Un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno In Vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógeno sorgénicos de la disfunción cardiovascular después de la menopausia

Biochemistry

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Summary

Clínicamente, la deficiencia de estrógeno en mujeres menopáusicas puede agravar la incidencia de trastornos lipídicos y aterosclerosis. Establecimos un modelo de deficiencia de estrógeno in vivo por ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/-. El modelo de ratón es aplicable para el cribado de tratamientos de estrógeno exógeno de disfunción cardiovascular después de la menopausia.

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Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

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Abstract

Las mujeres posmenopáusicas corren un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares que las mujeres premenopáusicas. Los ratones hembra ovariectomizados (OVX) en la exhibición de destete muestran un aumento de las lesiones ateroscleróticas en la aorta en comparación con los ratones hembra con la función ovárica intacta. Sin embargo, faltan modelos de laboratorio que involucran ratones con deficiencia de estrógeno con estado propenso a la aterosclerosis. Este déficit es crucial porque la deficiencia clínica de estrógeno en mujeres menopáusicas puede agravar la incidencia de la alteración de lípidos preexistentes o en curso y la aterosclerosis. En este estudio, establecemos un modelo de ratón in vivo con deficiencia de estrógeno por ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en apolipoproteína E (apoE)-/- ratones. A continuación, comparamos los efectos de 17o-estradiol y pseudoprotodioscina (PPD) (un fitoestrógeno) perorgénicamente administrados a través de la propagación de avellanas. Encontramos que aunque ppD ejerce algún efecto en la reducción del peso corporal final y el TG plasmático en ratones OVX apoE-/-, tiene capacidades anti-ateroscleróticas y olascitoras comparables con su contraparte de 17o-estradiol. La PPD es un fitoestrógeno que se ha divulgado para ejercer propiedades antitumorales. Por lo tanto, el método propuesto es aplicable para el cribado de fitoestrógenos a través de la administración peroral para sustituir la terapia tradicional de reemplazo hormonal en mujeres posmenopáusicas, que se ha informado que tiene potencialmente perjudicial tumorigenetica Capacidad. La administración peroral a través de la propagación de avellanas no es invasiva, por lo que es ampliamente aplicable a muchos pacientes. Este artículo contiene demostraciones paso a paso de la ovariectomía bilateral a través de la doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/- y reemplazo peroral 17o-estradiol o hormona fitoestrógeno a través de la propagación de avellanas. Siguen los análisis de lípidos plasmáticos y de la función cardiovascular mediante ecocardiografía.

Introduction

Los estudios epidemiológicos y clínicos han demostrado que las mujeres posmenopáusicas tienen un riesgo considerablemente mayor de enfermedad cardiovascular que las mujeres premenopáusicas1,2. La terapia de reemplazo hormonal (HRT) puede reducir el riesgo relativo de enfermedad cardiovascular a 0,37-0,793. Entre otras complicaciones, la aterosclerosis causada por enfermedades cardiovasculares es la principal causa de muerte en todo el mundo4. Sin embargo, faltan modelos de laboratorio que involucran ratones con deficiencia de estrógeno que presentan un estado propenso a la aterosclerosis. Este protocolo proporciona un modelo de ratón por deficiencia de estrógeno in vivo para la detección de tratamientos de estrógeno exógenos de disfunción cardiovascular después de la menopausia.

Estudios anteriores muestran que la aplicación de OVX en roedores aterosclerósicos alimentados con una dieta alta en colesterol puede imitar a las mujeres posmenopáusicas que sufren de aterosclerosis5,6,7,8. Un modelo animal reproducible y conveniente que se asemeja al estado aterosclerógeno en las mujeres menopáusicas es la base de la investigación de estrógenoexógenos. Aquí, se aplicó una doble incisión dorsal-lateral de la ovariectomía bilateral en ratones propensos a la aterosclerosis E knockout (apoE-/-)9,10. En comparación con la incisión abdominal o dorsal media, la incisión dorsal doble es un método más fácil y lento que puede evitar la adhesión e inflamación graves de la cavidad abdominal. La administración peroral a través de la propagación de avellanas (ver Tabla de Materiales)no es invasiva y conveniente, por lo que es ampliamente aplicable como modo de administración a largo plazo11. La implantación de pellets de liberación lenta también es popular6. Sin embargo, los implantes pueden agravar la incidencia de infección, especialmente en ratones sometidos a OVX. Otros modos de administración no invasivos, como el gavage oral y la administración del agua, también tienen muchos inconvenientes. Por lo general, el avalo oral estresa a los ratones y puede causar lesiones esofágicas. La administración de la hormona a través del agua potable es altamente beneficioso; sin embargo, la adición de DMSO como emulsionante es inevitable ya que los estrógenos exógenos son insolubles en agua. Aquí, elegimos el reemplazo de hormona peroral 17o-estradiol o fitoestrógeno a través de la propagación de avellanas para la administración a largo plazo.

Recientemente, el efecto beneficioso de la HRT en el sistema cardiovascular de las mujeres posmenopáusicas se ha disputado en los ensayos12de la iniciativa de salud de la mujer (WHI). Por un lado, estrógeno exógeno por sí solo ejerce un efecto beneficioso sobre el sistema cardiovascular; por otro lado, se puede combinar con acetato de metohidroxiprogesterona para aumentar el riesgo de eventos cardiovasculares. Más en serio, HRT puede conducir a la progresión de la mama y el tumor uterino, y este efecto ha limitado notablemente su uso13,14. Más interés se ha centrado en los efectos cardiovasculares-protectores de los estrógenos exógenos que carecen de actividad mitotica en las células tumorales15,16,17. Múltiples estudios en seres humanos y animales sugieren que los fitoestrógenos con estructuras similares a la de los estrógenos pueden desempeñar un papel beneficioso en la protección cardiovascular15,18.

Por lo tanto, los objetivos del presente trabajo son (i) construir un modelo de ratón con deficiencia de estrógeno in vivo mediante ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/- y (ii) comparar los efectos protectores cardiovasculares de peroalmente administrado 17o-estradiol y pseudoprotodioscina (PPD), a través de la propagación de avellanas. 17o-estradiol es un tipo de estrógeno exógenoque pertenece a las hormonas sexuales femeninas 6,11,19. PPD, un esteroide saponina y fitoestrógeno de plantas de Dioscorea, se ha divulgado previamente para ejercer propiedades antitumorales20.

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Protocol

Todos los protocolos experimentales y de cuidado de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Academia China de Ciencias Médicas y el Colegio Médico de la Unión de Pekín (No permiso: SYXK (Pekín) 2013-0023). El origen de los ratones apoE-/- es C57BL/6J9,10.

1. Ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en apoE-/- Ratones

  1. Al destete (edad 28 días), anestetizar hembra apoE-/- C57BL/6J ratones con avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente).
    NOTA: 32 ratones apoE-/- se dividieron aleatoriamente en 4 grupos: SHAM, OVX, OVX/E2 y oVX/PPD (n.o 8 por grupo).
  2. Coloque el animal en posición propensa sobre una almohadilla de calentamiento. Aplique lubricante para los ojos para la protección ocular durante la anestesia.
  3. Mantener la temperatura corporal dentro de 36 o0,5 oC. Administrar 5 mg/kg de peso corporal del carprofeno analgésico por vía subcutánea al aspecto lateral del cuello del ratón.
  4. Afeitar un cefálico de 3 x 5 cm2 de área del ratón de la cresta ilíaca. Antes de cubrir el animal con una lámina quirúrgica de 3 x 5 cm2 de apertura, limpie bien el área agotada con yodo y luego un 70% de etanol. Utilice instrumentos estériles y guantes durante el experimento.
  5. Utilice tijeras y fórceps para hacer una incisión 1 cm lateral a la línea media y 1 cm lateral a las costillas costales.
  6. Disecciona el tejido subcutáneo con fórceps.
  7. Use gafas dissección (ver Tabla de materiales)para identificar el tejido adiposo blanco en la cavidad abdominal.
  8. Utilice microtijeras y microcóceps para hacer una incisión de 0,5-1 cm a través de la fascia hasta que se alcance la cavidad abdominal.
    NOTA: Para el grupo atravesado, cierre las heridas directamente. Sutura la capa muscular y la piel por separado usando una sutura monofilamento.
  9. Cuando se pueda ver el tejido adiposo blanco en la cavidad abdominal, agarre el tejido adiposo con microfólceps y tire suavemente de él. Se puede ver un ovario rosado en forma de morera envuelto por tejido adiposo en la cavidad abdominal.
  10. Ligar el vaso proximal de 0,5-1 cm y el cuerno uterino utilizando una sutura monofilamento. Retire el ovario con microtijeras y vuelva a colocar el tejido restante en la cavidad abdominal.
    NOTA: Los principales síntomas adversos para la operación de OVX son la ligadura ureteral que conduce a una alta mortalidad en ratones operados por OVX. Esto se puede evitar mediante la identificación de los tejidos utilizando una sesión de gafas de diseción.
  11. Cierra las heridas. Sutura la capa muscular y la piel por separado usando una sutura monofilamento.
  12. Utilice tijeras y fórceps para hacer otra incisión 1 cm lateral a la línea media y 1 cm lateral a las costillas costales en el otro lado. Repita el procedimiento anterior (1.5 a 1.11).
  13. Deje que el animal despierte de la anestesia. Mantenga el ratón por separado el primer día después de la cirugía.
  14. Limpie o reemplace la jaula con frecuencia durante la fase de recuperación.
  15. Aproximadamente 24 h después de la cirugía, administrar otros 5 mg/kg de peso corporal del carprofeno analgésico por vía subcutánea.

2. Administración peroral de 17o-estradiol o PPD a través de la propagación de avellanas

  1. Disolver a fondo 17o-estradiol o PPD en aceite de sésamo, y luego mezclar el aceite de sésamo con la extensión de avellana (ver Tabla de Materiales). Una porción diaria por cada ratón de 30 g contiene 3 g de 17o-estradiol o 15 g de PPD, 4 l de aceite de sésamo y 60 mg de dispersión de avellana. Preparar un placebo para cada ratón de 30 g contiene 4 ml de aceite de sésamo y 60 mg de avellana.
    NOTA: La porción de administración diaria de 17o-estradiolo PPD se basó en estudios previos 6,11 y experimentos preliminares.
  2. Una semana después del OVX, alimenta a los ratones con una dieta alta en colesterol (1,25% colesterol, 0% de colación) durante 12 semanas. Un esquema de tratamiento experimental típico, tal como se utiliza en este estudio, se ilustra en la Figura1.
  3. 5 días antes de la administración peroral de avellana diseminada en la semana 4, entrenar a los ratones para comer el placebo que contiene aproximadamente 30 mg de avellana esparcida para 2-5 ratones durante 5 días. Entrenar a los ratones en grupos en sus jaulas domésticas durante los primeros 3 días. Coloque los ratones en jaulas separadas en el cuarto y quinto día de entrenamiento y sirva la porción diaria para que se asemeje a la situación experimental.
  4. Durante las últimas 9 semanas, coloque los ratones en jaulas separadas y luego sirva una porción diaria de la porción de avellana esparcida para cada ocasión de alimentación.
    NOTA: Servir una porción diaria que contenga 17o-estradiol (0,1 mg-kg-1) o PPD (0,5 mg-kg-1) a través de la propagación de avellanas en el grupo OVX/E2 y OVX/PPD respectivamente; servir una porción diaria que contiene avellanas sin hormonas disecidas en el grupo SHAM y OVX.

3. Determinación del espesor de los medios de intima y la disfunción cardíaca mediante un sistema de microultrasonido

  1. Biomicroscopía ultrasonográfica
    1. Un día antes de la terminación, examine el grosor de los medios de comunicación intima y la disfunción cardíaca utilizando un sistema de microultrasonido (ver Tabla de Materiales)como se describió anteriormente21.
    2. Antes del examen, le dé a cada ratón una inyección intraperitoneal de 200 mg/kg de avertina (tribromoetanol) como anestesia (n.o 8 ratones por grupo).
    3. Aficiones el pelo del cuello de cada ratón con cuidado. Aplique el gel de transmisión de ultrasonido caliente liberalmente para garantizar una calidad de imagen óptima.
    4. Obtenga imágenes ultrasonográficas basales de la raíz aórtica y la aorta ascendente con el cabezal de escaneo de 30 MHz con un enfoque de 12,7 mm y una resolución de 40 m.
    5. Utilice la electrocardiografía con una configuración de plomo II para el monitoreo.
    6. Capturar imágenes parasternales derechas de eje largo de la aorta ascendente, arco aórtico y rama de la arteria braquiocéfala en un plano en sístole (Figura3).
  2. Mediciones de medios intima y espesor máximo de placa
    1. Ajuste la distancia entre el transductor y el sitio arterial fácilmente para obtener imágenes claras.
    2. Almacene un bucle cine de 10 s digitalmente para su examen fuera de línea en un sistema de análisis de imágenes.
    3. Elija manualmente una imagen ultrasonográfica de fotograma congelado óptima para realizar más mediciones. Compruebe las imágenes en la curvatura menor de la aorta ascendente. Si se puede ver la placa en la aorta ascendente, mida el espesor máximo de la placa. Si no se puede ver la placa en la aorta ascendente, mida la IMT máxima.
    4. Mida las IMT (distancia entre la interfaz luminal-intimal vascular y la interfaz medial-adventitial). Mida el espesor máximo de la placa (la distancia más gruesa entre el borde del lumen vascular y la capa adventitial).
    5. Datos medios de tres sitios de lesiones (Figura3).
  3. Determinación de la disfunción cardíaca mediante ecocardiografía
    NOTA:
    Examine la función cardíaca a través de ecocardiografía utilizando un sistema de microultrasonido, como se describió anteriormente22.
    1. Dirija un haz de ultrasonido hacia el corazón, cerca de los músculos papilares.
    2. Consiga una visualización de kilohercios basados en electrocardiogramas bidimensionales.
    3. Realice una ecocardiografía transtorácica in vivo del ventrículo izquierdo utilizando un cabezal de exploración de 30 MHz.
    4. Mida los parámetros asociados con la función cardíaca digitalmente a partir de trazados en modo M.
    5. Promedio de los datos de tres a cinco ciclos cardíacos (Tabla1).
  4. Variabilidad intra-e interobservadora
    1. Para la validación de la variabilidad intraobservador, analice los datos por un operador en dos ocasiones diferentes.
    2. Para la evaluación de la variabilidad interobservador, analice los datos por un operador diferente.

4. Medición semanal del peso corporal y medición del colesterol total plasmático (TC) y triglicéridos (TG) Determinación

  1. Medición semanal del peso corporal
    1. Mida el peso corporal una vez a la semana desde la semana -1 hasta la semana 12.
      NOTA: n a 8 ratones por grupo.
  2. Preparación del plasma
    1. Antes de recoger muestras de sangre a través de una punción intracardiaca, prepare jeringas y tubos. Utilice EDTA como anticoagulante. Añadir 10 ml de EDTA de 0,5 M a cada jeringa de 2 ml y añadir 8 ml de EDTA de 0,5 M a cada tubo de 1,5 ml.
    2. En la semana 12, después de un ayuno nocturno, anestesiar a los ratones con avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente).
      NOTA: n 3 ratones por grupo.
    3. Prepare la zona del pecho ventral con 70% de etanol.
    4. Usa tijeras y fórceps para abrir la cavidad torácica y cortar las costillas hasta que el corazón latiendo esté expuesto.
    5. Inserte la aguja de 25 G en el ventrículo derecho. Aspirar lentamente hasta que la sangre comience a fluir hacia la jeringa.
      NOTA: Utilizamos jeringas desechables en estado estéril con agujas de 25 G (ver Tabla de Materiales).
    6. Continúe aspirando con presión constante y uniforme. Si no se ve sangre, vuelva a colocar la aguja y repita la aspiración.
    7. Mantenga a los ratones profundamente anestesiados antes de recoger el volumen sanguíneo requerido. Normalmente, se pueden recolectar hasta 1 ml de sangre. Eutanasia a los ratones por luxación cervical bajo esta condición anestésica profunda.
    8. Pipetear muestras de sangre en tubos de 1,5 ml e invertir la sangre a fondo para asegurar la mezcla de EDTA en la sangre. A continuación, coloque muestras de sangre en hielo inmediatamente.
    9. Muestras de centrífuga durante 20 min a 400 x g a 4oC dentro de los 30 min de recogida.
    10. Recoge el sobrenadante con cuidado. Aliquot y almacenar muestras de plasma a -80 oC.
  3. Construir curvas estándar para la medición de contenido TC o TG
    1. Para la curva estándar TC, prepare varias concentraciones de normas de colesterol: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L y 10,34 mmol/L. Medir O.D. para el colesterol cada norma. Establezca el D.O. promedio para cada estándar de colesterol. Como valor del eje vertical (Y), establezca la concentración como el valor del eje horizontal (X). Cree una curva estándar utilizando un software estadístico.
    2. Para la curva estándar TG, prepare varias concentraciones de estándares TG: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L y 9,04 mmol/L. Medida O.D. para cada norma TG. Establezca el D.O. promedio para cada estándar TG como el valor del eje vertical (Y); establecer la concentración como el valor del eje horizontal (X). Cree una curva estándar utilizando un software estadístico.
      NOTA: En el presente estudio se utilizó un accesorio de curva logística de cuatro parámetros (4-pl) para la construcción de curvas estándar. Compruebe la curva estándar antes de medir las muestras de plasma y asegúrese de que r2 sea mayor que 0,995.
  4. Medición del contenido de TC
    1. Etiquete la botella de reactivo de color (25 ml) del kit de ensayo TC como "Solución de trabajo TC".
    2. Vortex los especímenes refrigerados brevemente. Preparar diluciones: 20 ml de plasma en 80 ml de agua destilada. Diluciones breves de vórtices.
    3. Añadir 2,5 l de normas de colesterol (5,17 mmol/L) o 2,5 l de plasma diluido o 2,5 l de agua destilada (en blanco) a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos. Se recomienda triplicación.
    4. A todos los pozos, agregue 250 s de reactivo de color.
    5. Incubar a 37oC durante 10 min.
    6. Encienda el lector de microplacas y deje un calentamiento de 10 minutos.
    7. Retire la(s) placa(s) de la incubadora(s) y lea el lector de microplacas a 510 nm. Asegúrese de que no haya burbujas ni polvo en los pocillos microtíteres o en la parte inferior de la placa, respectivamente.
    8. Calcule la concentración de TC de la siguiente manera:
      TC cont. - normas de colesterol cont.
  5. Medición del contenido de TG
    1. Etiquete la botella de reactivo de color (25 ml) del kit de ensayo TG como "Solución de trabajo TG".
    2. Vortex los especímenes refrigerados brevemente.
    3. Añadir 2,5 l de normas de TG (2,26 mmol/L) a o 2,5 l de plasma diluido o 2,5 l de agua destilada (en blanco) a los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos. Se recomienda triplicación.
    4. A todos los pozos, agregue 250 s de reactivo de color.
    5. Incubar a 37oC durante 10 min.
    6. Encienda el lector de microplacas y deje un calentamiento de 10 minutos.
    7. Retire la(s) placa(s) de la incubadora(s) y lea el lector de microplacas a 510 nm.
      NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas o polvo en los pocillos de microtíter o en la parte inferior de la placa.
    8. Calcule la concentración de TG de la siguiente manera:
      TG cont. - Estándares TG cont. ( muestra de plasma O.D.-o.D.o en blanco)/(Normas TG O.D.-O.D. en blanco)

5. Es Análisis facial de lesiones ateroscleróticas aórticas

  1. Aislamiento y escisión de Aorta
    1. En la semana 12, después de un ayuno nocturno, anestesiar a los ratones con avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Eutanasia a los ratones por luxación cervical bajo esta condición anestésica profunda.
      NOTA: Usamos 3 ratones por grupo.
    2. Prepare la zona del pecho ventral con 70% de etanol. Usa tijeras y fórceps para abrir la cavidad torácica y cortar las costillas hasta que el corazón latiendo esté expuesto.
    3. Llene una jeringa de 50 ml con solución salina tamponada de fosfato a pH 7.4 (ver Tabla de Materiales). Inserte una aguja de 25 G en el ventrículo izquierdo y corte la aurícula derecha para evitar altas presiones por perfusión.
    4. Realizar perfusión in situ a un caudal de 0,05-0,08 ml/min. Absorber líquido de perfusión con tejidos.
    5. Retire las costillas y los pulmones en la cavidad torácica con tijeras y fórceps. Luego, abre la cavidad abdominal y extrae los órganos dentro para una mejor vista de la aorta.
    6. Retire la aorta sosteniendo el corazón con las microfólceps y separando la aorta de la columna dorsal con microscissdores hasta la bifurcación ilíaca.
      NOTA: Cuando se disecte cerca de las ramas auriculares renales, corte profundamente usando microtijeras para evitar daños en la aorta.
    7. Fijar el corazón y la aorta durante 48 h en 4% paraformaldehído. Almacene las aortas en salina a temperatura ambiente o a 2-8oC durante unas horas.
      NOTA: Este procedimiento facilitará la limpieza.
  2. Preparación de la aorta
    1. Quita el corazón. Retire cuidadosamente los tejidos adventiales de las aortas usando microcóceps y microscissdores bajo un estereomicroscopio. Use salina para mantener el tejido húmedo durante la limpieza.
      NOTA: Tenga cuidado de no rasgar o cortar la aorta y algunas ramas importantes, como la arteria nominada, la arteria carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda.
    2. Dejar 1 mm de las arterias carótidas comunes y dejar las arterias carótidas comunes y cortar toda la arteria subclavia izquierda.
    3. Cortar la curvatura externa a través de la arteria innominada, luego a la arteria carótida común izquierda, y luego a la arteria subclavia izquierda.
    4. Cortar abierto a lo largo de la curvatura interna de la parte ascendente a la parte inferior de la parte abdominal.
    5. Anclar la aorta plana sobre una lámina de plástico negro y aplicar salina para evitar que las aortas se sequen.
  3. Imagen de la región intimal de la aorta
    1. Tome fotografías de aortas en face con un microscopio estéreo. Incluya una regla de escala milimétrica en las imágenes para calibrar las mediciones.
    2. Incluya el arco y las regiones torácicas en la misma imagen y la región abdominal en otra. Guardar imágenes como JPEG o TIFF.
      NOTA: La región del arco es desde la unión del miocardio hasta 3 mm distal de la arteria subclavia izquierda, la región torácica es de 3 mm distal a la arteria subclavia izquierda hasta la última arteria intercostal, y la región abdominal es la última arteria intercostal a la ilíaca Bifurcación.
  4. Cuantificación del método facial de lesión aterosclerótica
    1. Calibración
      1. Abra la imagen con el software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales), vaya a Calibración espacial y siga las instrucciones.
      2. Cambie las unidades de referencia a mm colocando la regla sobre la línea.
    2. Medición
      1. Establezca la calibración correcta para cada imagen.
      2. Mida 3 mm en la regla.
      3. Medición del arco y la región torácica: Delinee la región del arco desde la unión del miocardio hasta el disal de 3 mm desde la arteria subclavia izquierda y la región torácica de 3 mm de distal a la arteria subclavia izquierda hasta la última arteria intercostal. Traza lesiones en el arco y la región torácica y mira la aorta a través del microscopio.
      4. Medición de la región abdominal: Esboza la región abdominal desde el final de la región torácica hasta la bifurcación ilíaca. Rastrea lesiones en la región abdominal y observa la aorta a través del microscopio.
      5. Calcular el área de la lesión en relación con la superficie interna de la aorta.
      6. Verifique la cuantificación a través de un segundo observador que sea ciego a los grupos de estudio.

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Representative Results

Un esquema de tratamiento experimental típico, tal como se utiliza en este estudio, se ilustra en la Figura1. Al destete (edad 28 días), las hembras apoE-/- C57BL/6J ratones fueron anestesiados conavertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Los ratones fueron bilateralmente OVX o falsos operados a través de una incisión dorsal de 1 cm. Una semana después del OVX bilateral, los ratones recibieron una dieta alta en colesterol (1,25% colesterol, 0% de colación) durante 12 semanas. 17o-Estradiol (0,1 mg-kg-1) o PPD (0,5 mg-kg-1 ) se administró perorally en paralelo mediante propagación de avellanas durante las últimas 9 semanas de tratamiento. Todos los ratones fueron pesados semanalmente. Como se muestra en la Figura 2, se evaluaron los efectos de los estrógenos exógenos (17o-estradiol y PPD) en los lípidos plasmáticos y el peso corporal semanal de los ratones apoE-/- después de la deficiencia de estrógeno. Después de 12 semanas de una dieta alta en colesterol, ratones OVX mostraron un aumento notable en las concentraciones plasmáticas de TC y TG. Los ratones OVX administrados peroalmente con 17o-estradiol o PPD a través de la propagación de avellanas mostraron concentraciones plasmáticas significativamente más bajas de TC plasmáticas que los ratones operados por falsos (Figura2A). Los niveles de TG plasmáticos disminuyeron en ratones OVX administrados peroalmente con 17o-estradiol pero no con PPD (Figura2B). Como se muestra en la Figura 2C, mientras que se observó una tendencia hacia el aumento del peso corporal (BW) en ratones OVX en comparación con los ratones operados por falsos, BW en ratones OVX administrados peroalmente con 17o-estradiol o PPD a través de la propagación de avellanas después de una dieta alta en colesterol mostró una tendencia opuesta a la de los ratones OVX. Sin embargo, el peso corporal final de los ratones en diferentes grupos no mostró cambios significativos.

La función cardiovascular se evaluó mediante ecocardiografía. Como se muestra en la Figura 3, la placa máxima o IMT de la aorta ascendente se midió en ratones OVX administrados peroalmente con 17o-estradiol o PPD a través de la propagación de avellanas. El arco aórtico de ratones apoE-/- alimentados con alta dieta se observó mediante ecocardiografía en modo B. Las imágenes longitudinales representativas de la aorta ascendente fueron capturadas por biomicroscopía ultrasonográfica. Las flechas rojas indican las placas. Los ratones OVX mostraron una mayor placa máxima o IMT de la aorta ascendente en comparación con ratones operados por falsos. Tras la administración peroral de 17o-estradiol o PPD a través de la propagación de avellanas, la placa máxima o IMT de la aorta ascendente disminuyó notablemente en comparación con la de los ratones OVX. (Figura 3). También observamos disfunción cardíaca en respuesta a OVX en ratones apoE-/- después de una alimentación de alta dieta de colesterol de 12 semanas (Tabla 1). La función cardíaca se examinó a través de ecocardiografía. En ratones con OVX, la administración peroral de 17(-estradiol o PPD a través de propagación de avellanas podría atenuar parcialmente los parámetros que muestran disfunción cardíaca.

A continuación, utilizamos el análisis facial para determinar lesiones ateroscleróticas aórticas. Como se informó anteriormente, después de 12 semanas, una dieta alta en colesterol condujo a la formación de placa aterosclerótica en la superficie luminal de la aorta. Como se muestra en la Figura 4, el porcentaje medio de área de lesiones aórticas en relación con toda el área aórtica aumentó significativamente en ratones OVX. Tras la administración peroral con 17o-estradiol o PPD a través de la propagación de avellanas, el área de lesión aórtica disminuyó notablemente en comparación con la contraparte de los ratones OVX. Este resultado es coherente con la protección de 17o-estradiol o PPD contra el desarrollo de la aterosclerosis presentada en la Figura3.

En conclusión, el procedimiento propuesto, que utiliza la ovariectomía bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral en ratones apoE-/-, es aplicable para el cribado de tratamientos de estrógeno exógeno no invasivos de disfunción cardiovascular después de la menopausia. También es especialmente útil para evitar la capacidad tumorigenética notelosa.

Figure 1
Figura 1. Esquema de tratamiento de ratón. Al destetado (edad, 28 días), los ratones hembra apoE-/- C57BL/6J fueron anestesiados con avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Los ratones fueron bilateralmente ovariectomizados (OVX) o operados por una incisión dorsal de 1 cm. Una semana después del OVX, los ratones recibieron una dieta alta en colesterol (1,25% colesterol, 0% de colación) durante 12 semanas. 17o-Estradiol (0,1 mg-kg-1) o PPD (0,5 mg-kg-1 ) se administró perorally en paralelo mediante propagación de avellanas durante las últimas 9 semanas de tratamiento. Todos los ratones eran pesados cada semana. En la semana 12, el análisis de la función cardiovascular se evaluó utilizando ecocardiografía. Después de 12 semanas de una dieta alta en colesterol, todos los ratones fueron eutanasiados, y se cosecharon muestras de sangre y tejidos para una investigación adicional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Efectos de varios estrógenos exógenos en lípidos plasmáticos y peso corporal semanal en ratones apoE-/-. Los ratones Sham se sometieron a una simulación y recibieron una dieta alta en colesterol. Los ratones OVX se sometieron a una ovariectomía bilateral y luego se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos: el grupo OVX, que fue tratado con una dieta alta en colesterol; el grupo OVX/E2 (17o-estradiol), que recibió una dieta alta en colesterol durante 12 semanas más 0,1 mg/kg de E2 a través de la administración oral a través de la propagación de avellanas durante las últimas 9 semanas de tratamiento; y el grupo OVX/PPD, que recibió una dieta alta en colesterol durante 12 semanas más 0,5 mg/kg de PPD a través de la administración peroral a través de la propagación de avellanas durante las últimas 9 semanas de tratamiento. Los niveles totales de colesterol y triglicéridos de plasma se midieron mediante métodos enzimáticos (A-B). Los datos se expresan como los medios de SEM de n a 5 ratones por grupo. Los pesos corporales semanales se midieron desde la semana -1 hasta la semana 12 (C). Los datos se expresan como los medios de SEM de n a 8 ratones por grupo. El ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett se llevó a cabo para múltiples comparaciones. *p < 0.05 en comparación con el grupo falso; # < 0,05 en comparación con el grupo OVX. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Mediciones de espesor de placa IMT o máximo en ratones apoE-/-. Se presentan imágenes en modo B que muestran el arco aórtico de ratones apoE-/-. Las imágenes longitudinales de la aorta ascendente se obtuvieron mediante biomicroscopía ultrasonográfica. Se midió la placa máxima o IMT de la aorta ascendente (mm). Las imágenes ultrasonográficas muestran la placa en la curvatura menor de la aorta ascendente; las flechas rojas indican las placas. Los datos se expresan como la media de SEM de n a 8 ratones por grupo. El ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett se llevó a cabo para múltiples comparaciones. *p < 0.05 en comparación con el grupo falso; # < 0,05 en comparación con el grupo OVX. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. En análisis facial de lesiones ateroscleróticas aórticas en ratones apoE-/-. El porcentaje promedio del área de la lesión aórtica en relación con toda el área aórtica se cuantificó en todos los grupos. Se muestran micrografías representativas de las lesiones intimales (en cara) de la aorta. Los datos se expresan como la media de SEM de n a 3 ratones por grupo. El ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett se llevó a cabo para múltiples comparaciones. *p < 0.05 en comparación con el grupo falso; # P < 0.05 en comparación con el grupo OVX. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Farsa OVX OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (mm) 3,72 a 0,10 3,74 á 0. 24 3,68 a 0,16 3,88 a 0,16
LVID (mm) 2,34 á 0,11 2,16 a 0,22 2,12 a 0,13 2,55 á 0,12?
IVSd (mm) 0,83 a 0,09 0,84 á 0,07 0,91 a 0,05 0,74 á 0,06?
IVS (mm) 1,24 á 0,02 1,35 a 0,06* 1,45 á 0,04? 1,09 a 0,04?
PWTd (mm) 0,7o 0,10 0,68 a 0,04 0,72 a 0,07 0,58 á 0,07?
PWTs (mm) 1.10 a 0,12 1,17 a 0,08 1,24 á 0,04 0,98 á 0,08?
EDV (mm3) 58,89 a 3,74 59,88 a 9,02 57,39 x 5,79 65,11 a 6,13
ESV (mm3) 18,86 x 2,17 15,75 a 4,00 14,85 x 2,37 23,45 á 2,64?
EF (%) 67,84 á 1,52 73,91 x 3 .63* 74,23 a 1,50 63,91 á 3,61?
FS (%) 37,19 a 1,53 42,22 a 1,17* 42,36 á 1,21 34,28 á 2,69?
LVIDd - Diámetro interno del LV durante la diástole; LVID - Diámetro interno del LV durante la sístole; IVSd - tabique ventricular interno durante la diástole; IVSs - tabique ventricular interno durante la sístole; PWTd - espesor de pared posterior durante la diastole; PWTs - espesor de pared posterior durante la sístole; EF - fracción de eyección; FS - acortamiento fraccionario; EDV - volumen diastólico final; ESV - volumen sistólico final.

Tabla 1: Evaluación de la función cardíaca mediante Ecocardiografía. Los parámetros asociados con la función cardíaca digitalmente a partir de trazados en modo M se cuantificaron en todos los grupos. Los datos se expresan como la media de SEM de n a 8 ratones por grupo. El ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett se llevó a cabo para múltiples comparaciones. *p < 0.05 en comparación con el grupo falso; # < 0,05 en comparación con el grupo OVX.

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Discussion

La metodología descrita aquí es un modelo de ratón que se asemeja a la alteración de los lípidos y la aterosclerosis vista en las mujeres menopáusicas. Está bien documentado que la deficiencia de estrógeno en mujeres posmenopáusicas puede agravar la incidencia de hipercolesterolemia preexistente o en curso con lesiones aterosclerosósticas progresivamente complejas y generalizadas1. Para imitar el estado propenso a la aterosclerosis en la clínica, se aplicaron ratones apoE deficientes, una fuente reproducible y conveniente de animales con la que estudiar aterogénesis23,24,25,. Como se muestra en el presente estudio, las hembras OVX apoE-/- ratones en el destete mostraron un aumento de las lesiones ateroscleróticas en la aorta en comparación con la apoE hembra-/- ratones con función ovárica intacta. En este modelo animal, también comparamos el efecto de varias terapias de reemplazo de estrógeno exógeno en el tamaño de la lesión aterosclerótica bajo una condición dietética controlada.

La doble incisión dorsal-lateral de la ovariectomía bilateral presentada en este artículo es técnicamente más fácil, menos lenta y segura en comparación con la incisión dorsal-lateral media o la incisión abdominal media de la ovariectomía bilateral en apoE-/- ratones. La ovariectomía bilateral a través de una incisión abdominal media presenta un gran inconveniente: puede causar una adhesión grave a la cavidad abdominal, lo que, a su vez, puede afectar la absorción de fármacos. Informes recientes muestran que la administración peroral de dosis bajas de 17o-estradiol protege contra la isquemia cerebral26. Por lo tanto, seleccionamos la administración peroral a través de la propagación de avellanas en el presente estudio. Los pellets comerciales de liberación lenta son un modo de administración frecuente mente utilizado para probar efectos farmacológicos en un modelo de ratón, pero pueden causar daños cerebrales perjudiciales27. Los implantes son propensos a infecciones, especialmente si los ratones son sometidos a OVX bilateral a través de una doble incisión dorsal-lateral. Aunque se realiza una desinfección cuidadosa de la piel antes de la incisión, la infección es difícil de evitar. La administración del agua y el avago oral son dos métodos menos utilizados que han sido probados. La administración de la hormona a través del agua potable es altamente beneficioso debido a que es extremadamente no invasivo porque casi no se requiere ningún manejo de animales. Sin embargo, 17o-estradiol no es soluble en agua sin un emulsionante. Así, utilizamos DMSO a una concentración inferior al 0,5% para facilitar su solución en agua potable. Sin embargo, este enfoque para la administración a largo plazo de DMSO en dosis bajas es difícil de controlar y tóxico para ratones o humanos. Los ratones también pueden beber agua durante las 24 horas de vigilancia, lo que dificulta el consumo real de drogas. Otra desventaja de este enfoque es que la ingesta de agua del individuo es difícil de controlar. La mayor desventaja del gavage oral es que es estresante para los animales y puede causar lesiones esofágicas y afectar el comportamiento alimentario. En la metodología descrita aquí, se llevó a cabo un entrenamiento de 5 días de consumo de avellanas sin hormonas antes del experimento. Aproximadamente más del 95% de los ratones aceptarán la propagación de avellanas si están entrenados como lo que se menciona en la sección de protocolo. Una vez completamente habituado, la mayoría de los ratones lo consumirán en cuestión de segundos. Consistente con un estudio anterior6,11, los niveles plasmáticos de E2 disminuyeron en ratones OVX en comparación con la contraparte operada por falsos en la semana 4 (datos no mostrados). En la semana 12 después de la determinación, observamos atrofia del útero en ratones operados por OVX. Sin embargo, los niveles de estrógeno circulante no fueron monitoreados después de OVX en el presente estudio.

En ausencia de detección de lesiones ateroscleróticas en la aorta ascendente, las IMT aórticas pueden evaluarse midiendo la distancia entre la interfaz lumen-intimal y la interfaz medial-adventitial. Esta medición se basa en un protocolo previamente validado en humanos28. Promedio de datos de tres sitios que están separados aproximadamente a 100 m entre sí. La carga de trabajo cardiaca aumenta después de OVX en ratones apoE-/- puede deberse al crecimiento hipertrófico compensatorio de cardiomiocitos individuales que eventualmente puede conducir a un aumento de la producción cardíaca (Tabla1). Mientras que, tras la administración peroral de PPD durante 9 semanas, la hipertrofia cardíaca compensatoria se atenuó con un EF% comparable a la contraparte falsa. Para la validación de la variabilidad intra o entre observadores, analice los coeficientes de variación para las mediciones de espesor aterosclerótica y los parámetros asociados a la función cardíaca por un operador en dos ocasiones diferentes o por un operador diferente.

Como se presenta en nuestro estudio, ratones OVX administrados peroalmente con 17o-estradiol o PPD a través de la propagación de avellanas tendieron a prevenir el aumento de peso corporal y reducir la interrupción de lípidos asociada a la deficiencia de estrógeno, aunque no hubo diferencias significativas en el peso corporal final Observado. Estudios anteriores también han demostrado que la variación de los parámetros lipídicos puede ser demasiado menor para explicar los efectos antiateroscleróticos de las hormonas29. Los efectos beneficiosos del estrógeno no se limitan a los cambios en las propiedades de la proteína lipídica. Algunos efectos no lipídicos de estrógeno30,31, como la inflamación, disfunción endotelial, y éxtasis hemodinámica, pueden facilitar la protección cardiovascular en enfermedades humanas. Teniendo en cuenta los resultados observados en el presente estudio, la protección del estrógeno exógeno del desarrollo de la aterosclerosis es parcialmente independiente de los niveles de lípidos sistémicos. En las células endoteliales, PPD inhibió expresiones de molécula de adhesión y mediadores inflamatorios (datos no mostrados). Además, la PPD podría suprimir la formación adiposa perivascular que está estrechamente correlacionada con la anticontractilidad endotelial. Por lo tanto, la acción de la PPD y del 17o-estradiol fue diferente y se debe seguir explorando el mecanismo subyacente. Sin duda, el consumo excesivo de alimentos ricos en energía, como la propagación de avellanas, podría causar aumento de peso. Sin embargo, las pequeñas cantidades de propagaciónde avellanas (200 mg-kg -1-día-1) como se menciona en el presente estudio sólo podrían ser responsables de menos del 5% de la ingesta diaria de energía de los animales. Además, no se detectó un aumento de peso obvio mediante el uso de esta cantidad de propagación de avellana. El uso de 17o-estradiol y PPD fue principalmente para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Porque, durante la progresión de la aterosclerosis en ratones aopE-/- operados por OVX, desde la semana 4 hasta la semana 12, se administró 17o-estradiol o PPD perorally.

Un punto no despreciable del uso clínico de la HRT son sus efectos secundarios perjudiciales, que incluyen cáncerderos de ovario y de mama13,14. El fitoestrógeno probado en el presente estudio es un compuesto de saponina esteroide encontrado en las plantas de Dioscorea. PPD se ha divulgado para tener un efecto inhibitorio en algunas líneas celulares de cáncer20. Además, PPD muestra propiedades antiateroescleróticas comparables con las de 17o-estradiol. El modelo que presentamos aquí puede ayudar a detectar posibles compuestos candidatos, incluyendo fitoestrógeno, que ejerce un efecto mínimo sobre la proliferación tumoral.

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Disclosures

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (81202526 a J.X.), la National Natural Science Foundation of China (81302769 a B.S.), la Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 a B.S.), la China Postdoctoral Science Foundation (20110490325 a J.X.), y la Fundación de Programas de Doctorado del Ministerio de Educación de China (20121106120031 a B.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

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