Un modèle in vivo de souris d'insuffisance d'oestrogène pour le criblage des traitements exogènes exogènes de la dysfonction cardio-vasculaire après ménopause

Biochemistry

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Summary

Cliniquement, l'insuffisance d'oestrogène dans les femmes ménopausiques peut aggraver l'incidence de la perturbation de lipide et de l'athérosclérose. Nous avons établi un modèle in vivo d'insuffisance d'oestrogène par ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire d'une double incision dorsal-latérale dans apoE-/- souris. Le modèle de souris est applicable pour le dépistage des traitements exogènes exogènes de dysfonctionnement cardio-vasculaire après la ménopause.

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Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

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Abstract

Les femmes ménopausées sont plus à risque de développer des maladies cardiovasculaires que les femmes préménopausées. Les souris femelles ovariectomized (OVX) à l'affichage de soudure ont augmenté des lésions athérosclérotiques dans l'aorte comparées aux souris femelles avec la fonction ovarienne intacte. Cependant, les modèles de laboratoire impliquant des souris oestrogène-déficientes avec l'état athérosclérose-enclin font défaut. Ce déficit est crucial parce que l'insuffisance clinique d'oestrogène dans les femmes ménopausées peut aggraver l'incidence de la perturbation préexistante ou continue de lipide et de l'athérosclérose. Dans cette étude, nous établissons un modèle in vivo de souris oestrogène-déficient par ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire d'une double incision dorsal-latérale dans l'apolipoprotein E (apoE)-/- souris. Nous comparons ensuite les effets de la propagation de la tartine de noisette et de la pseudoprotodioscine (PPD) (un phytoestrogène) administrés peroraux par tartinade aux noisettes. Nous constatons que bien que PPD exerce un certain effet sur la réduction du poids corporel final et du plasma TG chez les souris OVX apoE-/- il a des capacités anti-atherosclérotiques et cardiaques-protectrices comparables à son homologue de 17 ans et plus. PPD est un phytoestrogène qui a été rapporté pour exercer des propriétés anti-tumorales. Ainsi, la méthode proposée est applicable pour le dépistage des phytoestrogènes par l'administration perorale pour remplacer l'hormonothérapie substitutive traditionnelle chez les femmes ménopausées, qui a été rapportée pour avoir potentiellement délétère tumorigenetic capacité. L'administration perorale par l'intermédiaire de la propagation de noisette est non envahissante, la rendant largement applicable à beaucoup de patients. Cet article contient des démonstrations étape par étape de l'ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire de l'incision dorsal-latérale double dans apoE-/- souris et peroral 17-estradiol ou remplacement d'hormone de phytoestrogen par la propagation de noisette. Les analyses de lipide et de fonction cardio-vasculaire de plasma utilisant l'échocardiographie suivent.

Introduction

Des études épidémiologiques et cliniques ont montré que les femmes ménopausées sont considérablement plus à risque de maladie cardiovasculaire que les femmes préménopausées1,2. L'hormonothérapie substitutive (THS) peut réduire le risque relatif de maladie cardiovasculaire à 0,37-0,793. Parmi d'autres complications, l'athérosclérose causée par les maladies cardiovasculaires est la principale cause de décès dans le monde4. Cependant, les modèles de laboratoire impliquant des souris oestrogène-déficientes présentant le statut enclin d'athérosclérose manquent. Ce protocole fournit un modèle in vivo de souris d'insuffisance d'oestrogène pour le criblage des traitements exogènes d'oestrogène de la dysfonction cardio-vasculaire après ménopause.

Des études antérieures montrent que l'application d'OVX chez les rongeurs athérosclérotiques nourris avec un régime riche en cholestérol peut imiter les femmes ménopausées souffrant d'athérosclérose5,6,7,8. Un modèle animal reproductible et commode ressemblant à l'état athérosclérotique dans les femmes ménopausées est la base de la recherche exogène d'oestrogène. Ici, une double incision dorsal-latérale de l'ovariectomy bilatéral a été appliquée dans l'athérosclérose-encline E knock-out (apoE-/-) souris9,10. Comparé e à l'incision abdominale moyenne ou dorsal, l'incision double dorsal-latérale est une méthode plus facile et moins longue qui peut éviter l'adhérence et l'inflammation abdominales graves de cavité. L'administration perorale par propagation de noisette (voir tableau des matériaux) est non invasive et pratique, la rendant largement applicable en tant que mode d'administration à long terme11. L'implantation de granulés à libération lente est également populaire6. Cependant, les implants peuvent aggraver l'incidence de l'infection en particulier chez les souris soumises à OVX. D'autres modes d'administration non invasifs, tels que le gavage oral et l'administration de l'eau, ont également de nombreux inconvénients. Le gavage oral stresse généralement les souris et peut causer des lésions oesophagiennes. L'administration de l'hormone par l'intermédiaire de l'eau potable est très bénéfique; cependant, l'ajout de DMSO comme émulsifiant est inévitable car les oestrogènes exogènes sont insolubles dans l'eau. Ici, nous avons choisi le remplacement peroral d'hormone de 17 ou de phytoestrogen par l'écart de noisette pour l'administration à long terme.

Récemment, l'effet bénéfique de HRT sur le système cardio-vasculaire des femmes postmenopausal a été contesté dans les essais d'initiative de santé des femmes (WHI)12. D'une part, l'oestrogène exogène seul exerce un effet bénéfique sur le système cardio-vasculaire ; d'autre part, il peut combiner avec l'acétate de metohydroxyprogestérone pour augmenter le risque d'événements cardio-vasculaires. Plus sérieusement, HRT peut mener à la progression de tumeur de sein et utérin, et cet effet a nettement limité son utilisation13,14. Plus d'intérêt a été porté sur les effets cardio-protecteurs des oestrogènes exogènes manquant d'activité mitotique dans les cellules tumorales15,16,17. De multiples études chez l'homme et les animaux suggèrent que les phytoestrogènes avec des structures similaires à celle des oestrogènes peuvent jouer un rôle bénéfique dans la protection cardiovasculaire15,18.

Ainsi, les buts du travail actuel sont (i) de construire un modèle in vivo de souris d'insuffisance d'oestrogène par ovaricectomie bilatérale par l'intermédiaire d'une incision dorsal-latérale double dans apoE-/- souris et (ii) pour comparer les effets protecteurs cardio-vasculaires de perorally administré 17'-estradiol et pseudoprotodioscine (PPD), par l'intermédiaire de la propagation de noisette. 17-estradiol est un genre d'oestrogène exogène qui appartient aux hormones sexuelles féminines6,11,19. PPD, une saponine stéroïde et phytoestrogène des usines de Dioscorea, a été précédemment rapporté pour exercer des propriétés anti-tumorales20.

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Protocol

Tous les protocoles de soins aux animaux et d'expérimentation ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Académie chinoise des sciences médicales et du Peking Union Medical College (Permission No.: SYXK (Beijing) 2013-0023). L'origine de apoE-/- souris est C57BL/6J9,10.

1. Ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire d'une incision dorsal-latérale double dans l'apoE-/- Souris

  1. Au sœur (âge 28 jours), anesthésier l'apoE femelle-/- souris C57BL/6J avec avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg ; intraperitoneally).
    REMARQUE : 32 apoE-/- les souris ont été aléatoirement divisées en 4 groupes : SHAM, OVX, OVX/E2, et OVX/PPD (n - 8 par groupe).
  2. Placez l'animal en position couchée sur un coussin chauffant. Appliquer le lubrifiant pour les yeux pour la protection oculaire pendant l'anesthésie.
  3. Maintenir la température corporelle dans un rayon de 36 à 0,5 oC. Administrer le poids corporel de 5 mg/kg du carprofène analgésique sous-cutané à l'aspect latéral du cou de la souris.
  4. Raser une zone de souris de 3 x 5 cm2 céphalique de la crête iliaque. Avant de recouvrir l'animal d'une feuille chirurgicale d'ouverture de 3 x 5 cm 2, nettoyez soigneusement la zone rasée avec de l'iode, puis 70 % de l'éthanol. Utilisez des instruments et des gants stériles pendant l'expérience.
  5. Utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une incision latérale de 1 cm à la ligne médiane et de 1 cm latérale mentaux aux côtes costales.
  6. Disséquer carrément le tissu sous-cutané à l'aide de forceps.
  7. Utilisez des lunettes de dissection (voir Tableau des matériaux)pour identifier le tissu adipeux blanc dans la cavité abdominale.
  8. Utilisez des microcisse et des microforceps pour faire une incision de 0,5 à 1 cm à travers le fascia jusqu'à ce que la cavité abdominale soit atteinte.
    REMARQUE: Pour le groupe opéré par une imposture, refermez directement les plaies. Suturer la couche musculaire et la peau séparément à l'aide d'une suture monofilament.
  9. Lorsque le tissu adipeux blanc dans la cavité abdominale peut être vu, saisir le tissu adipeux à l'aide de microforceps et le retirer doucement. Un ovaire rose en forme de mûrier enveloppé par le tissu adipeux dans la cavité abdominale peut être vu.
  10. Ligate le vaisseau proximal de 0,5 à 1 cm et la corne utérine à l'aide d'une suture monofilament. Retirez l'ovaire à l'aide de microscissors et placez le tissu restant dans la cavité abdominale.
    REMARQUE: Les principaux symptômes indésirables de l'opération OVX sont la ligature uréérale qui entraîne une mortalité élevée chez les souris opérées par OVX. Cela peut être évité en identifiant les tissus à l'aide d'une lunette séchage.
  11. Fermez les plaies. Suturer la couche musculaire et la peau séparément à l'aide d'une suture monofilament.
  12. Utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une autre incision latérale de 1 cm à la ligne médiane et de 1 cm latérale ment aux côtes costales de l'autre côté. Répétez la procédure ci-dessus (1,5 à 1,11).
  13. Laissez l'animal se réveiller de l'anesthésie. Séparer garder la souris le premier jour après la chirurgie.
  14. Nettoyez ou remplacez fréquemment la cage pendant la phase de récupération.
  15. Environ 24 h après chirurgie, administrer un autre poids corporel de 5 mg/kg du carprofène analgésique sous-cutané.

2. Administration perorale de 17 estradiol ou PPD par l'intermédiaire de la propagation de noisette

  1. Dissoudre complètement 17'-estradiol ou PPD dans l'huile de sésame, puis mélanger l'huile de sésame avec la tartinade de noisette (voir Tableau des matériaux). Une portion quotidienne pour chaque souris de 30 g contient 3 g de 17 o-estradiol ou 15 g de PPD, 4 l'huile de sésame et 60 mg de tartinade de noisettes. Préparer un placebo pour chaque souris de 30 g contient 4 L d'huile de sésame et 60 mg de tartinade de noisettes.
    REMARQUE: La partie d'administration quotidienne de 17-estradiol ou PPD était basée sur des études précédentes6,11 et des expériences préliminaires.
  2. Une semaine après OVX, nourrir les souris avec un régime riche en cholestérol (1,25% de cholestérol, 0% de cholate) pendant 12 semaines. Un schéma de traitement expérimental typique, tel qu'il est utilisé dans cette étude, est illustré dans la figure 1.
  3. 5 jours avant l'administration perorale de la propagation de noisette à la semaine 4, former les souris à manger le placebo contenant environ 30 mg de propagation de noisette pour 2-5 souris pendant 5 jours. Entraînez les souris en groupes dans leurs cages d'origine pendant les 3 premiers jours. Placez les souris dans des cages séparées les quatrième et cinquième jours de formation et servez la partie quotidienne pour ressembler à la situation expérimentale.
  4. Au cours des 9 dernières semaines, placez les souris dans des cages séparées, puis servez une portion quotidienne de la portion de tartinade de noisettes pour chaque occasion d'alimentation.
    REMARQUE: Servir une portion quotidienne contenant 17 'estradiol (0.1 mg-kg-1) ou PPD (0.5 mg-kg-1) par l'intermédiaire de la tartinade de noisette dans le groupe OVX/E2 et OVX/PPD respectivement; servir une portion quotidienne contenant la propagation de noisette sans hormone dans le groupe SHAM et OVX.

3. Détermination de l'épaisseur intima-média et du dysfonctionnement cardiaque à l'aide d'un système de microéchographie

  1. Biomicroscopie ultrasonographique
    1. Un jour avant la terminaison, examinez l'épaisseur intima-média et le dysfonctionnement cardiaque à l'aide d'un système de micro-échographie (voir Tableau des matériaux) tel que décrit précédemment21.
    2. Avant l'examen, donnez à chaque souris une injection intrapéritonéale de 200 mg/kg d'avertin (tribromoéthanol) sous anesthésie (n - 8 souris par groupe).
    3. Raser soigneusement les poils du cou de chaque souris. Appliquer le gel de transmission d'ultrason chaud généreusement pour assurer la qualité optimale d'image.
    4. Obtenez des images ultrasonographiques de base de la racine aortique et de l'aorte ascendante avec la tête de balayage de 30 MHz à une mise au point de 12,7 mm et une résolution de 40 m.
    5. Utilisez l'électrocardiographie avec une configuration lead II pour la surveillance.
    6. Capturez des images à long axe parasternal droite de l'aorte ascendante, de l'arc aortique et de la branche de l'artère brachiocéphale dans un plan en systole (figure 3).
  2. Mesures de l'épaisseur de l'intima-média et de la plaque maximale
    1. Ajuster facilement la distance entre le transducteur et le site artériel pour obtenir des images claires.
    2. Stockez une boucle de 10 s ciné numériquement pour un examen hors ligne sur un système d'analyse d'image.
    3. Choisissez manuellement une image ultrasonographique à cadre gel optimal pour d'autres mesures. Vérifiez les images dans la courbure mineure de l'aorte ascendante. Si la plaque dans l'aorte ascendante peut être vue, mesurez l'épaisseur maximale de plaque. Si la plaque dans l'aorte ascendante ne peut pas être vue, mesurez l'IMT maximal.
    4. Mesurer l'IMT (distance entre l'interface vasculaire luminal-intimal et l'interface médial-adventitial). Mesurer l'épaisseur maximale de la plaque (la distance la plus épaisse entre la bordure du lumen vasculaire et la couche adventitielle).
    5. Données moyennes provenant de trois sites de lésion (figure 3).
  3. Détermination du dysfonctionnement cardiaque utilisant l'échocardiographie
    REMARQUE :
    Examiner la fonction cardiaque par l'échocardiographie utilisant un système de microécho, comme précédemment décrit22.
    1. Dirigez un faisceau d'ultrasons vers le cœur, près des muscles papillaires.
    2. Atteindre la visualisation bidimensionnelle de kilohertz à base d'électrocardiogramme.
    3. Effectuer l'échocardiographie transthoracique in vivo du ventricule gauche à l'aide d'une tête de balayage de 30 MHz.
    4. Mesurer les paramètres associés à la fonction cardiaque numériquement à partir des tracés en mode M.
    5. Moyenne des données de trois à cinq cycles cardiaques (tableau1).
  4. Variabilité intra- et interobservateur
    1. Pour la validation de la variabilité intra-observateur, analysez les données par un opérateur à deux occasions différentes.
    2. Pour l'évaluation de la variabilité interobservateur, analyser les données par un opérateur différent.

4. Mesure hebdomadaire du poids corporel et plasma cholestérol total (TC) et détermination du triglycéride (TG)

  1. Mesure hebdomadaire du poids corporel
    1. Mesurez le poids corporel une fois par semaine de la semaine -1 à la semaine 12.
      REMARQUE : n 8 souris par groupe.
  2. Préparation au plasma
    1. Avant de prélever des échantillons de sang par perforation intracardiaque, préparez des seringues et des tubes. Utilisez EDTA comme anticoagulant. Ajouter 10 OL de 0,5 M EDTA à chaque seringue de 2 ml, et ajouter 8 'L de 0,5 M EDTA à chaque tube de 1,5 ml.
    2. À la semaine 12, après une nuit rapide, anesthésier les souris avec avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intrapéritonement).
      REMARQUE : n 3 souris par groupe.
    3. Préparer la zone de la poitrine ventrale avec 70% d'éthanol.
    4. Utilisez des ciseaux et des forceps pour ouvrir la cavité thoracique et couper les côtes jusqu'à ce que le cœur battant soit exposé.
    5. Insérer l'aiguille de 25 G dans le ventricule droit. Aspirez lentement jusqu'à ce que le sang commence à couler dans la seringue.
      REMARQUE: Nous utilisons des seringues jetables dans un état stérile avec des aiguilles de 25 G (voir Tableau des matériaux).
    6. Continuez à aspirer avec une pression constante et uniforme. Si aucun sang n'est vu, repositionner l'aiguille et répéter l'aspiration.
    7. Gardez les souris profondément anesthésiés avant de recueillir le volume sanguin requis. Normalement, jusqu'à 1 ml de sang peut être recueilli. Euthanasier les souris par luxation cervicale sous cette condition anesthésique profonde.
    8. Échantillons de sang Pipette dans des tubes de 1,5 ml et inverser le sang à fond pour assurer le mélange EDTA dans le sang. Ensuite, placez des échantillons de sang sur la glace immédiatement.
    9. Échantillons de centrifugeuse de 20 min à 400 x g à 4 oC dans les 30 min de la collecte.
    10. Recueillir le supernatant soigneusement. Aliquot et stocker des échantillons de plasma à -80 oC.
  3. Construire des courbes standard pour la mesure du contenu TC ou TG
    1. Pour la courbe standard de TC, préparez diverses concentrations de normes de cholestérol : 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2,07 mmol/L, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L et 10,34 mmol/L. Measure O.D. pour chaque norme de cholestérol. Définir l'OD moyen pour chaque norme de cholestérol. En tant que valeur verticale (Y) de l'axe, définir la concentration comme valeur horizontale (X) de l'axe. Créez une courbe standard à l'aide d'un logiciel statistique.
    2. Pour la courbe standard TG, préparez diverses concentrations de normes TG : 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L et 9,04 mmol/L. Measure O.D. pour chaque norme TG. Définir l'O.D. moyen pour chaque norme TG comme valeur verticale (Y) de l'axe ; définir la concentration en tant que valeur horizontale (X) de l'axe. Créez une courbe standard à l'aide d'un logiciel statistique.
      REMARQUE: Un raccord de courbe logistique à quatre paramètres (4 pl) a été utilisé pour la construction de la courbe standard dans la présente étude. Vérifiez la courbe standard avant de mesurer les échantillons de plasma et assurez-vous que r2 est supérieur à 0,995.
  4. Mesure du contenu de TC
    1. Étiquetez la bouteille de réactif de couleur (25 ml) du kit d'assidut de TC comme « solution de travail de TC ».
    2. Vortex les spécimens réfrigérés brièvement. Préparer les dilutions : 20 l de plasma dans 80 l d'eau distillée. Dilutions de vortex brèves.
    3. Ajouter 2,5 l de normes de cholestérol (5,17 mmol/L) ou 2,5 l de plasma dilué ou 2,5 l d'eau distillée (blanc) aux puits appropriés d'une assiette de 96 puits. La triplication est recommandée.
    4. Pour tous les puits, ajouter 250 l de la couleur réagent.
    5. Incuber à 37 oC pendant 10 min.
    6. Allumez le lecteur de microplaque et laissez un échauffement de 10 min.
    7. Retirez la plaque de l'incubateur et lisez le lecteur de microplaque à 510 nm. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles ou de poussière dans les puits de microtiter ou au fond de la plaque, respectivement.
    8. Calculez la concentration de TC comme suit :
      TC cont. - normes de cholestérol cont. (échantillon plasmatique O.D.-blank O.D)/(normes de cholestérol O.D.-blank O.D)
  5. Mesure du contenu TG
    1. Étiquetez la bouteille de réactif de couleur (25 ml) du kit d'assay TG comme « solution de travail TG ».
    2. Vortex les spécimens réfrigérés brièvement.
    3. Ajouter 2,5 L de normes TG (2,26 mmol/L) à ou 2,5 l de plasma dilué ou 2,5 l d'eau distillée (blanc) aux puits appropriés d'une plaque de 96 puits. La triplication est recommandée.
    4. Pour tous les puits, ajouter 250 l de la couleur réagent.
    5. Incuber à 37 oC pendant 10 min.
    6. Allumez le lecteur de microplaque et laissez un échauffement de 10 min.
    7. Retirez la plaque de l'incubateur et lisez le lecteur de microplaque à 510 nm.
      REMARQUE: Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles ou de poussière dans les puits de microtiter ou au fond de la plaque.
    8. Calculez la concentration TG comme suit :
      TG cont. - Normes TG cont. (échantillon plasma o.D.-blank O.D)/(TG standards O.D.-blank O.D)

5. En Face Analyse des lésions athérosclérotiques aortiques

  1. Isolement et excision d'Aorta
    1. À la semaine 12, après une nuit rapide, anesthésier les souris avec avertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intrapéritonement). Euthanasier les souris par luxation cervicale sous cette condition anesthésique profonde.
      REMARQUE: Nous avons utilisé 3 souris par groupe.
    2. Préparer la zone de la poitrine ventrale avec 70% d'éthanol. Utilisez des ciseaux et des forceps pour ouvrir la cavité thoracique et couper les côtes jusqu'à ce que le cœur battant soit exposé.
    3. Remplissez une seringue de 50 ml de phosphate tamponné salin au pH 7.4 (voir Tableau des matériaux). Insérez un 25 G d'aiguille dans le ventricule gauche et coupez l'oreillette droite pour éviter la pression élevée de la perfusion.
    4. Effectuer la perfusion in situ à un débit de 0,05-0,08 ml/min. Absorber le liquide de perfusion avec les tissus.
    5. Enlever les côtes et les poumons dans la cavité thoracique à l'aide de ciseaux et de forceps. Ensuite, ouvrez la cavité abdominale et enlevez les organes à l'intérieur pour une meilleure vue de l'aorte.
    6. Enlever l'aorte en tenant le cœur avec les microforceps et en séparant l'aorte de la colonne vertébrale dorsally avec microscissors jusqu'à la bifurcation iliaque.
      REMARQUE: Lorsque vous disséquez près des branches rénales auriculaires, coupez profondément à l'aide de microcise pour éviter les dommages causés par l'aorte.
    7. Fixer le cœur et l'aorte pendant 48 h dans 4% de paraformaldéhyde. Conserver les aortes dans la saline à température ambiante ou à 2-8 oC pendant quelques heures.
      REMARQUE: Cette procédure facilitera le nettoyage.
  2. Préparation de l'aorte
    1. Retirez le cœur. Retirez soigneusement les tissus adventitiaux des aortes à l'aide de microforceps et de microscissors sous un stéréomicroscope. Utilisez saline pour garder le tissu humide pendant le nettoyage.
      REMARQUE: Veillez à ne pas déchirer ou entailler l'aorte et certaines branches importantes, telles que l'artère innominée, l'artère carotide commune gauche, et l'artère sous-clavian gauche.
    2. Laisser 1 mm de l'innominate et laisser les artères carotides communes et couper toute l'artère sous-clavière gauche.
    3. Coupez la courbure externe par l'artère innominée, puis à l'artère carotide commune gauche, et puis à l'artère sous-clavian gauche.
    4. Couper ouvert le long de la courbure intérieure de la partie ascendante vers le bas de la partie abdominale.
    5. Épingler l'aorte à plat sur une feuille de plastique noire et appliquer la saline pour empêcher les aortas de sécher.
  3. Image de la région intimal de l'aorte
    1. Prenez des photos d'aortes en face avec un microscope stéréo. Inclure une règle d'échelle millimétrique dans les images pour calibrer les mesures.
    2. Inclure l'arc et les régions thoraciques dans la même image et la région abdominale dans une autre. Enregistrez des images comme JPEG ou TIFF.
      REMARQUE: La région de l'arc est de la jonction du myocarde à 3 mm distal de l'artère sousclavian gauche, la région thoracique est de 3 mm distal à l'artère sousclavière gauche à la dernière artère intercostale, et la région abdominale est la dernière artère intercostale à l'iliac bifurcation.
  4. Quantification de la lésion athérosclérotique-en méthode du visage
    1. Étalonnage
      1. Ouvrez l'image avec un logiciel d'analyse d'image (voir Tableau des matériaux),allez à La calibration spatiale et suivez les instructions.
      2. Changer les unités de référence en mm en positionnant la règle sur la ligne.
    2. tour
      1. Définir l'étalonnage correct pour chaque image.
      2. Mesurer 3 mm sur la règle.
      3. Mesure de région d'arche et thoracique : Décrivez la région d'arc de la jonction du myocardium à 3 millimètres distal de l'artère subclavière gauche et de la région thoracique de 3 mm distal à l'artère subclavière gauche à la dernière artère intercostale. Tracez les lésions dans l'arc et la région thoracique et regardez l'aorte à travers le microscope.
      4. Mesure de région abdominale : Décrivez la région abdominale de la fin de la région thoracique à la bifurcation iliaque. Trace zona lésions dans la région abdominale et regarder l'aorte à travers le microscope.
      5. Calculer la zone de lésion par rapport à la surface intérieure de l'aorte.
      6. Vérifier la quantification par l'intermédiaire d'un deuxième observateur aveugle aux groupes d'étude.

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Representative Results

Un schéma de traitement expérimental typique, tel qu'il est utilisé dans cette étude, est illustré dans la figure 1. Au sénage (âge 28 jours), les souris femelles d'apoE-/- C57BL/6J ont été anesthésiés aveclen (tribromoethanol ; 200 mg/kg ; intraperitoneally). Des souris ont été bilatéralement OVX ou simulacre actionné par une incision dorsal de 1 cm. Une semaine après OVX bilatéral, les souris ont été alimentées un régime à haute teneur en cholestérol (1.25% cholestérol, 0% cholate) pendant 12 semaines. L'estradiol (0,1 mg-kg-1) ou le PPD (0,5 mg-kg-1) a été administré peroralement en parallèle par tartinade de noisettes au cours des 9 dernières semaines de traitement. Toutes les souris étaient pesées chaque semaine. Comme le montre la figure 2, les effets des oestrogènes exogènes (17'estradiol et PPD) sur les lipides plasmatiques et le poids corporel hebdomadaire de l'apoE-/- les souris après l'insuffisance d'oestrogène ont été évalués. Après 12 semaines d'un régime à haut cholestérol, les souris d'OVX ont montré une augmentation remarquable des concentrations de TC et de TG de plasma. Les souris OVX administrées perorally avec 17'-estradiol ou PPD par l'intermédiaire de la propagation de noisette ont montré des concentrations sensiblement inférieures de Plasma TC que les souris simulées -opérées (figure 2A). Les niveaux de TG de plasma ont diminué chez les souris OVX administrées perorally avec 17'-estradiol mais pas avec PPD (Figure 2B). Comme le montre la figure 2C, tandis qu'une tendance à l'augmentation du poids corporel (BW) a été observée chez les souris OVX par rapport aux souris opérées par faux, BW chez les souris OVX administrées peroralement avec 17'-estradiol ou PPD par propagation de noisette après un régime de haut-cholestérol a montré une tendance opposée que chez les souris OVX. Cependant, le poids corporel final des souris dans différents groupes n'a montré aucun changement significatif.

La fonction cardio-vasculaire a été évaluée en utilisant l'échocardiographie. Comme le montre la figure 3, la plaque maximale ou IMT de l'aorte ascendante a été mesurée chez des souris OVX administrées peroralement avec 17-estradiol ou PPD par propagation de noisette. L'arc aortique de l'apoE-alimentation-alimenté de haut-cholestérol-alimenté-/- des souris ont été observés par l'échocardiographie de B-mode. Des images longitudinales représentatives de l'aorte ascendante ont été capturées par biomicroscopie ultrasonographique. Les flèches rouges indiquent les plaques. Les souris d'OVX ont exhibé la plaque maximale accrue ou IMT de l'aorte ascendante comparée aux souris simulées-opérées. Après administration perorale de 17-estradiol ou PPD par l'intermédiaire de la propagation de noisette, la plaque maximale ou IMT de l'aorte ascendante remarquablement diminuée comparée à celle des souris d'OVX. (Figure 3). Nous avons également observé le dysfonctionnement cardiaque en réponse à OVX dans apoE-/- souris après une alimentation de 12 semaines de haut-cholestérol-diète (tableau 1). La fonction cardiaque a été examinée par l'échocardiographie. Chez les souris OVX, l'administration perorale de 17'-estradiol ou PPD par l'intermédiaire de la propagation de noisette pourrait atténuer partiellement des paramètres montrant le dysfonctionnement cardiaque.

Ensuite, nous avons employé l'analyse de visage pour déterminer les lésions atherosclérotiques aortiques. Comme indiqué précédemment, après 12 semaines, un régime à haut cholestérol a mené à la formation athérosclérotique de plaque sur la surface luminal de l'aorte. Comme le montre la figure 4, le pourcentage moyen de lésion aortique par rapport à l'ensemble de la zone aortique a considérablement augmenté chez les souris OVX. Après administration perorale avec 17-estradiol ou PPD par l'intermédiaire de la propagation de noisette, la zone de lésion aortique a remarquablement diminué comparée à celle de la contrepartie de souris d'OVX. Ce résultat est compatible avec la protection de l'estradiol de 17 ans ou de la DPP contre le développement de l'athérosclérose présentée à la figure 3.

En conclusion, la procédure proposée, qui emploie l'ovariectomy bilatéral par l'intermédiaire d'une double incision dorsal-latérale dans apoE-/- souris, est applicable pour le criblage des traitements exogènes exogènes non invasifs de la dysfonction cardio-vasculaire après ménopause. Il est également particulièrement utile pour éviter la capacité tumorigénétique délétère.

Figure 1
Figure 1. Schéma de traitement de la souris. Au sœur (âge, 28 jours), les souris femelles d'apoE-/- C57BL/6J ont été anesthésiés avec avertin (tribromoethanol ; 200 mg/kg ; intraperitoneally). Des souris ont été bilatéralement ovariectomized (OVX) ou si mulcisée actionnées par une incision dorsal de 1 cm. Une semaine après OVX, les souris ont été alimentées un régime à haute teneur en cholestérol (1.25% cholestérol, 0% cholate) pendant 12 semaines. L'estradiol (0,1 mg-kg-1) ou le PPD (0,5 mg-kg-1) a été administré peroralement en parallèle par tartinade de noisettes au cours des 9 dernières semaines de traitement. Toutes les souris étaient pesées chaque semaine. À la semaine 12, l'analyse cardio-vasculaire de fonction a été évaluée utilisant l'échocardiographie. Après 12 semaines d'un régime à haut cholestérol, toutes les souris ont été euthanasiées, et des échantillons de sang et des tissus ont été moisis pour une étude plus approfondie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Effets de divers oestrogènes exogènes sur les lipides plasmatiques et le poids corporel hebdomadaire chez les souris apoE-/. Les souris de Sham ont subi une opération simulée et ont reçu un régime à haute teneur en cholestérol. Les souris d'OVX ont subi l'ovariectomy bilatéral et puis aléatoirement divisées dans les groupes suivants : le groupe d'OVX, qui a été traité avec un régime à haute teneur en cholestérol ; le groupe OVX/E2 (17 ans et plus), qui a reçu un régime riche en cholestérol pendant 12 semaines plus 0,1 mg/kg E2 par administration perorale par propagation de noisettes pendant les 9 dernières semaines de traitement; et le groupe OVX/PPD, qui a reçu un régime à haute teneur en cholestérol pendant 12 semaines plus 0,5 mg/kg PPD par l'administration perorale par l'intermédiaire de la propagation de noisette pendant les 9 dernières semaines de traitement. Les niveaux totaux de cholestérol et de triglycérides du plasma ont été mesurés par des méthodes enzymatiques (A-B). Les données sont exprimées comme le moyen de SEM de n 5 souris par groupe. Les poids corporels hebdomadaires ont été mesurés de la semaine -1 à la semaine 12 (C). Les données sont exprimées comme le moyen de SEM de n 8 souris par groupe. L'ANOVA à sens unique, suivi du test post hoc de Dunnett, a été effectué pour de multiples comparaisons. p 'lt; 0.05 par rapport au groupe de faux; # p lt; 0,05 par rapport au groupe OVX. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. IMT ou mesures maximales d'épaisseur de plaque dans apoE-/- souris. Des images de mode B montrant l'arc aortique de l'apoE-/- souris sont présentées. Les images longitudinales de l'aorte ascendante ont été obtenues par biomicroscopie ultrasonographique. La plaque maximale ou IMT de l'aorte ascendante (mm) a été mesurée. Les images ultrasonographiques montrent la plaque dans la courbure mineure de l'aorte ascendante ; les flèches rouges indiquent les plaques. Les données sont exprimées comme la moyenne de 8 souris par groupe. L'ANOVA à sens unique, suivi du test post hoc de Dunnett, a été effectué pour de multiples comparaisons. p 'lt; 0.05 par rapport au groupe de faux; # p lt; 0,05 par rapport au groupe OVX. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. En analyse de visage des lésions aortiques atherosclérotiques dans apoE-/- souris. Le pourcentage moyen de la zone de lésion aortique par rapport à l'ensemble de la zone aortique a été quantifié dans tous les groupes. Des micrographies représentatives des lésions intimal (en face) de l'aorte sont montrées. Les données sont exprimées comme la moyenne de 3 souris par groupe. L'ANOVA à sens unique, suivi du test post hoc de Dunnett, a été effectué pour de multiples comparaisons. p 'lt; 0.05 par rapport au groupe de faux; # P et lt; 0,05 par rapport au groupe OVX. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

simulacre OVX (EN) OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (mm) 3,72 à 0,10 3,74 à 0. 24 3,68 à 0,16 3,88 à 0,16
LVIDs (mm) 2,34 à 0,11 2,16 à 0,22 2,12 à 0,13 2,55 à 0,12euros
IVSD (mm) 0,83 à 0,09 0,84 à 0,07 0,91 à 0,05 0,74 à 0,06
IVS (mm) 1,24 à 0,02 1,35 à 0,06 1,45 à 0,04 1,09 à 0,04
PWTd (mm) 0,7 à 0,10 0,68 à 0,04 0,72 à 0,07 0,58 à 0,07euros
PWTs (mm) 1,10 à 0,12 1,17 à 0,08 1,24 à 0,04 0,98 à 0,08euros
EDV (mm3) 58,89 à 3,74 59,88 à 9,02 57,39 à 5,79 65,11 à 6,13
ESV (mm3) 18,86 à 2,17 15,75 à 4,00 14,85 à 2,37 23.45 à 2.64euros
EF (%) 67,84 à 1,52 73,91 euros 3 ,63 74,23 à 1,50 63,91 à 3,61euros
FS (%) 37,19 à 1,53 42,22 à 1,17 42,36 à 1,21 34,28 à 2,69euros
LVIDd - Diamètre interne LV pendant le diastole; LVIDs - Diamètre interne LV pendant le systole; IVSD - septum ventriculaire interne pendant le diastole; IVSs - septum ventriculaire interne pendant le systole; PWTd - épaisseur de la paroi postérieure pendant le diastole; PWTs - épaisseur postérieure de mur pendant systole ; EF - fraction d'éjection; FS et raccourcissement fractionnaire; EDV - volume fin-diastolique; ESV - volume fin-systolique.

Tableau 1 : Évaluation de la fonction cardiaque à l'aide de l'échocardiographie. Les paramètres associés à la fonction cardiaque numériquement à partir des tracés en mode M ont été quantifiés dans tous les groupes. Les données sont exprimées comme la moyenne de 8 souris par groupe. L'ANOVA à sens unique, suivi du test post hoc de Dunnett, a été effectué pour de multiples comparaisons. p 'lt; 0.05 par rapport au groupe de faux; # p lt; 0,05 par rapport au groupe OVX.

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Discussion

La méthodologie décrite ici est un modèle de souris ressemblant à la perturbation de lipide et à l'athérosclérose vu dans les femmes ménopausées. Il est bien documenté que l'insuffisance d'oestrogène dans les femmes postmenopausal peut aggraver l'incidence de l'hypercholestérolémie préexistante ou continue avec les lésions atherosclérostic progressivement complexes et répandues1. Pour imiter le statut athérosclérose-enclin dans la clinique, les souris apoE-déficientes, une source reproductible et commode des animaux avec lesquelles étudier l'athérogénèse23,24,25, ont été appliquées. Comme le montre la présente étude, les femelles OVX apoE-/- les souris au serrage ont montré une augmentation des lésions athérosclérotiques dans l'aorte comparée à l'apoE femelle-/- souris avec la fonction ovarienne intacte. Dans ce modèle animal, nous avons également comparé l'effet de diverses thérapies exogènes de remplacement d'oestrogène sur la taille atherosclérotique de lésion sous une condition diététique commandée.

L'incision dorsal-latérale double de l'ovariectomy bilatéral présenté dans cet article est techniquement plus facile, moins longue, et plus sûre comparée à l'incision dorsal-latérale moyenne ou à l'incision abdominale moyenne de l'ovariectomy bilatéral dans l'apoE-/- souris. L'ovaricectomie bilatérale par l'incision abdominale moyenne présente un inconvénient majeur : elle peut causer l'adhérence abdominale grave de cavité, qui, à son tour, peut affecter l'absorption de drogue. Des rapports récents montrent que l'administration perorale de faible dose de 17'-estradiol protège contre l'ischémie cérébrale26. Ainsi, nous avons choisi l'administration perorale par l'écart de noisette dans la présente étude. Les granulés commerciaux à libération lente sont un mode d'administration fréquemment utilisé pour tester les effets pharmacologiques dans un modèle de souris, mais peuvent causer des dommages cérébraux préjudiciables27. Les implants sont sujets aux infections, surtout si les souris sont soumises à ovX bilatéral par une double incision dorsal-latérale. Bien qu'une désinfection soigneuse de la peau avant l'incision soit effectuée, l'infection est difficile à éviter. L'administration de l'eau et le gavage oral sont deux méthodes moins fréquemment utilisées qui ont été testées. L'administration de l'hormone par l'intermédiaire de l'eau potable est très bénéfique en raison de son être extrêmement non invasif parce que presque aucune manipulation animale n'est nécessaire. Cependant, l'estradiol de 17 ans et plus n'est pas soluble dans l'eau sans émulsifiant. Ainsi, nous avons utilisé DMSO à une concentration inférieure à 0,5% pour faciliter sa solution dans l'eau potable. Cependant, cette approche pour l'administration à long terme du DMSO à faible dose est difficile à contrôler et toxique pour les souris ou les humains. Les souris peuvent également boire de l'eau pendant les 24 h de surveillance, ce qui rend la consommation réelle de drogues difficile à déterminer. Un autre inconvénient de cette approche est que la consommation d'eau de l'individu est difficile à contrôler. Le plus grand inconvénient du gavage oral est qu'il est stressant pour les animaux et peut causer des blessures oesophagiennes et affecter le comportement alimentaire. Dans la méthodologie décrite ici, une formation de 5 jours de manger la propagation de noisette sans hormone avant l'expérience a été menée. Environ plus de 95 % des souris accepteront la propagation des noisettes si elles sont formées comme mentionné dans la section du protocole. Une fois pleinement habitués, la plupart des souris le consommeront en quelques secondes. Conformément à une étude précédente6,11, les niveaux plasma tiques E2 diminué chez les souris OVX par rapport à la contrepartie opérée par faux à la semaine 4 (données non montrées). À la semaine 12 après détermination, nous avons observé l'atrophie d'utérus dans les souris OVX-opérées. Cependant, les niveaux circulants d'oestrogène n'ont pas été surveillés après OVX dans la présente étude.

En l'absence de la détection des lésions athérosclérotiques dans l'aorte ascendante, l'IMT aortique peut être évaluée en mesurant la distance entre l'interface lumen-intimal et l'interface médial-aventitiale. Cette mesure est basée sur un protocole précédemment validé chez l'homme28. Données moyennes provenant de trois sites distants d'environ 100 m. La charge de travail cardiaque augmente après OVX dans apoE-/- les souris peuvent être dues à la croissance hypertrophique compensatoire des cardiomyocytes individuels qui peuvent par la suite mener à augmenter la sortie cardiaque (tableau 1). Considérant que, sur l'administration perorale de PPD pendant 9 semaines, l'hypertrophie cardiaque compensatoire a été atténuée avec un EF% comparable à l'homologue de faux. Pour la validation de la variabilité intra- ou inter-observateurs, analyser les coefficients de variation pour les mesures d'épaisseur athérosclérotiques et les paramètres associés à la fonction cardiaque par un opérateur à deux occasions différentes ou par un opérateur différent.

Comme présenté dans notre étude, les souris d'OVX perorally administrées avec le 17-estradiol ou PPD par l'intermédiaire de la propagation de noisette ont eu tendance à empêcher le gain de poids corporel et à réduire la perturbation de lipide oestrogène-associée à l'insuffisance, bien qu'aucune différence significative dans le poids corporel final n'ait été Observé. Des études antérieures ont également montré que la variation des paramètres lipidiques peut être trop mineure pour expliquer les effets antiatherosclérotiques des hormones29. Les effets bénéfiques de l'œstrogène ne se limitent pas aux changements dans les propriétés des protéines lipidiques. Certains effets non lipidiques de l'œstrogène30,31, tels que l'inflammation, dysfonctionnement endothélial, et la stase hémodynamique, peut faciliter la protection cardiovasculaire dans les maladies humaines. Considérant les résultats observés dans la présente étude, la protection de l'oestrogène exogène contre le développement d'athérosclérose est partiellement indépendante des niveaux systémiques de lipide. Dans les cellules endothéliales, PPD a inhibé des expressions de molécule d'adhérence et des médiateurs inflammatoires (données non montrées). En outre, PPD pourrait supprimer la formation d'adipose périvasculaire qui est étroitement corrélée avec l'anti-contractilité endothéliale. Ainsi, l'action de ppD et de 17-estradiol était différente et le mécanisme sous-jacent doit être exploré plus avant. Il ne fait aucun doute que la consommation excessive d'aliments riches en énergie, comme la tartinade aux noisettes, pourrait entraîner un gain de poids. Cependant, les petites quantités de tartinade de noisettes (200 mg-kg-1-jour-1) mentionnées dans la présente étude ne pourraient être responsables que de moins de 5 % de l'apport énergétique quotidien des animaux. En outre, aucun gain de poids évident n'a été détecté en utilisant cette quantité de tartinade de noisette. L'utilisation de 17-estradiol et PPD était principalement pour le traitement des maladies cardio-vasculaires. Parce que, pendant la progression de l'athérosclérose chez les aopE opérés par OVX-/- les souris, de la semaine 4 à la semaine 12, 17-estradiol ou PPD a été administré perorally.

Un point non négligeable de l'utilisation clinique de HRT est ses effets secondaires néfastes, qui incluent les cancers de l'ovaire et du sein13,14. Le phytoestrogène testé dans la présente étude est un composé de saponine stéroïde trouvé dans les plantes Dedioscorea. PPD a été rapporté pour avoir un effet inhibiteur sur quelques lignes de cellules cancéreuses20. En outre, PPD montre des propriétés antiatherosclérotiques comparables à celles de 17-estradiol. Le modèle que nous présentons ici peut aider à examiner les composés candidats potentiels, y compris le phytoestrogène, qui exerce un effet minimal sur la prolifération tumorale.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81202526 à J.X.), la National Natural Science Foundation of China (81302769 à B.S.), la Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 à B.S.), le Science Foundation (20110490325 à J.X.), et la Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China (20121106120031 à B.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

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