Un modello di topo a carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa

Biochemistry

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Summary

Clinicamente, carenza di estrogeni nelle donne in menopausa può aggravare l'incidenza di perturbazione dei lipidi e aterosclerosi. Abbiamo stabilito un modello di carenza di estrogeni in vivo mediante ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale nei topi apoe-/-. Il modello murino è applicabile per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa.

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Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

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Abstract

Le donne in postmenopausa sono più a rischio di sviluppare malattie cardiovascolari rispetto alle donne in premenopausa. I topi femminili ovarictomizzati (OVX) al display di svezzamento hanno aumentato le lesioni aterosclerotiche nell'aorta rispetto ai topi femminili con funzione ovarica intatta. Tuttavia, i modelli di laboratorio che coinvolgono topi estrogeno-carenti con status aterosclerosi-incline sono carenti. Questo deficit è cruciale perché la carenza di estrogeni clinici nelle donne in menopausa può aggravare l'incidenza di interruzione e aterosclerosi dei lipidi preesistenti o in corso. In questo studio, stabiliamo un modello murino estrogeno-carente in vivo con ovariectomia bilaterale tramite una doppia incisione dorsale laterale in apolipoproteina E (apoE)-/- topi. Confrontiamo quindi gli effetti di 17-estradiolo e pseudoprotodioscina (PPD) (un fitoestrogeno) somministrati peroralmente tramite diffusione di nocciole. Troviamo che anche se il PPD esercita un certo effetto sulla riduzione del peso corporeo finale e del plasma TG in ovulazione OVX-/- topi, ha capacità anti-aterosclerotiche e cardiache-protettive paragonabili alla sua controparte 17-estradiolo. PPD è un fitoestrogeno che è stato segnalato per esercitare proprietà anti-tumorali. Pertanto, il metodo proposto è applicabile per lo screening dei fitoestrogeni tramite somministrazione perorale per sostituire la terapia ormonale sostitutiva tradizionale nelle donne in postmenopausa, che è stato segnalato per avere tumorigenetica potenzialmente deleteria capienza. La somministrazione perorale tramite la diffusione della nocciola non è invasiva, rendendola ampiamente applicabile a molti pazienti. Questo articolo contiene dimostrazioni passo-passo di ovariectomia bilaterale attraverso la doppia incisione dorsale laterale in apoE-/- topi e perorali 17-estradiolo o la sostituzione dell'ormone fitoestrogeno tramite diffusione di nocciole. Seguono analisi dei lipidi al plasma e delle funzioni cardiovascolari che utilizzano l'ecocardiografia.

Introduction

Studi epidemiologici e clinici hanno dimostrato che le donne in postmenopausa sono molto più a rischio di malattie cardiovascolari rispetto alle donne in premenopausa1,2. La terapia ormonale sostitutiva (HRT) può ridurre il rischio relativo di malattia cardiovascolare a 0.37-0.793. Tra le altre complicazioni, l'aterosclerosi causata da malattie cardiovascolari è la principale causa di morte in tutto il mondo4. Tuttavia, i modelli di laboratorio che coinvolgono topi estrogeno-carenti che presentano lo stato incline all'aterosclerosi sono carenti. Questo protocollo fornisce un modello murino di carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa.

Studi precedenti dimostrano che l'applicazione dell'OVX nei roditori aterosclerotici alimentati con una dieta ad alto colesterolo può imitare le donne in postmenopausa5,6,7,8. Un modello animale riproducibile e conveniente simile allo stato aterosclerotico nelle donne in menopausa è la base della ricerca sugli estrogeni esogeni. Qui, una doppia incisione dorsale-laterale dell'ovariectomia bilaterale è stata applicata nell'aerosclerosi-prona apolipoproteina E knockout (apoe-/-) topi9,10. Rispetto all'incisione addominale media o dorsale, la doppia incisione dorsale-laterale è un metodo più facile e meno dispendioso in termini di tempo che può evitare una grave adesione e infiammazione della cavità addominale. L'amministrazione perorale tramite diffusione di nocciole (vedi Tabella deimateriali) non è invasiva e conveniente, rendendola ampiamente applicabile come modalità di amministrazione a lungo termine11. L'impianto a pellet a rilascio lento è anche popolare6. Tuttavia, gli impianti possono aggravare l'incidenza dell'infezione soprattutto nei topi sottoposti a OVX. Anche altre modalità di amministrazione non invasiva, come la spiagazione orale e la somministrazione dell'acqua, presentano molti inconvenienti. Gavage orale in genere stress topi e può causare lesioni esofagee. Somministrare l'ormone tramite acqua potabile è altamente vantaggioso; tuttavia, l'aggiunta di DMSO come emulsionante è inevitabile come estrogeni esogeni sono insolubili in acqua. Qui, abbiamo scelto la sostituzione dell'ormone perorale 17-estradiolo o fitoestrogeno tramite la diffusione di nocciole per la somministrazione a lungo termine.

Recentemente, l'effetto benefico della HRT sul sistema cardiovascolare delle donne in postmenopausa èstato contestato negli studi 12 . Da un lato, estrogeni esogeni da solo esercita un effetto benefico sul sistema cardiovascolare; d'altra parte, può combinarsi con acetato metoidrossisprogesterone per aumentare il rischio di eventi cardiovascolari. Più seriamente, HRT può portare alla progressione del tumore del seno e dell'utero, e questo effetto ha notevolmente limitato il suo uso13,14. Più interesse si è concentrato sugli effetti cardiovascolare-protettivi degli estrogeni esogeni privi di attività mitotica nelle cellule tumorali15,16,17. Studi multipli su esseri umani e animali suggeriscono che i fitoestrogeni con strutture simili a quella degli estrogeni possono svolgere un ruolo benefico nella protezione cardiovascolare15,18.

Pertanto, gli obiettivi del presente lavoro sono (i) costruire un modello murino in vivo per carenza di estrogeni mediante ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale in apoE-/- topi e (ii) per confrontare gli effetti protettivi cardiovascolari del perorali somministrato 17-estradiol e pseudoprotodioscin (PPD), tramite diffusione di nocciole. 17-estradiol è un tipo di estrogeno esogeno che appartiene agli ormoni sessuali femminili6,11,19. PPD, una saponina steroide e fitoestrogeno da piante Dioscorea, è stato precedentemente segnalato per esercitare proprietà anti-tumorali20.

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Protocol

Tutti i protocolli di cura e sperimentale per gli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Accademia cinese delle scienze mediche e del Peking Union Medical College (Autorizzazione n.: SYXK (Pechino) 2013-0023). L'origine dei topi apoE-/- è C57BL/6J9,10.

1. Ovariectomia bilaterale tramite una doppia incisione dorsale-laterale in apoE-/- Topi

  1. Allo svezzamento (età 28 giorni), anestesizzare femmina apoE-/- C57BL/6J topi con risparmio (tribromoetanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente).
    NOTA: 32 topi apoE-/- sono stati suddivisi in modo casuale in 4 gruppi: SHAM, OVX, OVX/E2 e gruppo OVX/PPD (n - 8 per gruppo).
  2. Posizionare l'animale in posizione prona su un pad di riscaldamento. Applicare il lubrificante per gli occhi per la protezione degli occhi durante l'anestesia.
  3. Mantenere la temperatura corporea entro 36 : 0,5 gradi centigradi. Somministrare 5 mg/kg di peso corporeo del carprofen analgesico sottocutaneo all'aspetto laterale del collo del mouse.
  4. Rasare un'area del topo 3 x 5 cm2 dalla cresta iliaca. Prima di coprire l'animale con un foglio chirurgico 3 x 5 cm2 apertura, pulire accuratamente l'area rasata con iodio e poi 70% di etanolo. Utilizzare strumenti sterili e guanti durante l'esperimento.
  5. Utilizzare forbici e pinze per fare un'incisione 1 cm laterale alla linea mediana e 1 cm laterale alle costole costali.
  6. Contunta il tessuto sottocutaneo usando le pinze.
  7. Utilizzare occhiali dissetti (vedi Tabella deimateriali) per identificare il tessuto adiposo bianco nella cavità addominale.
  8. Utilizzare microscissori e microforzaci per fare un'incisione di 0,5-1 cm attraverso la fascia fino a raggiungere la cavità addominale.
    NOT: Per il gruppo operato con finta, chiudete direttamente le ferite. Suturare lo strato muscolare e la pelle separatamente utilizzando una sutura monofilamento.
  9. Quando il tessuto adiposo bianco nella cavità addominale può essere visto, afferrare il tessuto adiposo utilizzando microforzape e tirarlo delicatamente fuori. Si può vedere un'ovaia a forma di gelso rosa avvolta dal tessuto adiposo nella cavità addominale.
  10. Ligate il recipiente prossimale di 0,5-1 cm e il corno uterino utilizzando una sutura monofilamento. Rimuovere l'ovaio utilizzando microscissors e riporre il tessuto rimanente nella cavità addominale.
    NOT: I principali sintomi avversi dell'operazione OVX sono la legatura uretetale che porta ad un'elevata mortalità nei topi ovulati da OVX. Questo può essere evitato identificando i tessuti utilizzando una maschera dissetta.
  11. Chiudi le ferite. Suturare lo strato muscolare e la pelle separatamente utilizzando una sutura monofilamento.
  12. Utilizzare forbici e pinze per fare un'altra incisione 1 cm laterale alla linea mediana e 1 cm laterale alle costole costali sull'altro lato. Ripetere la procedura precedente (da 1,5 a 1,11).
  13. Lascia che l'animale si svegli dall'anestesia. Separatamente tenere il mouse il primo giorno dopo l'intervento chirurgico.
  14. Pulire o sostituire frequentemente la gabbia durante la fase di recupero.
  15. Circa 24 h dopo l'intervento chirurgico, somministrare altri 5 mg/kg di peso corporeo del carprofene analgesico sottocutaneo.

2. Amministrazione Perorale di 17-estradiolo o PPD tramite Diffusione Nocciola

  1. Sciogliere accuratamente 17-estradiol o PPD in olio di sesamo, quindi mescolare l'olio di sesamo con la diffusione di nocciole (vedere Tabella dei materiali). Una porzione giornaliera per ogni topo da 30 g contiene 3 g di 17 estradiolo o 15 g di PPD, 4 ll di olio di sesamo e 60 mg di diffusione di nocciole. Preparare un placebo per ogni topo da 30 g contiene 4 ll l di olio di sesamo e 60 mg di diffusione di nocciole.
    NOT: La porzione di somministrazione giornaliera di 17-estradiolo o PPD si basava su studi precedenti6,11 ed esperimenti preliminari.
  2. Una settimana dopo OVX, nutrire i topi con una dieta ad alto colesterolo (1.25% colesterolo, 0% cholate) per 12 settimane. Un tipico schema di trattamento sperimentale, come utilizzato in questo studio, è illustrato nella Figura 1.
  3. 5 giorni prima della somministrazione perorale della nocciola diffusa alla settimana 4, allenare i topi a mangiare il placebo contenente circa 30 mg di diffusione di nocciole per 2-5 topi per 5 giorni. Allena i topi in gruppi nelle gabbie di casa durante i primi 3 giorni. Posizionare i topi in gabbie separate il quarto e il quinto giorno di allenamento e servire la porzione quotidiana per assomigliare alla situazione sperimentale.
  4. Durante le ultime 9 settimane, mettere i topi in gabbie separate e poi servire una porzione giornaliera della porzione di diffusione della nocciola per ogni occasione di alimentazione.
    NOT: Servire una porzione giornaliera contenente 17 ,1 mg-kg-1)o PPD (0,5 mg-kg -1) tramite diffusione di nocciole nel gruppo OVX/E2 e OVX/PPD rispettivamente; servire una porzione giornaliera contenente diffusione di nocciole senza ormoni nel gruppo SHAM e OVX.

3. Determinazione dello spessore dell'intima-media e della disfunzione cardiaca utilizzando un sistema di microultrasuoni

  1. Biomicroscopia ultrasonografica
    1. Un giorno prima della terminazione, esaminare lo spessore dell'intima media e la disfunzione cardiaca utilizzando un sistema di microultrasuoni (vedi Tabella dei materiali) come descritto in precedenza21.
    2. Prima dell'esame, dare a ogni topo un'iniezione intraperitoneale di 200 mg/kg di eproprio (tribromoetanolo) come anestesia (n - 8 topi per gruppo).
    3. Rasare i capelli del collo di ogni topo con attenzione. Applicare gel di trasmissione a ultrasuoni caldo liberamente per garantire una qualità ottimale dell'immagine.
    4. Ottenere immagini ultrasonografiche di base della radice aortica e aorta ascendente con la testa di scansione di 30 MHz a un fuoco di 12,7 mm e una risoluzione di 40 m.
    5. Utilizzare l'elettrocardiografia con una configurazione di piombo II per il monitoraggio.
    6. Acquisire le immagini a lungo termine parasternal destra dell'aorta ascendente, dell'arco aortico e del ramo dell'arteria brachiocefalica in un piano in sistole (Figura 3).
  2. Misurazioni dell'intima-media e dello spessore massimo della placca
    1. Regolare facilmente la distanza tra il trasduttore e il sito arterioso per ottenere immagini chiare.
    2. Memorizza digitalmente un loop cine da 10 s per l'esame offline su un sistema di analisi delle immagini.
    3. Scegliere manualmente un'immagine ultrasonografica a liofilda ottimale per ulteriori misurazioni. Controllare le immagini nella curvatura minore dell'aorta ascendente. Se si vede la placca nell'aorta ascendente, misurare lo spessore massimo della placca. Se la placca nell'aorta ascendente non può essere vista, misurare l'IMT massimo.
    4. Misurare l'IMT (distanza tra l'interfaccia vascolare lumino-intimale e l'interfaccia mediale-avvenimento). Misurare lo spessore massimo della placca (la distanza più spessa tra il bordo del lume vascolare e lo strato avvenziale).
    5. Dati medi provenienti datre siti di lesioni (Figura 3).
  3. Determinazione della disfunzione cardiaca con ecocardiografia
    NOTA:
    Esaminare la funzione cardiaca attraverso l'ecocardiografia utilizzando un sistema di microultrasuoni, come descritto in precedenza22.
    1. Dirigere un fascio di ultrasuoni verso il cuore, vicino ai muscoli papillari.
    2. Ottieni una visualizzazione bidimensionale di kilohertz basata sull'elettrocardiogramma.
    3. Eseguire l'ecocardiografia transtoracica in vivo del ventricolo sinistro utilizzando una testa di scansione a 30 MHz.
    4. Misura i parametri associati alla funzione cardiaca digitalmente dalle tracce M-mode.
    5. Calcolare la media dei dati da tre a cinque cicli cardiaci (Tabella 1).
  4. Variabilità intra e interosservatoria
    1. Per la convalida della variabilità intraobserver, analizzare i dati di un operatore in due diverse occasioni.
    2. Per valutare la variabilità dell'interosservato, analizzare i dati da un operatore diverso.

4. Misurazione settimanale del peso corporeo e colesterolo totale al plasma (TC) e determinazione del trigliceridi (TG)

  1. Misurazione settimanale del peso corporeo
    1. Misurare i pesi corporei una volta alla settimana dalla settimana -1 alla settimana 12.
      N.B.: n - 8 topi per gruppo.
  2. Preparazione del plasma
    1. Prima di raccogliere campioni di sangue attraverso la puntura intracardiaca, preparare siringhe e tubi. Utilizzare EDTA come anticoagulante. Aggiungete 10 di EDTA da 0,5 M a ogni siringa da 2 mL e aggiungete 8 M EDTA a ciascun tubo da 1,5 mL.
    2. Alla settimana 12, dopo un digiuno notturno, anestesizzare i topi con la frantina (tribromoetanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente).
      N: n - 3 topi per gruppo.
    3. Preparare la zona ventrale del torace con il 70% di etanolo.
    4. Utilizzare forbici e pinze per aprire la cavità toracica e tagliare le costole fino a quando il cuore battente è esposto.
    5. Inserire l'ago da 25 G nel ventricolo destro. Aspirare lentamente fino a quando il sangue inizia a fluire nella siringa.
      NOT: Usiamo siringhe usa e getta in condizioni sterili con aghi da 25 G (vedi Tabella deiMateriali).
    6. Continuare ad aspirare con pressione costante e uniforme. Se non si vede sangue, riposizionare l'ago e ripetere l'aspirazione.
    7. Tenere i topi profondamente anestesizzati prima di raccogliere il volume di sangue richiesto. Normalmente, fino a 1 mL di sangue può essere raccolto. Eutanasia i topi dalla lussazione cervicale in questa profonda condizione anestetica.
    8. Pipette campioni di sangue in tubi da 1,5 mL e invertire accuratamente il sangue per garantire la miscelazione EDTA nel sangue. Quindi mettere campioni di sangue sul ghiaccio immediatamente.
    9. Centrifuga per 20 min a 400 x g a 4 gradi centigradi entro 30 min di raccolta.
    10. Raccogliere il supernatante con attenzione. Aliquota e conservare campioni di plasma a -80 gradi centigradi.
  3. Costruire curve standard per la misurazione del contenuto TC o TG
    1. Per la curva standard TC, preparare varie concentrazioni di standard di colesterolo: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2.07 mmol/L, 4.14 mmol/L, 6.20 mmol/L, 8.27l mmol/L e 10.34 mmol/L. Measure O.D. per ciascuno standard di colesterolo. Impostare l'OD media per ogni standard di colesterolo. Come valore dell'asse verticale (Y), impostare la concentrazione come valore dell'asse orizzontale (X). Creare una curva standard utilizzando un software statistico.
    2. Per la curva standard TG, preparare varie concentrazioni di standard TG: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1.81 mmol/L, 3.62 mmol/L, 5.42 mmol/L, 7.23 mmol/L e 9.04 mmol/L. Measure O.D. per ogni standard TG. Impostare l'OD media per ogni standard TG come valore dell'asse verticale (Y); impostare la concentrazione come valore dell'asse orizzontale (X). Creare una curva standard utilizzando un software statistico.
      NOT: Per la costruzione di curve standard nel presente studio è stata utilizzata una curva logistica di quattro parametri (4-pl). Controllare la curva standard prima di misurare i campioni di plasma e assicurarsi che r2 sia maggiore di 0,995.
  4. Misurazione del contenuto TC
    1. Etichettare la bottiglia di reagente di colore (25 mL) dal kit di saggio TC come "TC Working Solution".
    2. Vortice i campioni refrigerati brevemente. Preparare le diluizioni: 20 l di plasma in 80 - L di acqua distillata. Diluizioni di vortice brevemente.
    3. Aggiungere 2,5 - L di standard di colesterolo (5,17 mmol/L) o 2,5 litri di plasma diluito o 2,5 litri di acqua distillata (vuota) ai pozzi appropriati di una piastra di 96 pozze. Si consiglia triplicazione.
    4. A tutti i pozze, aggiungere 250 l del reagente di colore.
    5. Incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
    6. Accendere il lettore di micropilla e lasciare un riscaldamento di 10 min.
    7. Togliere le placche dall'incubatrice e leggere il lettore di microplacino a 510 nm. Assicurarsi che non siano presenti bolle o polveri nei pozzi dei microtiteri o sul fondo della piastra, rispettivamente.
    8. Calcolare la concentrazione di TC come segue:
      TC cont. - standard di colesterolo cont. - (campione di plasma O.D.-vuoto O.D)/(standard di colesterolo O.D.-vuoto O.D)
  5. Misurazione del contenuto TG
    1. Etichettare la bottiglia di reagente di colore (25 mL) dal kit di saggio TG come "TG Working Solution".
    2. Vortice i campioni refrigerati brevemente.
    3. Aggiungete 2,5 l di standard TG (2,26 mmol/L) a o 2,5 l di plasma diluito o 2,5 l di acqua distillata (vuota) ai pozzi appropriati di una piastra di 96 pozzetti. Si consiglia triplicazione.
    4. A tutti i pozze, aggiungere 250 l del reagente di colore.
    5. Incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
    6. Accendere il lettore di micropilla e lasciare un riscaldamento di 10 min.
    7. Togliere le placche dall'incubatrice e leggere il lettore di microplacino a 510 nm.
      NOT: Assicurarsi che non siano presenti bolle o polvere nei pozzetti dei microtiteri o sul fondo della piastra.
    8. Calcolare la concentrazione di TG come segue:
      TG cont. - Standard TG cont. - (campione di plasma O.D.-blank O.D)/(standard TG O.D.-blank O.D)

5. En Face Analisi di Lesioni Aorrosclerotiche

  1. Isolamento ed escissione dell'Aorta
    1. Alla settimana 12, dopo un digiuno notturno, anestesizzare i topi con la frantina (tribromoetanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Eutanasia i topi dalla lussazione cervicale in questa profonda condizione anestetica.
      NOT: Abbiamo usato 3 topi per gruppo.
    2. Preparare la zona ventrale del torace con il 70% di etanolo. Utilizzare forbici e pinze per aprire la cavità toracica e tagliare le costole fino a quando il cuore battente è esposto.
    3. Riempire una siringa da 50 mL con salina tamponata di fosfato al pH 7.4 (vedere Tabella dei materiali). Inserire 25 G di ago nel ventricolo sinistro e tagliare l'atrio destro per evitare l'alta pressione della perfusione.
    4. Eseguire la perfusione in situ ad una portata di 0,05-0,08 mL/min. Assorbo fluido perfusione con tessuti.
    5. Rimuovere costole e polmoni nella cavità toracica con forbici e pinze. Quindi, aprire la cavità addominale e rimuovere gli organi all'interno per una migliore vista dell'aorta.
    6. Rimuovere l'aorta tenendo il cuore con le microforzape e separando l'aorta dalla colonna vertebrale dorsalmente con microscissors fino alla biforcazione iliaca.
      NOT: Quando si seziona vicino ai rami atriale renali, tagliare profondamente utilizzando microscissors per evitare danni all'aorta.
    7. Fissare il cuore e l'aorta per 48 h in 4% paraformaldeide. Conservare le aortas in salina a temperatura ambiente o a 2-8 gradi centigradi per alcune ore.
      NOT: Questa procedura faciliterà la pulizia.
  2. Preparazione di aorta
    1. Togliete il cuore. Rimuovere con attenzione i tessuti avventiziani dalle aortas utilizzando microforcep e microscissors sotto uno stereoscopio. Utilizzare salina per mantenere il tessuto umido durante la pulizia.
      NOT: Fare attenzione a non strappare o intasare l'aorta e alcuni rami importanti, come l'arteria innominata, sinistra arteria carotide comune, e sinistra arteria subclavia.
    2. Lasciare 1 mm dell'innomina e ha lasciato le comuni arterie carotidee e tagliare l'intera arteria subclaviane sinistra.
    3. Tagliare aprire la curvatura esterna attraverso l'arteria innominata, poi a sinistra comune carotide, e poi a sinistra arteria subclavia.
    4. Tagliare aperto lungo la curvatura interna della porzione ascendente sul fondo della porzione addominale.
    5. Pin l'aorta piatta su un foglio di plastica nera e applicare salina per evitare che le aortas si asciughino.
  3. Immagine della regione intima di aorta
    1. Scatta foto di aortas en face con un microscopio stereo. Includere un righello in scala millimetrico nelle immagini per calibrare le misure.
    2. Includere l'arco e le regioni toraciche nella stessa immagine e la regione addominale in un'altra. Salvare le immagini in formato JPEG o TIFF.
      NOT: La regione dell'arco è dalla giunzione del miocardio a 3 mm distale dall'arteria subclaviana sinistra, la regione toracica è di 3 mm distale all'arteria subclaviana sinistra all'ultima arteria intercostale, e la regione addominale è l'ultima arteria intercostale al iliaco Biforcazione.
  4. Quantificazione del metodo di lesione-faccia aterosclerotica
    1. Calibrazione
      1. Aprire l'immagine con il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali), passare a Calibrazione spaziale e seguire le istruzioni.
      2. Modificare le unità di riferimento in mm posizionando il righello sulla linea.
    2. misura
      1. Impostare la calibrazione corretta per ogni immagine.
      2. Misurare 3 mm sul righello.
      3. Misurazione della regione ad arco e toracica: delineare la regione dell'arco dalla giunzione del miocardio a 3 mm distal dall'arteria subclaviana sinistra e la regione toracica da 3 mm dissarte all'arteria subclaviana sinistra all'ultima arteria intercostale. Tracciale nell'arco e nella regione toracica e guarda l'aorta attraverso il microscopio.
      4. Misurazione della regione addominale: Delineare la regione addominale dalla fine della regione toracica alla biforcazione iliaca. Traccia le lesioni nella regione addominale e guarda l'aorta attraverso il microscopio.
      5. Calcolare l'area di lesione rispetto alla superficie interna dell'aorta.
      6. Verificare la quantificazione attraverso un secondo osservatore che è cieco ai gruppi di studio.

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Representative Results

Un tipico schema di trattamento sperimentale, come utilizzato in questo studio, è illustrato nella Figura 1. Allo svezzamento (età 28 giorni), i topi femminili apoE-/- C57BL/6J sono stati anestesizzati withavertin (tribromoethanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente). I topi erano omeno CON osorgi bilaterali da OVX o sham attraverso un'incisione dorsale di 1 cm. Una settimana dopo l'OVX bilaterale, i topi sono stati alimentati con una dieta ad alto colesterolo (1,25% di colesterolo, 0% di cholate) per 12 settimane. Nel corso delle ultime 9 settimane di trattamento è stato somministrato peroralmente in parallelo (0,1 mg-kg-1)o PPD (0,5 mg-kg). Tutti i topi sono stati pesati settimanalmente. Come mostrato nella Figura 2, sono stati valutati gli effetti di entrambi gli estrogeni esogeni (17 estradioli e PPD) sui lipidi plasmatici e sul peso corporeo settimanale dei topi apoE-/- dopo la carenza di estrogeni. Dopo 12 settimane di una dieta ad alto contenuto di colesterolo, i topi OVX hanno mostrato un notevole aumento delle concentrazioni di TC e TG al plasma. I topi OVX somministrati peroralmente con 17 estradiolo o PPD tramite diffusione di nocciole presentavano concentrazioni di TC al plasma significativamente inferiori rispetto ai topi mastinati (Figura 2A). I livelli di TG al plasma sono diminuiti nei topi OVX somministrati peroralmente con 17 estradiolo ma non con PPD (Figura 2B). Come mostrato nella Figura 2C, mentre nei topi OVX è stata osservata una tendenza all'aumento del peso corporeo (BW) rispetto ai topi con la finzione, BW nei topi OVX somministrati peroralmente con 17-estradiolo o PPD tramite diffusione di nocciole dopo una dieta ad alto contenuto di colesterolo ha mostrato una tendenza opposta a quella nei topi OVX. Tuttavia, il peso corporeo finale dei topi in gruppi diversi non ha mostrato cambiamenti significativi.

La funzione cardiovascolare è stata valutata utilizzando l'ecocardiografia. Come mostrato nella Figura 3, la placca massima o IMT dell'aorta ascendente è stata misurata in topi OVX somministrati peroralally con 17 estradiolo o PPD tramite diffusione di nocciole. L'arco aortico di apoE alimentato ad alto colesterolo-/- topi sono stati osservati dall'ecocardiografia in modalità B. Le immagini longitudinali rappresentative dell'aorta ascendente sono state catturate dalla biomicroscopia ultrasonografica. Le frecce rosse indicano le placche. I topi OVX hanno mostrato una maggiore placca massima o IMT dell'aorta ascendente rispetto ai topi rotoli di sham. Dopo la somministrazione perorale di 17-estradiolo o PPD tramite diffusione di nocciole, la placca massima o IMT dell'aorta ascendente è notevolmente diminuita rispetto a quella dei topi OVX. (Figura 3). Abbiamo anche osservato la disfunzione cardiaca in risposta all'OVX in apoE-/- topi dopo un'alimentazione ad alto colesterolo-dieta di 12 settimane (Tabella 1). La funzione cardiaca è stata esaminata attraverso l'ecocardiografia. Nei topi OVX, la somministrazione perorale di 17-estradiolo o PPD tramite diffusione di nocciole potrebbe attenuare parzialmente i parametri che mostrano la disfunzione cardiaca.

Successivamente, abbiamo usato l'analisi en face per determinare le lesioni dell'aerosclerotico aortico. Come riportato in precedenza, dopo 12 settimane, una dieta ad alto colesterolo ha portato alla formazione di placca aterosclerotica sulla superficie luminosa dell'aorta. Come mostrato nella Figura 4, la percentuale media di area di lesione aortica rispetto all'intera area aortica è aumentata significativamente nei topi OVX. Dopo la somministrazione perorale con 17-estradiolo o PPD tramite diffusione di nocciole, l'area di lesione aortica è notevolmente diminuita rispetto a quella della controparte dei topi OVX. Questo risultato è coerente con la protezione di 17 estradiolo o PPD dallo sviluppo dell'aterosclerosi presentata nella Figura 3.

In conclusione, la procedura proposta, che utilizza l'ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale in apoe-/- topi, è applicabile per lo screening di trattamenti estrogeni esogeni non invasivi della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa. È anche particolarmente utile per evitare la capacità tumorale deleteria.

Figure 1
come illustrato nella Figura 1. Schema di trattamento del mouse. Allo svezzamento (età, 28 giorni), i topi femminili apoE-/- C57BL/6J sono stati anestesizzati con evitamento (tribromoetanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente). I topi erano ovariactomizzati bilateralmente (OVX) o fini operati attraverso un'incisione dorsale di 1 cm. Una settimana dopo OVX, i topi sono stati alimentati con una dieta ad alto colesterolo (1.25% colesterolo, 0% cholate) per 12 settimane. Nel corso delle ultime 9 settimane di trattamento è stato somministrato peroralmente in parallelo (0,1 mg-kg-1)o PPD (0,5 mg-kg). Tutti i topi venivano pesati ogni settimana. Alla settimana 12, l'analisi della funzione cardiovascolare è stata valutata utilizzando l'ecocardiografia. Dopo 12 settimane di una dieta ad alto colesterolo, tutti i topi sono stati eutanasia e campioni di sangue e tessuti sono stati raccolti per ulteriori indagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. Effetti di vari estrogeni esogeni sui lipidi plasmatici e peso corporeo settimanale in apoE-/- topi. I topi finti hanno subito un'operazione fittizia e hanno ricevuto una dieta ad alto colesterolo. I topi OVX sono stati sottoposti a ovariectomia bilaterale e poi suddivisi casualmente nei seguenti gruppi: il gruppo OVX, che è stato trattato con una dieta ad alto colesterolo; il gruppo OVX/E2 (17-estradiol), che ha ricevuto una dieta ad alto colesterolo per 12 settimane più 0,1 mg/kg E2 attraverso la somministrazione perorale tramite diffusione di nocciole per le ultime 9 settimane di trattamento; e il gruppo OVX/PPD, che ha ricevuto una dieta ad alto contenuto di colesterolo per 12 settimane più 0,5 mg/kg di PPD attraverso la somministrazione perorale tramite diffusione di nocciole per le ultime 9 settimane di trattamento. I livelli totali di colesterolo e trigliceridi del plasma sono stati misurati tramite metodi ezimatici (A-B). I dati sono espressi come i mezzi : SEM di n - 5 topi per gruppo. I pesi corporei settimanali sono stati misurati dalla settimana -1 alla settimana 12 (C). I dati sono espressi come i mezzi : SEM di n - 8 topi per gruppo. ANOVA di sola andata, seguita dal test post hoc di Dunnett, è stato condotto per confronti multipli. -p < 0,05 rispetto al gruppo sham; # p < 0.05 rispetto al gruppo OVX. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
come illustrato nella figura 3. Misurazione dello spessore massimo della placca IMT o in topi apoe-/-. Vengono presentate immagini in modalità B che mostrano l'arco aortico di topi apoe-/-. Le immagini longitudinali dell'aorta ascendente sono state ottenute mediante biomicroscopia ultrasonografica. È stata misurata la placca massima o IMT dell'aorta ascendente (mm). Le immagini ultrasonografiche mostrano la placca nella curvatura minore dell'aorta ascendente; le frecce rosse indicano le placche. I dati sono espressi come la media : SEM di n - 8 topi per gruppo. ANOVA di sola andata, seguita dal test post hoc di Dunnett, è stato condotto per confronti multipli. -p < 0,05 rispetto al gruppo sham; # p < 0.05 rispetto al gruppo OVX. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
come illustrato nella Figura 4. En face analisi delle lesioni aorrosclerotiche nei topi apoE-/-. La percentuale media di area di lesione aortica rispetto all'intera area aortica è stata quantificata in tutti i gruppi. Vengono mostrate micrografie rappresentative delle lesioni intimissive (in faccia) dell'aorta. I dati sono espressi come la media : SEM di n - 3 topi per gruppo. ANOVA di sola andata, seguita dal test post hoc di Dunnett, è stato condotto per confronti multipli. -p < 0,05 rispetto al gruppo sham; # P < 0,05 rispetto al gruppo OVX. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

messinscena Ovx OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (mm) 3,72 x 0,10 3,74 x 0. 24 3.68 - 0,16 3,88 x 0,16
LVID (mm) 2,34 x 0,11 2.16 - 0,22 2.12 - 0,13 2,55 - 0,12
IVSD (mm) 0,83 - 0,09 0,84 x 0,07 0,91 - 0,05 0,74 x 0,06
IVS (mm) 1,24 x 0,02 1,35 x 0,06 1,45 - 0,04 1,09 - 0,04
PWTd (mm) 0,7x 0,10 0,68 x 0,04 0,72 x 0,07 0,58 x 0,07
PWT (mm) 1.10 - 0,12 1,17 x 0,08 1,24 x 0,04 0,98 - 0,08
EDV (mm3) 58,89 x 3,74 59,88 x 9,02 57,39 x 5,79 65.11 - 6,13
ESV (mm3) 18.86 - 2,17 15,75 x 4,00 14,85 x 2,37 23,45 : 2,64
EF (%) 67,84 x 1,52 73,91 , 3,63 e 3 74,23 x 1,50 63,91 - 3,61
FS (%) 37,19 x 1,53 42,22 x 1,17 42,36 x 1,21 34,28 - 2,69)
LVIDd - Diametro interno LV durante la diastole; LVIDs - Diametro interno LV durante la sistole; IVSD - setto ventricolare interno durante la diastole; IVS - setto ventricolare interno durante la sistole; PWTd - spessore della parete posteriore durante la diastole; PWT: spessore della parete posteriore durante la sistole; EF : frazione di espulsione; FS - accorciamento frazionario; EDV - volume di diastolico finale; ESV - volume end-systolic.

Tabella 1: Valutazione della funzione cardiaca tramite ecocardiografia. I parametri associati alla funzione cardiaca digitalmente dalle tracce in modalità M sono stati quantificati in tutti i gruppi. I dati sono espressi come la media : SEM di n - 8 topi per gruppo. ANOVA di sola andata, seguita dal test post hoc di Dunnett, è stato condotto per confronti multipli. -p < 0,05 rispetto al gruppo sham; # p < 0.05 rispetto al gruppo OVX.

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Discussion

La metodologia qui descritta è un modello murino simile alla rottura dei lipidi e all'aterosclerosi osservata nelle donne in menopausa. È ben documentato che la carenza di estrogeni nelle donne in postmenopausa può aggravare l'incidenza di ipercolesterolemia preesistente o in corso con lesioni ateroscolistiche progressivamente complesse e diffuse1. Per imitare lo stato di aterosclerosi-incline in clinica, topi apoE-carenti, una fonte riproducibile e conveniente di animali con cui studiare l'aterogenesi23,24,25, sono stati applicati. Come si e' dimostrato nel presente studio, i topi femminili OVX apoE-/- allo svezzamento hanno mostrato un aumento delle lesioni aterosclerotiche nell'aorta rispetto ai topi femminili apoE-/- con funzione ovarica intatta. In questo modello animale, abbiamo anche confrontato l'effetto di varie terapie di sostituzione dell'estrogeno esogeno sulla dimensione della lesione aterosclerotica in una condizione dietetica controllata.

La doppia incisione dorsale-laterale dell'ovariectomia bilaterale presentata in questo articolo è tecnicamente più facile, meno dispendiosa in termini di tempo e più sicura rispetto all'incisione dorsale-laterale centrale o all'incisione addominale media dell'ovariectomia bilaterale in apoe-/- topi. L'ovariectomia bilaterale attraverso l'incisione addominale media presenta un grave inconveniente: può causare una grave adesione della cavità addominale, che, a sua volta, può influenzare l'assorbimento del farmaco. Recenti rapporti dimostrano che la somministrazione perorale di basse dosi 17-estradiolo protegge contro l'ischemia cerebrale26. Così, abbiamo scelto la somministrazione perorale tramite la diffusione di nocciole nel presente studio. I pellet a lento rilascio commerciale sono una modalità di somministrazione frequentemente utilizzata per testare gli effetti farmacologici in un modello murino, ma possono causare danni cerebrali dannosi27. Gli impianti sono soggetti a infezioni, soprattutto se i topi sono soggetti a OVX bilaterale tramite una doppia incisione dorsale-laterale. Anche se viene eseguita un'attenta disinfezione della pelle prima dell'incisione, l'infezione è difficile da evitare. La somministrazione dell'acqua e il gavage orale sono due metodi utilizzati meno frequentemente che sono stati testati. Somministrare l'ormone tramite acqua potabile è altamente vantaggioso a causa del suo essere estremamente non invasivo perché quasi nessuna manipolazione animale è necessaria. Tuttavia, 17-estradiol non è solubile in acqua senza un emulsionante. Così, abbiamo usato DMSO ad una concentrazione inferiore allo 0,5% per facilitarne la soluzione nell'acqua potabile. Tuttavia, questo approccio per la somministrazione a lungo termine di DMSO a basso dosaggio è difficile da controllare e tossico per i topi o gli esseri umani. I topi possono anche bere acqua su tutto 24 h di sorveglianza, che rende il consumo effettivo di droga difficile da determinare. Un altro svantaggio di questo approccio è che l'assunzione di acqua dell'individuo è difficile da controllare. Il più grande svantaggio del gavage orale è che è stressante per gli animali e può causare lesioni esofagee e influenzare il comportamento alimentare. Nella metodologia qui descritta, è stata condotta una formazione di 5 giorni per mangiare diffusione di nocciole senza ormoni prima dell'esperimento. Circa più del 95% dei topi accetterà la diffusione della nocciola se viene addestrato come quanto menzionato nella sezione protocollo. Una volta completamente abituato, la maggior parte dei topi lo consumerà in pochi secondi. Coerentemente con uno studio precedente6,11, i livelli di E2 plasma sono diminuiti in topi OVX rispetto alla controparte finta alla settimana 4 (dati non mostrati). Alla settimana 12 dopo la determinazione, abbiamo osservato l'atrofia dell'utero nei topi con operai OVX. Tuttavia, i livelli di estrogeni circolanti non sono stati monitorati dopo OVX nel presente studio.

In assenza di rilevamento di lesioni aterosclerotiche nell'aorta ascendente, l'IMT aortico può essere valutato misurando la distanza tra l'interfaccia lumen-intimale e l'interfaccia mediale-avventiziale. Questa misurazione si basa su un protocollo convalidato in precedenza in esseri umani28. Dati medi provenienti da tre siti che si trovano a circa 100 m di distanza l'uno dall'altro. Il carico di lavoro cardiaco aumenta dopo l'OVX nei topi apoE-/- può a causa della crescita ipertrofica compensativa dei singoli cardiomiociti che alla fine può portare ad aumentare la produzione cardiaca (Tabella 1). Mentre, al momento della somministrazione perorale di PPD per 9 settimane, l'ipertrofia cardiaca compensativa è stata attenuata con un EF% paragonabile alla controparte sham. Per la convalida della variabilità intra o inter-osservatore, analizzare i coefficienti di variazione per le misurazioni dello spessore aterosclerotico e i parametri associati alla funzione cardiaca da parte di un operatore in due diverse occasioni o da un operatore diverso.

Come presentato nel nostro studio, i topi OVX somministrati peroralmente con 17-estradiolo o PPD tramite diffusione di nocciole tendevano a prevenire l'aumento di peso corporeo e ridurre l'interruzione dei lipidi associati alla carenza di estrogeni, anche se non sono state differenze significative nel peso corporeo finale Osservato. Studi precedenti hanno anche dimostrato che la variazione dei parametri lipidici può essere troppo minore per spiegare gli effetti antiathesclerotici degli ormoni29. Gli effetti benefici degli estrogeni non sono limitati ai cambiamenti nelle proprietà delle proteine lipidi. Alcuni effetti non lipidi dell'estrogeno30,31, come l'infiammazione, disfunzione endoteliale, e stasi emodinamica, possono facilitare la protezione cardiovascolare nella malattia umana. Considerando i risultati osservati nel presente studio, la protezione dell'estrogeno esogeno dallo sviluppo dell'aterosclerosi è parzialmente indipendente dai livelli di lipidi sistemici. Nelle cellule endoteliali, PPD ha inibito espressioni di molecola di adesione e mediatori infiammatori (dati non mostrati). Inoltre, il PPD potrebbe sopprimere la formazione di adiposi perivascolare, strettamente correlata all'anti-contrattualità endoteliale. Pertanto, l'azione del PPD e del 17-estradiolo era diversa e il meccanismo sottostante deve essere ulteriormente esplorato. Indubbiamente, un consumo eccessivo di alimenti ricchi di energia, come la diffusione di nocciole, potrebbe causare aumento di peso. Tuttavia, le piccole quantità di diffusione di nocciole (200 mg-kg-1giorno-1) come menzionato nel presente studio potrebbero essere responsabili solo di meno del 5% dell'assunzione giornaliera di energia degli animali. Inoltre, nessun aumento di peso evidente è stato rilevato utilizzando questa quantità di diffusione di nocciole. L'uso di 17-estradiol e PPD è stato principalmente per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Perché, durante la progressione dell'aterosclerosi nei topi aopE-/- operati da OVX, dalla settimana 4 alla settimana 12, è stato somministrato peroralmente 17-estradiolo o PPD.

Un punto non trascurabile dell'uso clinico della TOS è i suoi effetti collaterali dannosi, che includono i tumori ovarici e mammari13,14. Il fitoestrogeno testato nel presente studio è un composto di saponina steroide trovato nelle piante di Dioscorea. PPD è stato segnalato per avere un effetto inibitorio su alcune linee cellulari del cancro20. Inoltre, ppD mostra proprietà antiaterosclerotiche paragonabili a quelle di 17 estradiol. Il modello che presentiamo qui può aiutare a vagliare potenziali composti candidati, tra cui fitoestrogeno, che esercita un effetto minimo sulla proliferazione tumorale.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81202526 a J.X.), la National Natural Science Foundation of China (81302769 a B.S.), la Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 a B.S.), la Chinese Postdoctoral Foundation Science Foundation (20110490325 a J.X.) e la Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China (20121106120031 a B.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

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