Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

Biochemistry

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Summary

Clinicamente, a deficiência de estrogênio em mulheres menopáusicas pode agravar a incidência de ruptura lipídica e aterosclerose. Nós estabelecemos um modelo in vivo da deficiência do estrogen pelo ovariectomia bilateral através de uma incisão dorsal-lateral dobro em APOE-/- ratos. O modelo do rato é aplicável para a triagem de tratamentos de estrogênio exógena de disfunção cardiovascular após a menopausa.

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Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

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Abstract

Mulheres na pós-menopausa estão em maior risco de desenvolver doenças cardiovasculares do que as mulheres na pré-menopausa. Camundongos fêmeas ovariectomizados (OVX) na exposição ao desmame aumentaram as lesões ateroscleróticas na aorta em comparação com camundongos fêmeas com função ovariana intacta. Entretanto, faltam modelos laboratoriais envolvendo camundongos deficientes em estrogênio com estado propenso à aterosclerose. Esse déficit é crucial porque a deficiência clínica de estrogênio em mulheres menopausadas pode agravar a incidência de distúrbios lipídicos pré-existentes ou contínuos e aterosclerose. Neste estudo, nós estabelecemos um modelo in vivo estrogênio-deficiente do rato pela ovariectomia bilateral através de uma incisão dorsal-lateral dobro em apolipoproteína E (APOE)-/- ratos. Nós comparamos então os efeitos de 17β-estradiol e de pseudoprotodioscin (PPD) (um phytoestrogen) administrado peroralmente através da propagação da avelã. Nós achamos que apesar de PPD exercer algum efeito na redução do peso corporal final e do plasma TG em camundongos OVX apoE-/- , tem capacidades antiateroscleróticas e de proteção cardíaca comparáveis com sua contraparte de 17β-estradiol. PPD é um fitoestrogênio que tem sido relatado para exercer propriedades antitumorais. Assim, o método proposto é aplicável para a triagem de fitoestrogênios via administração oral para substituir a terapia de reposição hormonal tradicional em mulheres na pós-menopausa, que tem sido relatado para ter fatores potencialmente deletério Capacidade. A administração oral através da propagação da avelã é não invasora, tornando-a extensamente aplicável a muitos pacientes. Este artigo contem demonstrações passo a passo da ovariectomia bilateral através da incisão dorsal-lateral dobro no APOE-/- ratos e na recolocação oral do hormônio 17β-estradiol ou do fitoestrógeno através da propagação da avelã. Análises da função lipídica e cardiovascular do plasma usando a Ecocardiografia seguem.

Introduction

Estudos epidemiológicos e clínicos mostraram que as mulheres na pós-menopausa têm um risco consideravelmente maior de doença cardiovascular do que as mulheres na pré-menopausa1,2. A terapia de reposição hormonal (HRT) pode reduzir o risco relativo de doença cardiovascular para 0,37-0,793. Entre outras complicações, a aterosclerose causada por doenças cardiovasculares é a principal causa de morte no mundo4. No entanto, modelos de laboratório envolvendo camundongos deficientes em estrogênio apresentando estado propenso à aterosclerose estão faltando. Este protocolo fornece um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem de tratamentos de estrogênio exógena de disfunção cardiovascular após a menopausa.

Estudos prévios mostram que a aplicação de OVX em roedores ateroscleróticos alimentados com uma dieta de alto colesterol pode imitar mulheres na pós-menopausa que sofrem de aterosclerose5,6,7,8. Um modelo animal reprodutível e conveniente assemelhando-se ao estado aterosclerótico em mulheres menopausadas é a base da pesquisa exógena de estrogênio. Aqui, uma incisão dorsal-lateral dobro da ovariectomia bilateral foi aplicada em ratos da apolipoproteína E do Knockout da aterosclerose-propensas (APOE-/-)9,10. Comparado com a incisão abdominal ou dorsal média, a incisão dorsal-lateral dobro é um método mais fácil, menos demorada que possa evitar a adesão e a inflamação severas da cavidade abdominal. A administração oral via propagação de avelãs (ver tabela de materiais) é não invasiva e conveniente, tornando-a amplamente aplicável como um modo de administração a longo prazo11. Implantação de pellet de liberação lenta também é popular6. No entanto, os implantes preagravam a incidência de infecção, especialmente em camundongos submetidos a OVX. Outros modos de administração não invasivos, como gavagem oral e administração de água, também têm muitos inconvenientes. Gavagem oral tipicamente ratos do esforço e pode causar ferimento esofágico. Administrar o hormônio via água potável é altamente benéfico; no entanto, a adição de DMSO como emulsificante é inevitável, pois os estrogênios exógenos são insolúveis em água. Aqui, nós escolhemos o 17β-estradiol oral ou a recolocação da hormona do fitoestrógeno através da propagação da avelã para a administração a longo prazo.

Recentemente, o efeito benéfico da HRT sobre o sistema cardiovascular de mulheres na pós-menopausa tem sido contestada em ensaios de iniciativa de saúde da mulher (WHI)12. Por um lado, o estrogênio exógeno sozinho exerce um efeito benéfico sobre o sistema cardiovascular; por outro lado, pode combinar com acetato de metohidroxiprogesterona para aumentar o risco de eventos cardiovasculares. Mais seriamente, HRT pode conduzir à progressão do peito e do tumor uterine, e este efeito limitou acentuadamente seu uso13,14. Mais interesse tem sido focado nos efeitos protetores cardiovasculares dos estrogênios exógenos que faltam a atividade mitótica nas células tumorais15,16,17. Estudos múltiplos em humanos e animais sugerem que os fitoestrogênios com estruturas semelhantes às dos estrogênios podem desempenhar um papel benéfico na proteção cardiovascular15,16.

Assim, os objetivos do presente trabalho são (i) construir um modelo de camundongo de deficiência de estrogênio in vivo por ovariectomia bilateral por meio de incisão dorsal-lateral dupla em camundongos apoE-/- e (II) comparar os efeitos protetores cardiovasculares de peroralmente administrado 17β-estradiol e pseudoprotodioscina (PPD), através da propagação da avelã. 17β-estradiol é um tipo de estrogênio exógeno que pertence a hormônios sexuais femininos6,11,12. PPD, saponina esteróide e fitoestrogênio de plantas de Dioscorea , tem sido relatado anteriormente para exercer propriedades antitumorais20.

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Protocol

Todos os cuidados com os animais e protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Academia Chinesa de ciências médicas e Peking Union Medical College (permissão no.: SYXK (Pequim) 2013-0023). A origem dos ratos APOE-/- é C57Bl/6J9,10.

1. ovariectomia bilateral via incisão dorsal-lateral dupla em camundongos apoE-/-

  1. No desmame (idade 28 dias), anestesiar camundongos apoE-/- C57Bl/6J fêmeas com avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente).
    Nota: 32 APOE-/- camundongos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: Sham, OVX, OVX/E2 e grupo OVX/PPD (n = 8 por grupo).
  2. Coloque o animal em posição prona em uma almofada de aquecimento. Aplique o lubrificante do olho para a proteção de olho durante a anestesia.
  3. Manter a temperatura corporal dentro de 36 ± 0,5 ° c. Administrar 5 mg/kg de peso corporal do analgésico carprofeno por via subcutânea para o aspecto lateral do pescoço do rato.
  4. Depilar um 3 x 5 cm2 rato área cefólica da crista ilíaca. Antes de cobrir o animal com uma folha cirúrgica de 3 x 5 cm2 abertura, limpe a área raspada completamente com iodo e, em seguida, 70% etanol. Use instrumentos estéreis e luvas durante o experimento.
  5. Use tesouras e fórceps para fazer uma incisão 1 cm lateral para a linha média e 1 cm lateral para as costelas costais.
  6. Dissecar bluntly o tecido subcutaneous usando o fórceps.
  7. Use óculos de dissecação (ver tabela de materiais) para identificar o tecido adiposo branco na cavidade abdominal.
  8. Use Microtesoura e micropinça para fazer uma incisão de 0,5-1 cm através da fáscia até que a cavidade abdominal seja atingida.
    Nota: Para o grupo Sham-operated, feche as feridas diretamente. Suturar a camada muscular e a pele separadamente usando uma sutura de monofilamento.
  9. Quando o tecido adiposo branco na cavidade abdominal pode ser visto, pegue o tecido adiposo usando micropinça e puxe-o suavemente para fora. Um ovário cor-de-rosa Mulberry-shaped envolvido pelo tecido adiposo na cavidade abdominal pode ser visto.
  10. Ligate a embarcação proximal de 0.5-1 cm e o chifre uterine usando uma sutura do monofilamento. Retire o ovário usando Microtesoura e coloque o tecido restante de volta na cavidade abdominal.
    Nota: Os principais sintomas adversos para a operação OVX são a ligadura ureteral que leva à alta mortalidade em camundongos operados por OVX. Isto pode ser evitado identificando os tecidos usando um Goggle de dissecação.
  11. Fechem as feridas. Suturar a camada muscular e a pele separadamente usando uma sutura de monofilamento.
  12. Use tesouras e fórceps para fazer uma outra incisão 1 cm lateral para a linha média e 1 cm lateral para as costelas costais do outro lado. Repita o procedimento acima (1,5 a 1,11).
  13. Deixe o animal acordar da anestesia. Separadamente manter o mouse no primeiro dia após a cirurgia.
  14. Limpe ou substitua a gaiola freqüentemente durante a fase de recuperação.
  15. Aproximadamente 24 h após a cirurgia, administrar outro 5 mg/kg de peso corporal do analgésico carprofeno subcutaneamente.

2. administração oral de 17β-estradiol ou PPD via propagação de avelã

  1. Dissolva completamente 17β-estradiol ou PPD em óleo de gergelim e, em seguida, misture o óleo de gergelim com propagação de avelã (ver tabela de materiais). Uma porção diária para cada rato de 30 g contém 3 μg de 17β-estradiol ou 15 μg de PPD, 4 μL de óleo de gergelim e 60 mg de propagação de avelã. Prepare um placebo para cada rato de 30 g contém 4 μL de óleo de gergelim e 60 mg de propagação de avelã.
    Nota: A porção diária da administração de 17β-estradiol ou PPD foi baseada em estudos prévios6,11 e experimentos preliminares.
  2. Uma semana após OVX, alimentar os ratos com uma dieta de colesterol elevado (1,25% colesterol, 0% cholate) por 12 semanas. Um esquema de tratamento experimental típico, como utilizado neste estudo, é ilustrado na Figura 1.
  3. 5 dias antes da administração oral de avelã propagação na semana 4, treinar os ratos para comer o placebo contendo aproximadamente 30 mg de avelã propagação para 2-5 camundongos por 5 dias. Treinar os ratos em grupos em suas gaiolas de casa durante os primeiros 3 dias. Coloque os camundongos em gaiolas separadas no quarto e quinto dias de treinamento e sirva a porção diária para se assemelhar à situação experimental.
  4. Durante as últimas 9 semanas, coloc os ratos em gaiolas separadas e sirva então uma parcela diária a parcela da propagação da avelã para cada ocasião de alimentação.
    Nota: Sirva uma porção diária contendo 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) ou PPD (0,5 mg · kg-1) via avelã ESPALHADA no grupo OVX/E2 e OVX/PPD, respectivamente; Sirva uma porção diária contendo a propagação de avelãs sem hormônio no grupo SHAM e OVX.

3. determinação da espessura íntima-média e da disfunção cardíaca usando um sistema Microultrasound

  1. Biomicroscopia ultrassonográfica
    1. Um dia antes da terminação, examine a espessura do íntima-Media e a deficiência orgânica cardíaca usando um sistema microultrasound (veja a tabela de materiais) como descrito previamente21.
    2. Antes do exame, dê a cada camundongo uma injeção intraperitoneal de 200 mg/kg de avertina (tribromoetanol) como anestesia (n = 8 camundongos por grupo).
    3. Raspar o cabelo do pescoço de cada rato com cuidado. Aplique o gel morno da transmissão do ultra-som liberalmente para assegurar a qualidade óptima da imagem.
    4. Obter imagens ultrassonográficas de base da raiz aórtica e aorta ascendente com a cabeça de varredura de 30 MHz a um foco de 12,7 mm e uma resolução de 40 μm.
    5. Use a eletrocardiografia com uma configuração de chumbo II para monitoramento.
    6. Capturar imagens de eixo longo do paraesternal direito da aorta ascendente, arco aórtico e ramo da artéria braquiocefálico em um plano na sístole (Figura 3).
  2. Medições de íntima-média e espessura máxima da chapa
    1. Ajuste a distância entre o transdutor e o local arterial prontamente para obter imagens claras.
    2. Armazene um loop de Cine de 10 s digitalmente para exame off-line em um sistema de análise de imagem.
    3. Escolha manualmente uma imagem Ultrasonographic do Freeze-frame ideal para umas medidas mais adicionais. Verifique as imagens na curvatura menor da aorta ascendente. Se a placa na aorta ascendente puder ser observada, meça a espessura máxima da chapa. Se a placa na aorta ascendente não puder ser observada, meça o IMT máximo.
    4. Meça o IMT (distância entre a relação Luminal-intimal vascular e a relação medial-adventtial). Meça a espessura máxima da chapa (a distância mais grossa entre a borda do lúmen vascular e a camada adventícia).
    5. Dados médios de três sítios de lesão (Figura 3).
  3. Determinação da disfunção cardíaca com ecocardiografia
    Nota:
    examine a função cardíaca através da Ecocardiografia usando um sistema microultrasound, como descrito previamente22.
    1. Dirija um feixe de ultra-som em direção ao coração, perto dos músculos papilares.
    2. Obtenha visualização de quilohertz com base em eletrocardiograma bidimensional.
    3. Realize a Ecocardiografia transtorácica in vivo do ventrículo esquerdo usando uma cabeça da varredura de 30 megahertz.
    4. Medir os parâmetros associados à função cardíaca digitalmente dos traçados do modo M.
    5. Média dos dados de três a cinco ciclos cardíacos (tabela 1).
  4. Variabilidade intra e interobservador
    1. Para validação da variabilidade intraobservador, analisar os dados por um operador em duas ocasiões diferentes.
    2. Para avaliação da variabilidade interobservador, analisar os dados por um operador diferente.

4. medição semanal do peso corporal e determinação do colesterol total do plasma (TC) e triglicerídeos (TG)

  1. Medição semanal do peso corporal
    1. Medir pesos corporais uma vez por semana a partir da semana-1 para a semana 12.
      Nota: n = 8 ratos por grupo.
  2. Preparação do plasma
    1. Antes de recolher amostras de sangue através de punção intracardíaca, prepare seringas e tubos. Use EDTA como um anticoagulante. Adicione 10 μL de 0,5 M de EDTA a cada seringa de 2 mL e adicione 8 μL de EDTA de 0,5 M a cada tubo de 1,5 mL.
    2. Na semana 12, após um jejum noturno, anestesiar os camundongos com avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente).
      Nota: n = 3 ratos por grupo.
    3. Prepare a área torácica ventral com 70% de etanol.
    4. Use tesouras e fórceps para abrir a cavidade torácica e cortar as costelas até que o coração batendo é exposto.
    5. Insira a agulha de 25 G no ventrículo direito. Aspirar lentamente até que o sangue começa a fluir para a seringa.
      Nota: Utilizamos seringas descartáveis em condições estéreis com agulhas de 25 G (ver tabela de materiais).
    6. Continue a aspirar com pressão constante, mesmo. Se não for observado sangue, reposicione a agulha e repita a aspiração.
    7. Mantenha os ratos profundamente anestesiados antes de recolher o volume sanguíneo necessário. Normalmente, podem ser recolhidos até 1 mL de sangue. Eutanizar os camundongos por luxação cervical esta condição anestésica profunda.
    8. Pipetar amostras de sangue em 1,5 tubos de mL e inverter o sangue completamente para garantir a mistura de EDTA no sangue. Em seguida, coloque amostras de sangue no gelo imediatamente.
    9. Centrifugue amostras para 20 minutos em 400 x g em 4 ° c dentro de 30 minutos da coleção.
    10. Colete o sobrenadante com cuidado. Alíquota e armazenar amostras de plasma a-80 ° c.
  3. Construa curvas padrão para medição de conteúdo TC ou TG
    1. Para a curva padrão TC, prepare várias concentrações de padrões de colesterol: 0 mmol/L, 0,52 mmol/l, 1, 3 mmol/L, 2, 7 mmol/l, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L e 10,34 mmol/L. medida O.D. para cada padrão de colesterol. Defina a média de O.D. para cada padrão de colesterol. Como o valor do eixo vertical (Y), defina a concentração como o valor do eixo horizontal (X). Crie uma curva padrão usando um software estatístico.
    2. Para a curva padrão do TG, prepare várias concentrações de padrões de TG: 0 mmol/L, 0,45 mmol/l, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/l, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L e 9, 4 mmol/L. medida O.D. para cada padrão de TG. Defina a média de O.D. para cada padrão TG como o valor do eixo vertical (Y); definir a concentração como o valor do eixo horizontal (X). Crie uma curva padrão usando um software estatístico.
      Nota: Utilizou-se o encaixe de curva logística de quatro parâmetros (4-pl) para a construção da curva padrão no presente estudo. Verifique a curva padrão antes de medir as amostras de plasma e certifique-se de que r2 é maior que 0,995.
  4. Medição de conteúdo TC
    1. Rotule o frasco do reagente da cor (25 mL) do jogo do ensaio do TC como "a solução de trabalho TC".
    2. Vórtice os espécimes refrigerados brevemente. Preparar diluições: 20 μL de plasma em 80 μL de água destilada. Brevemente diluições vortex.
    3. Adicionar 2,5 μL de padrões de colesterol (5,17 mmol/L) ou 2,5 μL de plasma diluído ou 2,5 μL de água destilada (em branco) aos poços apropriados de uma placa de poço de 96. Recomenda-se triplicação.
    4. Para todos os poços, adicione 250 μL do reagente de cor.
    5. Incubar a 37 ° c durante 10 min.
    6. Ligue o leitor de microplacas e deixe um aquecimento de 10 min.
    7. Retire a placa (s) da incubadora e leia o leitor de microplacas a 510 nm. Assegure-se de que nenhuma bolha ou poeira estejam presentes nos poços de microtitula ou na parte inferior da placa, respectivamente.
    8. Calcule a concentração TC da seguinte forma:
      TC cont. = padrões de colesterol cont. × (amostra de plasma O.D.-Blank O. D)/(padrões de colesterol O.D.-Blank O. D)
  5. Medição de conteúdo TG
    1. Rotule o frasco do reagente da cor (25 mL) do jogo do ensaio do TG como "a solução de trabalho TG".
    2. Vórtice os espécimes refrigerados brevemente.
    3. Adicionar 2,5 μL de normas TG (2,26 mmol/L) ou 2,5 μL de plasma diluído ou 2,5 μL de água destilada (em branco) aos poços apropriados de uma placa de poço de 96. Recomenda-se triplicação.
    4. Para todos os poços, adicione 250 μL do reagente de cor.
    5. Incubar a 37 ° c durante 10 min.
    6. Ligue o leitor de microplacas e deixe um aquecimento de 10 min.
    7. Retire a placa (s) da incubadora e leia o leitor de microplacas a 510 nm.
      Nota: Certifique-se de que não há bolhas ou poeira estão presentes nos poços de de microtitulação ou na parte inferior da placa.
    8. Calcule a concentração de TG da seguinte forma:
      TG cont. = normas TG cont. × (amostra de plasma O.D.-Blank O. D)/(TG normas O.D.-Blank O. D)

5. análise da face de lesões ateroscleróticas aórticas

  1. Isolação e excisão da aorta
    1. Na semana 12, após um jejum noturno, anestesiar os camundongos com avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Eutanizar os camundongos por luxação cervical esta condição anestésica profunda.
      Nota: Utilizamos 3 camundongos por grupo.
    2. Prepare a área torácica ventral com 70% de etanol. Use tesouras e fórceps para abrir a cavidade torácica e cortar as costelas até que o coração batendo é exposto.
    3. Encha uma seringa de 50 mL com soro fisiológico tamponado com fosfato em pH 7,4 (ver tabela de materiais). Insira um 25 G de agulha no ventrículo esquerdo e corte o átrio direito para evitar a alta pressão da perfusão.
    4. Realize a perfusão in situ a um caudal de 0,05-0,08 mL/min. absorva o fluido de perfusão com os tecidos.
    5. Retire as costelas e os pulmões na cavidade torácica com tesouras e fórceps. Em seguida, abra a cavidade abdominal e retire os órgãos dentro para uma melhor visão da aorta.
    6. Retire a aorta segurando o coração com o microfórceps e separando a aorta da espinha dorsal com microscisssors até a bifurcação ilíaca.
      Nota: Quando dissecando perto dos ramos atriais renais, corte profundamente usando Microtesoura para evitar danos na aorta.
    7. Fixar o coração e aorta para 48 h em 4% paraformaldeído. Guarde as aortas em soro fisiológico à temperatura ambiente ou a 2-8 ° c durante algumas horas.
      Nota: Este procedimento facilitará a limpeza.
  2. Preparação da aorta
    1. Retire o coração. Remova com cuidado os tecidos adventitial do aortas usando o microfórceps e o microscisssors um stereomicroscope. Use soro fisiológico para manter o tecido úmido durante a limpeza.
      Nota: Tenha cuidado para não rasgar ou Nick a aorta e alguns ramos importantes, como a artéria innominada, artéria carótida comum esquerda, e artéria subclávia esquerda.
    2. Deixe 1 milímetro das artérias carotídeas comuns inominada e esquerdas e corte a artéria subclávia esquerda inteira.
    3. Corte abrir a curvatura externa através da artéria innominada, em seguida, para a artéria carótida comum esquerda, e depois para a artéria subclávia esquerda.
    4. Corte aberto ao longo da curvatura interna da porção ascendente até o fundo da porção abdominal.
    5. Fixar a aorta plana sobre uma folha de plástico preto e aplicar soro fisiológico para manter aortas de secagem.
  3. Imagem da região intimal da aorta
    1. Tire fotos de aortas en face com um microscópio estéreo. Inclua uma régua de escala milímetro nas imagens para calibrar as medições.
    2. Inclua o arco e as regiões torácicas na mesma imagem e na região abdominal em outro. Salvar imagens como JPEG ou TIFF.
      Nota: A região do arco é da junção do miocárdio a 3 mm distal da artéria subclávia esquerda, a região torácica é de 3 mm distal à artéria subclávia esquerda até a última Artéria intercostal, e a região abdominal é a última Artéria intercostal ao ilíaco Bifurcação.
  4. Quantificação da lesão aterosclerótica-en face Method
    1. Calibração
      1. Abra a imagem com o software de análise de imagem (consulte a tabela de materiais), vá para calibração espacial e siga as instruções.
      2. Altere as unidades de referência para mm posicionando a régua sobre a linha.
    2. Medição
      1. Defina a calibração correta para cada imagem.
      2. Medir 3 mm na régua.
      3. Medida do arco e da região torácica: delineie a região do arco a partir da junção do miocárdio a 3 mm distal da artéria subclávia esquerda e da região torácica de 3 mm distal à artéria subclávia esquerda até a última Artéria intercostal. Trace lesões no arco e região torácica e olhe para a aorta através do microscópio.
      4. Medida da região abdominal: delinear a região abdominal do final da região torácica até a bifurcação ilíaca. Trace lesões na região abdominal e olhe a aorta através do microscópio.
      5. Calcule a área da lesão em relação à superfície interna da aorta.
      6. Verificar a quantificação através de um segundo observador que é cego para os grupos de estudo.

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Representative Results

Um esquema de tratamento experimental típico, como utilizado neste estudo, é ilustrado na Figura 1. No desmame (idade 28 dias), os ratos fêmeasde APOE-/- C57Bl/6J foram anestesiados withavertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally). Camundongos foram bilateralmente OVX ou Sham operados através de uma incisão dorsal de 1 cm. Uma semana após OVX bilateral, os ratos foram alimentados com uma dieta de alto colesterol (1,25% colesterol, 0% cholate) por 12 semanas. 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) ou PPD (0,5 mg · kg-1) foi administrado peroralmente em paralelo através da propagação de avelãs durante as últimas 9 semanas de tratamento. Todos os camundongos foram pesados semanalmente. Como mostra a Figura 2, avaliaram-se os efeitos de estrógenos exógenos (17β-estradiol e PPD) sobre os lipídios plasmáticos e o peso corporal semanal de camundongos APOE-/- após a deficiência estrogênica. Após 12 semanas de uma dieta do elevado-colesterol, os ratos de OVX mostraram um aumento notável em concentrações do plasma TC e do TG. Camundongos OVX peroralmente administrados com 17β-estradiol ou PPD via propagação de avelãs exibiram concentrações plasmáticas de TC significativamente inferiores aos camundongos operados por Sham (Figura 2a). Os níveis plasmáticos de TG diminuíram em camundongos OVX peroralmente administrados com 17β-estradiol, mas não com PPD (Figura 2b). Como é mostrado na Figura 2C, enquanto uma tendência para o aumento do peso corporal (PN) foi observada em camundongos OVX em comparação com os camundongos Sham-operado, BW em camundongos OVX peroralmente administrados com 17β-estradiol ou PPD via propagação de avelã após uma dieta de alto colesterol mostraram uma tendência oposta àquela em camundongos OVX. No entanto, o peso corporal final dos camundongos em diferentes grupos não apresentou alterações significativas.

A função cardiovascular foi avaliada por meio de ecocardiografia. Como se mostra na Figura 3, a placa máxima ou o IMT da aorta ascendente foi medido em camundongos OVX peroralmente administrados com 17β-estradiol ou PPD via propagação de avelã. O arco aórtico do Alto-colesterol-dieta-alimentou os ratos apoE-/- foram observados pela ecocardiografia da B-modalidade. Imagens longitudinais representativas da aorta ascendente foram capturadas por biomicroscopia ultrassonográfica. As setas vermelhas indicam as placas. Camundongos OVX exibiram maior placa máxima ou IMT da aorta ascendente em comparação com camundongos operados por Sham. Depois da administração oral de 17β-estradiol ou de PPD através da propagação da avelã, a chapa máxima ou o IMT da aorta de ascensão diminuíram notavelmente comparado com o aquele de ratos de OVX. (Figura 3). Observou-se também disfunção cardíaca em resposta ao OVX em camundongos apoE-/- após uma alimentação de 12 semanas de alta-colesterol-dieta (tabela 1). A função cardíaca foi examinada com a ecocardiografia. Em camundongos OVX, a administração oral de 17β-estradiol ou PPD via propagação de avelãs pode atenuar parcialmente os parâmetros que mostram disfunção cardíaca.

Em seguida, utilizou-se a análise de face para determinar as lesões ateroscleróticas aórticas. Como relatado previamente, após 12 semanas, uma dieta do elevado-colesterol conduziu à formação aterosclerótica da chapa na superfície Luminal da aorta. Como mostrado na Figura 4, o percentual médio de área da lesão aórtica em relação à área aórtica inteira aumentou significativamente em camundongos OVX. Após a administração oral com 17β-estradiol ou PPD através da propagação da avelã, a área da lesão aórtica diminuiu notàvelmente comparada com a aquela da contraparte dos ratos de OVX. Esse resultado é consistente com a proteção de 17β-estradiol ou PPD a partir do desenvolvimento da aterosclerose apresentada na Figura 3.

Em conclusão, o procedimento proposto, que usa a ovariectomia bilateral através de uma incisão dorsal-lateral dobro em apoE-/- ratos, é aplicável para a seleção de tratamentos de estrogênio exógenos não invasivos de disfunção cardiovascular após a menopausa. Também é especialmente útil para evitar a capacidade tumorigenética deletéria.

Figure 1
Figura 1. Esquema de tratamento do rato. No desmame (idade, 28 dias), os ratos fêmeasde APOE-/- C57Bl/6J foram anestesiados com Avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally). Camundongos foram ovariectomizados bilateralmente (OVX) ou Sham operados através de uma incisão dorsal de 1 cm. Uma semana após o OVX, os camundongos receberam uma dieta de alto colesterol (1,25% colesterol, 0% cholate) por 12 semanas. 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) ou PPD (0,5 mg · kg-1) foi administrado peroralmente em paralelo através da propagação de avelãs durante as últimas 9 semanas de tratamento. Todos os ratos foram pesados todas as semanas. Na semana 12, a análise da função cardiovascular foi avaliada por meio de ecocardiografia. Após 12 semanas de uma dieta do elevado-colesterol, todos os ratos foram eutanasiados, e as amostras e os tecidos de sangue foram colhidos para uma investigação mais adicional. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Efeitos de vários estrogênios exógenos em lipídios plasmáticos e peso corporal semanal em ratos apoE-/- . Ratos Sham foram submetidos a uma operação simulada e receberam uma dieta de colesterol elevado. Camundongos OVX foram submetidos à ovariectomia bilateral e, em seguida, divididos aleatoriamente nos seguintes grupos: o grupo OVX, que foi tratado com uma dieta de alto colesterol; o grupo OVX/E2 (17β-Estradiol), que recebeu uma dieta de colesterol elevado durante 12 semanas mais 0,1 mg/kg E2 através da administração oral através de avelãs espalhadas pelas últimas 9 semanas de tratamento; e o grupo OVX/PPD, que recebeu uma dieta de colesterol elevado durante 12 semanas mais 0,5 mg/kg de PPD através da administração oral através da propagação da avelã durante as últimas 9 semanas de tratamento. Os níveis totais de colesterol e triglicerídeos do plasma foram medidos por meio de métodos enzimáticos (a-B). Os dados são expressos em médias ± SEM de n = 5 camundongos por grupo. Os pesos corporais semanais foram medidos a partir da semana-1 para a semana 12 (C). Os dados são expressos em médias ± SEM de n = 8 camundongos por grupo. ANOVA One-Way seguida pelo teste post hoc de Dunnett foi realizada para comparações múltiplas. *p < 0, 5 comparado com o grupo Sham; # p < 0, 5 comparado com o grupo OVX. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. IMT ou medidas máximas da espessura da chapa em ratos de apoE-/- . As imagens do B-modo que mostram o arco aórtico de apoE-/- ratos são apresentadas. As imagens longitudinais da aorta ascendente foram obtidas por biomicroscopia ultrassonográfica. A placa máxima ou o IMT da aorta ascendente (milímetro) foram medidos. As imagens ultrassonográficas mostram a placa na curvatura menor da aorta ascendente; as setas vermelhas indicam as placas. Os dados são expressos em média ± SEM de n = 8 camundongos por grupo. ANOVA One-Way seguida pelo teste post hoc de Dunnett foi realizada para comparações múltiplas. *p < 0, 5 comparado com o grupo Sham; # p < 0, 5 comparado com o grupo OVX. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Análise de face em lesões ateroscleróticas aórticas em camundongos apoE-/- . A porcentagem média da área da lesão aórtica em relação à área aórtica inteira foi quantificada em todos os grupos. Os micrografias representativos das lesões intimal (EN a cara) da aorta são mostrados. Os dados são expressos em média ± SEM de n = 3 camundongos por grupo. ANOVA One-Way seguida pelo teste post hoc de Dunnett foi realizada para comparações múltiplas. *p < 0, 5 comparado com o grupo Sham; # P < 0, 5 comparado com o grupo OVX. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Farsa OVX OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (milímetro) 3,72 ± 0,10 3,74 ± 0. 24 3,68 ± 0,16 3,88 ± 0,16
LVIDs (milímetro) 2,34 ± 0,11 2,16 ± 0,22 2,12 ± 0,13 2,55 ± 0,12#
IVSd (milímetro) 0,83 ± 0, 9 0,84 ± 0, 7 0,91 ± 0, 5 0,74 ± 0, 6#
IVSs (milímetro) 1,24 ± 0, 2 1,35 ± 0, 6 * 1,45 ± 0, 4# 1, 9 ± 0, 4#
PWTd (milímetro) 0,7 ± 0,10 0,68 ± 0, 4 0,72 ± 0, 7 0,58 ± 0, 7#
PWTs (milímetro) 1,10 ± 0,12 1,17 ± 0, 8 1,24 ± 0, 4 0,98 ± 0, 8#
EDV (mm3) 58,89 ± 3,74 59,88 ± 9, 2 57,39 ± 5,79 65,11 ± 6,13
ESV (mm3) 18,86 ± 2,17 15,75 ± 4, 0 14,85 ± 2,37 23,45 ± 2,64#
EF (%) 67,84 ± 1,52 73,91 ± 3.63 * 74,23 ± 1,50 63,91 ± 3,61#
FS (%) 37,19 ± 1,53 42,22 ± 1,17 * 42,36 ± 1,21 34,28 ± 2,69#
LVIDd = diâmetro interno do ve durante a diástole; LVIDs = diâmetro interno do ve durante a sístole; IVDP = septo interno ventricular durante a diástole; IVSs = septo ventricular interno durante a sístole; PWTd = espessura da parede posterior durante a diástole; PWTs = espessura da parede posterior durante a sístole; EF = fração de ejeção; FS = encurtamento fracionário; EDV = volume diastólico final; ESV = volume sistólico final.

Tabela 1: avaliação da função cardíaca por meio da ecocardiografia. Os parâmetros associados à função cardíaca digitalmente dos traçados do modo M foram quantificados em todos os grupos. Os dados são expressos em média ± SEM de n = 8 camundongos por grupo. ANOVA One-Way seguida pelo teste post hoc de Dunnett foi realizada para comparações múltiplas. *p < 0, 5 comparado com o grupo Sham; # p < 0, 5 comparado com o grupo OVX.

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Discussion

A metodologia descrita aqui é um modelo de rato que se assemelha a perturbação lipídica e aterosclerose observada em mulheres menopausadas. É bem documentado que a deficiência de estrogênio em mulheres na pós-menopausa pode agravar a incidência de hipercolesterolemia pré-existente ou em curso com lesões ateroscleróticas progressivamente complexas e disseminadas1. Para imitar o estado propenso à aterosclerose na clínica, camundongos deficientes APOE, uma fonte de animais reprodutível e conveniente para estudar a aterogênese23,24,25, foram aplicados. Como se mostra no presente estudo, fêmeas OVX apoE-/- camundongos no desmame apresentaram aumento das lesões ateroscleróticas na aorta em comparação com camundongos APOE-/- fêmeas com função ovariana intacta. Neste modelo animal, também comparamos o efeito de várias terapias de reposição de estrogênio exógeno no tamanho da lesão aterosclerótica uma condição dietética controlada.

A incisão dorsal-lateral dupla da ovariectomia bilateral apresentada neste artigo é tecnicamente mais fácil, menos demorada e mais segura em comparação com a incisão dorsal-lateral média ou incisão abdominal média da ovariectomia bilateral em apoE-/- os ratos. O ovariectomia bilateral através da incisão abdominal média apresenta um inconveniente principal: pode causar a adesão severa da cavidade abdominal, que, por sua vez, pode afetar a absorção da droga. Os relatórios recentes mostram que a administração oral da baixo-dose 17β-estradiol protege de encontro à isquemia cerebral26. Assim, selecionamos a administração oral via avelã disseminada no presente estudo. As pelotas comerciais de liberação lenta são um modo de administração freqüentemente usado para testar efeitos farmacológicos em um modelo de mouse, mas podem causar dano cerebral prejudicial27. Os implantes são propensos a infecções, especialmente se os camundongos são submetidos a OVX bilateral através de uma dupla incisão dorsal-lateral. Embora a desinfecção cuidadosa da pele antes da incisão seja realizada, a infecção é difícil de evitar. A administração da água e o gavagem oral são dois métodos menos-freqüentemente usados que foram testados. Administrar o hormônio através da água potável é altamente benéfico devido ao seu ser extremamente não invasivo, porque quase nenhuma manipulação animal é necessária. No entanto, 17β-estradiol não é solúvel em água sem um emulsificante. Assim, utilizou-se DMSO em uma concentração inferior a 0,5% para facilitar sua solução em água potável. Entretanto, esta aproximação para a administração a longo prazo do DMSO da baixo-dose é difícil de controlar e tóxico aos ratos ou aos seres humanos. Os camundongos também podem beber água ao longo de toda a 24 h de vigilância, o que torna o consumo real de drogas difícil de determinar. Outra desvantagem desta abordagem é que a ingestão de água do indivíduo é difícil de controlar. A maior desvantagem da gavagem oral é que é estressante para os animais e pode causar lesão esofágica e afetar o comportamento alimentar. Na metodologia descrita aqui, foi realizado um treinamento de 5 dias de ingestão de avelãs sem hormônio alimentar antes do experimento. Aproximadamente mais de 95% dos camundongos aceitarão a propagação da avelã se estiver sendo treinado como o que mencionado na seção de protocolo. Uma vez totalmente habituado, a maioria dos ratos irá consumi-lo dentro de segundos. Consistente com um estudo anterior6,11, os níveis de E2 de plasma diminuíram em camundongos OVX em comparação com a contraparte Sham-operado na semana 4 (dados não mostrados). Na semana 12 após a determinação, nós observamos a atrofia do útero em ratos OVX-operados. Entretanto, os níveis de estrogênio circulantes não foram monitorados após o OVX no presente estudo.

Na ausência de detecção de lesões ateroscleróticas na aorta ascendente, o IMT aórtico pode ser avaliado através da mensuração da distância entre a interface lúmen-intimal e a interface medial-adventícia. Esta medida é baseada em um protocolo previamente validado nos seres humanos28. Dados médios de três locais que são aproximadamente 100 μm separados uns dos outros. A carga de trabalho cardíaca aumenta após OVX em apoE-/- camundongos pode, devido ao crescimento hipertrófico compensatório de cardiomiócitos individuais que podem eventualmente levar a aumentar o débito cardíaco (tabela 1). Considerando que, após a administração oral de PPD por 9 semanas, a hipertrofia cardíaca compensatória foi atenuada com um EF% comparável ao homólogo simulado. Para validação da variabilidade intra ou interobservador, analisar coeficientes de variação para medidas de espessura aterosclerótica e parâmetros associados à função cardíaca por um operador em duas ocasiões diferentes ou por um operador diferente.

Conforme apresentado em nosso estudo, camundongos OVX administrados por via oral com 17β-estradiol ou PPD através da propagação de avelãs tenderam a prevenir o ganho de peso corporal e reduzir o rompimento lipídico associado à deficiência de estrogênio, embora não houvesse diferenças significativas no peso corporal final Observado. Estudos prévios também mostraram que a variação dos parâmetros lipídicos pode ser muito menor para explicar os efeitos antiateroscleróticos dos hormônios29. Os efeitos benéficos do estrogênio não se limitam a alterações nas propriedades protéicas lipídicas. Alguns efeitos não lipídicos do estrogênio30,31, como inflamação, disfunção endotelial e estase hemodinâmica, podem facilitar a proteção cardiovascular na doença humana. Considerando os resultados observados no presente estudo, a proteção do estrogênio exógeno do desenvolvimento da aterosclerose é parcialmente independente dos níveis de lipídios sistêmicos. Nas células endoteliais, a PPD inibiu as expressões de molécula de adesão e mediadores inflamatórios (dados não mostrados). Além disso, o PPD poderia suprimir a formação adiposa perivascular que é correlacionada pròxima com anti-contractility endothelial. Assim, a ação do PPD e do 17β-estradiol foi diferente e o mecanismo subjacente deve ser mais explorado. Sem dúvida, o consumo excessivo de alimentos ricos em energia, como a propagação de avelãs, pode causar ganho de peso. No entanto, as pequenas quantidades de propagação de avelãs (200 mg · kg-1· dia-1), como mencionado no presente estudo, só podiam ser responsáveis por menos de 5% do consumo diário de energia dos animais. Também, nenhum ganho de peso óbvio foi detectado usando esta quantidade de propagação da avelã. O uso de 17β-estradiol e PPD foi principalmente para o tratamento da doença cardiovascular. Porque, durante a progressão da aterosclerose no OVX-operado aopE-/- camundongos, a partir da semana 4 para a semana 12, 17β-estradiol ou PPD foi administrado peroralmente.

Um ponto não negligenciável do uso clínico da HRT é seus efeitos colaterais prejudiciais, que incluem câncer de ovário e mama13,14. O fitoestrogênio testado no presente estudo é um composto de saponina esteróide encontrado em plantas de Dioscorea . PPD tem sido relatado para ter um efeito inibitório em algumas linhas de células cancerosas20. Além disso, o PPD apresenta propriedades antiateroscleróticas comparáveis àquelas de 17β-estradiol. O modelo que apresentamos aqui pode ajudar a tela compostos potenciais candidatos, incluindo fitoestrogênio, que exerce um efeito mínimo sobre a proliferação tumoral.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81202526 para J.X.), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (81302769 a B.S.), a Fundação Municipal de ciência natural de Pequim (47144226 a B.S.), o pós-doutorado chinês Science Foundation (20110490325 a J.X.), e a Fundação de programas de doutorado do Ministério da educação da China (20121106120031 a B.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

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References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329, (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26, (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153, (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45, (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63, (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258, (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14, (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64, (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288, (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372, (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15, (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76, (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4, (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299, (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7, (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107, (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23, (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833, (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168, (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10, (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89, (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14, (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281, (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25, (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74, (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143, (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75, (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40, (5), 893-900 (1999).

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