनों से अपेक्षित परिणाम देता है. एम एन की आवृत्ति के साथ-साथ साइटोकिनेसिस ब्लॉक प्रसार सूचकांक (सीबीपीआई) दोनों के आधारभूत मूल्यों को विकसित करने के लिए विलायक नियंत्रण और ऋणात्मक नियंत्रण रसायनों दोनों का उपयोग करके कई प्रयोग करना बहुत महत्वपूर्ण है। जनविषता के लिए, एम एन आवृत्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि आधार रेखा एम एन आवृत्तियों जो सेल प्रकार का इस्तेमाल किया जा रहा के लिए अच्छी तरह से जाना जाना चाहिए की तुलना के माध्यम से निर्धारित कर रहे हैं. इसके अलावा सभी cytotoxicity गणना नियंत्रण नमूनों के सीबीपीआई पर आधारित हैं और इसलिए, मोनो, BNCs और POLY कोशिकाओं की आधारभूत दरों को नियंत्रण में अच्छी तरह से मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए।

एम एन परख के संदर्भ में एमआईएफसी के उपयोग की अनेकसीमाएं और लाभ पिछले कार्य 29,32में वर्णित किए गए हैं . मुख्य सीमाओं कम MN आवृत्तियों चिंता जब माइक्रोस्कोपी की तुलना में, जो शायद लचीलापन की कमी से दोनों का परिणाम है जब विश्लेषण सॉफ्टवेयर में स्कोरिंग मापदंड को लागू करने के साथ ही MIFC के क्षेत्र की सीमित गहराई. अच्छी तरह से समोच्च मास्क सही मुख्य नाभिक की पहचान करने के लिए बनाया जा सकता है, लेकिन MN कि छू रहे हैं (या बहुत करीब) मुख्य नाभिक BNC मुखौटा के भीतर कब्जा कर लिया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, बहुत छोटे MN कि बल्कि आसानी से माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रन बनाए जा सकते हैं शायद गलत तरीके से याद कर रहे हैं जब MIFC का उपयोग कर MN मुखौटा के क्षेत्र पैरामीटर पर कम सीमा के कारण छोटे कलाकृतियों स्कोरिंग से बचने के लिए. छवि आधारित डेटा विश्लेषण में मौजूद कठिनाइयों के अलावा, इसके डिजाइन के कारण, MIFC तीन आयामी सेलुलर वस्तुओं के दो आयामी प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करता है. यह संभावना कुछ MN ध्यान की एक अलग गहराई पर कब्जा कर लिया है कि दो मुख्य MN, उन्हें बहुत मंद और un-scorable मास्किंग का उपयोग कर दिखाई देता है का कारण बनता है. इसके अलावा, MN का एक छोटा सा अंश दो मुख्य नाभिकों में से एक के पीछे रह सकता है, जिससे उन्हें कल्पना करना और स्कोर करना असंभव हो जाता है। इसलिए, इन कठिनाइयों पर विचार, सावधानी का उपयोग किया जाना चाहिए जब कम खुराक पर MN आवृत्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि की व्याख्या.

इन कमियों के बावजूद, MIFC विधि यहाँ वर्णित अन्य तकनीकों पर कई लाभ प्रदान करता है. Fenech एट अल प्रस्तावित मानदंड और दिशा निर्देशों कि जब MN assays36के लिए स्वचालित प्रणाली और तरीकों के विकास पर विचार किया जाना चाहिए . ये शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, मुख्य नाभिक और कोशिका द्रव्य के प्रत्यक्ष दृश्य, रासायनिक या एजेंट की विभिन्न खुराक से एमएन की आवृत्ति का निर्धारण परीक्षण किया जा रहा है और आकृति विज्ञान की मात्रा और सभी की स्थिति निर्धारित करने की क्षमता नाभिक और MN सुनिश्चित करने के लिए वे कोशिका द्रव्य के भीतर हैं. इस पत्र से पता चलता है कि MIFC विधि इन विट्रो MN परख संतुष्ट करने के लिए विकसित (या संतुष्ट करने की क्षमता के पास) इन मानदंडों. विशेष रूप से, नाभिक और एमएन की छवियों फ्लोरोसेंट लेज़रों द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है, जबकि कोशिकाद्रव्यी कल्पना बीएफ एलईडी का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. सामान्य परमाणु आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं की छवि स्वचालित रूप से उन्नत मास्क और सुविधाओं का एक संयोजन का उपयोग अनियमित आकृति विज्ञान के साथ उन कोशिकाओं से विभेदित किया जा सकता है. कोल्चिसिन और मिटोमाइसिन सी के लिए प्रस्तुत परिणामोंसे पता चलताहै कि विलायक नियंत्रणों की तुलना में जीनोटॉक्सिसिटी और साइटोटॉक्सिसिटी दोनों का मूल्यांकन विभिन्न खुराकों पर किया जा सकता है और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण एम एन आवृत्तियों को देखा जाता है जहां अपेक्षित. इसके अलावा, ओईसीडी टेस्ट गाइडलाइन 487 साइटोटॉक्सिसिटी9निर्धारित करने के लिए प्रति परीक्षण एकाग्रता के साथ कम से कम 500 कोशिकाओं के साथ जीनोटॉक्सिसिटी का निर्धारण करने के लिए एमएन की उपस्थिति का आकलन करने के लिए परीक्षण एकाग्रता प्रति 2,000 BNCs स्कोर करने की सिफारिश की; यह मैनुअल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर 1 एच से अधिक ले जा सकते हैं। प्रोटोकॉल और इस पत्र में परिणाम बताते हैं कि के बारे में 6,000 BNCs, 16,000 मोनो कोशिकाओं, और 800 POLY कोशिकाओं के एक औसत पर कब्जा कर लिया और के बारे में 20 मिनट में परीक्षण एकाग्रता के प्रति रन बनाए थे. डेटा अधिग्रहण की तेजी से दर और इतने कम समय में बनाए गए उम्मीदवार कोशिकाओं की उच्च संख्या इन विट्रो एमएन परख करने के लिए एमआईएफसी को रोजगार देने के एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ को उजागर करती है।

जबकि इस पत्र में प्रस्तुत परिणाम उत्साहजनक हैं, वे एक प्रारंभिक सबूत के अवधारणा विधि के प्रतिनिधि हैं. इस काम के बाद एक बड़ा, अधिक विविध रासायनिक सेट है कि कई वर्गों और जीनोटॉक्सिसिटी और cytotoxicity के तंत्र को शामिल किया गया है जैसे कि Kirkland एट अल द्वारा सुझाए गए उन लोगों के द्वारा और अधिक गहन जांच द्वारा पीछा किया जाना चाहिए37 ऐसे अध्ययनों का आयोजन कर रहे हैं समय लेने वाली और श्रम गहन, और इस कागज के दायरे के बाहर गिर हालांकि, इन बड़े पैमाने पर अध्ययन विधि की क्षमता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए मज़बूती से कमजोर genotoxic एजेंटों की पहचान करेगा. यहाँ प्रस्तुत पद्धति अभी तक एक microwell प्रारूप है, जो एक बड़ी खुराक रेंज भर में और अधिक तेजी से और कुशल स्क्रीनिंग की अनुमति होगी करने के लिए miniaturized नहीं किया गया है. इस प्रकार, अपने वर्तमान रूप में, MIFC आधारित इन विट्रो MN परख यहाँ प्रस्तुत सबसे अच्छा श्रम गहन अनुवर्ती अध्ययन या अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं में अनुसंधान के लिए उपयुक्त हो सकता है. हालांकि, विधि अनुकूलित और मान्य किया जा करने के लिए जारी रहेगा, और आकृति विज्ञान से संबंधित रासायनिक विशिष्ट घटनाओं का पता लगाने में वृद्धि हुई लचीलापन के लिए अनुमति देने की क्षमता के पास, इस तरह के aneugen जोखिम है कि के साथ कोशिकाओं के अनुपात बढ़ जाती है के रूप में अभी भी स्कॉरेबल38हैं कि गैर-वृत्तीय नाभिक । अंत में, MIFC विधि MN प्रेरण के तंत्र का एक अधिक व्यापक दृश्य प्रदान करने के लिए MN परख (जैसे kinetochore धुंधला) में अतिरिक्त biomarkers शुरू करने का अवसर प्रस्तुत करता है.

Disclosures

लेखक Luminex निगम, ImageStream multispectral इमेजिंग प्रवाह cytometer है कि इस काम में इस्तेमाल किया गया था के निर्माता द्वारा कार्यरत है.

Acknowledgments

लेखक धन्यवाद क्रिस्टीन Probst (Luminex निगम) डेटा विश्लेषण टेम्पलेट के पिछले रूपों के विकास में उसके प्रयासों के लिए, साथ ही डॉ हैली Pugsley (Luminex निगम) और डॉ फिल Morrissey (Luminex निगम) की समीक्षा करने और संपादन के लिए पांडुलिपि.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath - PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

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