Autoimmunity के एक मिश्रित चिमेरिक मॉडल में Photoactivation द्वारा व्यक्तिगत Autoreactive अंकुरण केंद्रों पूछताछ

Immunology and Infection
 

Summary

यह प्रोटोकॉल सहज स्व-प्रतिरक्षित अंकुल केंद्रों के साथ मिश्रित म्यूरिन अस्थि मज्जा chimeras की पीढ़ी का वर्णन है, जिसमें autoreactive लिम्फोसाइटों एक photoactivatable हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी-gfp) रिपोर्टर ले । यह अनुप्रवाह आण्विक और कार्यात्मक विश्लेषण के साथ ऊतकों में सेलुलर स्थान लिंक करने की क्षमता प्रदान करता है ।

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Wittenborn, T. R., Hagert, C., Degn, S. E. Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity. J. Vis. Exp. (146), e59397, doi:10.3791/59397 (2019).

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Abstract

Autoimmune रोगों एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य बोझ मौजूद है । मौलिक विकास और स्व-प्रतिरक्षित रोग की प्रगति के बारे में सवाल अनुत्तरित रह । अंतर्निहित रोग तंत्र और सेलुलर गतिशीलता की हमारी समझ में प्रगति के लिए एक आवश्यकता अनुप्रवाह आणविक या कार्यात्मक विश्लेषण के साथ सेल सबसेट के microसंरचनात्मक स्थान का सटीक युग्मन है; एक लक्ष्य है कि परंपरागत रूप से प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो गया है । स्थिर photoactivatable जैविक फ्लोरोहोरेज़ के विकास और रिपोर्टर उपभेदों में उनके एकीकरण हाल ही में सटीक microसंरचनात्मक लेबलिंग और म्यूरिन मॉडल में सेलुलर सबसेट की ट्रैकिंग सक्षम है । यहां, हम वर्णन कैसे करने के लिए एक अंकुरण केंद्रों से autoreactive लिम्फोसाइटों का विश्लेषण करने की क्षमता autoimmunity में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकते हैं, एक उदाहरण के रूप में एक photoactivatable रिपोर्टर के साथ autoimmunity के एक उपंयास chimeric मॉडल के संयोजन का उपयोग . हम एक photoactivatable हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर को लेकर लिम्फोसाइटों द्वारा आबादी सहज autoreactive अंकुल केंद्रों के साथ मिश्रित chimeras पैदा करने के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन । Vivo लेबलिंग रणनीतियों में उपयोग करते हुए, एकल अंकुरल केंद्र explanted लिम्फोइड ऊतकों और उनके सेलुलर घटक दो-photon माइक्रोस्कोपी द्वारा photoसक्रियित में कल्पना किया जा सकता है । एकल अंकुरल केंद्रों से Photoएक्टिवेट लिम्फोसाइटों तो विश्लेषण या प्रवाह cytometrically सॉर्ट किया जा सकता है, एकल कोशिकाओं या थोक में के रूप में, और अतिरिक्त बहाव आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण सीधे autoimmunity के क्षेत्र में नए सिरे से अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन अस्थि मज्जा chimeras और photoactivation प्रक्रिया पैदा करने के लिए प्रक्रिया इसके अतिरिक्त संक्रामक रोगों के अध्ययन में व्यापक आवेदन मिल सकता है और ट्यूमर मेटास्टेसिस ।

Introduction

पिछले दशकों में, विशेष रूप से पश्चिमी समाजों में स्व-प्रतिरक्षित रोग की घटना तेजी से बढ़ी है । आज, ऑटोइम्यून रोग पश्चिमी दुनिया1में रुग्णता और मृत्यु दर के सबसे प्रचलित कारणों की सूची में तीसरे स्थान पर है । मौलिक विकास और स्व-प्रतिरक्षित रोग की प्रगति के बारे में सवाल अनुत्तरित रह । अंतर्निहित रोग तंत्र और सेलुलर गतिशीलता की हमारी समझ में प्रगति के लिए एक आवश्यकता अनुप्रवाह आणविक या कार्यात्मक विश्लेषण के साथ सेल सबसेट के microसंरचनात्मक स्थान के सटीक युग्मन है । पिछले एक दशक में, स्थिर photoconvertible, photoactivatable, या photoswitchable जैविक फ्लोरोफोरेज़ और रिपोर्टर उपभेदों में उनके एकीकरण के एक नंबर के विकास सटीक microसंरचनात्मक लेबल और सेलुलर की ट्रैकिंग सक्षम है म्यूरिन मॉडल में सबसेट ।

Kaede, एक photoconvertible फ्लोरोसेंट एक पथरीले कोरल से उत्पन्न प्रोटीन, बैंगनी या पराबैंगनी प्रकाश2के लिए जोखिम पर लाल प्रतिदीप्ति के लिए हरी प्रतिदीप्ति से अपरिवर्तनीय photoconvertible से गुजरती है । शुरू में व्यक्तिगत कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार का पालन करने के लिए organotypic मस्तिष्क स्लाइसें3विकसित करने में नियोजित, एक kaede दस्तक की पीढ़ी माउस में बाद में vivo में सेलुलर आंदोलन की अनुमति दी, और प्रणाली के विश्लेषण के लिए लागू किया गया था प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन और लिम्फ नोड्स से4. यह दृष्टिकोण बाद में एक दूसरी पीढ़ी के रिपोर्टर5के साथ परिष्कृत किया गया था । एक ऐसे ही रिपोर्टर Dendra6है, जो हाल ही में vivo7में लिम्फ नोड मेटास्टेसिस ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

पहली photoactivatable प्रोटीन विकसित एक बिंदु उत्परिवर्तन (T203H) के साथ एक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) इंजीनियर था, ४५० से ५५० एनएम8के तरंग दैर्ध्य क्षेत्र में एक बहुत कम absorbance के लिए अग्रणी । वायलेट लाइट द्वारा photoactivation के बाद, इस photoactivatable हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP) अपने अवशोषण अधिकतम स्विच ~ ४०० से ~ ५०० एनएम, एक अनुमानित १०० गुना तीव्रता वृद्धि जब ४८८ एनएम की एक तरंग दैर्ध्य के साथ उत्साहित । ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी जिसमें सभी हेमटोपोइटिक कोशिकाओं को PA-GFP की अनुमति है, पहली बार के लिए, अंकुरक केंद्र9के शारीरिक रूप से परिभाषित प्रकाश और अंधेरे क्षेत्रों में बी कोशिका चयन का गहराई से विश्लेषण ।

जबकि photoactivation एक फ्लोरोसेंट राज्य के लिए एक प्रतिदीप्त राज्य से एक अपरिवर्तनीय रूपांतरण है, और photoactivation एक तरंग दैर्ध्य से दूसरे करने के लिए एक मार्ग संक्रमण है, photoswitchable प्रोटीन दोनों शर्तों के बीच शटल करने में सक्षम है10 . यह उत्तरार्द्ध क्षमता हाल ही में प्रोटीन गतिविधि11के ऑप्टिकल नियंत्रण इंजीनियर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP रिपोर्टर का उपयोग, हम हाल ही में सहज रक्तिम के एक उपंयास मॉडल में एकल अंकुरल केंद्रों के बी सेल repertoires विशेषता-autoimmunity12की तरह । इस मॉडल के साथ मिश्रित chimeras पर आधारित है 1 भाग अस्थि मज्जा एक autoreactive बी सेल रिसेप्टर दस्तक शरण ribonuclear के लिए विशिष्टता के साथ-प्रोटीन परिसरों (564igi13,14) किसी भी वांछित से 2 भागों अस्थि मज्जा के साथ संयुक्त दाता. लगभग 6 सप्ताह के बाद पुनर्गठन, समस्थिति स्थितियों में प्राप्त कर रहे है जिसमें सहज autoreactive अंकुअल केंद्रों तिल्ली और त्वचीय लिम्फ नोड्स में मौजूद हैं । विशेष रूप से, अंकुर केंद्र बी सेल जनसंख्या लगभग विशेष रूप से है (~ ९५%) गैर-564Igi डिब्बे से व्युत्पंन कोशिकाओं से बना है, और इन जंगली प्रकार व्युत्पंन बी कोशिकाओं स्वतः सक्रिय हो गए हैं । इसलिए, मॉडल विभिन्न transgenes, दस्तक-बहिष्कार और संवाददाताओं का उपयोग autoreactive अंकुर केंद्र बी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक ' प्लग और प्ले ' दृष्टिकोण की अनुमति देता है. यहां, हम सहज autoreactive अंकुर PA-gfp रिपोर्टर ले जाने लिम्फोसाइटों द्वारा आबादी केंद्रों के साथ मिश्रित chimeras पैदा करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन । Vivo लेबलिंग रणनीतियों में उपयोग करते हुए, एकल अंकुरल केंद्रों को एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के उपयोग से explanted लसीकाभ ऊतकों और उनके सेलुलर घटकों में विज़ुअलाइज्ड किया जा सकता है । एकल अंकुरल केंद्रों से प्रकाशसक्रिय लिम्फोसाइटों को बाद में प्रवाह कोशिकामिति द्वारा विश्लेषित किया जा सकता है या फ्लूरोक्रोम-एक्टिवेट सेल सॉर्टिंग (FACS) द्वारा छांटा जाता है और अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम आण्विक और कार्यात्मक विश्लेषणों के अधीन है । एकल अंकुरल केंद्रों से स्वत: सक्रिय लिम्फोसाइटों का विश्लेषण करने की क्षमता सीधे autoimmunity के क्षेत्र में नए सिरे से अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन तकनीकों और दृष्टिकोण के अध्ययन में इसके अतिरिक्त प्रासंगिक अनुप्रयोगों मिल सकता है वर्णित संक्रामक रोग और ट्यूमर मेटास्टेसिस ।

Protocol

सभी पशु यूरोपीय समुदाय के दिशा निर्देशों के अनुरूप उपयोग करें और डेनिश पशु अनुसंधान निरीक्षणालय (2017-15-0201-01348) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. जनरल माउस पशुपालन और बफ़र्स और उपकरण की तैयारी

  1. विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (SPF) शर्तों के तहत घर माउस लाइनों, मानक दिशा निर्देशों के अनुसार स्वास्थ्य की स्थिति की आवधिक निगरानी के साथ ।
  2. वैकल्पिक: गैर-मॉनिटर आकस्मिक संक्रमण के कारण भोले चूहों में सहज अंकुर केन्द्रों की अनुपस्थिति की जाँच करें । यह इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है (अंकुर केंद्र संरचनाओं की उपस्थिति) या प्रवाह cytometry (अंकुल केंद्र बी कोशिकाओं की आवृत्ति) के रूप में पहले से वर्णित12.
    नोट: या तो मादा या नर इस्तेमाल किया जा सकता है । आम तौर पर, यह सेक्स मैच दाताओं और प्राप्तकर्ताओं के लिए आदर्श है, सेक्स के एक बेमेल के रूप में सैद्धांतिक रूप से महिला प्राप्तकर्ताओं द्वारा पुरुष Y-antigen के प्रति alloreactivity के लिए नेतृत्व कर सकते है/
  3. CD 45.1 प्राप्तकर्ताओं का उपयोग करें (B6. SJL-Ptprcएक pepcb/boyj) लगभग 6-10 सप्ताह की उंर में । 564Igi (बी-6 का प्रयोग करें । सीजी-Ightm1 (Igh564) टिकigktm1 (Igk564) tik/j) और pa-gfp (बी-6. सीजी-टीजी (ubc-PA-Gfp) 1mnz/
  4. शल्य चिकित्सा उपकरण (सीधे ठीक कैंची और dumont संदंश #5 और #7) उंहें autoclaving द्वारा नित्य नसबंदी दिशा निर्देशों के अनुसार ।
  5. ५०० मिलीलीटर (बीएम) बफर फॉस्फेट युक्त खारा (पीबीएस), 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1 मिमी एथेलेनेडिएमीनेटेट्राएसिटिक एसिड (EDTA) पीएच ७.४ पर तैयार करें । बीएम बफर तैयार करने के लिए, हीट-अक्रियाशील के 10 मिलीलीटर जोड़ें (एक ५६ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 1 घंटे के पूरक को निष्क्रिय करने के लिए) FBS और १.२५ मिलीलीटर एक ४०० मिमी EDTA समाधान (पीएच ७.४ करने के लिए समायोजित) के लिए PBS, पीएच ५०० के ७.४ मिलीलीटर, और अच्छी तरह से मिश्रण । ०.२ μm फिल्टर फ्लास्क का उपयोग कर बफर को फिल्टर करें ।
  6. 10 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर (१५५ मिमी राष्ट्रीय राजमार्ग4सीएल, 12 मिमी नहको3, ०.१ मिमी edta) को एक 10x स्टॉक के 1 मिलीलीटर के लिए अभिकर्मक ग्रेड पानी के साथ कुल मात्रा के 10 मिलीलीटर को कमजोर करके तैयार करें । 5 मिमी EDTA, pH ७.४ के साथ PBS की ५० मिलीलीटर तैयार करें ।

2. मिश्रित अस्थि मज्जा chimeras की स्थापना

  1. प्राप्तकर्ताओं के विकिरण (0 दिवस)
    1. एक उपयुक्त विकिरण कंटेनर में सीडी 45.1 अस्थि मज्जा प्राप्तकर्ताओं प्लेस और एक गामा irradiator में १,१०० राड के साथ विकीर्ण ।
      नोट: वैकल्पिक विकिरण स्रोतों का इस्तेमाल किया जा सकता है । स्रोत की परवाह किए बिना, खुराक/समय के लिए पशुओं को ंयूनतम संपार्श्विक ऊतक क्षति के साथ अधिकतम myeloablative प्रभाव उपज अनुकूलित किया है ।
    2. एंटीबायोटिक पानी विज्ञापन libitum पर प्लेस (1 मिलीग्राम सल्फाडियाजिन और ०.२ मिलीग्राम trimethoprim/एमएल पीने के पानी की) ।
  2. हड्डियों का निष्कर्षण (दिन 1)
    1. Anesthetize हवा में 4% isoflurane के निरंतर प्रवाह से 564Igi अस्थि मज्जा दाताओं, और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा euthanize । इथेनॉल के साथ नीचे दानदाताओं स्प्रे और उंहें प्रवाह हुड में बाँझ सर्जिकल पैड पर जगह है । बाँझ बफ़र्स और उपकरणों का उपयोग कर, बाँझ शर्तों को बनाए रखने काम करने के लिए आगे बढ़ें ।
    2. फीमुर और टिबिया निकालने के लिए, पहले टखने के चारों ओर एक चीरा बनाने के लिए और सीधे ठीक कैंची का उपयोग कर कूल्हे के लिए ऊपर की तरफ सभी तरह का विस्तार । एक भारी शुल्क संदंश या अंगूठे और सूचकांक उंगलियों का प्रयोग, त्वचा को खींच और शरीर की ओर पैर से । इसी तरह त्वचा को नीचे और पैर से खींचकर उतारें ।
    3. कूल्हे पर पैर कब्जाने और जबरदस्ती पैर खींच कर घुटने और टखने के जोड़ों को बाहर पॉप करें । टखने के जोड़ को तोड़ने के लिए आगे बढ़ना और टिबिया पर पकड़े हुए शरीर की ओर पैर खींचने, जिससे टिबिया से tendons और मांसपेशियों को अलग करना ।
    4. तोड़ घुटने के संयुक्त टिबिया रिहाई के लिए, और इसी तरह शरीर की ओर खींचो, जबकि फीर पर पकड़े, जिससे tendons और फीर से मांसपेशियों को अलग करना । हिप संयुक्त पर एक चीरा बनाओ और tendons कटौती, तो हिप सॉकेट से बाहर फीर खींच । Contralateral पक्ष के लिए 2.2.2-2.2.4 कदम दोहराएं ।
    5. सभी शेष मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को दूर करने के क्रम में एक मोटे कागज तौलिया के साथ उन्हें रगड़ द्वारा ध्यान से हड्डियों को साफ करें । फिर उंहें बर्फ में कुल्ला ठंडा बीएम बफर से पहले अंततः बर्फ पर ताजा ठंडा बीएम बफर को स्थानांतरित करने के लिए Dumont #7 forceps की एक जोड़ी का उपयोग कर । PA-GFP दानदाताओं के लिए २.२ चरण को दोहराएं ।
      नोट: एक ही दाता से अस्थि मज्जा कोशिकाओं की संख्या सेक्स और उंर के अनुसार बदलता रहता है । वांछित इनपुट अस्थि मज्जा अनुपात और संख्या और प्राप्तकर्ताओं की वांछित संख्या के अनुसार दाताओं की संख्या स्केल । यदि दानदाताओं दुर्लभ हैं, सामने अंग अस्थि मज्जा निष्कर्षण के लिए शामिल किया जा सकता है । यह आम तौर पर पिछले अंगों से प्राप्त कोशिकाओं के 1/2 के लिए एक अतिरिक्त 1/3 पैदावार । आमतौर पर, कहीं भी 50-200 लाख कोशिकाओं से प्रति दाता बरामद किया जा सकता है, उंर, लिंग, पृष्ठभूमि पर निर्भर करता है और क्या केवल हिंद या दोनों हिंद और सामने अंग शामिल हैं ।
  3. अस्थि मज्जा कोशिका निष्कर्षण
    1. आइस-कोल्ड बीएम बफर में रिसिंग करके मोर्टार तैयार करें । कुल्ला बफर नाली और एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ एक इलेक्ट्रिक पिपेट नियंत्रक का उपयोग करने के लिए ताजा बर्फ ठंडा बीएम बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. 564igi दानदाताओं से हड्डियों के हस्तांतरण के लिए डमोंट #7 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर और मूसल को कुचलने और हड्डियों को पीस करने के लिए अस्थि मज्जा रिहाई का उपयोग करें । एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ अस्थि मज्जा निकालने महाप्राण और यह एक ७० μm सेल छलनी के माध्यम से बर्फ पर एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में पारित ।
    3. मोर्टार के लिए ताजा बर्फ ठंडा बीएम बफर के एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं की पूरी वसूली सुनिश्चित करने के लिए दोहराएं । एक कागज तौलिया के साथ मोर्टार से अस्थि सामग्री निकालें, उचित रूप से छांटे, और ७०% इथेनॉल, बीएम बफर के बाद के साथ ध्यान से मोर्टार कुल्ला । PA-GFP अस्थि मज्जा दाता समूह के लिए २.३ चरण को दोहराएं ।
  4. अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गणना
    1. एक micropipette का उपयोग कर, प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े पर RBC lysis बफर की ४० μL युक्त एक छोटी बूंद जगह । 564Igi अस्थि मज्जा ट्यूब कुछ समय उलटा और एक micropipette का उपयोग कर एक 10 μL aliquot बाहर ले । यह RBC lysis बफर ड्रॉप के ४० μL के साथ मिलाएं ।
    2. इसके बाद ड्रॉप करने के लिए Trypan नीले रंग (जलीय समाधान में ०.४%) के ५० μL जोड़ें । तुरंत एक Burker-तुर्क hemocytometer में परिणामी मिश्रण के 10 μL लोड और माइक्रोस्कोप के तहत गिनती । 10x कुल तनुता गुणक का उपयोग करते हुए, प्रति मिलीलीटर कक्षों की संख्या परिकलित करें । 90% > पर्याप्त सेल व्यवहार्यता की पुष्टि करें । PA-GFP अस्थि मज्जा दाता समूह के लिए २.४ चरण को दोहराएं ।
  5. दाता निलंबन की तैयारी
    1. चरण २.४ और प्राप्तकर्ताओं की वांछित संख्या में प्राप्त गिनती के आधार पर, दाता मिश्रण ट्यूब में मिलाया जा करने के लिए दो दाता समूहों में से प्रत्येक से दाता अस्थि मज्जा की मात्रा की गणना ।
      नोट: उदाहरण के लिए, 1:2 मिश्रित 564Igi के एक समूह की स्थापना के लिए: PA-GFP चिमेर्स 6 सीडी 45.1 प्राप्तकर्ताओं के साथ: प्रत्येक प्राप्तकर्ता की आवश्यकता है 20 x 106 दाता कोशिकाओं कुल, 1 भाग 564igi और 2 भागों PA-gfp । इस प्रकार, यह 6 x 1/3 x 20 x 106 = ४० x 106 564igi दाता कोशिकाओं और 6 x 2/3 x 20 x 106 = ८० x 106 PA-gfp दाता कोशिकाओं की आवश्यकता है ।
    2. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में PA-GFP और 564lgi दाता मज्जा की उचित मात्रा में मिक्स । एक झूल बाल्टी रोटर का उपयोग कर 10 मिनट के लिए २०० x जी और 4 ° c पर अस्थि मज्जा मिश्रण सेंट्रीफ्यूज ।
    3. इस सुपरनैजेंट को Decant और आइस-कोल्ड बीएम बफर में कोशिकाओं को 1 x 108 सेलों प्रति मिलीलीटर के घनत्व पर रेसपेंड करें । बर्फ पर एक precooled १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  6. दाता अस्थि मज्जा के साथ अस्थि मज्जा प्राप्तकर्ताओं को फिर से गठित
    1. एनस्थेटाइज़ प्राप्तकर्ताओं को हवा में 4% isoflurane के निरंतर प्रवाह के साथ प्रेरण का उपयोग कर, ३.७५% पर रखरखाव के बाद । पैर की अंगुली-चुटकी पलटा की अनुपस्थिति से संवेदनाहरण के पर्याप्त विमान की पुष्टि करें ।
    2. बोन मैरो कोशिकाओं के पर्याप्त पुनर्पेंशन सुनिश्चित करने के लिए अस्थि मज्जा मिश्रण युक्त ट्यूब को सावधानी से फ़्लिक करें, फिर अस्थि मज्जा मिश्रण की २०० μL (~ 20 x 106 कोशिकाओं), एक ०.३ मिलीलीटर में, 30 गेज इंसुलिन सिरिंज में महाप्राण ।
    3. अपनी ओर से प्राप्तकर्ता प्लेस, धीरे से ऊपर और आंख के नीचे की त्वचा खिंचाव ' आंख बाहर पॉप ', और धीरे सिरिंज की टिप डालने के लिए आंख सॉकेट के सामने में एक 30 ° कोण पर लगभग, आंख और आसपास के ऊतकों से बचने के लिए देखभाल ले । जब सुई की नोक आंख सॉकेट रेखांकित हड्डी को छूने के लिए महसूस किया है, थोड़ा (~ ०.५ मिमी) मुकर और धीरे दाता अस्थि मज्जा स्थिर दबाव का उपयोग कर सुई ।
      नोट: कोई खून बह रहा है, कोई तरल पदार्थ का रिसाव और इंजेक्शन पर आंख की बहुत मामूली उभड़ा करने के लिए नहीं होना चाहिए ।
    4. विज्ञापन libitum एंटीबायोटिक पानी के साथ पिंजरे के लिए माउस लौटें और प्रक्रिया से तत्काल वसूली की पुष्टि करें । प्रत्येक प्राप्तकर्ता के लिए २.६ चरण को दोहराएं ।
      नोट: पूंछ-नस इंजेक्शन इसी तरह के परिणामों के साथ retroकक्षीय इंजेक्शन के एवज में इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, हमारे हाथ में यह काफी धीमी है, जो एक चिंता का विषय हो सकता है जब प्राप्तकर्ताओं के बड़े समूहों के साथ काम कर रहा है । छोटे व्यास बिस्तर पर सीधे एनेस्थेटाइज्ड जानवरों की वसूली से बचना चाहिए क्योंकि यह एक आकांक्षा और asphyxiation जोखिम बन गया है
  7. एंटीबायोटिक पानी हटाना (14 दिन)
    1. पिंजरे (ओं) से एंटीबायोटिक पानी निकालें और ताजा नियमित रूप से पीने के पानी के साथ बदलें ।

3. जांच सफल पुनर्गठन और chimerism के उचित डिग्री की पुष्टि (सप्ताह 6)

  1. चिमाराओं और नियंत्रणों की प्रतिकक्षीय रक्तस्राव
    1. प्राप्तकर्ता कान टैग संख्या के अनुसार लेबलिंग १.५ मिलीलीटर माइक्रोअपकेंद्रज ट्यूबों द्वारा रक्त संग्रह ट्यूबों तैयार करने और 5 मिमी EDTA युक्त PBS के ५० μL जोड़ने.
      नोट: PA-GFP, CD 45.1 और CD 45.2, और 9D11 (idiotype) के लिए उपयुक्त नियंत्रण शामिल करें । यह 1 PA-GFP + माउस, 1 सीडी 45.1 माउस, 1 बी 6 माउस और 1 564Igi माउस सहित द्वारा किया जा सकता है ।
    2. संवेदनाहरण चूहों और 2.6.1 चरण में के रूप में बेहोशी के पर्याप्त विमान की पुष्टि करें । अपनी ओर से चिमेरा रखें, धीरे से ऊपर और आंख के नीचे त्वचा खिंचाव थोड़ा ' आंख बाहर पॉप ' ।
    3. धीरे से एक BoPET-लपेटा heparinized केशिका ट्यूब (६० μL आंतरिक मात्रा) लगभग एक ४० ° कोण पर आंख सॉकेट के सामने में, ध्यान रखने के लिए आंख और आसपास के ऊतकों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए डालें । धीरे ट्विस्ट/ट्यूब घुमाएगी जब तक यह खून से भरना शुरू होता है ।
    4. रक्त को निष्क्रिय केशिका कार्रवाई द्वारा ट्यूब भरने के लिए अनुमति देते हैं, लगभग पूरी तरह से भरा हुआ है, तो ट्यूब वापस लेना और यह इसी पूर्व लेबल संग्रह ट्यूब में जगह है, जबकि एक ही समय में तुरंत आंख के आसपास पकड़ आराम करने के लिए आंख की अनुमति स्थिति में वापस बसा । रक्तस्राव तुरंत बंद कर देना चाहिए ।
    5. सुनिश्चित करें कि केशिका ट्यूब संग्रह ट्यूब में खाली कर दिया है और यह एक sharps कंटेनर में त्यागने । बंद ट्यूब और तीन बार उलटा PBS के साथ पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए/
    6. पिंजरे के लिए माउस वापस लौटें और प्रक्रिया से तत्काल वसूली की पुष्टि करें । प्रत्येक प्रायोगिक माउस और उपयुक्त नियंत्रणों के लिए ३.१ चरण को दोहराएं ।
      नोट: सावधानी रखना जब अवअधोहनुज नस पंचर का उपयोग कर के रूप में इस पद्धति को किरणित प्राप्तकर्ताओं में अपस्थानिक संक्रमण के लिए एक बड़ा खतरा हो सकता है इससे पहले कि ये पूरी तरह से पुनर्गठित कर रहे हैं । इसके अलावा, हमारे अनुभव में, हम पाते है कि रक्त एकत्र की मात्रा और खून की मात्रा अत्यधिक रक्तस्राव के कारण खो दिया है और अधिक चर है । इन दोनों के विचार महत्वपूर्ण हैं, के रूप में अस्थि मज्जा chimeras पुनर्गठन चरण में संवेदनशील हैं, इससे पहले कि नई अस्थि मज्जा पूरी तरह से नक्काशी और hematopoiesis सामांय स्तर फिर से शुरू कर दिया है ।
  2. परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (PBMC) शुद्धि
    1. रक्त संग्रह के पूरा होने के बाद, संक्षेप (10 एस) कम गति पर ट्यूबों सेंट्रीफ्यूज (< 200 x जी) ट्यूब के नीचे पतला स्थिर रक्त इकट्ठा करने के लिए ।
    2. लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और एक 18 जी सुई देते हैं । पहली ट्यूब के नीचे करने के लिए सुई डालें और लिम्फोसाइट जुदाई माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ रक्त के नमूने अंडरलेयर । ध्यान से सुई को वापस लेने और एक कागज तौलिया के साथ मिटा करने के लिए अगले नमूने के पार संदूषण को रोकने के ।
    3. सभी नमूनों के माध्यम से आगे बढ़ें, तो ८०० एक्स जीपर 25 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, कमरे के तापमान पर, एक झूल-बाल्टी सेंट्रीफ्यूज में, कम करने के लिए सेट ब्रेक के साथ/
    4. तदनुसार लेबल का एक सेट तैयार १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों युक्त 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा बीएम बफर प्रत्येक ।
    5. प्रत्येक नमूने के लिए अपकेंद्रण के बाद, एक २०० μL माइक्रोपिपेट के साथ ऊपरी (प्लाज्मा) परत दर्ज करें और मोनोन्यूक्लियर सेल (MNC) परत बस अंतरफलक के ऊपर । तदनुसार लेबल ट्यूब बीएम बफर के 1 मिलीलीटर युक्त करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित । ढक्कन बंद करें और मिश्रण करने के लिए उलटा । लिम्फोसाइट पृथक्करण मध्यम युक्त ट्यूब छोड़ें ।
    6. सभी नमूनों के माध्यम से आगे बढ़ें और फिर २०० x g पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए, 4 ° c एक झूल बाल्टी रोटर में । महाप्राण और supernatant त्यागने, और बर्फ ठंडा बीएम बफर के २०० μL में गोली resuspend । नमूने अब एंटीबॉडी-धुंधला करने और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।
  3. प्रवाह cytometric मूल्यांकन के लिए धुंधला होना
    नोट: सुझाया पैनल: सीडी 45.1-FITC, B220-PerCP-Cy 5.5, 9D11-A568, सीडी 45.2-APC । गैर-सक्रिय PA-GFP प्रशांत नारंगी (या समकक्ष) चैनल में पाया जाता है । कोई व्यवहार्यता डाई के रूप में लिम्फोसाइट जुदाई मृत कोशिकाओं से छुटकारा मिल जाता है की आवश्यकता है ।
    1. एक micropipette का उपयोग कर, एक ९६-well थाली के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक चिमेरा और नियंत्रण नमूना के लिए प्रति सेल निलंबन के १०० μL जोड़ें ।
    2. 3 गैर-PA-GFP नियंत्रण नमूनों के लिए, प्रत्येक नमूना (३०० μL कुल) के शेष १०० μL पूल । बिना दाग नियंत्रण और एकल दाग नियंत्रण कुओं के लिए इस सामग्री का ५० μL जोड़ें । PA-GFP एकल-दाग नियंत्रण के लिए अतिरिक्त ५० μL अनसना PA-GFP नमूना जोड़ें ।
    3. प्रत्येक कूप के लिए, १०० μL बफर (बिना दाग), एकल एंटीबॉडी (PA-GFP क्षतिपूर्ति नियंत्रण के अलावा एकल-दाग मुआवजा नियंत्रण,) या एंटीबॉडी मिक्स (नमूने) जोड़ें । 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनसेबेट ।
    4. 4 ° c पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर सेंट्रीफ्यूज । बफ़र बाहर फ़्लिक । प्रत्येक कूप और सेंट्रीफ्यूज करने के लिए फिर से धोने के लिए बीएम बफर की २०० μL जोड़ें । बफर बाहर झाड़ और प्रत्येक में अच्छी तरह से २०० μL में बीएम बफर के कोशिकाओं resuspend । नमूने अब एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण के लिए तैयार कर रहे है (चित्रा 1) ।
      नोट: चिमारास में अंकुरल केंद्र प्रतिक्रियाओं 6 सप्ताह के बाद से किसी भी बिंदु पर विश्लेषण किया जा सकता है ।

4. vivo में सीमांत क्षेत्र के लेबलिंग/सबकैप्सूलर साइनस एकल अंकुरल केंद्रों की पहचान सहायता करने के लिए

नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल footpad के लिए प्रदर्शन किया है/ओल (popliteal लिम्फ नोड) और नसों में (i.v., प्लीहा) इंजेक्शन, लेकिन लक्ष्य साइट के अनुसार अलग कर सकते हैं ।

  1. पॉप्टेशियल लिम्फ नोड लेबलिंग के लिए द्विपक्षीय फूटपैड इंजेक्शन
    1. के रूप में 2.6.1 चरण में चूहों Anesthetize ।
    2. एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, पीई के 2 μL पतला-लेबल चूहा विरोधी माउस CD169 एंटीबॉडी PBS, पीएच ७.४ के 18 μL में । प्लास्टिक पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े पर मिश्रण के 10 μL प्रत्येक की दो बूंदों प्लेस । महाप्राण प्रत्येक छोटी बूंद एक 30 गेज सुई के साथ एक ०.३ मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर ।
    3. या तो फ़ुटपैड में लेबलिंग मिश्रण के 10 μL सुई (फुटपैड के मध्य भाग में एक 5-10 डिग्री के कोण, पैर की उंगलियों की शुरुआत से समीपस् थ में सूई के साथ दर्ज करें, और सुई एड़ी की ओर लगभग आधे रास्ते डालें) या ओल (एक 5 पर सुई के साथ दर्ज करें- 10 ° कोण सिर्फ एड़ी के ऊपर और अपनी लंबाई के आधे रास्ते के बारे में डालने के घुटने की दिशा में achilles कण्डरा की धुरी के साथ) । चूहों को उनके पिंजरों में लौटाएं और चरण 5 के साथ आगे बढ़ने से पहले लगभग 15 मिनट प्रतीक्षा करें ।
  2. प्लीहा लेबलिंग के लिए अंतःशिरा इंजेक्शन
    1. बिंदु 2.6.1 में चूहों को एनस्थेटाइज़ करते हैं ।
    2. एक १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, पीई के 10 μL पतला-लेबल चूहा विरोधी माउस CD169 एंटीबॉडी PBS के ९० μL में । महाप्राण एक ०.३ मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज के साथ मिश्रण ।
    3. २.६ कदम प्रति के रूप में retroकक्षीय i.v. इंजेक्शन प्रदर्शन । चूहों को उनके पिंजरों में लौटाएं और चरण 5 के साथ आगे बढ़ने से पहले लगभग 15 मिनट प्रतीक्षा करें ।
      नोट: isoflurane के लिए एक विकल्प के रूप में, ऐसे ketamine के रूप में इंजेक्शन संवेदनाहारी/ हालांकि, यह सामांयतया धीमी पुनर्प्राप्ति समय की ओर जाता है । के बाद से लसीका जल निकासी आम तौर पर कंकाल पेशी आंदोलन से प्रभावित है, यह धीमी जल निकासी समय के लिए नेतृत्व की उंमीद है ।

5. प्लीहा और लिम्फ नोड्स Explanting और photoactivation के लिए तैयारी

  1. एक दोहरे तरफा इमेजिंग और photoactivation कक्ष की तैयारी
    1. एक 20 मिलीलीटर सिरिंज और वापस से डुबकी निकालें वैक्यूम तेल के साथ यह वैक्यूम तेल की एक ट्यूब के नोक डालने से लोड इसे में । तो एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से डुबकी हटाने और वापस करने के लिए 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें-यह वैक्यूम तेल के साथ लोड ।
    2. वैक्यूम चर्बी का प्रयोग करें 5 मिलीलीटर सिरिंज लोड एक फ्लैट सतह पर एक वर्ग coverslip रखने और वैक्यूम तेल के साथ coverslip के किनारों के साथ अनुरेखण द्वारा एक इमेजिंग और photoactivation चैंबर तैयार करने के लिए (के बारे में 1-2 मिमी किनारों से) ।
      ध्यान दें: ध्यान रखना वैक्यूम तेल संदूषण से बचने के लिए किसी भी और सभी सतहों कि बाद में माइक्रोस्कोप लेंस के साथ संपर्क में आते हैं, के रूप में विसर्जन पानी में इमल् सीफाइड वैक्यूम तेल की microdroplets लेंस दूषित कर सकते हैं ।
    3. बर्फ ठंडा बीएम बफर और एक ठंडे सपाट सतह पर जगह के साथ कवर पर्ची वैक्यूम तेल चैंबर भरें ।
  2. लिम्फ नोड्स और प्लीहा संचयन
    1. वीवो में चिमेरिक माउस लेबल के रूप में 2.2.1 कदम के अनुसार विश्लेषण किया जाना है । ७०% इथेनॉल के साथ नीचे लोथ स्प्रे ।
    2. जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड का उपयोग करने के लिए, सीधे ठीक कैंची का प्रयोग करने के लिए सिर्फ घुटने के गड्ढे के नीचे त्वचा में एक चीरा बनाने के लिए, और के साथ ऊपर की ओर कट विस्तार-रेखा लगभग कूल्हे संयुक्त जब तक । डुमोंट #5 या #7 forceps का उपयोग करना, त्वचा के बाहर के उजागर फ्लैप के प्रत्येक खींच जानुपृष्ठीय खात में ऊतक का पर्दाफाश करने के लिए (चित्रा 2a) ।
    3. डूमोंट #5 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, ध्यान से जानुपृष्ठीय केवल औसत दर्जे का खात दर्ज करें और काटना और खोलने और पैर की धुरी के साथ संदंश बंद करने के द्वारा वसा को खोलने, आदेश अंतर्निहित जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड बेनकाब करने के लिए ।
    4. अंगूठे और तर्जनी (चित्रा 2b) का उपयोग घुटने के सामने की ओर समीपकाल से quadriceps मांसपेशी चुटकी लेते हुए द्वारा खात से बाहर लिम्फ नोड पॉप । इसे आसपास के ऊतकों से मुक्त करने के लिए संदंश के साथ नीचे से लिम्फ नोड हड़पने (चित्र 2c) और फिर यह वैक्यूम तेल चरण ५.१ में तैयार चैंबर में जगह है ।
    5. चरण 5.2.2-5.2.4 contralateral पक्ष के लिए दोहराएं । एकाधिक लिम्फ नोड्स अगर वांछित एक एकल कक्ष में फिट किया जा सकता है ।
    6. अंत में वैक्यूम तेल रिम के शीर्ष पर एक दूसरे coverslip रखने और धीरे नीचे दबाने, सभी हवाई बुलबुले बाहर निकालने के लिए देखभाल के द्वारा चैंबर बंद करो ।
      नोट: बफर के कुछ बाहर धकेल दिया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से, लेकिन निर्वात तेल एक तंग मुहर फार्म चाहिए, द्रव के रिसाव को रोकने (चित्रा 2d) । लिम्फ नोड्स अब एक डबल तरफा इमेजिंग चैंबर में हैं ।
    7. तिल्ली का उपयोग करने के लिए, सीधे ठीक कैंची की एक जोड़ी का उपयोग माउस के बाईं ओर पेट की दीवार के माध्यम से एक चीरा बनाने के लिए, समीपवर्ती मध्यवर्ती रेखा के निकट, बस ribcage के नीचे, और यह शरीर के आसपास के पश्च कक्षीय लाइन के लिए विस्तार । तिल्ली की नोक दिखाई देनी चाहिए (चित्र 3A) ।
    8. दुमोंट #7 की एक जोड़ी के साथ तिल्ली को बाहर खींचो और इसे जारी करने के लिए नीचे पर आसंजन काट । सीधे ठीक कैंची की जोड़ी का प्रयोग करें ~ 2 मिमी मोटी, पार सेक्शनल, स्लाइस काटने के लिए ।
    9. कदम ५.१ में तैयार वैक्यूम तेल चैंबर में स्लाइस रखें । एकाधिक प्लीहा स्लाइस अगर वांछित एक एकल कक्ष में फिट किया जा सकता है ।
    10. अंत में वैक्यूम तेल रिम के शीर्ष पर एक दूसरे coverslip रखने और धीरे नीचे दबाने, सभी हवाई बुलबुले बाहर निकालने के लिए देखभाल के द्वारा चैंबर बंद करो । हर समय बर्फ पर सभी इमेजिंग कक्षों को छोड़कर, इमेजिंग और photoactivation के दौरान के अलावा रखो ।
      नोट: बफर के कुछ बाहर धकेल दिया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से, लेकिन निर्वात तेल एक तंग मुहर फार्म, द्रव के रिसाव को रोकने चाहिए । प्लीहा स्लाइस अब एक डबल तरफा इमेजिंग चैंबर (चित्रा 3B) में हैं ।

6. फोटोसक्रियण

  1. एकल अंकुरल केंद्रों की पहचान
    नोट: इस प्रोटोकॉल तिल्ली के लिए वर्णित है, लेकिन लिम्फ नोड्स के लिए पूरी तरह से अनुरूप है ।
    1. इमेजिंग चैंबर को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें । एक ३.५ मिलीलीटर प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, ऊपरी coverslip के शीर्ष पर आसुत पानी की एक बूंद जगह और संपर्क की बात जब तक उद्देश्य कम । संचारित प्रकाश का उपयोग कर ऊतक के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित ।
    2. डार्क मोड और दो photon उत्तेजना के लिए स्विच, और ९४० एनएम के लिए लेजर धुन ।
      नोट: उपयुक्त फिल्टर सेट के साथ, इस तरंग दैर्ध्य और बड़े जहाजों और संरचनात्मक तत्वों के साथ जुड़े कोलेजन-युक्त संरचनाओं में दूसरा harmonics पीढ़ी का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, साथ ही CD169 चरण ४.२ में इंजेक्शन पीई, जो सीमांत क्षेत्र की पहचान करता है । हालांकि, ९४० एनएम उत्तेजन पीए-GFP photoactivate नहीं है ।
    3. Information व्यक्तिगत सफेद लुगदी क्षेत्रों (CD169-PE धुंधला द्वारा घिरा) ऊतक की सतह के पास, और दूसरी harmonics केंद्रीय arteriole के साथ जुड़े पीढ़ी द्वारा पेरिएट्रीयोलर लिम्फोइड म्यान (दोस्तों, टी कोशिका क्षेत्र) की पहचान । दोस्तों और सीमांत क्षेत्र के बीच के क्षेत्र में, अत्यधिक autoफ्लोरोसेंट की उपस्थिति के लिए देखो, सक्रिय tingible-शरीर मैक्रोफेज (सभी चैनलों में मजबूत ऑटोफ्लोरोसेंट संकेत, बूँद-अंधेरे vacuoles के साथ उपस्थिति की तरह) (चित्र 4a) ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, ऊतक के अवांछनीय अभिविन्यास के कारण, इमेजिंग चैंबर फ़्लिप किया जा सकता है और इमेजिंग दूसरी दिशा से किया जा सकता है.
    4. चरण 6.1.3. में पहचान की बानगी के आधार पर, एक एकल अंकुरल केंद्र क्षेत्र की पहचान ब्याज के एक क्षेत्र आकर्षित । लगभग 100-150 μm गहराई के एक जेड स्टैक सेट, ऊतक की सतह से शुरू, और ~ 3 μm के एक कदम आकार का उपयोग कर ।
    5. ८३० एनएम उत्तेजन तरंगदैर्घ्य के लिए स्विच करें । बंद या मंद सभी चैनलों डिटेक्टरों को धूप को रोकने के लिए (के रूप में लेजर शक्ति और उत्पादन प्रतिदीप्ति आम तौर पर इस तरंग दैर्ध्य में नाटकीय रूप से अधिक है), और फिर ' छवि ' ढेर ।
      नोट: विशिष्ट सेटिंग्स, जैसे लेजर पावर और पिक्सेल वास समय, ऊतक में गहराई पर निर्भर करते हैं, विशिष्ट ऊतक इस्तेमाल किया, और इमेजिंग प्रणाली । प्रत्येक आवेदन का इस्तेमाल किया विशिष्ट इमेजिंग प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जाना है । हालांकि यह स्टैक भर में कुशल photoactivation प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, देखभाल करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए photoक्षतिग्रस् त कोशिकाओं ।
    6. वापस ९४० एनएम उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के लिए स्विच और चैनलों को फिर से खोलना । (चित्रा 4B) भर में कुशल photoactivation की पुष्टि करने के लिए ढेर के माध्यम से स्कैन और photoक्षतिग्रस् त (फैलाना, गैर कोशिका घिरा पीए gfp संकेत, काले धब्बे या photoसक्रियित क्षेत्र में उच्च डिग्री autofluorescence) की अनुपस्थिति ।
    7. इमेजिंग चैंबर में सभी प्रासंगिक ऊतकों photoactivate करने के लिए आगे बढ़ना है, तो तुरंत यह आगे की प्रक्रिया तक बर्फ को वापस । अतिरिक्त इमेजिंग मंडलों के photoactivation के साथ आगे बढ़ें ।
      नोट: ऊतक explanting, बढ़ते और विशेष रूप से photoactivation समय लेने वाली प्रक्रियाओं हैं, लेकिन कुल बारी के आसपास समय 4-6 घंटे के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए, सेल व्यवहार्यता में नाटकीय कमी को रोकने के लिए ।

7. वसूली और photoसक्रियित कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. लिम्फोसाइटों के लिंफ नोड्स और प्लीहा से निष्कर्षण
    1. प्रत्येक photoसक्रियित नमूना के लिए, एक तदनुसार लेबल १.५ मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब बर्फ पर बीएम बफर के ५०० μL युक्त तैयार करें । एक गैर-PA-GFP नियंत्रण और एक गैर-सक्रिय PA-GFP माउस से नमूने शामिल करें । यह एक बी-6 नियंत्रण और एक PA-GFP नियंत्रण माउस को शामिल करके पूरा किया जा सकता है ।
    2. ध्यान से ऊपरी कवर पर्ची इमेजिंग चैंबर से हटाने के लिए, नमूने की स्थिति बनाए रखने के लिए देखभाल (यदि एकाधिक नमूनों एक ही कक्ष में मौजूद हैं), और प्रत्येक नमूना अपने संबंधित नमूना ट्यूब में जगह है ।
    3. एक खल homogenizer का उपयोग कर, ऊतक निचोड़ और ट्यूब में मूसल लिम्फोसाइटों को रिहा करने के लिए ट्विस्ट । एक micropipette का उपयोग करना, एक ताजा, पूर्व ठंडा १.५ मिलीलीटर microकेंद्रापसारक ट्यूब में एक ७० μm सेल छलनी के माध्यम से lysate और फिल्टर महाप्राण । लिम्फ नोड नमूनों के लिए, 7.1.5 कदम करने के लिए छोड़ दें ।
    4. तिल्ली नमूनों के लिए, एक झूल बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर सेंट्रीफ्यूज । Supernatant छोड़ें और RBC lysis बफर के २०० μL में गोली resuspend । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते, तो बर्फ ठंडा बीएम बफर के ८०० μL जोड़ें और कदम 7.1.5 के लिए आगे बढ़ना ।
    5. एक झूल बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर सेंट्रीफ्यूज । स्प्नैंट को छोड़ें और आइस-कोल्ड बीएम बफर की २०० μL में रेसपेंड करें । नमूने अब प्रवाह cytometric मूल्यांकन और छंटाई, यदि वांछित के लिए धुंधला करने के लिए तैयार हैं ।
  2. प्रवाह cytometric मूल्यांकन के लिए धुंधला होना
    नोट: सुझाए गए पैनल: CD169-PE, B220-PerCP-Cy 5.5, 9D11-A647, CD38-PE-Cy7, Fixable व्यवहार्यता डाई Efluor-७८०, GL7-प्रशांत नीला । गैर-सक्रिय PA-GFP प्रशांत नारंगी (या समकक्ष) चैनल में पाया जाता है । GFP चैनल में Photoसक्रियित PA-GFP का पता चला है । किसी भी सह-शुद्ध मैक्रोफेज (जो हो सकता है या नहीं हो सकता है vivo में CD169-PE के साथ लेबल) CD169-PE के साथ धुंधला करके और एक डंप गेट के रूप में इस का उपयोग करके बाहर रखा जा सकता है ।
    1. एक micropipette का उपयोग कर, एक ९६-well थाली में, प्रत्येक चिमेरा और नियंत्रण नमूना के लिए अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के १०० μL जोड़ें ।
    2. B6 नियंत्रण नमूनों के लिए, बिना दाग नियंत्रण और एकल दाग नियंत्रण कुओं के लिए इस सामग्री का ५० μL जोड़ें । गैर-सक्रिय PA-GFP एकल-दाग नियंत्रण के लिए अतिरिक्त बिना दाग गैर सक्रिय PA-GFP नमूने के ५० μL जोड़ें । सक्रिय PA-GFP एकल-दाग नियंत्रण के लिए, सभी photoसक्रियित नमूनों के लिए शेष सामग्री पूल ।
    3. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से, बफर के १०० μL जोड़ें (unstained और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP मुआवजा नियंत्रण), एकल एंटीबॉडी (एकल दाग मुआवजा नियंत्रण) या एंटीबॉडी मिश्रण (photoसक्रियित नमूने) । 20 मिनट के लिए बर्फ पर इनसेबेट ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर २०० x g 5 मिनट पर सेंट्रीफ्यूज । बफ़र बाहर फ़्लिक । प्रत्येक कूप और सेंट्रीफ्यूज करने के लिए फिर से धोने के लिए बीएम बफर की २०० μL जोड़ें । बफर बाहर झाड़ और प्रत्येक में अच्छी तरह से २०० μL में बीएम बफर के कोशिकाओं resuspend । नमूने अब एक प्रवाह cytometer या सॉर्टर ( चित्रा 5में प्रतिनिधि परिणाम) पर विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।

Representative Results

मिश्रित अस्थि मज्जा चिम्लास की पीढ़ी

वर्तमान प्रोटोकॉल के रूप में 1 चित्रा में प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है के रूप में बी सेल डिब्बे में एक के पास पूर्ण chimeras के साथ मिश्रित अस्थि मज्जा chimeras प्राप्त (सांख्यिकीय महत्व के लिए कृपया 12को देखें) । Serotyping 6 सप्ताह के बाद पुनर्गठन (चित्रा 1a), 9d11 की एक कम आवृत्ति (idiotype) सकारात्मक परिसंचारी बी कोशिकाओं 564igi डिब्बे से संस्थाओ (चित्र 1b) के साथ में सामांय बी सेल नंबर का पता चलता है । कुल लिम्फोसाइट गेट के भीतर, अवशिष्ट प्राप्तकर्ता-व्युत्पन्न कोशिकाओं की एक कम आवृत्ति है, ~ 6% सीडी 45.1 (Q1), ~ ९४% (चित्रा 1C) के chimerism की एक समग्र डिग्री का संकेत है. दाता डिब्बे के भीतर (सीडी 45.1-, Q4 + Q3) 564Igi (Q4) के PA-GFP (Q3) के अनुपात के आसपास है 23% से ७७% । इस इनपुट से थोड़ा कम ३३% से ६६% अनुपात बी कोशिकाओं के भारी नकारात्मक चयन द्वारा समझाया गया है 564Igi डिब्बे 12से व्युत्पंन । के रूप में चित्रा 1 डीमें देखा, वहां बी सेल डिब्बे (९९.९% सीडी 45.1-) और फिलीस्तीनी अथॉरिटी-gfp अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न बी कोशिकाओं (Q3), जो 564Igi-व्युत्पन्न बी कोशिकाओं के भारी नकारात्मक चयन का एक परिणाम है के प्रभुत्व में लगभग पूरा chimerism है ।

ऊतकों की कटाई, प्रसंस्करण और प्रवाह cytometric मूल्यांकन

चित्रा 2 और 3 चित्रा और हौसले से अलग लिम्फ नोड्स और प्लीहा स्लाइस explanting के परिणाम के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन । चित्रा 4 एक explanted तिल्ली स्लाइस में एक ही अंकुरण केंद्र क्षेत्र के विवो लेबलिंग और photoactivation में के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करता है । के रूप में देखा जा सकता है (चित्र 4a), VIVO में CD169 के साथ लेबलिंग-पीई है मामूली सीमांत क्षेत्र (लाल, द्वारा संकेत "mz" लेबल) । दूसरा harmonics के संकेत कोलेजन में स्पष्ट है-संरचनात्मक तत्वों और प्रमुख जहाजों (नीला) युक्त, पेरिआरट्रियोलर लिम्फोइड म्यान (दोस्तों) के मध्य धमनिका सहित. अत्यधिक ऑटोफ्लोरोसेंट, सक्रिय tingible-शरीर मैक्रोफेज अंकुरल केंद्र गतिविधि (आरोहेडस) के साथ जुड़े हुए हैं । एक साथ लिया, सीमांत क्षेत्र की पहचान, दोस्तों, और tingible-शरीर मैक्रोफेज, ब्याज के एक क्षेत्र की पहचान की संभावना है जो एक ही अंकुर केंद्र शामिल की अनुमति देता है । ब्याज का क्षेत्र फोटोसक्रिय है, जैसा कि चित्र 4Bमें दर्शाया गया है । के रूप में प्रदर्शन किया, photoactivation microसंरचनात्मक रूप से सटीक9है, सक्रियण के एक परिभाषित क्षेत्र उपज । प्रस्तुत परिणाम इसके अलावा पुनर्गठित chimeras और सहज अंकुर केंद्रों की उपस्थिति में फिलीस्तीनी अथॉरिटी-GFP + लिम्फोसाइटों के एक उच्च घनत्व की पुष्टि के रूप में सेवा करते हैं । डाउनस्ट्रीम प्रवाह cytometric मूल्यांकन इसके अलावा सामांयीकृत बी सेल डिब्बे संख्या (चित्र 5d), एक सहज अंकुर केंद्र जनसंख्या (चित्रा 5e) की पुष्टि करता है, और अंकुल केंद्र बी कोशिकाओं के एक सबसेट की उपस्थिति है जो किया गया है photoसक्रियित (चित्रा 5F) ।

इस प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल सहज autoreactive अंकुल केंद्रों, जो मुख्य रूप से जंगली प्रकार व्युत्पंन बी एक photoactivatable रिपोर्टर ले जाने की कोशिकाओं से बना रहे है के साथ मिश्रित अस्थि मज्जा chimeras के उत्पादन के लिए एक मजबूत तरीका प्रस्तुत करता है । यह बारी में व्यक्तिगत अंकुरल केंद्रों के बहाव विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ( चित्रा 6में ग्राफिकल सिंहावलोकन) ।

Figure 1
चित्रा 1: 564Igi (सीडी 45.1-, फिलीस्तीनी अथॉरिटी-gfp-):P ए-GFP (सीडी 45.1-, फिलीस्तीनी अथॉरिटी-gfp +) के खून में chimerism की डिग्री के प्रवाह cytometric मूल्यांकन lethally किरणित सीडी 45.1 प्राप्तकर्ताओं (सीडी 45.1 +, PA-GFP-), 6 सप्ताह के बाद पुनर्गठन में मिश्रित chimerism । एक) B220 + बी कोशिकाओं के gating दिखा प्लॉट, पूर्व सिंगलेट lymphocytes पर gated । ) बी सेल जनसंख्या के भीतर 9D11 + (idiotype) आवृत्ति दिखा रहा है, प्लॉट ए से subgate. ) PA-gfp बनाम सीडी 45.1 की साजिश, पूर्व-सिंगलेट लिम्फोसाइटों पर gated । ) प्लॉट ए से बी सेल उपगेट में पीए-जीएफपी बनाम सीडी 45.1 का प्लाट । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2: इमेजिंग और photoactivation के लिए कटाई और बढ़ते जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड्स के लिए प्रक्रिया । ) एक चीरा घुटने के नीचे किया जाता है और कूल्हे संयुक्त करने के लिए विस्तारित है, और किनारों पक्षों को मुकर रहे हैं, आदेश में जानुपृष्ठीय खात (आरोह) का पर्दाफाश करने के लिए । B) ओवरलाइंग फाटपैड खोला जाता है और पॉप्लिटीयल लिम्फ नोड (ऐरोहेडड) को दिखाया जाता है । ) जानुपृष्ठीय लिम्फ नोड खात से प्राप्त की है । ) प्रक्रिया contralateral पक्ष के लिए दोहराया जाता है और दोनों नोड्स बीएम बफर से भरा एक डबल पक्षीय coverslip/वैक्यूम-तेल चैंबर में रखा जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फसल कटाई और इमेजिंग और photoactivation के लिए तिल्ली बढ़ते के लिए प्रक्रिया । क) एक चीरा बस रिबकेज के नीचे पूर्वकाल औसत दर्जे की रेखा पर किया जाता है और पीछे के कक्षीय लाइन के लिए शरीर के आसपास विस्तारित है, और किनारों तिल्ली की नोक (आरोह) को बेनकाब करने के लिए मुकर रहे हैं । ) तिल्ली से मुकर और उत्तेजित है, और पतली में कटौती (1-2 मिमी) स्लाइस, जो एक डबल तरफा coverslip में बढ़ रहे हैं,/ कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: फोटोसक्रियणA) फोटोसक्रियण से पहले प्लीहा में एक अंकुरण केंद्र का दो-फोटॉन माइक्रोग्राफ. Vivo में विरोधी के साथ लेबलिंग-CD169-पीई तिल्ली के फसल से पहले सीमांत क्षेत्र लेबल के लिए प्रदर्शन किया था (लाल, "MZ द्वारा संकेत") । दूसरी harmonics संकेत कोलेजन में स्पष्ट है-एकीकरण और प्रमुख जहाजों (नीला) के साथ जुड़े संरचनाओं युक्त. ऐरोहेड अत्यधिक ऑटोफ्लोरोसेंट की पहचान करते हैं, सक्रिय टिंगिबल-शरीर मैक्रोफेज के साथ जुड़े अंकुरल केंद्र गतिविधि. इमेजिंग ९४० एनएम उत्तेजन पर प्रदर्शन किया गया था । शीर्ष बाएं हाथ कोने में स्केल बार के रूप में एक के लिए २०० μm. B) इंगित करता है, लेकिन ८३० एनएम पर photoactivation के बाद । Photoसक्रियित कोशिकाओं अब सीमांत क्षेत्र द्वारा घिरा ब्याज की एक परिभाषित क्षेत्र में (हरी) दिखाई दे रहे हैं और पहले से पहचान की टिंगिबल-शरीर मैक्रोफेज को शामिल. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रकाशसक्रिय अंकुल केंद्र बी कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण । एक) आगे की साजिश बनाम साइड स्कैटर और लिम्फोसाइट गेट । ) लिम्फोसाइट गेट के भीतर आगे तितर बितर ऊंचाई के एक समारोह के रूप में आगे तितर बितर क्षेत्र की साजिश है, और जिसके परिणामस्वरूप सिंलेट गेट । ) सिंलेट गेट के भीतर व्यवहार्यता डाई बहिष्करण साजिश, और जिसके परिणामस्वरूप लाइव सेल गेट । D) B220 + B कोशिकाओं का गेटिंग. ) अंकुल केंद्र बी कोशिकाओं के गेटिंग, B220 + गेट के भीतर CD38lo GL7hi कोशिकाओं के रूप में पहचान की । ) GC B सेल जनसंख्या के भीतर photoसक्रियित कोशिकाओं के गेटिंग, कोशिकाओं के सबसेट के रूप में पहचान की सह गैर सक्रिय और PHOTOसक्रियित PA-gfp एक्सप्रेस । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: प्रोटोकॉल का ग्राफ़िकल ओवरव्यू । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

Autoimmunity के म्यूरिन मॉडल की एक बड़ी संख्या में उपलब्ध हैं, जिनमें से कई सहज अंकुरित केंद्रों16के साथ मौजूद हैं । हालांकि, उपलब्ध मॉडल के कई बंदरगाह जटिल आनुवंशिक पृष्ठभूमि या लिम्फोसाइट प्रसार या सक्रियण के केंद्रीय नियामकों में उत्परिवर्तनों, उंहें खराब रिपोर्टर लाइनों और सामांय लिम्फोसाइट व्यवहार के अध्ययन के साथ intercrossing के अनुकूल प्रतिपादन स्वत: प्रतिरक्षा में, क्रमशः । वर्तमान मॉडल, इसके विपरीत पर, एक ' प्लग और ' खेलने के दृष्टिकोण की अनुमति देता है में-autoreactive जंगली की गहराई से विश्लेषण-प्रकार व्युत्पंन अंकुल केंद्र बी कोशिकाओं transgenes के किसी भी वांछित संयोजन का उपयोग कर, दस्तक-बहिष्कार और पत्रकारों, वर्तमान मामले में द्वारा प्रतिनिधित्व photoactivatable GFP. Vivo लेबलिंग रणनीतियों में उपयोग करते हुए, एकल अंकुरल केंद्रों को एक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के उपयोग से explanted लसीकाभ ऊतकों और उनके सेलुलर घटकों में विज़ुअलाइज्ड किया जा सकता है । एकल अंकुरल केंद्रों से Photoसक्रियित लिम्फोसाइटों तो विश्लेषण या प्रवाह cytometrically, एकल कोशिकाओं या थोक में के रूप में क्रमबद्ध किया जा सकता है. इन कोशिकाओं को बाद में अतिरिक्त बहाव आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है के लिए autoimmunity के क्षेत्र में नए सिरे से अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

इस कार्यविधि के सफल निष्पादन के लिए कुछ महत्वपूर्ण चरण हैं । के रूप में प्रतिनिधि परिणाम, विकिरण (१,१०० Rad) और दाता अस्थि मज्जा पुनर्गठन के द्वारा प्रदर्शन सफलतापूर्वक प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा बी सेल डिब्बे में पूरी तरह से chimerism उपज डिब्बे की जगह । यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है, के रूप में अवशिष्ट प्राप्तकर्ता-B कोशिकाओं अंकुरण केंद्र जनसंख्या ' डार्क ' का एक सबसेट प्रदान करेगा । विकिरण के लिए इस्तेमाल किया स्रोत की परवाह किए बिना, खुराक/विकिरण के समय के लिए पशुओं के लिए ंयूनतम संपार्श्विक ऊतक नुकसान के साथ अधिकतम myeloablative प्रभाव उपज अनुकूलित किया जाना है । पुनर्गठन के लिए, अस्थि-क्रश प्रोटोकॉल और २०,०००,००० कुल रक्तदाता कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन के लिए उच्च पुनर्गठन डिग्री के लिए अत्यधिक उपज पाया गया है । अस्थि मज्जा निष्कर्षण के लिए बाँझ और ठंड काम कर रही है और दाता मज्जा की उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करता है । वांछित दाता अस्थि मज्जा अनुपात तक पहुंचने के लिए, यह महान देखभाल व्यायाम करने के लिए आवश्यक है जब कोशिकाओं के aliquots गिनती, दोनों ही गिनती के लिए और जब बाहर गिनती के लिए अस्थि मज्जा के उपप्रतिदर्श ले । मिश्रण और सह, बजाय सेंट्रीफ्यूज और फिर से शुरू करने के लिए दाता marrows, पेल्टिंग और फिर मिश्रण, सेल गिनती के बाद दाता अनुपात में किसी भी तिरछा को रोकने के लिए कार्य करता है ।

प्रोटोकॉल के मिश्रित अस्थि मज्जा कल्पना पीढ़ी अकेले खड़े कर सकते हैं, और यह किसी भी वांछित रिपोर्टर, transgene या दस्तक बाहर के साथ autoreactive अंकुअल केंद्रों के साथ chimeras के उत्पादन में सक्षम बनाता है । हालांकि, यह करने के लिए एक सीमा histocompatible दानदाताओं का उपयोग करने की आवश्यकता है । 564igi तनाव पर एक C57Bl/6j समस्वरिक पृष्ठभूमि है, और एक परिणाम के रूप में, अंय दाता (ओं) और प्राप्तकर्ताओं एक H-2b समस्वरिक पृष्ठभूमि होना चाहिए (या वैकल्पिक रूप से, 564igi तनाव वांछित तनाव और स्व-प्रतिरक्षित phenotype को backcrossed होना चाहिए नई पृष्ठभूमि पर सत्यापित) । विकिरण प्रक्रिया के लिए एक सहनशीलता17पर्यावरण एहसान जाता है, और कुछ मामूली histocompatibility एंटीजन में बेमेल बर्दाश्त किया जा सकता है । हालांकि, इस पहलू पर अच्छी तरह से विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से अगर पुरुष और महिला दाताओं और/या प्राप्तकर्ताओं, पुरुष प्रतिबंधित Y-एंटीजन के साथ महिला जेट के लिए क्षमता के कारण मिश्रण ।

इसी तरह, प्रोटोकॉल के photoactivation पहलू अकेले खड़े हो सकते हैं, और कई अलग संदर्भों में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, PA-gfp रिपोर्टर वर्तमान में केवल ubc promotor के साथ उपलब्ध है, जो सभी टेम वंश कोशिकाओं में सक्रिय है, लेकिन stromal कोशिकाओं में नहीं है । जैसा कि परिचय में कहा गया है, अंय photoactivatable, photoactivatable, या photoपरिवर्तनीय रिपोर्टर उपभेदों उपलब्ध हैं, और PA-GFP के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, प्रायोगिक परिस्थितियों के उचित समायोजन के साथ ।

यह अवांछित क्षेत्रों के अनजाने photoactivation से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, ९०० एनएम जब इमेजिंग के ऊपर अच्छी तरह से लेजर बनाए रखने के द्वारा, के रूप में इस तरंग दैर्ध्य पीए GFP photoactivation नहीं होगा । खुद photoactivation के लिए, लेजर शक्ति और पिक्सेल ध्यान केंद्रित समय के रूप में विशिष्ट सेटिंग्स, ऊतक में गहराई पर निर्भर करेगा, विशिष्ट उपयोग ऊतक, और इमेजिंग प्रणाली, और प्रत्येक अनुप्रयोग के लिए विशिष्ट इमेजिंग इस्तेमाल किया प्रणाली के लिए अनुकूलित किया है । देखभाल करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए photoक्षतिग्रस् त कोशिकाओं, लेकिन यह एक ही समय में आवश्यक है ढेर भर में कुशल धूप पाने के लिए, क्रम में बहाव के विश्लेषण के लिए सक्रिय कोशिकाओं का एक पर्याप्त प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए । अंकुरित केंद्र बी कोशिकाओं आमतौर पर कहीं भी ०.५% से प्लीहा या त्वचीय लिम्फ नोड बी कोशिकाओं के ~ 2% का गठन, और के रूप में प्रतिनिधि परिणामों से देखा जा सकता है (चित्रा 5), photoसक्रियित एकल अंकुल केंद्र बी कोशिकाओं को कुल का ~ 1% कर सकते है एक तिल्ली स्लाइस में मौजूद जनसंख्या । इसलिए, सफल विश्लेषण या कक्षों की एक महत्वपूर्ण संख्या की छंटाई घटनाओं की एक बड़ी संख्या में प्रसंस्करण की आवश्यकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

SE Degn एक Lundbeckfonden साथी और एक Carlsberg फाउंडेशन प्रतिष्ठित साथी है । यह काम अतिरिक्त रूप से एक NNF जैव चिकित्सा अनुदान (एसई Degn) द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody, 9D11-A568 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend 110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) Biolegend 144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) Biolegend 142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 Biolegend 102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Biolegend 103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized Fisher Scientific 211766
Cell strainer, 70 µm Falcon 352350
Conical tubes, 50 mL Falcon 352235
Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm Thermo Fisher Scientific 22X22-1
EDTA Merck 1,084,180,250
Ethanol, 70% VWR 8301.360
Fetal bovine serum Life Technologies 10270106
Flow cytometer, FACS Canto II BD Biosciences 338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP BD Biosciences - Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning VWR DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk VWR 630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet. Orion Pharma 9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) Cedarlane CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) Sarstedt 72.690.550
Microscope, Two-photon Prairie Technologies (now Bruker) - Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml VWR 410-0110
NaHCO3 Merck 1063290500
Needle, 18 gauge BD Medical 304622
NH4Cl VWR 87,769,290
PBS Sigma d8537
Pestle homogenizer VWR 47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm VWR 410-0122
Pipette, Serological, 10 ml VWR 612-3700
Pipette, transfer, plastic Sarstedt 861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M) Bemis PM996
Plate, 96-well Falcon 353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps FST - Fine Science Tools 91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps FST - Fine Science Tools 91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight FST - Fine Science Tools 91460-11
Syringe, 10 mL Terumo SS-10ES1
Syringe, 20 mL Terumo SS-20ES1
Syringe, 5 mL Terumo SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc BD Medical 324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml MSD Animal health 431577
Trypan blue solution, 0.4% VWR K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermo Fisher Scientific 65-0865-14

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References

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