다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

Bioengineering
 

Summary

시험관 내 미세핵 분석은 유전체 독성 및 세포 독성을 평가하기 위한 잘 확립된 방법이지만 수동 현미경 을 사용하여 분석법을 채점하는 것은 힘들고 주관성 및 득점자 간 가변성으로 고통받고 있습니다. 이 논문은 다중 스펙트럼 화상 진찰 유동 세포측정을 사용하여 분석의 완전 자동화된 버전을 능력을 발휘하기 위하여 개발된 프로토콜을 기술합니다.

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Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).

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Abstract

시험관 내 마이크로핵 (MN) 분석은 세포 독성 및 유독성을 평가하기 위하여 수시로 이용됩니다 그러나 수동 현미경 검사법을 통해 분석결과를 득점하는 것은 힘들고 득점자 사이 가변성 때문에 결과에 있는 불확실성을 소개합니다. 이를 해결하기 위해 자동 슬라이드 스캐닝 현미경 검사법과 기존의 유세포 분석 방법이 도입되어 득점자 편향을 제거하고 처리량을 개선했습니다. 그러나, 이러한 방법은 세포의 세포질을 시각화할 수 없고 유세포측정을 통한 시각적 MN 검증 또는 이미지 데이터 스토리지의 부족과 같은 고유한 한계를 가지고 있다. 다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정 (MIFC)는 이 한계를 극복할 가능성이 있습니다. MIFC는 현미경 검사법의 고해상도 형광 이미지와 기존의 유세포 분석의 통계적 견고성 및 속도를 결합합니다. 또한 수집된 모든 이미지는 용량별 파일에 저장할 수 있습니다. 이 백서에서는 MIFC에서 MN 분석의 완전 자동화버전을 수행하기 위해 개발된 프로토콜에 대해 설명합니다. 인간 림프모세포 TK6 세포를 저혈압 용액(75 mM KCl)을 사용하여 확대하였고, 4% 포르말린으로 고정하고 핵 함량을 Hoechst 33342로 염색하였다. 모든 샘플은 MIFC에서 현탁액으로 실행되어 분석에 필요한 모든 주요 이벤트의 고해상도 이미지 획득을 허용했습니다(예를 들어 MN유무에 관계없이 양핵세포뿐만 아니라 단핵핵및 다핵구세포). MIFC 데이터 분석 소프트웨어에서 이미지를 자동으로 식별, 분류 및 동그마리로 표시하여 세포 독성과 유전독성을 자동으로 채점할 수 있습니다. 결과는 MIFC를 사용하여 시험관 내 MN 분석기를 수행하면 TK6 세포의 노출 후 용매 대조군과 비교할 때 MN 주파수의 통계적으로 유의한 증가를 세포 독성의 여러 다른 수준에서 검출할 수 있음을 보여줍니다. 미토마이신 C 및 콜치친, 그리고 만니톨에 노출된 후 MN 빈도의 유의한 증가가 관찰되지 않는다는 것을.

Introduction

시험관 내 마이크로핵구(MN) 분석실험은 화학및 제약개발뿐만 아니라 다양한 에 노출된 개인들 간의 인간 생체모니터링과 같은 여러 연구 분야에서 세포독성 및 유전독성을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 시험이다. 환경, 직업 또는라이프 스타일 요인 1,2,3. MN은 2개의 주요 딸 핵의 한으로 통합되지 않는 세포 분열 도중 생성된 염색체 단편 또는 전체 염색체로 이루어져 있습니다. 말단 말단 에 이어, 이 염색체 물질은 주요 핵 2중 하나에서 분리되는 세포질 안쪽에개별, 둥근 바디로 형성합니다. 따라서, MN은 DNA 손상을 대표하며, 수년 동안 유독성 검사4. MN을 측정하는 가장 적합한 방법은 사이토카인시스 블록 미세핵법(CBMN) 분석법이다. CBMN 분석법, 양핵세포(BNCs)에서의 MN의 빈도는 시토칼라신 B(Cyt-B)를 샘플내로 통합함으로써 채점될 수 있다. Cyt-B는 핵 분열을 허용하지만 세포 분열을 방지하므로 MN의 점수를번만 분할한 BNC로 제한합니다.

현미경 검사법과 유세포분석법을 모두 이용한 프로토콜이 개발및 검증되었으며 시험관 내 MN 분석6,7,8,9,10, 11,12,13,14. 현미경 검사법은 MN이 합법적이지만 시간이 많이 걸리고 득점자15사이의 가변성을 가지고 있음을 시각적으로 확인할 수 있다는 이점을 제공합니다. 이를 해결하기 위해, 자동화 된 현미경 검사법은 슬라이드를 스캔하고 핵과 MN16,17,18,19의이미지를 캡처하기 위해 개발되었지만 세포질은 시각화 할 수 없으므로 MN이 실제로 특정 셀과 연관되어 있는지 확인하기가 어렵습니다. 더욱이, 이들 방법은 Cyt-B 9를 사용할 때 세포독성의 계산에 필요한 다핵(POLY) 세포(삼중 및 사분면세포 포함)를 식별하는 데 어려움을 겪는다. MN 분석법을 수행하기 위해 개발된 유세포분석법은 포염20,21에 이어 세포로부터 해방된 핵과 MN 모두의 집단을 식별하기 위해 전방 및 측 산란 강도뿐만 아니라 형광을 채용한다. ,22. 이를 통해 몇 분 안에 수천 개의 셀에서 데이터를수집할 수 있으며 자동화된 분석(23)을 허용합니다. 그러나 셀을 시각화할 수 없기 때문에 점수가 매겨진 이벤트가 정품인지 확인할 수 없습니다. 추가적으로, 세포막을 용해시키는 것은 Cyt-B의 사용을 억제할 뿐만 아니라 염색체 응집체 또는 세포사멸 체와 같은 다른 이물질을 포함하는 현탁액을 생성하고 이를 MN24와구별할 방법이 없다.

이러한 한계에 비추어, 다중 스펙트럼 이미징 유동 세포측정법(MIFC)은 현미경검사법의 고해상도 형광 이미지와 기존의 유세포분석의 통계적 견고성 및 속도를 결합하기 때문에 MN 분석법을 수행하는 이상적인 시스템입니다. MIFC에서 모든 세포는 유체 학 시스템으로 도입된 다음 유체 역학적으로 유동 세포 큐벳의 중심으로 집중됩니다. 모든 세포의 직교 조명은 브라이트필드(BF) 발광 다이오드(LED), 측면 산란 레이저 및(적어도) 하나의 형광 레이저를 사용하여 수행된다. 형광 광자는 3개(20x, 40x 또는 60x) 높은 수치 조리개 대물 렌즈 중 하나에 의해 포착된 다음 스펙트럼 분해 요소를 통과합니다. 그런 다음 광자가 충전 결합 장치(CCD) 카메라에 초점을 맞추어 유동 셀을 통과하는 모든 셀의 고해상도 이미지를 얻습니다. 흐리거나 줄무늬를 방지하기 위해 CCD는 흐름이 흐르는 셀의 속도와 동기화하여 CCD를 행에서 행아래로 연속으로 전송하여 개체를 추적하는 시간 지연 통합(TDI) 모드에서 작동합니다. 그런 다음 픽셀 정보는 마지막 픽셀 행에서 수집됩니다. 스펙트럼 분해와 결합된 TDI 이미징을 통해 최대 12개의 이미지(2 BF, 10 형광)를 유동 세포를 통과하는 모든 세포에서 동시에 캡처할 수 있습니다. 캡처된 모든 이미지는 샘플별 데이터 파일에 저장되어 MIFC 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 언제든지 분석을 수행할 수 있습니다. 마지막으로 데이터 파일은 모든 이변량 도표에서 셀룰러 이미지와 점 사이의 링크를 유지합니다. 즉, 기존의 이변량 플롯의 모든 점을 강조 표시할 수 있으며 해당 BF 및 형광 이미지가25로표시됩니다.

최근, MIFC 기반 의 방법은 분류 방사선 생체 도질학26,27,28,29,30,31 및 유전 모두에 대한 MN 분석법을 수행하기 위해 개발되었다. 독성학32,33 테스트. 이 연구는 주요 핵, MN 및 세포질의 세포 이미지가 다른 방법26보다더 높은 처리량으로 이미지화될 수 있음을 입증했다. MONO 셀, BNC(MN 유무) 및 폴리 셀을 포함한 분석에 필요한 모든 세포 유형은 MIFC 데이터 분석 소프트웨어에서 자동으로 식별될 수 있으며, Fenech et al.에 의해 개발된 채점 기준의 구현은 이를 통해 달성됩니다. 다양한 수학 알고리즘6,34의사용 . 생체 측정법으로부터의 결과는 BNC29당MN의 비율을 정량화할 때 문헌의 다른 자동화된 방법으로부터 수득된 것과 크기면에서 투여량 응답 교정 곡선이 유사하다는 것을 보여주었다. 또한, 독성학의 최근 작업은 MONO 세포, BNC (MN 유무에 관계없이) 및 POLY 세포의 이미지가 MIFC를 사용하여 자동으로 캡처, 식별, 분류 및 열거 될 수 있음을 입증했습니다. 프로토콜 및 데이터 분석은 TK6 세포를 여러 클라스토겐 및 기뉴겐(32)에 노출한 후세포 독성 및 유전독성의 계산을 가능하게 하였다.

본 백서에 제시된 프로토콜은 MIFC를 사용하여 시험관내 MN 분석법을 수행하는 방법을 설명한다. 이 작업에 사용되는 샘플 처리 기술은 단일 샘플을 처리하는 데 2시간 미만이 필요하며 다른 방법에 비해 상대적으로 쉽게 수행할 수 있습니다. MIFC 분석 소프트웨어의 데이터 분석은 복잡하지만 이 백서에 설명된 단계에 따라 몇 시간 안에 분석 템플릿을 만들 수 있습니다. 또한 템플릿이 만들어지면 추가 작업 없이 수집된 모든 데이터에 자동으로 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 TK6 세포를 클라스토겐및 어뉴겐에 노출하는 데 필요한 모든 단계를 간략하게 설명하고, 세포를 배양, 처리 및 염색하는 방법을 설명하고, MIFC를 사용하여 고해상도 이미지를 획득하는 방법을 보여줍니다. 또한 이 백서는 세포 독성과 유전독성을 모두 계산하기 위한 목적으로 MONO 세포, BNC 및 폴리 세포를 자동으로 식별하고 점수를 매기기 위해 MIFC 소프트웨어의 데이터를 분석하기 위한 현재 모범 사례를 보여줍니다.

Protocol

1. TK6 세포의 배양 배지 및 배양 준비

참고 : 이 프로토콜에 사용되는 일부 화학 물질은 독성이 있습니다. 사이토칼라신 B와 피부를 흡입, 삼키거나 접촉하는 것은 치명적일 수 있습니다. 실험실 코트와 니트릴 장갑 2켤레를 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 취급 후 손을 철저히 씻으십시오. 포르말린 / 포름 알데히드는 흡입하거나 삼켰을 때 독성이 있습니다. 눈, 호흡기 및 피부에 자극적입니다. 흡입이나 피부 접촉에 의한 과민성을 유발할 수 있습니다. 눈에 심각한 손상의 위험이 있습니다. 그것은 잠재적인 발암 물질.

  1. 1x RPMI 배양 배지의 565 mL를 준비합니다. MEM 비필수 아미노산 5 mL(100x), 피루바트 나트륨 5 mL(100 mM), 페니실린-스트렙토마이신 글루타민 5mL(100x), 태아 소 혈청 50mL(FBS) 500 mL을 1x RPMI 160의 500 mL 병에 추가합니다. 바이오 세이프티 캐비닛에 배지를 준비하고 2-8°C에 보관하십시오. TK6 셀에 첨가하기 전에 중간을 37°C로 가열합니다(재료 참조).
  2. TK6 세포의 1 mL (DMSO에서 -80 °C에서 저장)의 10 mL 배지에서 해동. 세포를 200 x g에서 8 분 동안 원심 분리하고 상월체를 흡인합니다. 세포를 50 mL의 매체로 옮기고 37°C, 5%CO2에서 배양한다. TK6 세포의 두 배 시간은 ~12-18 h에서 변화하고 몇 (3 또는 4) 대구는 세포가 최대 증식 속도에 도달하는 데 필요합니다 (재료 참조).
  3. 배양 100 mL의 세포농도 ~7-8 x 105 세포/mL로 배양하였다.

2. 클라스토겐 및/또는 아노겐 및 사이토칼라신 B의 준비

  1. 원하는 클라스토겐과 어우겐의 적절한 재고 농도를 준비합니다. 예를 들어, 미토마이신 C의 경우, 멸균수 10 mL에 2 mg 병을 완전히 녹여 최종 재고 농도200 μg/mL를 달성합니다. 미토마이신 C는 3개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다(재료 참조).
  2. 실험 당일, 멸균수 나 DMSO에서 각각 희석하는 경우 원하는 노출 농도보다 10 배 또는 100 배 높은 원하는 화학 물질의 희석을 준비하십시오.
  3. 미토마이신 C의 경우 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0 μg/mL의 멸균수에서 3 mL 희석을 준비합니다. 콜치신의 경우 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 μg/mL의 멸균수에서 3 mL 희석을 준비합니다. 마지막으로, Mannitol의 경우 5, 10, 20, 30, 40 및 50 mg/mL의 멸균수에서 3 mL 희석을 준비합니다.
  4. 5 mg 병을 DMSO 25 mL로 용해시킴으로써 Cytochalasin B의 200 μg/mL 재고 농도를 준비합니다. 사이토칼라신 B는 -20°C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있다.

3. 클라스토겐 및 / 또는 어뉴런에 세포의 노출

  1. T25 플라스크에서 ~ 7-8x105 세포/mL에서 9 mL의 세포에 원하는 화학 물질 (예 : 미토 마이신 C)의 1 mL을 추가하십시오. 대조군 시료의 경우 멸균수 1mL를 추가합니다. 플라스크를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 3시간 동안 놓습니다.
    참고: 화학물질이 DMSO에서 희석되는 경우, 각 플라스크에 100 μL의 화학물질만 추가하고 대조군DMSO 100 μL을 추가합니다. 각 플라스크는 9.900 mL의 세포를 포함해야 한다.
  2. 3시간 후, 인큐베이터로부터 플라스크를 제거하고 세포를 15 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 제거한다. 200 x g에서 8분 동안 원심분리기를, 상수세포를 흡인하고, 총 10 mL의 신선한 배양 배지를 함유하는 새로운 T25 플라스크로 세포를 이송한다. 각 플라스크에 Cytochalasin B의 재고 농도(200 μg/mL)의 150 μL을 추가하여 최종 농도3 μg/mL를 달성합니다.
  3. OECD 가이드라인 9에 의해 권장되는 바와 같이 플라스크를 37°C, 5% CO2 인큐베이터로 반납하여1.5-2.0 배의 회수 시간 동안. 이 작업에 사용된 TK6 세포의 경우, 회복 시간은 24시간이었다.
    참고: 여기서 사용된 TK6 세포의 두 배 시간은 15시간이고 24시간(1.6배 배)의 회수 시간이 사용되었다. 회수 시간 1.5 배 미만은 BNC의 수에 영향을 미치는 더 높은 용량에 노출 된 샘플의 증식을 감소시킬 것입니다. 반대로, 2.0 이상의 회복 시간은 대조군 샘플에서 불균형한 수의 다핵세포를 생성합니다. 세포 독성 계산을 왜곡.

4. DNA 함량의 고정 및 라벨링을위한 완충제 준비 (재료 표 참조)

  1. 초순수 2.79g에 500mL를 추가하여 염화칼륨(KCl)의 75mM를 준비합니다. 200 μm 필터를 통해 마그네틱 교반기 및 멸균 필터를 사용하여 5분 동안 용액을 저어줍니다. 75 mM KCl 용액은 몇 개월 동안 4°C에서 보관될 수 있다.
  2. 실험에 충분한 양의 4% 포르말린을 준비하고, 각 샘플에 총 2.1 mL을 첨가해야 합니다. 예를 들어, 4% 포르말린의 10 mL을 준비하려면 Ca2+ 또는 Mg2+ (PBS)없이 1x Dulbecco의 인산완충 식염수 용액의 6 mL에 10 % 포르말린 스톡 4 mL을 추가하십시오. 이 4 % 포르말린은 몇 주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.
  3. 1x PBS의 500 mL 병에 10 mL의 FBS를 추가하여 세척 버퍼 (1X PBS의 2 % FBS)의 510 mL을 준비하십시오.
  4. 1X PBS의 9,900 μL에 100 μL의 재고 농도(1 mg/mL)를 추가하여 Hoechst 33342의 100 μg/mL 농도의 100 μg/mL을 준비합니다. Hoechst 33342 용액은 몇 개월 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.

5. 견본 가공: hypotonic 팽윤, 고정, 세포 계산 및 DNA 내용 표지

  1. 회수 기간이 끝나면 인큐베이터에서 모든 플라스크를 제거하고 모든 샘플을 15 mL 폴리 프로필렌 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다. 원심분리기 는 8 분 동안 200 x g의 모든 샘플을 채우지 않습니다.
  2. 상월체를 흡인하고, 세포를 재중단하고 75 mM KCl. 5 mL을 추가하여 3회 반전하고 4°C에서 7분 동안 배양한다.
  3. 각 샘플에 4% 포르말린 2 mL를 넣고 3회 반전하여 부드럽게 섞고 4°C에서 10분간 배양합니다. 이 단계는 "소프트 고정"으로 작동합니다.
  4. 원심분리기 모든 샘플을 200 x g에서 8분 동안. 상수부 흡인하고 20분 동안 4% 포르말린의 100 μL로 재중단합니다. 이 단계는 "하드 고정"으로 작동합니다.
  5. 200 x g에 200 x g에 5 mL의 세척 버퍼를 추가하여 8 분 동안 상수부를 흡인하고 100 μL의 세척 버퍼에서 다시 일시 중단하십시오.
  6. 모든 샘플을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김.
  7. 각 샘플에 대한 셀 수를 수행하여 샘플당 셀 수를 확인합니다. 샘플은 고농축되므로 정확한 개수를 얻기 위해서는 1x PBS(PBS 990 μL의 시료 10 μL)에서 1:100 희석이 필요할 가능성이 높습니다.
    참고 : 이 시점에서 혈세포계를 사용하여 세포 수를 수행하는 것이 가장 좋습니다. KCl을 추가하면 세포질이 반투명하게 나타나므로 자동화된 셀 카운터가 이를 인식하기가 어렵습니다. 또한, 자동화 된 카운터는 크기로 인해 다핵 세포를 채점하는 데 어려움이 있습니다.
  8. MIFC에서 시료를 즉시 실행하지 않을 경우, 며칠 동안 4°C에서 보관할 수 있다. 시료를 실행할 준비가 되면 각 샘플에 1x106 셀/mL당 5 μL의 100 μg/mL를 추가합니다. 또한 50 μg/mL의 최종 농도를 위해 시료 100 μL당 RNase 의 500 μg/mL 10 μL을 추가합니다. 샘플을 37°C, 5% CO2에서 30분 동안 배양합니다.
  9. 마이크로 원심분리기 는 8 분 동안 200 x g의 모든 샘플을 사용하고 피펫을 사용하여 ~ 30 μL을 떠나는 상류를 제거합니다. MIFC에서 실행하기 전에 파이펫을 사용하여 모든 샘플을 다시 일시 중단하여 튜브에 기포가 없도록 합니다. 소용돌이를 하지 마십시오.

6. MIFC 시작 및 교정

  1. 칼집, 시스템 교정 시약, 디버터, 클렌저 및 멸균기 용기가 가득 찼고 폐탱크가 비어 있는지 확인하십시오. 시스템의 전원을 켜고 MIFC 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭합니다. 시작 버튼을 클릭하고 모든 교정 및 테스트 시작 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다. 이렇게 하면 시스템을 플러시하고, 외신 및 시스템 교정 시약이 세척되고, 시스템을 교정합니다(재료 참조).

7. MIFC에서 샘플 실행

참고: 이 섹션에서는 2개의 카메라 MIFC를 사용한다고 가정합니다. 1 카메라 MIFC를 사용하는 경우, 수집 하는 동안 플롯의 생성에 대 한 보충 1 - 전체 프로토콜, 섹션 7을 참조 하십시오

  1. MIFC 데이터 수집 소프트웨어를 시작합니다(재료 표 참조). 그림 1은 계측기 설정을 보여줍니다. 405 nm 레이저를 켜고 레이저 전원을 10mW (A)로 설정합니다. 다른 모든 레이저(SSC 포함)를 비활성화하고 BF를 채널1 및 9(B)로 설정합니다. 배율 슬라이더가 60x(C)로설정되어 있는지 확인하고, 고감도 모드(D)를 선택하고, 이미지 갤러리에 채널 1, 7 및 9만 표시되도록 합니다.
  2. 산점표 아이콘을 클릭합니다. 모든 모집단을 선택하고 Y축에서 X축 및 가로 세로 비율 M01에서 영역 M01을 선택합니다. 사각형 영역 아이콘을 클릭하고 단일 셀 주위에 영역을 그립니다. 이 영역의 이름을 단일셀로 지정합니다. 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 지역을선택합니다. 단일 영역을 강조 표시하고 x 좌표를 100 및 900으로 변경하고 y 좌표를 0.75 및 1로 변경합니다(그림1I).
  3. 산점표 아이콘을 클릭합니다. 단일 셀을 상위 모집단으로 선택하고 X축에서 그라데이션 RMS M01을 선택하고 Y축에서 그라데이션 RMS M07을 선택합니다. 사각형 영역 아이콘을 클릭하고 셀의 대부분을 중심으로 영역을 그립니다. 이 지역 포커스셀의 이름을 지정합니다. 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 지역을선택합니다. 포커스된 셀 영역을 강조 표시하고 x 좌표를 55 및 75로 변경하고 y 좌표를 9.5 및 20(그림1J)으로 변경합니다.
  4. 히스토그램 아이콘을 클릭합니다. 포커스된 모집단을 선택하고 강도 M07을 피처로 선택합니다. 선형 영역 아이콘을 클릭하고 히스토그램의 주요 피크를 가로질러 영역을 그립니다. 이 지역의 이름을 DNA 양성. 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 지역을선택합니다. DNA 양성 영역을 강조 표시하고 좌표를 2 x 105 및 2 x 106으로변경합니다. 히스토그램의 강도 피크에 따라 범위를 조정해야 할 수도 있습니다(도1K).
  5. 수집 매개 변수를 설정합니다(그림1E). 파일 이름과 대상 폴더를 지정하고 이벤트 수를 20,000개로 변경하고 DNA 양성 모집단을 선택합니다.
  6. 로드(그림1F)를클릭하고 제어 샘플을 MIFC에 배치합니다. 수집 버튼을 클릭하여 데이터를 수집합니다(그림1G). 수집이 완료되면 반환 단추를 클릭하여 샘플을 반환합니다(그림1H). 기기에서 샘플 튜브를 분리합니다. 실험의 나머지 모든 샘플에 대해 이 프로세스를 반복합니다.

8. 아이디어에서 데이터 파일 열기

  1. MIFC 분석 소프트웨어 패키지를 시작합니다(재료 참조). 분석 시작을 클릭하여 파일 열기마법사를 시작합니다. 원하는 원시 이미지 파일(.rif)을 탐색하여 데이터 파일을 선택합니다. 열기 버튼을 클릭하고 다음을 클릭합니다.
  2. 이것은 단일 색상 분석이므로 보정이 필요하지 않으므로 다음을 클릭하여 보상 단계를 우회합니다. 이 단계에서 적용할 분석 템플릿이 없으므로 다음을 다시 클릭합니다. 추가 자료에서 분석 템플릿을 다운로드한 경우 지금 선택합니다. 이러한 템플릿은 BF가 채널 1과 9로 설정된 2개의 카메라 MIFC와 수집 하는 동안 채널 7의 핵 이미지에서만 작동합니다.
  3. 기본적으로 .cif 및 .daf 파일 이름은 .rif와 일치하도록 자동으로 생성됩니다. .cif 및 .daf의 이름을 변경하지 않는것이 좋습니다. 다음을클릭합니다. 0107을선택하여 이미지 표시 속성을 설정합니다. 다음을클릭합니다. 이 응용 프로그램에 대한 마법사가 없으므로 완료를클릭합니다. 진행 률의 손실을 피하기 위해 9-14절 동안 데이터 분석 파일(.daf)과 분석 템플릿(.ast)을 자주 저장하는 것이 매우 중요합니다.

9. BNC를 식별하는 마스크 및 기능 만들기

  1. 이미지 갤러리 속성 아이콘(파란색/흰색 아이콘)을 클릭합니다. 속성 표시 탭에서 범위 픽셀 데이터를 클릭한 다음 색상을 노란색으로 변경합니다. 확인을클릭합니다. Hoechst 이미지는 이제 검은 색 배경에 대해 쉽게 볼 수 있습니다.
  2. 비세포 플롯을 작성합니다.
    1. 분석 탭을 클릭한 다음 마스크를 클릭합니다. 를 클릭한 다음 함수를클릭합니다. 기능 에서 임계값을 선택하고 마스크에서 M07을 선택하고 강도 백분율을 50으로 설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다. 닫기를 클릭합니다.
    2. 분석 탭을 클릭하고 기능을클릭한 다음 을 클릭합니다. 피쳐 유형 선택 영역의 경우 . 마스크의 경우 임계값(M07,Ch07,50)을선택합니다. 기본 이름 설정을 클릭하고 확인을클릭합니다. 닫기를 클릭하여 피처 값 계산을 시작합니다.
    3. 점 도표 아이콘을 클릭합니다. 모든 채우기를 선택합니다. X축 피쳐의 경우 Contrast_M01_Ch01 피쳐를 선택하고 Y축 피쳐의 경우 Area_Threshold(M07,Ch07,50)를선택합니다. 확인을클릭합니다.
    4. 사각형 영역 단추를 클릭하고 대부분의 셀 주위에 영역을 그립니다. 이 지역을 비사멸성으로 호출합니다. 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 영역을 클릭합니다. 비사멸 지역 강조 표시. x 좌표를 0과 15로 설정하고 y 좌표를 50및 300으로 설정합니다. 닫기를 클릭합니다.
  3. BNC 마스크(단계 9.3.1-9.3.5)를 만들어 두 개의 핵만 포함하는 세포를 식별합니다.
    1. 이미지 갤러리에서 BNC를 찾아클릭합니다. 이것은 Hoechst 채널에서 마스크의 생성을 시각화하는 것입니다.
    2. 분석 탭을 클릭한 다음 마스크를 클릭합니다. 를 클릭한 다음 함수를클릭합니다. 기능에서 레벨집합을 선택하고 마스크에서 M07을선택하고 중간 수준 마스크 라디오 단추를 선택하고 등고선 세부 눈금을 3.00으로 설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다.
    3. 를 클릭한 다음 함수를클릭합니다. 기능에서, 팽창을 선택하고 마스크 에서 레벨 집합 (M07, Ch07, 중간,3)을선택합니다. 이미지를 Ch07로표시하고 픽셀 수를 2로 설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다.
    4. 를 클릭한 다음 함수를클릭합니다. 함수에서 유역을선택하고 마스크에서 팽창 (레벨 셋(M07, Ch07, Middle,3)2)을선택합니다. 이미지를 Ch07로표시하고 두께를 1로 설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다.
    5. 를 클릭한 다음 함수를클릭합니다. 기능 에서 범위를선택, 마스크에서 유역 (레벨 세트 (레벨 셋(M07, Ch07, 중간,3)2))를선택합니다. 이미지를 Ch07로표시하도록 설정합니다. 최소 영역 및 최대 면적 값을 각각 115 및 5000으로 설정합니다. 최소 및 최대 종횡비 값을 각각 0.4 및 1로 설정합니다. 확인을 클릭합니다. 이름 필드에서 BNC를 읽을 텍스트를 변경한 다음 확인을클릭합니다.
  4. 피처 및 플롯을 작성하여 최종 BNC 채우기를 얻습니다.
    1. 스팟 카운트 BNC 기능: 분석 탭을 클릭한 다음 기능, . 피쳐 유형의 경우 스팟 수를선택합니다. 마스크의경우 9.3.5에서 만든 최종 BNC 마스크를 선택합니다. 연결성을 4로 설정하고 이름을 스팟 카운트 BNC로변경합니다. 확인을 클릭한 다음 닫기를 클릭하여 피처 값을 계산합니다.
    2. 스팟 카운트 BNC 히스토그램. 히스토그램 아이콘을 클릭합니다. 비-apoptotic을 부모 모집단으로 선택합니다. X축 피처의 경우 스팟 카운트 BNC 피처를 선택합니다. 확인을클릭합니다. 선형 영역 아이콘을 클릭합니다. Bin 2에서 영역을 그립니다. 이 지역을 2N으로호출합니다.
      참고: 보충 1 - 전체 프로토콜의 섹션 9를 참조하여 최종 BNC 모집단을 식별하기 위해 나머지 마스크, 피처 및 플롯을 작성합니다.

10. BNC 인구 내에서 MN을 식별하는 마스크 및 기능 만들기

  1. MN 마스크를 만듭니다. 이미지 갤러리에 MN이 포함된 BNC를 찾아클릭합니다. 이것은 Hoechst 채널에서 MN 마스크의 생성을 시각화하기 위한 것입니다. 분석 탭을 클릭한 다음 마스크를 클릭합니다.
    1. 스팟 식별 마스크 만들기 1:
      1. 를 클릭한 다음 함수를클릭합니다. 기능 아래에서 스팟을 선택하고 밝은 라디오 버튼이 선택되었는지 확인합니다. 마스크에서 M07을선택하고 스팟을 셀 배경 비율을 2.00으로설정합니다. 최소 반지름을 2로 설정하고 최대 반지름을 6으로설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다.
      2. 를 클릭한 다음 함수를클릭합니다. 기능 에서 범위를선택하고 마스크에서 레벨 집합 (M07, Ch07, 중간, 3)을선택합니다. 이미지를 Ch07로표시하도록 설정합니다. 최소 영역과 최대 면적을 각각 80 및 5000으로 설정합니다. 최소 종횡비와 최대 종횡비를 각각 0과 1로 설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다.
      3. 를 클릭한 다음 함수를클릭합니다. 기능에서 팽창을선택하고 마스크 에서 범위 (레벨 세트 (M07, Ch07, 중간,3), 80-50000,0-1)을선택합니다. 이미지를 Ch07로표시하도록 설정합니다. 픽셀 수를 2로 설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다.
      4. 을 클릭합니다. 스팟(M07, Ch07, 밝은, 2, 6, 2) 마스크를 두 번 클릭하여 마스크 정의에 추가합니다. And 연산자 다음 Not 연산을 클릭합니다. [범위](레벨셋(레벨셋, Ch07, 중간, 3), 80-5000, 0-1) 마스크를 두 번 클릭하여 마스크 정의에 추가합니다. 확인을클릭합니다.
      5. 를 클릭한 다음 함수를 클릭합니다. 기능 에서 범위를 선택하고 마스크 아래에서 10.1.1.4에서 만든 마스크를 선택합니다.
        1. 스팟(M07, Ch07, 밝은, 2, 6, 2) 및 팽창하지 않음(레벨셋(레벨셋, Ch07, 중간, 3), 80-5000, 0-1), 2를선택합니다.
        2. 이미지를 표시할 Ch07로설정합니다. 최소 영역과 최대 면적을 각각 10과 80으로 설정합니다. 최소 및 최대 종횡비 비율을 각각 0.4 및 1로 설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다. 스팟 식별 마스크 1이 완료되었습니다.
          참고: 보충 1 - 전체 프로토콜의 섹션 10을 참조하여 마스크, 기능 및 플롯을 만들어 최종 MN 모집단을 식별합니다.

11. 단핵구 및 다핵종 인구를 식별하기 위한 마스크, 피처 및 플롯 생성

  1. 폴리 마스크를 만듭니다. 분석을클릭한 다음 마스크를 클릭한 다음 다음 함수를클릭합니다. 기능에서 범위를선택, 마스크에서 유역 (레벨 세트 (레벨 셋,Ch07, 중간, 3) 2)를선택합니다. 이미지를 Ch07로표시하도록 설정합니다. 최소 영역 및 최대 면적 값을 각각 135 및 5000으로 설정합니다. 최소 종횡비 및 최대 종횡비 값을 각각 0.4 및 1로 설정합니다. 확인을클릭합니다. 이름 필드에서 POLY를 읽으려면 텍스트를 변경한 다음 확인을 클릭한 다음 닫기를클릭합니다. 폴리핵세포 마스크가 완성되었습니다.
  2. 폴리 구성요소 마스크를 작성합니다.
    1. 폴리 구성 요소 마스크 1: 분석 탭을 클릭한 다음 마스크를 클릭한다음 것 , 다음 기능. 기능 에서 구성 요소를선택하고 마스크 아래에서 POLY 마스크를 선택합니다. 순위 피처 선택 영역정렬 순서의 경우 내림차순 라디오 단추를 클릭합니다. 순위를 1로설정합니다. 확인을 클릭한 다음 다시 확인을 클릭합니다.
    2. 폴리 구성 요소 마스크 2, 3 및 4: 순위를 2, 34로 설정하지 제외하면 11.2.1의 모든 단계를 반복하여 개별 구성 요소 마스크를 만듭니다.
  3. POLY 마스크를 사용하여 스팟 카운트.
    1. 분석 탭을 클릭한 다음 기능, 을 클릭합니다. 피쳐유형의 경우 스팟 수를선택합니다. 마스크의 경우 POLY 마스크를 선택하고 연결성을 4로설정합니다. 기본 이름 설정을 클릭하고 확인을 클릭한 다음 닫기를 클릭하여 피처 값을 계산합니다.
    2. 히스토그램 아이콘을 클릭합니다. 비사멸 자족 인구를 선택합니다. X축 피처의 경우 스팟 카운트_POLY_4 피처를 선택합니다.
    3. MONO 스팟 카운트 지역입니다. 선형 영역 아이콘을 클릭합니다. 11.3.2에서 생성된 히스토그램에서 빈 1을 가로질러 영역을 그립니다. 이 지역을 1N으로호출합니다.
    4. TRI 스팟 카운트 지역입니다. 선형 영역 아이콘을 클릭합니다. 11.3.2에서 생성된 히스토그램에서 빈 3을 가로질러 영역을 그립니다. 이 지역을 3N으로호출합니다.
    5. 쿼드 모노 스팟 카운트 지역. 선형 영역 아이콘을 클릭합니다. 11.3.2에서 생성된 히스토그램에서 빈 4를 가로질러 영역을 그립니다. 이 지역을 4N으로호출합니다.
  4. MONO 모집단을 식별합니다.
    1. 모노 종횡비 피쳐를 작성합니다. 분석 탭을 클릭한 다음 기능, 을 클릭합니다. 피쳐유형에서 가로 세로 비율 피쳐를 선택하고 마스크 선택 구성요소(1, 면적, POLY, 내림차순)에서선택합니다. 기본 이름 설정을 클릭한 다음 확인을클릭합니다.
    2. MONO 순환 피쳐를 작성합니다. 기능 관리자 창을 계속 열려 있는 동안 를 클릭합니다. 피쳐유형에서 원형 피쳐를 선택하고 마스크 선택 구성요소(1, 면적, POLY, 내림차순)에서선택합니다. 기본 이름 설정을 클릭한 다음 확인을 클릭한 다음 닫기를 클릭하여 피처 값을 계산합니다.
    3. 원형 MONO 셀 점 플롯의 경우 점 도표 아이콘을 클릭합니다. 1N을 상위 모집단으로 선택합니다. X 축 피쳐의 경우 원형_구성요소(1, 면적, POLY, 내림차순)를 선택하고 Y축 피쳐의 경우 가로세로 비율_구성요소(1, 면적, POLY, 내림차순)를선택합니다. 확인을클릭합니다. 정사각형 영역 단추를 클릭하고 셀 채우기 주위의 영역을 플롯의 오른쪽 상단 부분으로 그립니다. 이 지역의 이름을 순환_1N. 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 영역을 클릭합니다. 원형_1N 영역을 강조 표시합니다. X 좌표를 20및 55로 변경하고 Y 좌표를 0.85 및 1.0으로 변경합니다. 닫기를 클릭합니다.
    4. 영역 폴리/영역_M07 피쳐를 작성합니다. 분석 탭을 클릭한 다음 기능, 을 클릭합니다. 피쳐유형에서 영역 피쳐를 선택하고 마스크 선택 구성요소(1, 영역, POLY, 내림차순)에서선택합니다. 기본 이름 설정을 클릭한 다음 확인을클릭합니다.
    5. 기능 관리자 창이 계속 열려 있는 동안 기능 유형 아래에서 를 클릭하면 결합된 라디오 단추를 클릭합니다. 피처 목록에서 Area_Component(1, 영역, POLY, 내림차순)을 강조 표시하고 아래쪽 화살표를 클릭하여 피쳐 정의에 추가합니다. 분할 기호(/)를 클릭합니다. Area_M07 피쳐를 선택하고 아래쪽 화살표를 클릭하여 피쳐 정의에 추가합니다. 기본 이름 설정을 클릭하고 확인을클릭합니다. 닫기를 클릭하여 피처 값 계산을 시작합니다.
    6. 최종 MONO 모집단 점 도표의 경우 점 도표 아이콘을 클릭합니다. 원형_1N을 부모 모집단으로 선택합니다. X 축 피쳐의 경우 가로세로 율_M07을 선택하고 Y 축 피쳐의 경우 Area_Component(1, 면적, POLY, 내림차순)/Area_M07을선택합니다. 확인을클릭합니다. 사각형 영역 단추를 클릭하고 대부분의 셀 주위에 영역을 그립니다. 이 영역의 이름을 단핵누수로지정합니다. 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 영역을 클릭합니다. 단핵구 영역을 강조 표시합니다. X 좌표를 0.85 및 1.0으로 변경하고 Y 좌표를 0.55 및 1.0으로 변경합니다. 닫기를 클릭합니다.
      참고: 보충 1 - 전체 프로토콜의 섹션 11을 참조하여 마스크, 기능 및 플롯을 만들어 최종 삼핵 및 다핵구 집단을 식별합니다.

12. BNC 및 MN 마스크를 검사하는 사용자 지정 보기 만들기

  1. 이미지 갤러리 속성 단추를 클릭한 다음 보기 탭을 클릭합니다. 이름 유형 Ch01/Ch07에서. 이미지 추가를 클릭합니다. 이미지에서 Ch01을 선택하고 백분율을 100으로 설정합니다. 이미지 아래에서 Ch07을 선택하고 백분율을 100으로 설정하여 이미지 추가를 다시 클릭합니다.
  2. 이름 유형 BNC 및 MN 마스크 아래에서 새 마스크 및 아래를 클릭합니다.
  3. 추가를 클릭합니다. 이미지 유형에서 Ch01을 선택하고 마스크 아래에서 없음을 선택합니다.
  4. 추가를 클릭합니다. 이미지 유형에서 Ch07을 선택하고 마스크 아래에서 없음을 선택합니다.
  5. 추가를 클릭합니다. 이미지 유형에서 Ch07을 선택하고 마스크 에서 BNC를 선택합니다.
  6. 추가를 클릭합니다. 이미지 유형에서 Ch07을 선택하고 마스크 아래에서 MN 마스크를 선택합니다.
  7. 추가를 클릭합니다. 이미지 유형 아래에서 합성 라디오 버튼을 클릭합니다. Ch01/Ch07 합성 이미지가 뷰에 자동으로 추가되어야 합니다. 확인을 클릭하여 이미지 갤러리 속성 창을 닫습니다.

13. POLY 마스크를 검사하는 사용자 지정 보기 만들기

  1. 보충 1 - 전체 프로토콜의 섹션 13을 참조하여 POLY 마스크를 검사하는 사용자 지정 보기를 만듭니다.

14. 주요 이벤트를 등록하는 통계 테이블 만들기

  1. 보고서 탭을 클릭한 다음 통계 보고서 정의를클릭합니다. 새 창에서 열 추가를 클릭합니다.
  2. BNC 개수 통계를 추가합니다. 통계에서 카운트를 선택하고 선택한 채우기 아래에서 BNC 채우기를 선택합니다. 통계 추가를 클릭하여 통계에 추가합니다.
  3. 14.2 단계를 반복하여 MN BNC, MONO, TRIPOLY 모집단에 대해 별도의 열을 작성합니다. 닫기 다음 확인을 클릭합니다.
  4. 데이터 분석 템플릿이완료되었습니다(그림 2). 템플릿을 저장합니다(파일, 템플릿으로 저장). 전체 마스크 목록은 보충 2 - 마스크 목록에서찾을 수 있습니다.

15. 데이터 분석 템플릿을 사용하여 배치 프로세스 실험 파일

  1. 도구 메뉴에서 데이터 파일 배치를 클릭한 다음 새 창에서 일괄 처리 추가를 클릭합니다.
  2. 새 창에서 파일 추가를 클릭하여 일괄 처리에 추가할 실험 파일(.rif)을 선택합니다. 템플릿 또는 데이터 분석 파일 선택(.ast, .daf) 옵션에서 열린 폴더 아이콘을 클릭하여 14.4단계에 저장된 데이터 분석 템플릿(.ast file)을 탐색하고 엽니다.
  3. 통계 보고서 미리 보기 단추를 클릭하여 통계 테이블을 미리 봅입니다. 아직 계산되지 않았기 때문에 여기에 값이 표시되지 않습니다. 그러나 이 단계는 일괄 처리를 실행하기 전에 적절한 분석 템플릿이 선택되었는지 확인하는 검사 역할을 합니다.
  4. 확인을 클릭하여 현재 창을 닫습니다. 그런 다음 일괄 처리를 클릭하여 모든 파일의 일괄 처리를 시작합니다.
  5. 일괄 처리가 완료되면 모든 .rif 파일이 포함된 폴더에서 .txt 파일을 사용할 수 있습니다. 이러한 통계를 사용하여 유전체 독성 및 세포 독성을 계산합니다.

16. 유독성 및 세포 독성 매개 변수 계산

  1. 유독성 계산: 유독성을 계산하려면 15.5에서 생성된 통계 표를 사용합니다. MN BNC 집단에 있는 세포의 수를 BNCs 인구에 있는 세포의 수로 분할하고 그 때 100을 곱합니다:
    Equation 1
  2. 세포 독성 계산: TRI 및 QUAD 셀수를 합산하여 총 폴리 셀 수를 결정합니다.
    1. MONO, BNC 및 POLY의 셀 수를 사용하여 사이토카인시스 블록 증식 지수(CBPI)를 다음과 같이 계산합니다.
      Equation 2
    2. 마지막으로, 제어 배양물(C) 및 화학적으로 노출된 배양물(T)으로부터의 CBPI 값을 이용하여 각 배양물의 세포독성을 다음과 같이 계산한다.
      Equation 3

Representative Results

이 백서에 설명된 분석 방법을 통해 MN 유무에 관계없이 BNC의 자동 식별 및 채점을 통해 유독성을 계산할 수 있습니다. 또한 MONO 및 POLY 세포는 세포 독성을 계산하기 위해 자동으로 식별되고 점수가 매겨지기도 합니다. 게시된 점수매기기 기준 6,34는 이러한 이벤트를 채점할 때 준수해야 하는 MIFC 데이터 분석 소프트웨어에서 구현된다. 여기에 제시된 결과는 세포 독성이 증가하는 MN 주파수에서 통계적으로 유의한 증가가 잘 알려진 MN 유도 화학물질(미토마이신 C 및 콜히친)에 인간 림프구성 세포TK6 세포의 노출에 따라 검출될 수 있음을 나타낸다. 시험된 추가 화학물질에 대한 유사한 결과는 별도의 간행물32에서입증되었다. 또한 Mannitol의 사용으로 인한 결과는 여기에 설명된 MIFC 방법을 사용하여 비 MN 유도 화학 물질도 올바르게 식별될 수 있음을 보여줍니다. 모든 마스크, 특징 및 영역 경계를 생성하기 위해 프로토콜에 설명된 파라미터는 다른 세포 유형(예: 중국 햄스터 셀)이 분석을 수행하는 데 사용되는 경우 조정되어야 할 것입니다.

그림 3은 BNC를 식별하기 위해 선택된 4개의 패널을 보여 주며(그림3A-3D). 여기에 표시된 히스토그램은 두 개의 핵을 가진 세포의 선택을 가능하게 하는 히스토그램(그림3A)및 유사한 원형을 가진 BNC의 선택을 가능하게 하는 이변량 플롯(그림3B), 유사한 영역 및 강도(그림3C) ) 및 BNC는 점수 등급 에 따라 잘 분리된, 비중첩 핵(그림3D)을 스코어링 크리티에리아6,34에따라 한다. 그림 3 E는 단일 또는 다중 MN을 가진 BNC가 식별되고 열거될 수 있음을 나타내는 BNC 및 MN 마스크뿐만 아니라 BF 및 Hoechst 이미지를 나타낸다. 이것은 최종 BNC 인구에 있는 micronucleated BNC의 비율을 결정하여 유독성이 계산될 수 있게 합니다. 그림 4는 POLY 마스크를 사용하여 MONO, TRI 및 QUAD 셀을 식별하는 스팟 카운트 기능의 적용을 보여줍니다. TRI 및 QUAD 셀의 개수는 최종 폴리 셀 수를 얻기위해 합산될 수 있다(표 1). 이를 통해 프로토콜에 도시된 수식을 사용하여 세포 독성을 계산할 수 있습니다. 따라서, 실험에서 각 투여 지점은 유독성 및 세포독성 파라미터 모두에 의해 평가될 수 있다.

5는 아누겐 콜치친, 클라스토겐 미토마이신 C 및 음의 대조군, 만니톨에 대한 유전자 독성 및 세포독성 값을 나타낸다. 콜히친(도5A)의 경우 0.02 내지 0.05 μg/mL 투여량은 MN 빈도에서 통계적으로 유의한 증가를 일으켰으며, 용매 대조군을 통해 각각 1.28%에서 2.44%까지 다양하였다(표 1). 미토마이신 C의 경우 (그림5B) 용매 대조군과 비교할 때 0.4 및 0.5 μg/mL의 2개의 최고 투여량이 통계적으로 유의한 MN 주파수를 생성하였다. 이들 MN 주파수는 0.4 μg/mL에서 0.93%, 0.5 μg/mL에서 1.02%였다(표 2). 마지막으로, Mannitol(도5C)의 경우, 시험된 투여량은 30% 이상의 세포독성을 유도하지 않으며, 예상대로 용매 대조군과 비교했을 때 MN 주파수에서 현저한 증가를 일으키지도 않았다(표 3).

Figure 1
그림 1 : MIFC 계측기 설정. 프로토콜의 섹션 7에 설명된 대로 MIFC 설정의 스크린샷입니다. (A) 405 nm 레이저 전력을 10mW로 설정합니다. (B) BF 채널 1 및 9를 설정합니다. (C) 60배 배율 대물렌즈선택. (D) 가장 높은 해상도의 이미지를 생성하는 가장 느린 유속을 선택합니다. (E) 수집할 이벤트 수를 20,000개로 지정합니다. (F) 로드 버튼을 클릭하여 샘플 로드 프로세스를 시작합니다. (G) 획득 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. (H) 반환 단추를 클릭하여 사용하지 않은 샘플을 반환합니다. (I) 단일 셀의 선택을 위한 BF 종횡비 대 BF 면적의 산점도. (J) 집중 된 세포의 선택을위한 BF 그라데이션 RMS 대 Hoechst 그라데이션 RMS의 산시도. (K) DNA 양성 세포의 선택을 위한 Hoechst 강도의 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : 분석 소프트웨어 게이팅 전략. 프로토콜의 섹션 9에 설명된 게이팅 전략의 스크린샷입니다. 영역은 이중 핵 세포 (적색 상자), 미세 핵 (노란색 상자), 및 단핵 및 다중 핵 세포 (파란색 상자)의 식별을 위해 순차적으로 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : MN 유무에 관계없이 BNC의 식별 및 채점 (A) 두 개의 뚜렷한 핵을 가진 세포의 선택. (B) 종횡비 강도 기능을 사용하여 2개의 고원형 핵을 가지는 이중핵세포(BNCs)의 식별. (C) 유사한 영역과 강도를 가진 핵을 가진 BNC의 선택. 이것은 둘 핵의 면적의 비율과 두 핵의 종횡비 비율을 계산함으로써 달성된다. (D) 두 개의 잘 분리된 핵을 가진 BNC를 식별하기 위해 형상 비율 및 종횡비 기능을 사용합니다. (e) 단일 또는 다중 MN을 가진 BNC가 식별되고 열거될 수 있음을 입증하는 마이크로핵큐피우스(MN) 마스크를 사용한 스팟 카운트 기능. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : MONO 및 폴리 셀의 식별 및 채점. 스팟 카운트 피처를 사용하여 모노, 트라이- 및 사분면 세포를 식별하고 여반합니다. 컴포넌트 마스크 1은 단핵구 세포(상단 이미지)의 식별을 허용한다. 성분 마스크 1 ~ 3은 삼각형 세포 (중간 이미지)의 식별을 허용합니다. 성분 마스크 1 ~ 4는 사분면 세포 (하단 이미지)의 식별을 허용합니다. 이 수치는 로드리게스 201832에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5 : 세포독성 정량화. 세포독성은 사이토카인시스 블록 증식 지수(black circles)를 이용하여 정량화하고, 3시간 노출 후 MN(클리어 바)의 백분율을이용하여 정량화하고 24시간 회복(A) 콜히친, (B) 미토마이신 C 및 ( C)만니톨. 대조군과 비교하여 MN 빈도의 통계적으로 유의한 증가는 별(카이제곱 테스트; * p&0.05, **p< 0.01, ***p < 0.001)으로 표시됩니다. 모든 수량은 각 투여 지점에서 2개의 복제물의 평균이다. 이 수치는 로드리게스 201832에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Table 1
표 1: Colchicine에 대한 세포 독성 (단핵, 이중 및 다핵 구종 세포의 수) 및 유독성 (미세 핵 핵 이핵세포의 수 및 백분율)을 계산하는 데 필요한 매개 변수. 모든 계산된 수량은 각 투여 지점에서 2개의 복제물의 평균이다.

Table 2
표 2: T그는 세포 독성 (단핵, 이중 핵 및 다중 핵 세포의 수) 및 유독성 (미세 핵 이핵화 된 세포의 수 와 백분율)을 미토 마이신 C에 대해 계산하는 데 필요한 매개 변수. 모든 계산된 수량은 각 투여 지점에서 2개의 복제물의 평균이다.

Table 3
표 3: Mannitol에 대한 세포 독성 (단핵, 이중 및 다핵 구종 세포의 수) 및 유독성 (미세 핵 핵 이핵세포의 수 및 백분율)을 계산하는 데 필요한 매개 변수. 모든 계산된 수량은 각 투여 지점에서 2개의 복제물의 평균이다.

보충 1: 전체 프로토콜. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 2: 마스크 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

최근 발표된 Verma et al.에서는 유세포분석의 높은 처리량 이점과 이미지 분석의 데이터 및 이미지 저장 이점을결합한 시스템 개발의 중요성을 강조했다(35). 본 논문에 기재된 MIFC 체외 MN 분석법은 이러한 견적을 포화시키고 현미경 검사법 및 유세포분석법에서 전술한 많은 과제를 극복할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 여기서 설명된 프로토콜은 세포 독성 및 유독성 이 모두 MIFC를 사용하여 평가될 수 있음을 보여준다. 샘플 준비, 셀룰러 염색 및 데이터 수집은 간단하지만 프로토콜에는 항상 구현해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 세포에 염화칼륨(KCl)을 첨가하는 것은 세포를 팽창시키고, 주 핵 사이의 분리를 생성하는 데 중요하다. 이것은 마스킹 알고리즘이 그들의 열거에 필요한 BNCs 및 POLY 세포 (POLY 세포)에 있는 모든 개별적인 핵을 확인할 수 있다는 것을 확인합니다. 또한 KCL은 정확한 MN 마스킹 및 정량화에 필수적인 핵과 MN 사이의 분리를 제공합니다. 또한, KCl의 첨가 에 따른 포르말린의 사용은 원심분리 중에 세포가 용해되는 것을 방지합니다. Cytochalasin B의 추가는 하나 이상의 핵 분열을 겪은 TK6 세포를 아주 큰 원인이 됩니다. 그 결과, 세포질은 깨지기 쉬워지고 KCl첨가 직후원심분리가 수행되면 용해될 수 있다. 더욱이, 최종 농도에 따라가 아니라 시료의 세포 수에 따라 샘플에 Hoechst를 도입하는 것이 매우 중요하다. 예를 들어 Hoechst의 최종 농도는 1 x 106 세포의 샘플을 균일하게 염색하지만 5 x 106 세포를 포함하는 샘플을 적절하게 염색하지 않을 수 있으며 희미하게 염색 된 핵을 가진 많은 세포가 분석하기 어려울 수 있습니다. MIFC에 488 nm 및/또는 642nm 여기 레이저가 장착된 경우 MIFC에 405 nm 여기 레이저 또는 DRAQ5가 장착된 경우 Hoechst는 DAPI와 같은 다른 DNA 염료로 교체될 수 있습니다. 핵 얼룩을 수정하는 경우 필요한/원하는 레이저 전력에 적합한 농도를 찾기 위해 얼룩을 적정하는 것이 중요합니다.

MIFC에서 데이터를 수집할 때 그라데이션 RMS 피쳐에 대한 최적의 영역 경계를 결정하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 제시된 경계는 MIFC 계측기 간의 약간의 차이로 인해 조정이 필요할 수 있습니다. 데이터 수집 중에 이 기능을 적용하면 집중도가 높은 이미지를 캡처할 수 있습니다. 데이터 파일에 흐리거나 초점이 맞지 않는 이미지가 많이 포함된 경우 분석 소프트웨어의 마스킹 알고리즘이 흐린 영역의 얼룩 아티팩트를 잘못 강조 표시하여 MN으로 점수가 매겨진 거짓 긍정 아티팩트가 많을 수 있습니다. 여기에 설명된 이미지 처리 기술은 어려울 수 있지만 MIFC 소프트웨어에서 분석 템플릿이 개발되면 배치 처리를 통해 데이터 파일을 자동으로 분석할 수 있으므로 사용자의 개입이 제거되므로 득점자가 바이어스. 또한, TK6 세포 이외의 세포주가 분석을 수행하는 데 사용되는 경우, 세포의 형태학적 특성(예를 들어, 크기)이 TK6 세포의 것과 다를 것이기 때문에 마스크 및 영역 경계를 수정할 필요가 있을 것이다.

여기에 제시된결과 (도 5) 미토마이신 C 및 콜히친의 다양한 투여량에 TK6 세포를 노출시킬 때 MN 유도에서 통계적으로 유의한 증가를 보여준다. 용매 대조군과 비교했을 때 MN의 빈도에서 통계적으로 유의한 증가는 두 화학물질 모두에서 여러 투여량에 대해 관찰되었다. 또한, 만니톨의 투여량은 30% 이상의 세포독성을 유발하지 않으며, 예상대로 용매 대조군과 비교했을 때 MN의 빈도가 통계적으로 유의하게 증가하였다. 본 서에 기재된 프로토콜은 시험관 내 MN 분석결과를 수행하기 위해 MIFC를 사용하여 양성 및 음성 대조화학물질 모두에서 예상되는 결과를 제공한다. MN의 주파수뿐만 아니라 사이토 카인시스 블록 증식 지수 (CBPI)의 기준값을 개발하기 위해 용매 제어 및 음성 제어 화학 물질을 모두 사용하여 여러 실험을 수행하는 것이 매우 중요합니다. 유전자 독성의 경우, MN 주파수의 통계적으로 유의한 증가는 사용되는 세포 유형에 대해 잘 알려져 있어야 하는 기준선 MN 주파수와 비교를 통해 결정된다. 또한 모든 세포 독성 계산은 대조군 샘플의 CBPI를 기반으로 하므로 MONO, BNC 및 POLY 셀의 기준속도는 컨트롤에서 잘 정량화되어야 합니다.

MN 분석법의 맥락에서 MIFC를 사용하는 몇 가지 제한 사항 및 장점은 전작29,32에기재되어 있다. 주요 한계는 현미경 검사법과 비교할 때 MN 주파수가 낮아지는데, 이는 분석 소프트웨어에서 채점 기준을 구현할 때 유연성이 부족하고 MIFC의 제한된 피사계 심도에서 비롯될 수 있습니다. 잘 윤곽이 잡힌 마스크는 주요 핵을 정확하게 식별하기 위해 생성될 수 있지만 주요 핵을 만지거나 (또는 매우 가깝게) 하는 MN은 BNC 마스크 내에서 포착될 수 있다. 또한, 현미경 을 사용하여 오히려 쉽게 채점 될 수있는 매우 작은 MN은 작은 아티팩트점수를 피하기 위해 MN 마스크의 영역 매개 변수에 대한 하한으로 인해 MIFC를 사용할 때 잘못 누락되었을 수 있습니다. MIFC는 이미지 기반 데이터 분석에 존재하는 어려움 외에도 설계로 인해 3차원 셀룰러 개체의 2차원 프로젝션 이미지를 얻습니다. 이로 인해 일부 MN이 두 가지 주요 MN이 다른 초점 깊이에서 캡처되어 마스킹을 사용하여 매우 어둡고 비할 데 없는 것처럼 보입니다. 더욱이, MN의 작은 분수는 그(것)들을 가시화하고 점수를 불가능하게 하는 2개의 주요 핵의 뒤에 상주할 수 있었습니다. 따라서, 이러한 어려움을 고려하여, 낮은 용량에서 MN 주파수의 현저한 증가를 해석할 때 주의를 기울여야 한다.

이러한 단점에도 불구하고 여기에 설명된 MIFC 방법은 다른 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. Fenech et al. MN 분석법36에대한 자동화 된 시스템 및 방법론을 개발할 때 고려해야 할 기준 및 지침을 제안했습니다. 이들은, 이에 제한되지 않으나, 주요 핵 및 세포질의 직접 시각화, 시험중인 화학 물질 또는 에이전트의 다양한 투여량으로부터 MN의 주파수의 결정 및 형태학을 정량화하고 모든 위치를 결정하는 능력을 포함한다. 핵과 MN은 세포질 내에 있는지 확인합니다. 이 논문은 시험관 내 MN 분석법을 수행하기 위해 개발된 MIFC 방법이 이러한 기준을 만족시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여준다. 구체적으로, 핵 및 MN의 이미지는 형광 레이저에 의해 포착될 수 있고 세포질 이미지는 BF LED를 사용하여 얻을 수 있다. 정상적인 핵 형태를 가진 세포의 이미지는 고급 마스크와 기능의 조합을 사용하여 불규칙한 형태를 가진 세포와 자동으로 분화 될 수 있습니다. 콜히친과 미토마이신 C(그림 5)에 대해 제시된 결과는 용매 대조군과 비교할 때 다양한 용량으로 유독성 및 세포독성을 평가할 수 있으며 통계적으로 유의한 MN 주파수가 어디에서 관찰된다는 것을 보여준다. 예상. 또한, OECD 시험 지침 487은 세포 독성을 결정하기 위해 시험 농도 당 적어도 500 세포와 함께 유독성을 결정하기 위해 MN의 존재를평가하기 위해 시험 농도 당 2,000 BNC를 채점할 것을 권장합니다 9; 이것은 수동 현미경 검사법을 사용하여 1 시간 이상 걸릴 수 있습니다. 이 논문의 프로토콜 및 결과는 약 6,000개의 BNC, 16,000개의 MONO 세포 및 800개의 POLY 세포가 약 20분 에서 시험 농도당 포획및 득점되었다는 것을 보여준다. 이러한 짧은 시간에 득점된 데이터 수집의 빠른 속도 및 높은 수의 후보 세포는 시험관 내 MN 분석을 수행하기 위해 MIFC를 채택하는 또 다른 중요한 이점을 강조한다.

이 백서에 제시된 결과는 고무적이지만 초기 개념 증명 방법을 대표합니다. 이 일은 Kirkland 등에서 제안한 것과 같은 여러 종류의 독성 및 세포 독성메커니즘을 다루는 더 크고 다양한 화학 세트에 대한 보다 철저한 조사에 의해 수행되어야 합니다. 그러나 시간이 많이 걸리고 노동이 집중적이며, 이 논문의 범위를 벗어나는 이러한 대규모 연구는 약한 유독성 물질을 안정적으로 식별하는 방법의 능력에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다. 여기에 제시된 방법론은 아직 마이크로웰 형식으로 소형화되지 않았으며, 이는 더 큰 용량 범위에서 보다 신속하고 효율적인 스크리닝을 허용할 것이다. 이와 같이, 현재의 형태로, 여기에 제시된 MIFC 기반 의 체외 MN 분석제는 노동 집약적인 후속 연구 또는 좋은 실험실 관행에 대한 연구에 가장 적합할 수 있다. 그러나, 이 방법은 계속 최적화되고 검증될 것이며, 세포의 비율을 증가시키는 무균 노출과 같은 형태와 관련된 화학적 특정 사건을 검출하는 데 있어 유연성을 높일 수 있는 잠재력을 지니고 있다. 비 원형 핵은 여전히 코클수38. 마지막으로, MIFC 방법은 MN 유도의 메커니즘에 대한 보다 포괄적인 뷰를 제공하기 위해 MN 분석법(예: 키네토코레 염색)에 추가적인 바이오마커를 도입할 수 있는 기회를 제공한다.

Disclosures

저자는 Luminex 공사에 의해 고용된다, 이 작품에 사용 된 ImageStream 다스펙트럼 이미징 유동 세포계의 제조 업체.

Acknowledgments

저자는 데이터 분석 템플릿의 이전 형태를 개발하는 그녀의 노력에 대한 크리스틴 Probst (루미넥스 공사) 감사뿐만 아니라 박사 헤일리 Pugsley (루미넥스 공사) 박사 필 모리시 (루미넥스 공사) 검토 및 편집 원고.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath - PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

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