Standard-Betriebsverfahren für Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan

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Summary

Dieses Protokoll führt ein Standard-Labor-Betriebsverfahren für diagnostische Tests von Lyssavirus-Antigenen bei Fledermäusen in Taiwan.

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Hsu, W. C., Hsu, C. L., Tu, Y. C., Chang, J. C., Tsai, K. R., Lee, F., Hu, S. C. Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan. J. Vis. Exp. (150), e59421, doi:10.3791/59421 (2019).

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Abstract

Viren innerhalb der Gattung Lyssavirus sind zoonotische Krankheitserreger, und mindestens sieben Lyssavirus-Arten sind mit menschlichen Fällen in Verbindung gebracht. Da Fledermäuse sind natürliche Reservoirs der meisten Lyssaviren, ein Lyssavirus-Überwachungsprogramm von Fledermäusen wurde in Taiwan seit 2008 durchgeführt, um die Ökologie dieser Viren bei Fledermäusen zu verstehen. In diesem Programm, nicht-staatliche Fledermaus-Schutz-Organisationen und lokale Tierseuchen-Kontrollzentren kooperierten, um tote Fledermäuse oder Fledermäuse sterben an Schwäche oder Krankheit zu sammeln. Gehirngewebe von Fledermäusen wurden durch Nekropsie erhalten und einem direkten fluoreszierenden Antikörpertest (FAT) und Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zum Nachweis von Lyssavirus-Antigenen und Nukleinsäuren unterzogen. Für die FAT werden mindestens zwei verschiedene Tollwut-Diagnosekonjugate empfohlen. Für die RT-PCR werden zwei Primersätze (JW12/N165-146, N113F/N304R) verwendet, um eine Teilsequenz des Lyssavirus-Nukleoprotein-Gens zu verstärken. Dieses Überwachungsprogramm überwacht Lyssaviren und andere Zoonoseerreger bei Fledermäusen. Taiwan Fledermaus Lyssavirus ist in zwei Fällen der japanischen Pipistrelle gefunden (Pipistrellus abramus) in 2016–2017. Diese Ergebnisse sollten die Öffentlichkeit, Gesundheitsfachleute und Wissenschaftler über die potenziellen Risiken der Kontaktaufnahme mit Fledermäusen und anderen Wildtieren informieren.

Introduction

Viren der Gattung Lyssavirus sind zoonotische Krankheitserreger. Es gibt mindestens sieben Lyssavirus-Arten, die mit menschlichen Fällen in Verbindung gebracht werden1. Zusätzlich zu den 16 Arten in dieser Gattung1,2,3, Taiwan Fledermaus Lyssavirus (TWBLV)4 und Kotalahti Fledermaus Lyssavirus5 wurden vor kurzem in Fledermäusen identifiziert, aber ihre taxonomischen Status haben noch nicht bestimmt werden.

Fledermäuse sind die natürlichen Wirte der meisten Lyssaviren, mit Ausnahme von Mokola Lyssavirus und Ikoma Lyssavirus, die noch nicht in irgendwelchen Fledermäusen identifiziert wurden1,2,3,6. Die Informationen über Lyssaviren bei asiatischen Fledermäusen sind immer noch begrenzt. Zwei nicht charakterisierte Lyssaviren bei asiatischen Fledermäusen (eines in Indien und das andere in Thailand)7,8 wurden berichtet. Ein menschlicher Tollwut-Fall im Zusammenhang mit einem Fledermausbiss in China wurde im Jahr 2002 berichtet, aber die Diagnose wurde nur durch klinische Beobachtung9gemacht. In Zentralasien wurde Das Aravan-Lyssavirus 1991 in Der weniger mausohrohrigen Fledermaus (Myotis blythi) in Kirgisistan und das Khujand-Lyssavirus in der Schnurrbartfledermaus (Myotis mystacinus) in Tadschikistan im Jahr 2001 10 identifiziert. In Südasien, Gannoruwa Fledermaus Lyssavirus wurde in der indischen Fliegenfuchs (Pteropus medius) in Sri Lanka im Jahr 2015identifiziert 3. In Südostasien zeigten mehrere serologische Studien an Fledermäusen auf den Philippinen, Thailand, Bangladesch, Kambodscha und Vietnam eine variable Seroprävalenz11,12,13,14, 15. Obwohl Irkut Lyssavirus in der größeren Röhrennasenfledermaus (Murina leucogaster) in der Provinz Jilin, China im Jahr 201216identifiziert wurde, bleiben die genauen Arten und Standorte von Lyssaviren in ostasiatischen Fledermauspopulationen unbekannt.

Um das Vorhandensein von Lyssavirus in taiwanesischen Fledermauspopulationen zu bewerten, wurde ein Überwachungsprogramm mit direkter FAT und RT-PCR initiiert. Taiwan Fledermaus Lyssavirus wurde in zwei Fällen der japanischen Pipistrelle identifiziert (Pipistrellus abramus)4 in 2016–2017. In diesem Artikel wird ein Laborstandard-Betriebsverfahren für die Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan eingeführt. Das Flussdiagramm der Fledermauslyssavirus-Diagnose in unserem Labor ist in Abbildung 1dargestellt.

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Protocol

1. Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit Lyssaviren

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Laborarbeiter, die mit Fledermausproben umgehen, eine Tollwutprophylaxe vor der Exposition erhalten17. Überwachen Sie die Tollwut-Antikörper-Spiegel der Arbeiter im Voraus und überprüfen Sie sie alle 6 Monate17. Für diejenigen, deren Antikörperspiegel unter 0,5 I.E./ml17liegen, ist eine Tollwut-Nachsorge erforderlich.
  2. Je nach den Biosicherheitsvorschriften des Landes, in dem sich das Labor befindet, stellen Sie sicher, dass die folgenden Verfahren in geeigneten Laboratorien auf Biosicherheitsebene (z. B. BSL-2-Laboratorien in Taiwan und BSL-3-Laboratorien in Australien) durchgeführt werden und dass Arbeitnehmer sind derzeit qualifiziert und tragen die richtige persönliche Schutzausrüstung18.
    HINWEIS: Die Tollwutimpfung bietet wenig bis gar keinen Schutz vor Lyssaviren der Phylogruppen II und III18. Die Arbeitnehmer müssen darüber informiert werden, dass mehrere zoonotische Krankheitserreger bei Fledermäusen19 identifiziert wurden und Proben unter geeigneten Laborbedingungen auf Biosicherheitsniveau mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung behandeln sollten.

2. Probensammlung

  1. Verwenden Sie gefunden schwache oder kranke Fledermäuse oder Kadaver.
    HINWEIS: Schwache oder kranke Fledermäuse werden zur tierärztlichen Versorgung oder Forschung an die Bat Conservation Society of Taipei geliefert, während Kadaver direkt an das Animal Health Research Institute übergeben werden. Keine gesunden Fledermäuse wurden in diesem Überwachungsprogramm eingeschläfert.
  2. Lassen Sie einen Fledermausökologen Fledermausarten durch morphologische Eigenschaften identifizieren20.
  3. Führen Sie DNA-Barcoding der Fledermaus-Arten, wenn Lyssavirus positiv diagnostiziert wird, mit zuvor veröffentlichten Verfahren21.
  4. Senden Sie ein Informationsblatt zu jedem Fledermauskadaver (Sammelstelle, Arten, klinische Zeichen usw.).

3. Nekropsie von Fledermausproben

  1. Bereiten Sie Materialien vor.
    1. Bereiten Sie eine saubere Sezierplatte vor und legen Sie ein steriles absorbierendes Pad für Nekropsie.
    2. Bereiten Sie Sammelrohre für das Sammeln von Fledermausorganen vor.
    3. Bereiten Sie Einweg-Pinzette und Skalpelle für Nekropsie. Ändern Sie die Werkzeuge zwischen der Nekropsie jeder Fledermaus. Bereiten Sie Baumwollkugeln mit 70% Ethanol befeuchtet für die Reinigung von Pinzetten und Skalpellen während der Probenahme.
    4. Bereiten Sie zwei Mikroskopdias für die FAT vor. Sammeln Sie frische Proben und fixieren Sie sie in formalin Lösung für histopathologische Untersuchungen.
  2. Untersuchen Sie alle externen Öffnungen vor der Nekropsie. Fotografieren Sie die äußeren Merkmale der Fledermaus, insbesondere den Kopf, die Ohren und die Flügel, für die Artendifferenzierung.
  3. Sammeln Sie eine orale Tupferprobe. Legen Sie die Fledermaus in ventrale Recumbency auf dem Brett und fixieren Sie den Kopf der Fledermaus mit einer Pinzette. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie der Calvaria mit einem Skalpell und ziehen Sie die Haut zu den Seiten. Schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie der Calvaria mit einem Skalpell und öffnen Sie ihn mit einer Pinzette, um das Gehirngewebe freizulegen.
  4. Entfernen Sie das Hirngewebe aus dem Schädel und legen Sie es auf einen sterilen Zungendrucker und machen Sie Abstriche aus dem Hirngewebe (siehe Schritt 4.2). Sammeln Sie ein kleines Stück frisches Hirngewebe und fixieren Sie es in Formalin für histopathologische Untersuchungen. Enthalten Sie das restliche Hirngewebe in einer Röhre für die Nukleinsäureextraktion.
  5. Saubere Pinzette und Skalpell mit Wattebällchen mit 70% Ethanol befeuchtet, um zurückgehaltene Gewebe zwischen der Probensammlung zu entfernen.
  6. Legen Sie die Fledermaus auf das Brett in dorsale Recumbency und fixieren Sie es auf dem Brett mit Nadeln an beiden Seiten der Axilla und Schwanz Ferse.
  7. Incise die Haut entlang der Mittellinie des Körpers von Unterkiefer zu Anus. Heben und trennen Sie die Haut und das darunter liegende Muskelgewebe mit einer Pinzette. Sammeln Sie die Speicheldrüsen, die in der Nähe des Unterkieferknochens sind.
  8. Heben Sie das Brustbein leicht mit einer Pinzette an und schneiden Sie das Brustbein und die Bauchwand entlang der Mittellinie mit einem Skalpell. Die Clavikeln mit einem Skalpell schneiden. Befestigen Sie die linken und rechten Rippenkäfige mit Nadeln am Brett, um die Brusthöhle zu öffnen.
  9. Erfassen Sie die Bruttoläsionen und den Grad der post-mortem Veränderung.
  10. Entfernen Sie das viszerale Gewebe (d. h. Herz, Lunge, Leber, Nieren, Darm) mit einer Pinzette und einem Skalpell aus dem Kadaver. Sammeln Sie die viszeralen Proben nach Bedarf für zukünftige Forschung.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, doppelte Proben zu sammeln. Eines sollte für die molekulare Diagnose gesammelt werden, das andere sollte bei -80 °C mit oder ohne virales Transportmedium für die Viruskultur eingefroren werden22.

4. Direkter fluoreszierender Antikörpertest (FAT)

  1. Machen Sie Eindruck Abstriche des Gehirngewebes für die FAT. Führen Sie die FAT wie zuvor beschrieben18,23 mit den folgenden Änderungen aus.
  2. Trennen Sie das Hirngewebe vorsichtig mit einer Pinzette vom verbundenen Nervengewebe und übertragen Sie das Hirngewebe in einen sterilen Zungendepressivum. Schneiden Sie den Querschnitt des Gehirns, einschließlich des Hirnstamms und Kleinhirn18,23. Machen Sie Eindruck Abstriche des Gehirngewebes durch leichtes Berühren der geschnittenen Oberfläche des Gehirngewebes, und drücken Sie das Dia auf Linsengewebe, um überschüssiges Gewebe zu entfernen.
  3. Befestigen Sie die Dias mit Aceton bei -20 °C für 30 min. Trocknen Sie die getesteten Dias und die positiven und negativen Kontrollen vor der Färbung mit Konjugat.
  4. Die Verwendung von jedem der beiden handelsüblichen FITC-konjugierten Antitollwut-Antikörper zur Färbung von Lyssavirus-Antigen wird sehr empfohlen23. Bestimmen Sie die Arbeitskonzentration des handelsüblichen Konjugats vor der ersten Färbung. Die verdünnten Konjugate durch einen Spritzenfilter von 0,45 m auf die Dias fallen lassen und die Dias 30 min in einer Nasskammer bei 37 °C inkubieren.
  5. Das überschüssige Konjugat von den Dias abtropfen lassen und die Dias nach der Inkubation mit phosphatgepufferter Kochchen (PBS) waschen.
  6. Lassen Sie eine kleine Menge von 10% Glycerin auf die Dias und Abdeckung mit Abdeckung Folien.
  7. Untersuchen Sie die Dias mit einem Fluoreszenzmikroskop.

5. Nukleinsäureextraktion

  1. Fügen Sie das richtige Volumen von MEM-10 (mindestens wesentliches Medium, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum) zum Hirngewebe hinzu (10% w/v).
  2. Homogenisieren Sie das Hirngewebe mit einer 5 mm Stahlperle in einem Homogenisator und Zentrifuge bei 825 x g für 10 min.
  3. Extrahieren Sie die Nukleinsäure, deren Endvolumen 50 l beträgt, innerhalb von 200 l des Überstandes unter Verwendung des handelsüblichen Gesamtnukleinsäureextraktionskits mit Instrument.

6. RT-PCR und phylogenetische Analyse

HINWEIS: Es wurden mehrere Primer-Sets veröffentlicht, um alle bekannten Lyssaviren oder spezifischen Lyssaviren zu erkennen. Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beispiel, das unser Labor verwendet und möglicherweise nicht allen experimentellen Anforderungen entspricht. Wählen Sie geeignete Primer nach Laborbedarf aus.

  1. Bereiten Sie das einstufige RT-PCR-Reagenz wie folgt vor: Fügen Sie dem Reaktionsgemisch, das 2,5 l 10x Reaktionspuffer, 0,5 l Vorwärts- und Rückwärtsprimer (jeweils 10 m), 4 l von 1,25 mM dNTP, 0,3 l RNase-Inhibitor (40 U/L) enthält, 5 l , 0,3 l Reverse-Transkriptase (10 U/L), 0,4 l DNA-Polymerase (5 U/L) und 11,5 l DEPC-behandeltes Wasser.
    HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Primersatz ist JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') und N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. Ändern Sie die Herstellung von Reagenzien und Fahrradbedingungen entsprechend den verwendeten Grundierungssätzen.
  2. Führen Sie das Radfahren unter den folgenden Bedingungen durch: Inkubation bei 42 °C für 40 min; anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 10 min; 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; und schließlich weitere Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
  3. Verwenden Sie einen anderen oder mehr Primer-Sets, um die Diagnoseempfindlichkeit zu erhöhen.
    1. Verwenden Sie N113F (5'-GTAGGATGCATGGG-3') und N304R (5'-TTGACGAAGATCTCTCTCTCAT-3')25,26, um das einstufige RT-PCR-Reagenz wie folgt vorzubereiten: Fügen Sie 5 l extrahierte Nukleinsäure zu einem Reaktionsgemisch hinzu, das 5 Vorwärts- und Reverse-Primer (jeweils 4 m), 5 l mit 1,25 mM dNTP, 0,5 l RNase-Inhibitor (40 U/L), 0,2 l Reverse-Transkriptase (10 U/L), 1 l DNA-Polymerase (5 U/L) und 23,3 l DEPC-behandeltes Wasser.
    2. Führen Sie das Radfahren unter den folgenden Bedingungen durch: Inkubation bei 42 °C für 40 min; anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 min; 35 Zyklen von 95 °C für 1 min, 55 °C für 1 min und 20 s und 72 °C für 1 min; und schließlich weitere Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
      HINWEIS: Wählen Sie je nach Laborbedarf geeignete Grundierungen für die Diagnose aus. N113F wurde ursprünglich für die Amplifikation von Tollwutviren entwickelt, kann aber für andere Lyssaviren nicht gut funktionieren. Der Satz von N113F und N304R funktioniert gut für Tollwut-Virus (Taiwan Frettchen Dachs Variante) und Taiwan Fledermaus Lyssavirus. Es wird einfacher sein, ganze Nukleoproteinsequenzen mit dem Satz von JW12 und N304R Primern zu erhalten, wenn das Lyssavirus durch beide der beiden oben genannten Primer-Sets verstärkt wird.
  4. Analysieren Sie das PCR-Produkt auf 2% Agarose-Gel-Elektrophorese und visualisieren Sie durch UV-Lichtbeleuchtung.
  5. Sequenzieren Sie das PCR-Produkt nach kommerziellem Sequenzierungsdienst.
  6. Geben Sie die Sequenz ein oder laden Sie sie auf die Webseite des Nukleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) hoch. Wählen Sie die Datenbank "Andere (nr etc.)" und geben Sie den Organismus als Lyssavirusein. Wählen Sie den MegaBlast-Algorithmus aus, und führen Sie den BLAST aus.

7. Virusisolierung

HINWEIS: Führen Sie die Virusisolation durch, wenn entweder 1) die FAT oder 2) die RT-PCR positiv angegeben ist.

  1. Homogenisieren Sie die Gehirnprobe in einer 10%(w/v) Suspension in MEM-10. Zentrifuge bei 825 x g für 10 min.
  2. Inokulieren Sie 200 l Überstand mit einer Suspension von 3 x 106 MNA (Mausneuroblastom) Zellen in 1 ml MEM-10 für 1 h bei 37 °C mit 1% CO2 . Übertragen Sie die Hirnhomogenat-Zellsuspension auf einen 25 cm2 Kolben und fügen Sie 6 ml MEM-10 hinzu.
  3. 1 ml der Hirnhomogenat-Zellsuspension in einem 4-Well-Teflon-beschichteten Glasschlitten mit 6 mm Durchmesser gleichzeitig anbauen.
  4. Nach 3–4 Tagen Inkubation bei 37 °C mit 1%CO2fixieren Sie die Zellen auf dem 4-Well-Dia mit 100% Aceton (v/v).
  5. Färben Sie die Dias mit zwei FITC-konjugierten Antitollwut-Antikörpern nach den Schritten 4.4–4.7. Die Zellen werden infiziert, wenn die intrazytoplasmatischen Einschlüsse untersucht werden. Zeichnen Sie den Prozentsatz der infizierten Zellen auf.
  6. Führen Sie Trypsinisierung und Subkultur der geimpften Zellkultur durch, wenn die Dias negativ befleckt werden:
    1. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie den Kolben mit 5 ml PBS.
    2. Fügen Sie 1 ml Trypsin in den Kolben und schlagen Sie fest auf den Boden des Kolbens.
    3. Fügen Sie 6 ml MEM-10 hinzu und setzen Sie die Zellen erneut aus.
    4. Setzen Sie die Zellsuspension in einen neuen Gewebekolben (6 ml) und auf eine 4-Well-Rutsche (1 ml).
  7. Wiederholen Sie die Schritte 7.4–7.6, bis eine 100% Infektiosität erreicht ist.
  8. Sammeln Sie den Überstand nach 24 h Inkubation.

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Representative Results

Von 2014 bis Mai 2017 wurden 332 Fledermauskadaver von 13 Arten zur Überwachung gesammelt. Zwei positiv getestet. Im ersten Fledermausfall wurde der Hirnabdruck mit einem der kommerziellen FITC-konjugierten Antitollwut-Antikörper negativ getestet (Abbildung 2), während die RT-PCRs mit jedem der beiden Primer-Sets (JW12/N165-146, N113F/N304R) positive Ergebnisse (Abbildung 3). Es wurde eine 428 bp-Sequenz von Amplicon (verstärkt mit N113F/N304R und enthält das partielle Nukleoproteingen) erhalten. Seine Reihenfolge wurde von der GenBank-Datenbank von BLAST-Abfragen unterzogen. Das Ergebnis zeigte, dass die Sequenz ähnlich wie Lyssaviren mit Identitäten von weniger als 79% war (Abbildung 4), die die Identitäten der nachgewiesenen Lyssaviren unterstützten.

Später wurden zwei Lyssaviren erfolgreich aus diesen beiden Gehirnen isoliert, und die Viren wurden durch FAT (Abbildung 5) und Sequenzierung bestätigt. Das identifizierte Lyssavirus wurde auf der Grundlage der Sequenzanalyse4als Taiwan Bat Lyssavirus (TWBLV) bezeichnet. Im zweiten Fall waren die Ergebnisse der FATs, die jeden der beiden kommerziellen FITC-konjugierten Antitollwut-Antikörper einsetzten, inkonsistent, wie im ersten Fall beschrieben.

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm zur Fledermauslyssavirus-Diagnose.
Flussdiagramm mit den aktuellen Prozess- und Diagnosemethoden, die unser Labor jetzt verwendet hat. Die Virusisolierung sollte durchgeführt werden, wenn entweder der direkte fluoreszierende Antikörpertest oder die Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion positiv ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Direkte FAT mit zwei kommerziellen FITC-konjugierten Anti-Tollwut-Antikörpern der gesamten Gehirnkompression von einer TWBLV-infizierten Fledermaus, die inkonsistente Ergebnisse liefert.
Fallnummer: 2016-2300: (A) Die FAT mit Reagenz A (5x Verdünnung), die apfelgrüne positive Signale demonstriert. (B) Die FAT mit Reagenz B mit negativem Ergebnis (20x Verdünnung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Produkte von RT-PCRs mit zwei Primer-Sets.
Das In den Bahnen 1 bis 3 verwendete Primer-Set war JW12/N165-146, und die erwartete Produktgröße betrug 111 Basenpaare. Das In den Bahnen 4 bis 6 verwendete Primer-Set war N113F /N304R, und die erwartete Produktgröße betrug 521 Basispaare. Beide Tests der Probe (Bahnen 1 und 4) waren positiv. M = 100 bp DNA-Leiter; Bahnen 1 und 4 = geprüfte Probe; Bahnen 2 und 5 = positiv gesteuert; Bahnen 3 und 6 = Negativkontrollen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: BLAST Ergebnis von N113F/N304R Produkt von TWBLV infiziertFledermaus.
BLAST-Ergebnisse zeigten, dass der Fall dem Lyssavirus am ähnlichsten war, aber die Identität mit dem Lyssavirus in der Datenbank betrug nur 79%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Vergleich der Lyssavirus-Antigenverteilung der Virusisolierung von TWBLV mit zwei FITC-konjugierten Antitollwutkonjugaten.
Die 10% Fledermaus-Gehirnemulsion (TWBLV infiziert) wurde in Maus-Neuroblastom-Zellen für die Virusisolation geimpft. Die FATs wurden im zehnten Durchgang durchgeführt und mit zwei FITC-konjugierten Antitollwut-Antikörpern befleckt. Die Antigenverteilung von Maus-Neuroblastomzellen mit zwei Tollwutkonjugaten zeigte signifikante Unterschiede. (A) Die FAT mit Reagenz A (5x Verdünnung). (B) Die FAT mit Reagenz B (5x Verdünnung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Laborstandard-Betriebsverfahren (SOP) bietet ein serielles Verfahren zur Prüfung von Fledermausproben auf das Vorhandensein von Lyssavirus-Antigenen in Taiwan. Zu den wichtigsten Schritten gehört der Einsatz von FAT und RT-PCR. Die Auswahl geeigneter Proben und die erfolgreiche Isolierung des Virus sind ebenfalls wichtig. Darüber hinaus wurde einige Fehlerbehebung während der Überwachung von Fledermaus Lyssaviren durchgeführt. Der Hauptunterschied waren die Zieltiere. Ursprünglich (2008-2009) waren die Zieltiere der Fledermaus-Lyssavirus-Überwachung lebende Fledermäuse, die auf Kinmen Island in Taiwan gefangen wurden und dann nach der Euthanasie auf Lyssavirus getestet wurden. Die meisten der gefangenen Fledermäuse waren gesund und unwahrscheinlich, Lyssavirus zu tragen, und dieser Ansatz zur Überwachung war nicht human. Daher wurden im dritten Jahr nur tote oder sterbende Fledermäuse gesammelt und das Überwachungsgebiet von regional auf national ausgeweitet. Nach acht Jahren kontinuierlicher Überwachung wurde der erste Fledermauslyssavirus-Fall schließlich in Taiwan entdeckt.

Obwohl FAT die am weitesten verbreitete Methode zur Tollwutdiagnose ist und von OIE und WHO18empfohlen wird, haben nur wenige Studien inkonsistente Ergebnisse gezeigt, wenn verschiedene Konjugate in der FAT5,27verwendet wurden. Ähnliche inkonsistente Ergebnisse traten auch in TWBLV-infizierten Fällen auf. In den TWBLV-infizierten MNA-Zellen zeigten die Ergebnisse von FAT signifikante Unterschiede in 2 Konjugaten (Abbildung 5). Einer der FITC-konjugierten Tollwut-Antikörper reagierte auch bei höheren Konzentrationen nicht gut. Aufgrund der Variation des Lyssavirus-Antigens in den Proben und der Variation der Antikörper-Avidität und Affinität von Antikörpern in den Konjugaten wird empfohlen, zwei verschiedene Konjugate in FAT zu verwenden, um falsche negative Ergebnisse im Lyssavirus zu verhindern. Diagnose23,28,29.

RT-PCR kann eine bestätigungsbasierte Diagnose für inkonsistente Fat-Ergebnisse liefern. Aufgrund der hohen genetischen Vielfalt des Lyssavirus wird empfohlen, mehr als einen Primer in RT-PCR zu verwenden, um die Genauigkeit des Lyssavirus-Screenings zu erhöhen29,30. Ein Primer-Set aus hochkonservierten Nukleoprotein-Genen ist das am häufigsten verwendete Set im Lyssavirus-Nachweis29. RT-PCR kann auch zur Diagnose in putrefaktiven Proben verwendet werden, wenn FAT nicht durchgeführt werden kann31,32. Um falsche Negativität zu vermeiden, die die Entdeckung eines neuartigen Lyssavirus verhindert, werden weitere Werkzeuge für den Nachweis empfohlen. Zwei neuartige Lyssaviren4, Taiwan Fledermaus Lyssavirus, wurden während dieser Umfrage mit dem SOP identifiziert.

Darüber hinaus wurden 2018 ein sehr unterschiedlicher TWBLV-Stamm und eine neuartige neue Art des Lyssavirus bei Fledermäusen in Taiwan gefunden (unveröffentlichte Daten). Die Ergebnisse bewiesen, dass die Beschäftigung von FAT und RT-PCR lyssaviren bei Fledermäusen zu erkennen ist. Einige Einschränkungen des RT-PCR-Primer-Sets, der in diesem SOP verwendet wird, sollten beachtet werden. Im Primer-Set von N113F/N304R wurde N113F ursprünglich für die Tollwutvirus-Verstärkung entwickelt, aber es kann nicht gut für andere Lyssaviren funktionieren. Mehrere Primer für den Lyssavirus-Nachweis wurden von anderen Forschernveröffentlicht 29,30 und können je nach Laborbedarf ausgewählt werden.

Dieser Artikel ist eine schrittweise Einführung in Fledermaus Lyssavirus Überwachung in Taiwan. Es ist zu hoffen, dass dieses SOP für Forscher hilfreich sein wird, die an der Überwachung des Fledermauslyssavirus interessiert sind. Da mehr Forscher Untersuchungen von Fledermäusen durchführen, werden in Zukunft mehr Lyssaviren identifiziert werden. Dieses SOP überwacht nicht nur Lyssaviren, sondern auch andere Zoonosen-Agenten bei Fledermäusen. Solche Ergebnisse können die Öffentlichkeit, Gesundheitsfachleute und Wissenschaftler über die potenziellen Risiken des Kontakts mit Fledermäusen und anderen Wildtieren informieren. Es wird auch dazu beitragen, das Verständnis der Evolution und der Ursprünge des Lyssavirus zu erweitern und zu erheblichen Fortschritten in der wissenschaftlichen Forschung zu führen.

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Disclosures

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Acknowledgments

Wir danken Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai und Ya-Lan Li für ihre Unterstützung während dieser Studie. Diese Studie wurde durch das Stipendium Nr. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) des Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan, unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090046 Trypsin
25 cm2 flask Greiner bio-one 690160
Acetone Honeywell 32201-1L
Agarose I VWR Life Science 97062-250
Alcohol NIHON SHIYAKU REAGENT NS-32294
AMV Reverse Transcriptase Promega M5101
Antibiotic-Antimycotic(100X)  Gibco 15240-062 MEM-10
Blade Braun BA215
Centrifuge eppendorf 5424R
Chemilumineance system TOP BIO CO. MGIS-21-C2-1M
Collection tube Qiagen 990381
Collection tube SSI 2341-SO
Cover slide Muto Pure chemical Co., LTD. 24505
DNA analyzer Applied Biosystems 3700XL
Fetal bovine serum Gibco 10437028 MEM-10
FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin Fujirebio Diagnostic Inc. 800-092 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B
Four-well Teflon-coating glass slide Thermo Fisher Scientific 30-86H-WHITE
Gel Electrophoresis System Major Science MJ-105-R
HBSS (1x) Gibco 14175095 Trypsin
Incubator ASTEC SCA-165DS
Inverted Microscope Olympus IX71
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco A2916801 MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent EMD Millipore Corporation 5100 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A
MagNA Pure Compact Instrument Roche 03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 Roche 03730964001
MEM (10x) Gibco 11430030 MEM-10
MEM NEAA (100x) Gibco 11140050 MEM-10
MEM vitamin solution Gibco 11120052 MEM-10
NaHCO3 Merck 1.06329.0500 MEM-10
Needle Terumo NN*2332R9
PBS Medicago 09-8912-100
Primer synthesis Mission Biotech
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
Sequencing service Mission Biotech
Slide Thermo Scientific AA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 MEM-10
Stainless Steel Beads QIAGEN 69989
Sterile absorbent pad 3M 1604T-2
Syringe filter Nalgene 171-0045
Taq polymerase JMR Holdings JMR-801
Thermal cycler Applied Biosystems 2720
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tongue depressor HONJER CO., LTD. 122246
Tweezer Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. A0601
Tylosin Tartrate Sigma T6271-10G MEM-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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