폐경 후 심장 혈관 기능 장애의 외인성 에스트로겐 치료를 선별하기위한 생체 내 에스트로겐 결핍 마우스 모델

Biochemistry

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Summary

임상적으로, 갱년기 여성의 에스트로겐 결핍은 지질 장애및 동맥 경화증의 발생률을 악화시킬 수 있습니다. 우리는 apoE-/- 마우스에 있는 이중 등측 절개를 통해 양측 난소 절제술에 의하여 생체 내 에스트로겐 부족 모형을 설치했습니다. 마우스 모델은 폐경 후 심혈관 기능 장애의 외인성 에스트로겐 치료를 스크리닝하는 데 적용가능하다.

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Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

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Abstract

폐경 후 여성은 폐경 전 여성보다 심혈관 질환이 발생할 위험이 더 큽입니다. 여성 마우스 난소 (OVX) 위닝 디스플레이에서 그대로 난소 기능을 가진 여성 마우스에 비해 대동맥에서 죽상 경화성 병변을 증가시켰다. 그러나, 동맥 경화 경향이 상태 와 에스트로겐 결핍 마우스를 포함 하는 실험실 모델 부족. 이 적자는 갱년기 여성의 임상 에스트로겐 결핍이 기존 또는 지속적인 지질 장애 및 동맥 경화증의 발생률을 악화시킬 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 이 연구에서, 우리는 apolipoprotein E (apoE)-/- 마우스에 있는 이중 등쪽 측삭 절개를 통해 양측 난소 절제술에 의하여 생체 내 에스트로겐 결핍 마우스 모형을 설치합니다. 그런 다음 헤이즐넛 스프레드를 통해 perorally 투여된 17β-estradiol 및 슈도프로토디오신(PPD) (식물성 에스트로겐)의 효과를 비교합니다. 우리는 PPD가 OVX apoE-/- 마우스에서 최종 체중 과 혈장 TG를 감소시키는 데 약간의 영향을 미치지만, 17β-estradiol 대응과 비교할 수 있는 항 동맥 경화 및 심장 보호 능력을 가지고 있음을 발견했습니다. PPD는 항 종양 특성을 발휘 하는 보고 된 식물 에스트로겐. 따라서, 제안된 방법은 폐경 후 여성의 전통적인 호르몬 대체 요법을 대체하기 위해 페랄라 투여를 통한 식물성 에스트로겐 스크리닝에 적용되며, 이는 잠재적으로 해로운 종양유전학을 가지고 있는 것으로 보고되었다. 용량. 헤이즐넛 퍼짐을 통한 페랄랄 투여는 비침습적이며, 많은 환자에게 널리 적용가능하다. 이 문서는 apoE-/- 마우스와 페랄 17β-estradiol 또는 헤이즐넛 확산을 통해 식물 에스트로겐 호르몬 교체에 이중 등쪽 측면 절개를 통해 양측 난소 절제술의 단계별 데모를 포함. 심초음파를 이용한 혈장 지질 및 심혈관 기능 분석은 다음과 같습니다.

Introduction

역학 및 임상 연구에 따르면 폐경 후 여성은 폐경 전 여성1,2보다심혈관 질환의 위험이 상당히 더 큽에 있는 것으로 나타났습니다. 호르몬 대체 요법 (HRT)는 심혈 관 질환의 상대적 위험을0.37-0.79 3으로 줄일 수 있습니다. 다른 합병증 중, 심혈 관 질환에 의해 발생 하는동맥 경화 는 전세계 사망의 주요 원인 4. 그러나, 에스트로겐 결핍 마우스 를 제시 하는 동맥 경화 경향이 상태를 포함 하는 실험실 모델 부족. 이 프로토콜은 폐경 후 심혈관 기능 장애의 외인성 에스트로겐 치료를 스크리닝하기 위한 생체 내 에스트로겐 결핍 마우스 모델을 제공한다.

이전 연구는 높은 콜레스테롤 식단을 공급 죽상 경화성 설치류에 OVX의 적용이 동맥 경화증으로 고통받는 폐경후 여성을 모방 할 수 있음을 보여 5,6,7,8. 갱년기 여성의 죽상 경화성 상태를 닮은 재현 가능하고 편리한 동물 모델은 외인성 에스트로겐 연구의 기초입니다. 여기서, 양측 난소 절제술의 이중 등쪽-측각절개는 동맥경화-경향이 있는 아포리포프로테인 E 녹아웃(apoE-/-) 마우스9,10에적용하였다. 중간 복부 또는 등측 절개에 비해, 이중 등측 절개는 심한 복강 접착 및 염증을 피할 수있는 쉽고 적은 시간 소모적 인 방법입니다. 헤이즐넛 스프레드를 통한 항포랄 투여(재료 참조)는 비침습적이고 편리하며, 장기 투여모드(11)로서널리 적용가능하다. 느린 방출 펠릿 이식도인기 6. 그러나, 임플란트는 OVX를 행한 마우스에서 특히 감염의 부각을 악화시킬 수 있습니다. 다른 비침습적 투여 모드, 예: 경구 관장 및 물 관리, 또한 많은 단점이 있다. 경구 관자는 전형적으로 마우스를 강조하고 식도 상해를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 마시는 물을 통해 호르몬을 관리 하는 것은 매우 도움이; 그러나 외인성 에스트로겐이 물에 불용성이기 때문에 유화제로서 DMSO를 첨가하는 것은 불가피합니다. 여기에서, 우리는 장기 적인 관리를 위한 헤이즐넛 퍼짐을 통해 peroral 17β-estradiol 또는 식물성 에스트로겐 호르몬 보충을 선택했습니다.

최근, 폐경 후 여성의 심혈관 시스템에 대한 HRT의 유익한 효과는 여성 건강 이니셔티브(WHI) 시험12에서논란이 되고 있다. 한편으로는 외인성 에스트로겐만으로도 심혈관 시스템에 유익한 효과를 발휘합니다. 다른 한편으로는, 그것은 심혈 관 이벤트의 위험을 증가 하는 metohydroxyproge스테론 아세테이트와 결합 할 수 있습니다. 더 심각하게, HRT는 유방과 자궁 종양 진행으로 이끌어 낼 수 있고, 이 효력은 그것의 사용13,14를현저하게 제한했습니다. 종양 세포 에서 유사 분열 활성이 결여된 외인성 에스트로겐의 심혈관 보호 효과에 더 많은 관심이 집중되고있다 15,16,17. 인간과 동물에 있는 다중 연구 결과는 에스트로겐과 유사한 구조물을 가진 식물성 에스트로겐이 심장 혈관 보호에 있는 유익한 역할을 할 수 있다는 것을 건의합니다15,18.

따라서, 본 작업의 목적은 (i) 양자 간 난소 절제에 의한 생체 내 에스트로겐 결핍 마우스 모델을 apoE-/- 마우스에서 이중 등측 절개를 통해 구축하고 (ii) 심혈관 보호 효과를 perorally비교하는 것이다. 헤이즐넛 스프레드를 통해 17β-estradiol 및 슈도 프로토 디오신 (PPD)을 투여. 17β-estradiol은 여성 성 호르몬6,11,19에속하는 외인성 에스트로겐의 한 종류이다. DIOSCOREA 식물에서 스테로이드 사포닌 및 식물에스트로겐인 PPD는, 이전에 항종양 성질을 발휘하기 위해 보고되었다20.

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Protocol

모든 동물 관리 및 실험 프로토콜은 중국 의학 아카데미 및 북경 연합 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (허가 번호 : SYXK (베이징) 2013-0023). 아포에-/- 마우스의 기원은 C57BL/6J9,10이다.

1. apoE에서 이중 등측 절개를 통한 양측 난소 절제술-/- 마우스

  1. 위닝 (나이 28 일), 아베르틴 (트리브로모에탄올; 200 mg/kg; 복강 내)으로 암컷 apoE-/- C57BL/6J 마우스를 마취시.
    참고: 32개의아포에-/- 마우스는 무작위로 4개의 그룹으로 나누어졌다: SHAM, OVX, OVX/E2, 및 OVX/PPD 군(n= 그룹당 8).
  2. 동물을 가열 패드에 놓기 쉬운 위치에 놓습니다. 마취 시 눈 보호를 위해 눈 윤활제를 바르습니다.
  3. 36 ± 0.5 °C 이내의 체온을 유지하십시오. 투여 5 진통 카프로펜의 체중을 마우스 목의 측면 측면에 피하.
  4. 장골 문장에서 3 x 5cm2 마우스 영역 을 면도하십시오. 동물을 3 x 5cm2 조리개 수술시트로 덮기 전에 면도 부위를 요오드로 완전히 청소한 다음 70% 에탄올로 청소하십시오. 실험 중에 멸균 기구와 장갑을 사용하십시오.
  5. 가위와 집게를 사용하여 중간선에 1cm 측면절개를 하고 늑골 갈비뼈에 1cm 를 측면으로 만듭니다.
  6. 집게를 사용하여 피하 조직을 무뚝뚝하게 해부하십시오.
  7. 해부 고글을 사용하여 (재료 참조) 복강에서 흰색 지방 조직을 식별합니다.
  8. 복강에 도달 할 때까지 근막을 통해 0.5-1cm 절개를 만들기 위해 마이크로 시저와 마이크로 포스를 사용합니다.
    참고: 가짜 수술 그룹의 경우 상처를 직접 닫습니다. 모모노필라멘트 봉합사를 사용하여 근육 층과 피부를 따로 봉합합니다.
  9. 복강 내의 백색 지방 조직을 볼 수 있을 때, 마이크로포스를 사용하여 지방 조직을 잡고 부드럽게 꺼냅니다. 복강 내 지방 조직에 의해 감싸인 분홍색 뽕나무 모양의 난소를 볼 수 있습니다.
  10. 0.5-1 cm 근위 혈관과 자궁 경적을 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 리게이트. 미세좌를 사용하여 난소를 제거하고 나머지 조직을 복강으로 다시 넣습니다.
    참고: OVX 수술을 위한 주요 불리한 현상은 OVX 작동마우스에 있는 높은 사망으로 이끌어 내는 요도 결찰입니다. 이것은 해부 고글을 사용하여 조직을 확인함으로써 피할 수 있습니다.
  11. 상처를 닫습니다. 모모노필라멘트 봉합사를 사용하여 근육 층과 피부를 따로 봉합합니다.
  12. 가위와 집게를 사용하여 중간선에 1cm 측면과 1cm 측면의 늑골 갈비뼈를 다른 절개를 만듭니다. 위의 절차(1.5 ~ 1.11)를 반복합니다.
  13. 동물이 마취에서 깨어나게하십시오. 별도로 수술 후 첫날에 마우스를 유지.
  14. 복구 단계에서 케이지를 자주 청소하거나 교체하십시오.
  15. 대략 24 수술 후 시간, 다른 관리 5 진통 카프로펜의 mg/kg 체중 피하.

2. 헤이즐넛 스프레드를 통해 17β-estradiol 또는 PPD의 페랄랄 투여

  1. 참기름에 17β-estradiol 또는 PPD를 완전히 녹인 다음 참기름을 헤이즐넛 스프레드와 혼합합니다(재료 참조). 각 30g 마우스에 대한 일일 분량에는 17β-estradiol 3 μg 또는 PPD 15 μg, 참기름 4 μL, 헤이즐넛 스프레드 60 mg이 들어 있습니다. 각 30g 마우스에 대한 위약을 준비 참기름 4 μL과 헤이즐넛 스프레드 60mg을 포함.
    참고: 17β-estradiol 또는 PPD의 일일 투여 부분은이전 연구 6,11 및 예비 실험에 기초하였다.
  2. OVX 후 1 주일, 높은 콜레스테롤 다이어트와 쥐를 먹이 (1.25% 콜레스테롤, 0% cholate) 12 주 동안. 본 연구에서 사용되는 전형적인 실험 적 치료 방식은 그림1에 예시되어 있습니다.
  3. 5 주 4에 퍼진 헤이즐넛의 peroral 관리 전에, 약 포함 하는 위약을 먹는 쥐를 훈련 30 mg 헤이즐넛 확산 에 대 한 2-5 쥐에 대 한 5 일. 처음 3 일 동안 그들의 홈 케이지에 그룹으로 마우스를 훈련. 생쥐를 훈련의 4일 및 5일에 별도의 케이지에 넣고 실험 상황을 닮은 일일 부분을 제공합니다.
  4. 마지막 동안 9 주, 별도의 케이지에 마우스를 배치하고 모든 먹이 행사에 대한 헤이즐넛 확산 부분을 매일 부분을 제공합니다.
    참고: OVX/E2 및 OVX/PPD 군에서 헤이즐넛스프레드를 통해 17β-estradiol (0.1 mg·kg-1) 또는 PPD(0.5 mg·kg-1)를 함유하는 일일 분량을 각각 제공; 샴과 OVX 그룹에서 호르몬이 없는 헤이즐넛 스프레드를 함유한 일일 분량을 제공합니다.

3. 마이크로 초음파 시스템을 사용하여 인티마 - 매체 두께 및 심장 기능 장애의 결정

  1. 초음파 생체 현미경
    1. 종료 하루 전에, 앞서 설명한 대로 마이크로 초음파 시스템을 사용하여 인티마 - 매체 두께 및 심장 기능 장애를 검사하십시오 (재료 참조)21.
    2. 검사 전에, 각 마우스에게 마취로 아베르틴 (tribromoethanol)의 복강 내 주사 200 mg / kg을 제공합니다 (그룹 당 n = 8 마우스).
    3. 각 마우스의 목 털을 조심스럽게 면도하십시오. 최적의 이미지 품질을 보장하기 위해 따뜻한 초음파 전송 젤을 자유롭게 바하십시오.
    4. 12.7mm 초점과 40 μm의 해상도로 30MHz 스캔 헤드를 사용하여 대동맥 근과 오름차순 대동맥의 기준선 초음파 이미지를 가져옵니다.
    5. 모니터링을 위해 리드 II 구성과 함께 심전도를 사용하십시오.
    6. 오름차순 대동맥, 대동맥 아치 및 brachiocephalic 동맥 가지의 오른쪽 파라스테른 장축 이미지를 시스톨에서 한 평면에서 캡처합니다(그림 3).
  2. 인티마-미디어 및 최대 플라크 두께 측정
    1. 트랜스듀서와 동맥 부위 사이의 거리를 쉽게 조정하여 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.
    2. 이미지 분석 시스템에서 오프라인 검사를 위해 10s cine 루프를 디지털로 저장합니다.
    3. 추가 측정을 위해 수동으로 최적의 동결 프레임 초음파 이미지를 선택하십시오. 오름차순 대물의 작은 곡률에서 이미지를 확인합니다. 오름차순 대동맥의 플라크를 볼 수 있다면, 최대 플라크 두께를 측정하십시오. 오름차순 대동맥의 플라크를 볼 수 없는 경우 최대 IMT를 측정하십시오.
    4. IMT(혈관 발광-친티컬 인터페이스와 내측 출현 인터페이스 사이의 거리)를 측정합니다. 최대 플라크 두께(혈관 루멘과 출현 층 사이의 가장 두꺼운 거리)를 측정합니다.
    5. 3개의 병변 부위에서평균 데이터 (그림 3).
  3. 심초음파를 이용한 심장 기능 장애의 결정
    참고 :
    앞서 설명한22에서설명한 바와 같이 미세 초음파 시스템을 사용하여 심초음파를 통해 심장 기능을 검사하십시오.
    1. 초음파 빔을 유두 근육 근처의 심장쪽으로 향하십시오.
    2. 2차원 심전도 기반 킬로헤르츠 시각화를 달성합니다.
    3. 30 MHz 스캔 헤드를 사용하여 좌심실의 생체 내 심초음파 를 수행합니다.
    4. M 모드 추적에서 심장 기능과 관련된 파라미터를 디지털 방식으로 측정합니다.
    5. 3~5개의 심장 주기에서 데이터를평균합니다(표 1).
  4. 관찰자 간 변동성
    1. 관찰자 내 가변성 유효성 검사를 위해 두 가지 경우에 한 연산자가 데이터를 분석합니다.
    2. 관찰자 간 가변성을 평가하기 위해 다른 연산자가 데이터를 분석합니다.

4. 주간 체중 측정 및 혈장 총 콜레스테롤 (TC) 및 트리 글리세라이드 (TG) 결정

  1. 주간 체중 측정
    1. 체중을 주 -1에서 주 12까지 일주일에 한 번 측정하십시오.
      참고: n = 그룹당 8개의 마우스.
  2. 플라즈마 준비
    1. 심장 내 구멍을 통해 혈액 샘플을 수집하기 전에 주사기와 튜브를 준비하십시오. EDTA를 항응고제로 사용하십시오. 각 2 mL 주사기에 0.5 M EDTA의 10 μL을 추가하고 각 1.5 mL 튜브에 0.5 M EDTA의 8 μL을 추가합니다.
    2. 주에 12, 하룻밤 금식 후, 아베르틴으로 마우스를 마취 (tribromoethanol; 200 mg/kg; 복강 내).
      참고: n = 그룹당 3개의 마우스.
    3. 70 % 에탄올로 복부 가슴 부위를 준비하십시오.
    4. 가위와 집게를 사용하여 흉강을 열고 박동하는 심장이 노출 될 때까지 갈비뼈를 자른다.
    5. 25G 바늘을 오른쪽 심실로 삽입하십시오. 혈액이 주사기로 흐르기 시작할 때까지 천천히 흡인합니다.
      참고: 우리는 25G 바늘로 멸균 상태에서 일회용 주사기를 사용합니다 (재료 참조).
    6. 안정적이고 균일한 압력으로 계속 흡인하십시오. 혈액이 보이지 않으면 바늘을 재배치하고 포부를 반복하십시오.
    7. 필요한 혈액량을 수집하기 전에 마우스를 깊이 마취하십시오. 일반적으로 최대 1 mL의 혈액을 수집 할 수 있습니다. 이 깊은 마취 상태에서 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사.
    8. 피펫 혈액 샘플 1.5 mL 튜브에 혈액을 철저 하 게 반전 EDTA 혈액에 혼합 을 보장 하기 위해. 그런 다음 즉시 얼음에 혈액 샘플을 놓습니다.
    9. 4°C에서 400 x g에서 20분 동안 원심분리기 시료를 수집 후 30분 이내로 샘플링합니다.
    10. 조심스럽게 상급을 수집합니다. Aliquot 및 -80 °C에서 플라즈마 샘플을 저장합니다.
  3. TC 또는 TG 함량 측정을 위한 표준 곡선 구성
    1. TC 표준 곡선의 경우, 콜레스테롤 표준의 다양한 농도를 준비: 0 mmol/L, 0.52 mmol/L, 1.03 mmol/L, 2.07 mmol/L, 4.14 mmol/L, 6.20 mmol/L, 8.27 mmol/L 및 각 콜레스테롤 표준에 대 한 측정 O.D. 각 콜레스테롤 표준에 대한 평균 O.D.를 설정합니다. 수직(Y) 축 값으로 농도를 수평(X) 축 값으로 설정합니다. 통계 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선을 만듭니다.
    2. TG 표준 곡선의 경우, TG 표준의 다양한 농도를 준비합니다: 0 mmol/L, 0.45 mmol/L, 0.90 mmol/L, 1.81 mmol/L, 3.62 mmol/L, 5.42 mmol/L, 7.23 mmol/L 및 9.04 mmol/L 측정 O.D. 각 TG 표준에 대 한. 각 TG 표준에 대한 평균 O.D.를 수직(Y) 축 값으로 설정합니다. 농도를 수평(X) 축 값으로 설정합니다. 통계 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선을 만듭니다.
      참고: 본 연구에서 표준 곡선 시공에 4파라미터 로지스틱 커브 피팅(4-pl)을 사용하였다. 플라즈마 샘플을 측정하기 전에 표준 곡선을 확인하고 r2가 0.995보다 큰지 확인합니다.
  4. TC 함량 측정
    1. TC 분석 키트의 컬러 시약(25mL)을 "TC 작업 용액"으로 라벨을 붙입니다.
    2. 냉장 된 표본을 잠시 소용돌이. 희석준비: 증류수 80 μL에서 플라즈마 20 μL. 간략하게 소용돌이 희석.
    3. 콜레스테롤 기준 2.5 μL(5.17 mmol/L) 또는 희석된 플라즈마 2.5 μL 또는 96웰 플레이트의 적절한 우물에 2.5 μL의 증류수(빈)를 추가합니다. 삼중 항을 권장합니다.
    4. 모든 웰에 250 μL의 컬러 시약을 추가합니다.
    5. 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
    6. 마이크로 플레이트 리더를 켜고 10 분 동안 따뜻하게 하십시오.
    7. 인큐베이터에서 플레이트(들)를 제거하고 510 nm에서 마이크로플레이트 리더를 판독한다. 마이크로티터 웰이나 플레이트 바닥에 기포나 먼지가 존재하지 않도록 하십시오.
    8. 다음과 같이 TC 농도를 계산합니다.
      TC cont. = 콜레스테롤 표준 연속 × (혈장 샘플 O.D.-빈 O.D)/(콜레스테롤 표준 O.D.-빈 O.D)
  5. TG 함량 측정
    1. TG 분석 키트의 컬러 시약(25mL)을 "TG 작업 솔루션"으로 라벨을 지정합니다.
    2. 냉장 된 표본을 잠시 소용돌이.
    3. 희석된 플라즈마 또는 2.5 μL의 희석 된 플라즈마 또는 2.5 μL의 증류수 (빈)에 TG 표준 (2.26 mmol / L)의 2.5 μL을 96 웰 플레이트의 적절한 우물에 추가하십시오. 삼중 항을 권장합니다.
    4. 모든 웰에 250 μL의 컬러 시약을 추가합니다.
    5. 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
    6. 마이크로 플레이트 리더를 켜고 10 분 동안 따뜻하게 하십시오.
    7. 인큐베이터에서 플레이트(들)를 제거하고 510 nm에서 마이크로플레이트 리더를 판독한다.
      참고: 마이크로티터 웰이나 플레이트 바닥에 기포나 먼지가 없는지 확인하십시오.
    8. 다음과 같이 TG 농도를 계산합니다.
      TG cont. = TG 표준 연속 × (플라즈마 샘플 O.D.-빈 O.D)/(TG 표준 O.D.-빈 O.D.)

5. 대동맥 경화성 병변의 En 얼굴 분석

  1. 대오타 격리 및 절제
    1. 주에 12, 하룻밤 금식 후, 아베르틴으로 마우스를 마취 (tribromoethanol; 200 mg/kg; 복강 내). 이 깊은 마취 상태에서 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사.
      참고: 우리는 그룹 당 3 마우스를 사용했습니다.
    2. 70 % 에탄올로 복부 가슴 부위를 준비하십시오. 가위와 집게를 사용하여 흉강을 열고 박동하는 심장이 노출 될 때까지 갈비뼈를 자른다.
    3. pH 7.4에서 인산완식염수로 50 mL 주사기를 채웁니다(재료 참조). 좌심실로 25G의 바늘을 삽입하고 관류에서 고압을 피하기 위해 오른쪽 심방을 잘라.
    4. 0.05-0.08 mL /min의 유량으로 관류 관류에서 수행하십시오.
    5. 가위와 집게로 흉강에서 갈비뼈와 폐를 제거하십시오. 그런 다음 복강을 열고 대불을 더 잘 볼 수 위해 내부의 장기를 제거하십시오.
    6. 마이크로 포스셉으로 심장을 잡고 장골 분기까지 마이크로시저로 등뼈에서 대류를 등지에서 분리하여 대불을 제거하십시오.
      참고: 신장 심방 가지 근처해부를 해부 할 때, 대인 손상을 피하기 위해 마이크로 시저를 사용하여 깊이 잘라.
    7. 4% 파라포름알데히드에 심장과 대반을 48시간 동안 고정하십시오. 대물다는 실온또는 2-8°C에서 식염수에 몇 시간 동안 보관하십시오.
      참고: 이 절차는 청소를 용이하게합니다.
  2. 대물의 준비
    1. 심장을 제거합니다. 신중하게 입체 현미경의 밑에 마이크로 포스와 마이크로시저를 사용하여 대동맥에서 출현 조직을 제거하십시오. 세척 중에 조직을 촉촉하게 유지하기 위해 식염수를 사용하십시오.
      참고: 대동맥과 부설 동맥, 왼쪽 일반적인 경동맥 및 왼쪽 쇄골 동맥과 같은 중요한 가지가 찢어지거나 별명을 얻지 않도록주의하십시오.
    2. innominate 및 왼쪽 일반적인 경동맥의 1 mm를 두고 전체 왼쪽 쇄골 동맥을 잘라.
    3. 부속 동맥을 통해 외부 곡률을 열고 왼쪽 일반적인 경동맥을 절단 한 다음 왼쪽 쇄골 동맥으로 자른 다음 왼쪽 쇄골 동맥으로 자른다.
    4. 오름차순 부분의 내부 곡률을 따라 복부의 바닥까지 잘라냅니다.
    5. 대불의 평평한 검은 색 플라스틱 시트에 고정하고 식염수를 적용하여 대종이 건조되지 않도록 합니다.
  3. 대물의 친밀한 영역의 이미지
    1. 스테레오 현미경으로 en 얼굴 대오르타스의 사진을 찍습니다. 측정을 보정하기 위해 이미지에 밀리미터 스케일 눈금자를 포함합니다.
    2. 동일한 이미지에 아치 및 흉부 영역과 다른 복부 영역을 포함합니다. 이미지를 JPEG 또는 TIFF로 저장합니다.
      참고: 아치 영역은 심근의 접합부로부터 왼쪽 쇄골 동맥에서 3 mm 말단으로, 흉부 영역은 마지막 늑간 동맥에 왼쪽 쇄골 동맥에 3 mm 말단이며, 복부 영역은 장골에 마지막 늑간 동맥이다 분기.
  4. 죽상 경화성 병변-en 얼굴 방법의 정량화
    1. 교정
      1. 이미지 분석 소프트웨어(재료 참조)를 사용하여 이미지를 열고 공간 교정으로 이동한 다음 지침을 따릅니다.
      2. 눈금자를 선 위에 배치하여 참조 단위를 mm으로 변경합니다.
    2. 측정
      1. 각 이미지에 대한 올바른 보정을 설정합니다.
      2. 눈금자에 3mm를 측정합니다.
      3. 아치 및 흉부 영역 측정: 왼쪽 쇄골 동맥및 흉부 부위로부터 3 mm 말단까지 심근의 접합부로부터 마지막 늑간 동맥까지 3 mm 말단에서 왼쪽 쇄골 동맥까지의 아치 영역을 윤곽. 아치와 흉부 부위의 병변을 추적하고 현미경을 통해 대인을 살펴보십시오.
      4. 복부 지역 측정: 흉부 영역의 끝에서 장골 분기까지 복부 영역을 윤곽을 조정합니다. 복부 지구에 있는 병변을 추적하고 현미경을 통해서 대인을 봅니다.
      5. 대반의 내부 표면을 기준으로 병변 면적을 계산합니다.
      6. 연구 그룹에 눈이 먼 두 번째 관찰자를 통해 정량화를 확인합니다.

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Representative Results

본 연구에서 사용되는 전형적인 실험 적 치료 방식은 그림1에 예시되어 있습니다. 위닝(나이 28일)에서, 암컷 아포에-/- C57BL/6J 마우스는 아베르틴(tribromoethanol; 200 mg/kg; 복강 내)으로 마취시켰다. 마우스는 양측 OVX 또는 1 cm 등절개를 통해 조작하였다. 양측 OVX 후 1주일, 마우스는 12주 동안 고콜레스테롤 식단(1.25% 콜레스테롤, 0% 콜레이트)을 공급하였다. 17β-Estradiol (0.1 mg/kg-1) 또는 PPD (0.5 mg·kg-1) 치료 의 마지막 9 주 동안 헤이즐넛 스프레드를 통해 병렬로 투여하였다. 모든 마우스를 매주 칭량하였다. 2에 나타낸 바와 같이, 에스트로겐 결핍 후 혈장 지질 및 주간 체중에 대한 외인성 에스트로겐(17β-estradiol 및 PPD)의 효과를 평가하였다. 12주 간의 고콜레스테롤 다이어트 후, OVX 마우스는 혈장 TC 및 TG 농도에서 현저한 증가를 보였다. 헤이즐넛 퍼짐을 통해 17β-estradiol 또는 PPD를 perorally 투여한 OVX 마우스는 샴 작동마우스보다 현저하게 낮은 혈장 TC 농도를 나타내었다(도 2A). 플라즈마 TG 수준은 17β-estradiol로 투여된 OVX 마우스에서 감소하되PPD를 사용하지 않았다(도 2B). 도 2C에나타낸 바와 같이, OVX 마우스에서 가짜 작동 마우스와 비교하여 OVX 마우스에서 증가된 체중(BW)을 향한 경향을 관찰하였듯이, OVX 마우스에서 BW는 고콜레스테롤 식이요법 후 헤이즐넛 스프레드를 통해 17β-estradiol 또는 PPD로 퍼짐을 병행하여 투여하였다. OVX 마우스에서 반대되는 경향을 보였다. 그러나, 상이한 그룹에서 마우스의 최종 체중은 유의한 변화를 보이지 않았다.

심혈관 기능을 심초음파를 이용하여 평가하였다. 3에 도시된 바와 같이, 요상대동맥의 최대 플라크 또는 IMT는 헤이즐넛 스프레드를 통해 17β-estradiol 또는 PPD로 퍼짐을 통해 OVX 마우스에서 측정하였다. 높은 콜레스테롤-다이어트-먹이 apoE의 대동맥 아치-/- 마우스는 B 모드 심초음파에 의해 관찰되었다. 오름차순 대장의 대표적인 종방향 이미지는 초음파 생체 현미경검사법에 의해 포착되었습니다. 빨간색 화살표는 플라크를 나타냅니다. OVX 마우스는 가짜 작동 마우스와 비교하여 오름차순 대동맥의 최대 플라크 또는 IMT증가를 나타내었다. 헤이즐넛 스프레드를 통해 17β-estradiol 또는 PPD의 항구 투여 후, OVX 마우스의 그것에 비해 요름대동맥의 최대 플라크 또는 IMT가 현저하게 감소하였다. (그림3). 우리는 또한 12 주 높은 콜레스테롤 다이어트 먹이 후 apoE-/- 마우스에서 OVX에 대 한 응답에서 심장 기능 장애를 관찰(표1). 심장 기능은 심초음파를 통해 검사되었습니다. OVX 마우스에서, 헤이즐넛 퍼짐을 통해 17β-estradiol 또는 PPD의 peroral 관리는 심장 기능 장애를 보여주는 매개 변수를 부분적으로 감쇠시킬 수 있었습니다.

다음으로, 우리는 대동맥 경화성 병변을 결정하기 위하여 en 얼굴 분석을 이용했습니다. 이전에보고 된 바와 같이, 후 12 주, 높은 콜레스테롤 다이어트는 대동맥의 발광 표면에 죽상 경화성 플라크 형성을 주도. 4에 도시된 바와 같이, 전체 대동맥 부위에 대한 대동맥 병변 영역의 평균 백분율은 OVX 마우스에서 유의하게 증가하였다. 헤이즐넛 스프레드를 통해 17β-estradiol 또는 PPD를 가진 항구 투여 후, 대동맥 병변 영역은 OVX 마우스의 대조물로 비교하여 현저하게 감소하였다. 이러한 결과는 3에 제시된 동맥경화증의 발달로부터 17β-에스트라디올 또는 PPD의 보호와 일치한다.

결론적으로, apoE-/- 마우스에 있는 이중 등측 절개를 통해 양측 난소 절제술을 사용하는 제안된 절차는 폐경 후에 심장 혈관 역기능의 비침범성 외인성 에스트로겐 처리를 검열하기 위해 적용됩니다. 그것은 또한 해로운 종양유전적 용량을 피하기 위해 특히 유용합니다.

Figure 1
그림 1. 마우스 치료 방식. 위닝(나이, 28일)에서, 암컷 아포에-/- C57BL/6J 마우스를 아베르틴(트리브로모에탄올; 200 mg/kg; 복강 내)으로 마취시켰다. 마우스는 양측 간 난소절제술(OVX) 또는 1 cm 등절개를 통해 조작된 샴을 하였다. OVX 후 1주일 후, 마우스는 12주 동안 고콜레스테롤 식단(1.25% 콜레스테롤, 0% 콜레이트)을 공급하였다. 17β-Estradiol (0.1 mg/kg-1) 또는 PPD (0.5 mg·kg-1) 치료 의 마지막 9 주 동안 헤이즐넛 스프레드를 통해 병렬로 투여하였다. 모든 마우스는 매주 무게를 측정하였다. 12주차에 심혈관 기능 분석은 심초음파를 사용하여 평가하였다. 고콜레스테롤 식단의 12주 후에, 모든 마우스는 안락사되었고, 혈액 샘플과 조직은 추가 조사를 위해 수확되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. 혈장 지질에 다양 한 외 인 에스트로겐의 효과 및 apoE에서 주간 체중-/- 마우스. 샴 마우스는 모의 수술을 받았고 고콜레스테롤 식단을 받았다. OVX 마우스는 양측 난소 절제술을 받은 다음 무작위로 다음 그룹으로 나뉘었다: OVX 그룹, 이는 높은 콜레스테롤 다이어트로 치료되었다; OVX/E2 (17β-estradiol) 그룹, 12 주 동안 높은 콜레스테롤 다이어트플러스 0.1 mg/kg E2 헤이즐넛 확산을 통해 peroral 관리를 통해 받은 9 치료의 주; 그리고 OVX/PPD 그룹은 12주 동안 고콜레스테롤 식단과 헤이즐넛 스프레드를 통해 0.5 mg/kg PPD를 치료의 마지막 9주 동안 받았다. 혈장의 총 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수준은 효소 방법(A-B)을통해 측정되었다. 데이터는 그룹당 n=5 마우스의 평균 ±SEM으로 표현된다. 주간 체중은 -1주부터 12주차(C)까지 측정하였다. 데이터는 그룹당 n=8 마우스의 평균 ±SEM으로 표현된다. Dunnett의 포스트 혹 테스트에 이어 단방향 ANOVA가 여러 번의 비교를 위해 수행되었습니다. *p < 0.05 샴 그룹과 비교; # OVX 그룹과 비교하여 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. imt 또는 최대 플라크 두께 측정 apoE-/- 마우스. apoE-/- 마우스의 대동맥 아치를 보여주는 B 모드 이미지가 제시된다. 오름차순 대장의 세로 이미지는 초음파 생체 현미경검사에 의해 얻어졌습니다. 오름차순 대동맥(mm)의 최대 플라크 또는 IMT를 측정하였다. 초음파 이미지는 오름차순 대동맥의 사소한 곡률에 플라크를 보여줍니다. 빨간색 화살표는 플라크를 나타냅니다. 데이터는 그룹당 n=8 마우스의 평균 ±SEM으로 표현된다. Dunnett의 포스트 혹 테스트에 이어 단방향 ANOVA가 여러 번의 비교를 위해 수행되었습니다. *p < 0.05 샴 그룹과 비교; # OVX 그룹과 비교하여 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4. apoE-/- 마우스에서 대동맥 경화성 병변의 En 얼굴 분석. 전체 대동맥 영역에 대한 대동맥 병변 영역의 평균 백분율은 모든 그룹에서 정량화되었다. 대반의 자궁 병변 (en face)의 대표적인 현미경 그래프가 도시됩니다. 데이터는 그룹당 n=3 마우스의 평균 ±SEM으로 표현된다. Dunnett의 포스트 혹 테스트에 이어 단방향 ANOVA가 여러 번의 비교를 위해 수행되었습니다. *p < 0.05 샴 그룹과 비교; # P < 0.05 OVX 그룹과 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

가짜 OVX (주)(주) OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (mm) 3.72 ± 0.10 3.74 ± 0. 24 3.68 ± 0.16 3.88 ± 0.16
LVID (mm) 2.34 ± 0.11 2.16 ± 0.22 2.12 ± 0.13 2.55 ± 0.12#
IVSd (mm) 0.83 ± 0.09 0.84 ± 0.07 0.91 ± 0.05 0.74 ± 0.06#
IVS (mm) 1.24 ± 0.02 1.35 ± 0.06* 1.45 ± 0.04# 1.09 ± 0.04#
PWTd(mm) 0.7± 0.10 0.68 ± 0.04 0.72 ± 0.07 0.58 ± 0.07#
PWT(mm) 1.10 ± 0.12 1.17 ± 0.08 1.24 ± 0.04 0.98 ± 0.08#
EDV (mm3) 58.89 ± 3.74 59.88 ± 9.02 57.39 ± 5.79 65.11 ± 6.13
ESV (mm3) 18.86 ± 2.17 15.75 ± 4.00 14.85 ± 2.37 23.45 ± 2.64#
EF (%) 67.84 ± 1.52 73.91 ±3 .63* 74.23 ± 1.50 63.91 ± 3.61#
FS (%) 37.19 ± 1.53 42.22 ± 1.17* 42.36 ± 1.21 34.28 ± 2.69#
LVIDd = 디아스톨 중 LV 내부 직경; LVIDs = 시스톨 동안LV 내부 직경; IVSd = 확장기 중 내부 심실 중격; IVSS = 실기 동안 내부 심실 중격; PWTd = 이스톨 동안의 후방 벽 두께; PWTs = 시스톨 동안의 후방 벽 두께; EF = 배출 분수; FS = 분수 단축; EDV = 끝 확장기 볼륨; ESV = 최종 수축기 볼륨.

표 1: 심초음파를 사용하여 심장 기능 평가. M 모드 추적에서 디지털 방식으로 심장 기능과 관련된 파라미터를 모든 그룹에서 정량화했습니다. 데이터는 그룹당 n=8 마우스의 평균 ±SEM으로 표현된다. Dunnett의 포스트 혹 테스트에 이어 단방향 ANOVA가 여러 번의 비교를 위해 수행되었습니다. *p < 0.05 샴 그룹과 비교; # OVX 그룹과 비교하여 0.05.

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Discussion

여기에서 기술된 방법론은 갱년기 여자에서 보인 지질 중단 및 동맥 경화증을 닮은 마우스 모형입니다. 그것은 잘 문서화 된 폐 경 후 여성에서 에스트로겐 결핍 점진적으로 복잡 하 고 광범위 한 동맥 경화 병 변기존의 또는 지속적인콜레스테롤 혈 증의 발생률을 악화 시킬 수 있습니다 1. 클리닉에서 동맥경화증이 발생하기 쉬운 상태를 모방하기 위해, 아포에결핍 마우스, 아테로제네시스23,24,25를연구할 수 있는 동물의 재현가능하고 편리한 공급원을 적용하였다. 본 연구에서 나타난 바와 같이, 여성 OVX apoE-/- 마우스는 난소 기능을 손상시키지 않은 암컷 아포에 비해 대동맥에서 죽상 경화성 병변의 증가를 나타냈다. 이 동물 모델에서, 우리는 또한 통제된 규정식 조건의 밑에 죽상 경화성 병변 크기에 각종 외인성 에스트로겐 보충 치료의 효력을 비교했습니다.

이 문서에 제시 된 양측 난소 절제의 이중 등쪽 측면 절개는 기술적으로 쉽고, 시간이 덜 걸리며, apoE에서 양측 난소 절제술의 중간 등쪽 측면 절개 또는 중간 복부 절개와 비교하여 안전합니다./- 마우스. 중간 복부 절개를 통해 양측 난소 절제술은 주요 단점을 제시: 그것은 차례로, 약물 흡수에 영향을 미칠 수있는 심한 복강 접착을 일으킬 수 있습니다. 최근 보고는 저용량 17β-estradiol의 peroral 행정이 대뇌 허혈26에 대하여 보호한다는 것을 보여줍니다. 따라서, 우리는 본 연구에서 헤이즐넛 확산을 통해 페랄랄 투여를 선택했다. 상업적인 저속 방출 펠릿은 마우스 모델에서 약리효과를 테스트하기 위해 자주 사용되는 투여 모드이지만 해로운 뇌손상(27)을일으킬 수 있다. 임플란트는 감염에 수그립니다, 마우스가 이중 등측 절개를 통해 양측 OVX를 복종하는 경우에 특히. 절개 전에 피부의 주의 깊은 소독이 수행되지만 감염을 피하기가 어렵습니다. 물 관리 및 경구 관위는 테스트된 덜 자주 사용되는 두 가지 방법입니다. 식수를 통해 호르몬을 관리하는 것은 거의 동물 취급이 필요하지 않습니다 때문에 매우 비 침습적인 때문에 매우 유익합니다. 그러나, 17β-estradiol은 유화제없이 물에 용해되지 않습니다. 따라서, 우리는 식수에서 용액을 용이하게하기 위해 0.5 % 미만의 농도로 DMSO를 사용했습니다. 그러나, 저용량 DMSO의 장기 투여를 위한 이러한 접근법은 마우스 또는 인간에게 제어하기 어렵고 독성이 있다. 마우스는 또한 감시의 전체 24 시간 동안 물을 마실 수 있습니다., 실제 약물 소비를 결정 하기 어렵게. 이 방법의 또 다른 단점은 개인의 물 섭취를 제어하기 어렵다는 것입니다. 구강 위장의 가장 큰 단점은 동물에 대 한 스트레스와 식도 부상을 일으킬 수 있습니다 및 먹는 행동에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에 기술된 방법론에서, 실험 전에 호르몬이 없는 헤이즐넛 스프레드를 먹는 5일 간의 훈련이 수행되었다. 대략 95% 마우스의 프로토콜 섹션에서 언급한 것과 같이 훈련되는 경우에 헤이즐넛 퍼짐을 받아들일 것입니다. 일단 완전히 습관화되면, 마우스의 대부분은 초 이내에 그것을 소비합니다. 이전 연구6,11과일치하여, OVX 마우스에서 혈장 E2 수치가 4주차에 샴 작동 대응에 비해 감소하였다(데이터는 도시되지 않음). 결정 후 12 주에, 우리는 OVX 작동 마우스에서 자궁 위축을 관찰. 그러나, 순환 에스트로겐 수준은 본 연구에서 OVX 후에 모니터링되지 않았다.

오름차순 대동맥에서 죽상 경화성 병변이 검출되지 않는 경우, 대동맥 IMT는 루멘 - 친근 인터페이스와 내측 출현 인터페이스 사이의 거리를 측정하여 평가 할 수 있습니다. 이 측정은 인간28에서이전에 검증 된 프로토콜을 기반으로합니다. 서로 약 100 μm인 세 사이트의 평균 데이터입니다. apoE에서 OVX 후 심장 워크로드 증가-/- 마우스는 결국 심장 출력을 증가로 이어질 수있는 개별 심근 세포의 보상비대 성장으로 인해 발생할 수 있습니다 (표 1). 반면, 9 주 동안 PPD의 퍼랄루셔런 투여 시, 보상 심장 비대는 가짜 에 필적하는 EF %로 감쇠되었다. 관찰자 간 가변성을 검증하기 위해 두 번의 서로 다른 경우 또는 다른 작업자에 의해 한 작업자가 심장 기능과 관련된 죽상 경화성 두께 측정 및 매개 변수에 대한 변동 계수를 분석합니다.

우리의 연구 결과에서 제시된 바와 같이, 헤이즐넛 퍼짐을 통해 17β-estradiol 또는 PPD로 perorally 투여된 OVX 마우스는 체중 증가를 방지하고 에스트로겐 결핍 관련 지질 중단을 감소시키는 경향이 있었습니다, 최종 체중에 있는 중요한 다름은 없었더라도 관찰. 이전 연구는 또한 지질 매개 변수 변화가호르몬29의항동맥 경화 효과를 설명하기에는 너무 사소할 수 있음을 보여주었습니다. 에스트로겐의 유익한 효과 지질 단백질 속성에 있는 변화에 국한 되지 않습니다. 에스트로겐30,31의일부 비지질 효과는 염증, 내피 기능 장애 및 혈역학적 정체와 같은, 인간 질환에서 심혈관 보호를 촉진할 수 있다. 본 연구에서 관찰된 결과를 고려할 때, 죽상 동맥 경화증 으로부터 외인성 에스트로겐의 보호는 전신 지질 수치와 부분적으로 독립적이다. 내피 세포에서, PPD는 유착 분자 및 염증 성 매개체의 발현을 억제하였다 (데이터는 도시되지 않음). 또한, PPD는 내피 항 수축과 밀접하게 상관되는 관쇄 지방 형성을 억제 할 수 있습니다. 따라서, PPD 및 17β-estradiol의 작용은 상이하였고, 근본적인 기전은 더 탐구될 것이다. 의심 할 여지없이, 헤이즐넛 확산과 같은 에너지가 풍부한 음식을 과도하게 섭취하면 체중 이 증가 할 수 있습니다. 그러나, 본 연구에서 언급한 소량의 헤이즐넛 스프레드(200 mg·kg-1·1·1)는 동물의 일일 에너지 섭취량의 5% 미만에 대해서만 책임질 수 있었다. 또한, 명백한 체중 증가 헤이즐넛 확산의이 금액을 사용 하 여 감지 되었다. 17β-estradiol 및 PPD의 사용은 주로 심혈관 질환의 치료를 위한 것이었다. OVX 작동aopE-/- 마우스에서 죽상동맥경화증의 진행 동안, 4주차부터 12주차까지, 17β-estradiol 또는 PPD를 영과하게 투여하였다.

HRT의 임상 사용의 한 무시할 수없는 점은 난소 및 유방암을 포함하는 해로운 부작용입니다13,14. 본 연구에서 시험된 식물성 에스트로겐은 디오스코어 식물에서 발견되는 스테로이드 사포닌 화합물이다. PPD는 일부 암 세포주(20)에 대한억제 효과가 있는 것으로 보고되었다. 또한, PPD는 17β-estradiol의 것과 유사한 항동맥 경화성 특성을 나타낸다. 우리가 여기에서 제시하는 모형은 종양 증식에 최소한의 효력을 발휘하는 식물성 에스트로겐을 포함하여 잠재적인 후보 화합물을, 검열하는 것을 도울 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81202526 에 J.X.), 중국 국립 자연 과학 재단 (81302769 - B.S.), 베이징 시 자연 과학 재단 (47144226 - B.S.), 중국 박사 학위에 의해 지원되었습니다. 과학재단(20110490325 ~ J.X.), 중국교육부 박사과정 재단(2011106120031 ~B.S.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

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References

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