En mus modell av vascularized Heterotopic milt transplantasjon for å studere milt Cell Biology og Transplant immunitet

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen detaljer kirurgiske trinn av en mus modell av vascularized heterotopic milt transplantasjon, en teknisk utfordrende modell som kan tjene som et kraftig verktøy i å studere skjebnen og lang levetid på milt celler, mekanismene av distinkte milt celle populasjoner i sykdomsprogresjon, og transplantasjon immunitet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, J. J., Qiu, L., Fernandez, R., Yeap, X. Y., Lin, C. X., Zhang, Z. J. A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity. J. Vis. Exp. (148), e59616, doi:10.3791/59616 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Milten er en unik lymfoide organ som spiller en avgjørende rolle i homeostase av immun-og blodkreft systemer. Pasienter som har gjennomgått splenektomi uavhengig av fremskynde årsaker er tilbøyelige til å utvikle en overveldende post-splenektomi infeksjon og oppleve økt risiko for dyp venetrombose og ondartet. Nylig Epidemiologiske studier indikerte at splenektomi kan være forbundet med forekomsten av hjerte-og karsykdommer, noe som tyder på at fysiologiske funksjoner av milten ennå ikke er fullstendig anerkjent. Her introduserer vi en mus modell av vascularized heterotopic milt transplantasjon, som ikke bare kan utnyttes til å studere funksjonen og atferdsdata aktivitet av milt immun celle undergrupper i ulike biologiske prosesser, men også kan være et kraftig verktøy for å teste terapeutisk potensialet av milt transplantasjon i visse sykdommer. De viktigste kirurgiske trinnene i denne modellen inkluderer donor milt innhøsting, fjerning av mottakeren innfødte milt, og milt pode revaskularisering. Ved hjelp av congenic mus stammer (f. eks, mus med CD 45.1/CD 45.2 bakgrunner), observerte vi at etter syngeneic transplantasjon, både donor-avledet milt lymfocytter og myelogen celler migrert ut av pode så tidlig som postoperativ dag 1, samtidig med tilstrømningen av flere typer mottaker celler, og dermed generere en unik Chimera.  Til tross for relativt utfordrende teknikker, kan denne fremgangsmåten utføres med > 90% suksess rate. Denne modellen gjør det mulig å spore skjebnen, lang levetid, og funksjon av splenocytes under steady state og i en sykdom innstilling etter en milt transplantasjon, og dermed tilbyr en flott mulighet til å oppdage den distinkte rolle for milt-avledet immunceller i ulike sykdoms prosesser.

Introduction

Milten er den største sekundære lymfoide organ i kroppen og er kritisk i immun-og blodkreft systemer. Dens funksjoner er hovedsakelig utført av to morfologisk distinkte rom, den røde massen og den hvite Pulp1. Den røde massen er en tredimensjonal meshwork av venøs bihulene og milt snorer som består av retikulære fibre, retikulære celler, og tilhørende makrofager. Denne unike strukturen gjør at den røde massen til å fungere som en effektiv blod filter som fjerner fremmede materialer og gamle eller ødelagte erytrocytter. Den hvite massen inneholder hårsekker, marginal sone, og periarteriolar lymfoide hylser (PALS) og er et viktig sted for antigen fangst og prosessering, lymfocytter homing, transformasjon, spredning, og modning2. Likevel, milten har ofte blitt betraktet som en unnværlig organ fordi andre lymfatisk organer, som lymfeknuter, kan også utføre noen av sine funksjoner og tap av milt ikke fører vanligvis til døden. Splenektomi har derfor vært mye utført som en terapeutisk metode for pasienter med milt Kader eller godartet Hematologic sykdommer3. Men pasienter med splenektomi står overfor en rekke langsiktige komplikasjoner. Bakterielle infeksjoner er de mest anerkjente komplikasjoner av splenektomi. Nylig har den overveldende post-splenektomi sepsis blitt anerkjent som en intensiv komplikasjon av splenektomi forbundet med en høy dødelighet6. Videre viser de siste epidemiologiske studiene at splenektomi kan knyttes til forekomsten av hjerte-og karsykdommer, noe som tyder på at ytterligere fysiologiske funksjoner i milten gjenstår å utforskes7,8.

Både milt autotransplantation og milt allografting har blitt utnyttet i klinikken. For tiden, milt autotransplantation av implanting deler av milt vev i poser opprettet i større segl regnes som den eneste muligheten for å bevare milt funksjon etter traumatisk splenektomi9,10. Imidlertid er effekten av denne operasjonen diskuteres som post-kirurgi komplikasjoner som aseptisk nekrose av milt vev og små tarm obstruksjon på grunn av postoperativ adhesjon kan forekomme11. Milt allografting er involvert i multivisceral transplantasjon12. Kliniske bevis fra multivisceral transplantasjon tyder på at milten allografting kan spille en beskyttende rolle i små tarm allograft avvisning uten å forårsake pode-versus-host sykdom (GVHD)12. Likevel litteratur om den gunstige effekten av milt allografting som en del av multivisceral transplantasjon er fortsatt begrenset, og de underliggende mekanismene gjenstår å bli definert. I 2006 rapporterte Yair Reisner et al. at transplantere gris embryonale milt vev som ikke har T-celler til mus kunne kurere hemofili A, en genetisk sykdom uten å forårsake GVHD13, som støtter at milt transplantasjon holder terapeutisk løfte i visse sykdommer. Derfor er det behov for videre undersøkelser om det terapeutiske potensialet for milt transplantasjon.

Animal modeller av milt transplantasjon er verdifulle for å utforske verdsatt funksjon av milt-avledet immunceller i sykdomsprogresjon, samt å teste den potensielle terapeutiske effekten av milt transplantasjon. Det er dokumentert at de har blitt sett på som en av de eksperimentelle hel miltenmodellene siden tidlig på 1900-tallet. I 1969, Coburn Richard J. og Lee et al. detaljert teknikken for milt transplantasjon hos rotter15,16. Flere nylig, Swirski FK et al. beskrev en mus modell av milt transplantasjon17. Sammenlignet med rotte modeller, mus modeller av milt transplantasjon er mer attraktive på grunn av sine mange iboende fordeler. Ved å bruke en musemodell, kan vi for eksempel få tilgang til et omfattende utvalg av reagenser som ikke er tilgjengelige for rotte modellene. Videre, ved å bruke congenic mus (f. eks, mus med CD 45.1/CD 45.2 bakgrunn), en syngeneic milt transplantasjon gjør det mulig å spore skjebnen, lang levetid, og funksjon av splenocytes18. Basert på arbeidet med Swirski FK et al.17, vi videre etablert denne forenklet og forbedret protokoll for milt transplantasjon i mus. Protokollen beskrevet nedenfor kombinerer både pålitelighet og gjennomførbarhet på en standardisert måte og kan benyttes som et verktøy for å studere milt biologi og transplantasjon immunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer og dyr bruk i denne studien ble utført i henhold til protokoller godkjent av Northwestern University intern Animal Care og use Committee (IACUC). I denne studien, 8 til 10 uker gamle mannlige CD 45.2 og CD 45.1 mus (både på BALB/c bakgrunn, fra Jackson laboratorium) ble brukt som milt donorer og mottakere, henholdsvis å lage syngeneic milt transplantasjon modeller. Alle dyrene ble plassert i det sterile miljøet i dyret fasiliteter ved Northwestern University. Øye smøremiddelet ble påført alle mus etter bedøvelsen for å hindre tørrhet.

1. kirurgisk forberedelse, bedøvelsen og analgesi regime

  1. Plasser en steril en gangs gardin (45,7 cm x 66 cm) på den kirurgiske plattformen. Grip forsiktig med musen, Injiser ketamin (50 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) intraperitonealt (i. p) for anestesi, og Injiser 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant for analgesi.
  2. Sikre dybden av anestesi ved tå-klype, barbere håret i hele magen området med en barberhøvel og plassere musen på steril kirurgisk plattform under drift mikroskop ved 6-10x forstørrelse.

2. donor milt Harvest

  1. Sterilisere magen med en alkohol prep pad, sikre lemmer med kirurgisk tape, og lage en 3-4 cm midtlinjen vertikal hud snitt fra pubis til xiphoid prosessen med saks.
  2. Trekk tilbake bukveggen med steril sårhaker laget av binders. Flytt tarmen til høyre flanke av magen (kirurg venstre) side med en steril bomullspinne for å avdekke milten. Cauterize den korte mage vene festet til milten med en steril lav temperatur cauterization (figur 1a). Plasser et sterilt gasbind fuktet med 37 ° c saltvann over milten for å holde den fuktig (figur 1B).
  3. Skill og mobilisere portalen blodåre fra bukspyttkjertelen vev (figur 1C) ved ligating portalen vene grener (overlegen pancreaticoduodenal vene og høyre mage vene); plassere en Sutur rundt portalen vene fra milt vene (figur 1d).
  4. Vend milten til høyre side for å avdekke aorta og cøliaki stammen med milt arterien (figur 1e). Analysere og mobilisere aorta-cøliaki-milt arterie ved ligating hepatic arterien og mage arterien; Plasser en Sutur rundt aorta proksimale til cøliaki (fig. 1F-G).
  5. Injiser 100 internasjonale enheter (IU) heparin inn i dårligere vena cava (IVC) for å heparinize hele kroppen og vente 3 min for å sikre at heparin tar effekter. Ombinde aorta proksimale til cøliaki arterien, kontinuerlig portalen vene, og deretter perfuse hele kroppen ved hjelp av 10 mL heparinisert kulde (4 ° c) saltvann (10 mL/20 s) fra abdominal aorta i retning av cøliaki (figur 1h).
  6. Samle milten pode en Bloc med tilhørende aorta-cøliaki-milt segmentet og portalen vene sammen med et segment av milt vene og en liten del av bukspyttkjertelen vev. Bevar pode i 5 mL 4 ° c saltvann før transplantasjon. Euthanize musen ved cervical forvridning.

3. mottaker Splenektomi og milt pode implantation

  1. Plasser en varmepute på den kirurgiske plattformen og Juster temperaturen til 37 ° c. Plasser en steril gardin (45,7 cm x 66 cm) oppå varmeputen for å skape en steril kirurgisk plattform. Gjenta trinn 2,1 og 2,2 for kirurgiske forberedelser og bedøvelsen. Lag en 3-4 cm midtlinjen snitt og trekke inn bukveggen som beskrevet i trinn 2,1 og trinn 2,2.
  2. Forsiktig flytte tarmen til høyre side av musen med en steril bomullsdott å utsette mottakerens milt. Ombinde milt vene og arterien og fjern milten.
  3. Forsiktig flytte tarmen til venstre side av musen og dekke tarmen med vått gasbind (dynket med sterilt 37 ° c saltvann). Analysere og ombinde korsryggen grener av kranieankrene aorta og IVC; kryss-klemme kranieankrene aorta og IVC ved hjelp av to 4 mm mikrovaskulær klemmer.
  4. Plasser en 11-0 nylon Sutur gjennom kranieankrene aorta (en full tykkelse) og trekk tilbake for å lage en elliptisk aortotomy med en enkelt kutt med microscissors (lengden skal samsvare med diameteren av donor aorta, figur 2a). Pierce IVC ved hjelp av en 30 G nål for å lage en elliptisk venotomy og forlenge åpningen til donor Portal vene-matchet lengde med microscissors (figur 2a).
  5. Tøm intraluminal blod eller blodpropp (i aorta og IVC) med 500 μL av heparinisert saltvann (10 enheter/mL).
  6. Plasser milten pode i høyre flanke av mottakeren musen magen; nøye identifisere donor ' s aorta cuff og donor Portal vene. Etter å sørge for at fartøyene ikke er vridd, dekke milten pode med gasbind fuktet med kaldt (4 ° c) saltvann.
  7. Koble donor-mansjetten til proksimale og den foran aortaotomy med to bo sting (11-0 nylon Sutur, samme som nedenfor) (figur 2b, C). Lag en anastomose med 2-3 biter av kontinuerlig 11-0 nylon sting mellom donor ' s aorta cuff og mottakerens aortaotomy (fremre vegg) (figur 2D). Snu milt pode over til venstre side av mottakeren; gjøre anastomose mellom donor ' s aorta cuff og mottakerens aortotomy (bakre vegg) (figur 2e).
  8. Utfør en anastomose å koble donor Portal vene til bakre vegg av mottakerens IVC, ved hjelp av 4 til 5 biter av kontinuerlig sting på innsiden av IVC og deretter lukke Sutur på utsiden av IVC (figur 2F, G).
  9. Løsne fartøyets klemmer og bruk en steril bomullspinne til tamponade blødning til milten har blitt gjenopprettet (fig. 2h).
  10. Lukk magen med en 5-0 syntetisk absorberbare vicryl Sutur i et kontinuerlig mønster. Lukk hud laget med en 5-0 nylon Sutur i et avbrutt mønster.
    Merk: For trinn 4.7-4.8, alternativt, foreta en anastomose mellom donor Portal vene og mottakerens IVC først (trinn 4,8); deretter lage en anastomose mellom donor ' s aorta cuff og bakre veggen av mottakerens aortotomy, ved hjelp av 2 til 3 kontinuerlige sting på innsiden av aorta og lukke Sutur på utsiden av aorta.

4. Animal Recovery

  1. Injiser 1 mL varm saltvann subkutant via 4 separate lokasjoner (0,25 mL/sted) etter at magen er lukket.
  2. Hold musen i en temperaturstyrt inkubator (30 ° c) for de første timene etter operasjonen, Overvåk musen til den har fått tilbake tilstrekkelig bevissthet, og deretter overføre musen til et nytt rent bur med vanlig mat og vann, med en varmepute (30 ° c ) under buret. Hold musen post-kirurgi i et eget bur.

5. post-kirurgisk smertebehandling

  1. Injiser 0,05 mg/kg buprenorfin subkutant 24 h og 48 h etter operasjonen for å opprettholde analgesi regime.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hele prosedyren for mus milt transplantasjon kan gjennomføres innen 90 min av erfarne microsurgeons. Vårt laboratorium har utført over 100 milt transplantasjon hos mus. Suksessen rate er over 90%, som definert av overlevelse av både mottaker mus og milt pode til post-operative dag (POD) 1 eller POD 7 (vår studie endepunkt). Overlevelsen av milten pode ble bekreftet av makroskopisk utseende og flyt flowcytometri analyse av splenocytes. Basert på vår erfaring, er flyt flowcytometri analyse (LIVE/DEAD Cell levedyktighet analyser) svært følsom for å avgjøre om en milt pode er overlevd, som flertallet av milten celler ville være død hvis milten nekrotisk. De tekniske utfordringene i denne prosedyren, vanlige komplikasjoner, og deres feilsøking er oppsummert i tabell 1.

For å teste pode morfologi etter transplantasjon, Haemotoxylin og Eosin (H & E) farging ble utført i milten isografts av BALB/c mus ved POD 1 og POD 7. De representative bildene er vist i Figur 3. Arkitekturen i milten isografts forble intakt i løpet av den første postoperativ uke. Den røde massen, hvit masse, og den marginale sonen var fortsatt klar og gjenkjennelig. For å undersøke celle migrasjon etter milt transplantasjon, ble Flow flowcytometri utført ved POD 1 og POD 7 for å undersøke fenotyper av leukocytter i milten isografts, lymfeknuter, blod, og benmarg. Som vist i figur 4a, ved Pod 1, 51 ± 7% (gjennomsnittlig ± SD, samme som nedenfor) av milten celler var donor-avledet og 46 ± 3% ble mottaker-avledet. I POD 7 utgjorde donor-avledede leukocytter 32 ± 10% av totalt milt celler, og mottaker-avledede celler var opp til 56 ± 13%. Vi observerte også at milt leukocytter migrert inn i lymfeknuter, blod, og benmarg så tidlig på dag 1 og opprettholdt på dag 7 (figur 4b), genererer en unik Chimera verdifullt for splenocyte menneskehandel forskning.

Tabell 1: Metoder for feilsøking.

Figure 1
Figur 1: donor milt innhøsting. (A) cauterize den korte mage vene festet til milten. (B) Plasser et lite stykke sterilt varmt vått gasbind over milten å holde den fuktig. (C) analysere og isolere portalen venen bak bukspyttkjertelen. (D) ombinde side grener av portalen vene og plassere en Sutur rundt portalen venen som er i ferd med å milt vene. De stiplede linjene representerer plasseringen transecting senere for anastomose med mottakeren IVC. (E) Vend milten over til høyre side av magen (kirurg venstre) for å avdekke aorta og cøliaki stammen med sine grener inkludert milt arterien. (F) analysere og mobilisere aorta-cøliaki-milt arterie ved ligating de to andre grener. (G) Plasser en Sutur rundt aorta proksimale til cøliaki. De stiplede linjene representerer plasseringen transecting som senere brukes for anastomose med mottaker abdominal aorta. (H) etter ligating av aorta og transecting portalen vene, perfuse milt pode med 10 ml heparinisert saltvann gjennom aorta. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: milt pode implantation. (A) etter isolasjon og krysser klemme AORTA og IVC, lage en langsgående aortotomy og venotomy i AORTA og IVC, henholdsvis. (B-D) Plasser milt pode på høyre side av magen (kirurg venstre side). Lag ende-til-side anastomose mellom donor aorta cuff og fremre veggen av mottakerens aortotomy, ved hjelp av 2-3 biter av fortsetter Sutur. (E) snu milten pode over til venstre flanke av mottakeren; Gjenta den forrige prosedyren mellom donor aorta cuff og bakre vegg av mottakerens aortotomy og lukke Sutur på utsiden av aorta. (F-G) Lag en ende-til-side anastomose mellom donor portalen venen og bakre vegg av mottakerens IVC, ved hjelp av 4 til 5 biter av kontinuerlig 11-0 nylon Sutur i innsiden av IVC og Lukk Sutur på utsiden av IVC. (H) etter endt anastomose, slipp fartøyet klemmer og plassere noen bomulls knopper for å stoppe blødningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative histologi av milt isografts på dag 1 og dag 7 etter operasjonen. Syngeneic milt Sygehus ble utført ved hjelp av BALB/c mus. Milt isografts ble høstet på dag 1 og dag 7 post-transplantasjon og fast i 10% formalin for 48 h. H & E flekker ble utført ved hjelp av parafin-embedded vev delen. Den representative histologi viser at milten isografts forblir intakt på 1 uke etter transplantasjon. Scale bar = 250 μm. POD, postoperativ dag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Chimera skapt av syngeneic milt transplantasjon. Tre syngeneic milt Sygehus ble utført ved hjelp BALB/c CD 45.2 mus som donorer og BALB/c CD 45.1 mus som mottakere. Den milt, blod, lymfe node (LN), og benmarg (BM) i mottakerens mus ble høstet på dag 1 og dag 7 etter transplantasjon. Enkelt celle isolasjon og flyt flowcytometri analyse ble utført for å analysere fenotype av cellene. (A) representative prikk tomter (gating fra live singleter) viser prosenter av donor eller mottaker-avledet leukocytter i de indikerte prøvene. (B) prosenter (gjennomsnittlig ± SEM) av de indikerte populasjoner i donor-avledede celler i de indikerte prøvene på dag 1 og dag 7. POD = postoperativ dag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: representant tomter (n = 3) viser prosenter av donor-avledet versus mottaker-avledet lymfocytter i den transplanterte milten, lymfeknuter, blod, og benmarg. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: representative tomter (n = 3) viser prosenter av donor-avledet versus mottaker-avledet CD11b + Ly6C + monocytter i den transplanterte milten, lymfeknuter, blod og benmarg. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Overbevisende bevis tyder på at milt-avledet monocytter spiller en viktig rolle i sterile inflammatoriske prosesser som aterosklerose19, akutt iskemiske hjerne20 eller lungeskade18, samt hjerte-i/R skade og remodeling21,22,23. Disse rapportene markere under-anerkjennelse rolle milten i mange kroniske sykdommer, hvorav hjerte-og karsykdommer er en viktig en (spesielt gitt det er nummer én killer globalt). Musen modell av milt transplantasjon gir en flott mulighet til å oppdage rollen som milt-avledet immunceller i ulike sykdommer, samt hvordan de er primet i milten. For eksempel, ved hjelp av musen modeller av milt transplantasjon, Swirski et al. fant at som svar på iskemisk hjerteinfarkt skade, milt-avledet monocytter øke motilitet, migrere ut av milten, følge skadet vev, og bidra til såret helbredelse17. Videre er denne modellen nyttig å ta opp longevities av modne immunceller i milten og underliggende mekanismer og å utforske terapeutiske potensialer for milt transplantasjon.

Flere aspekter bør tas i betraktning for å forbedre suksessen til denne protokollen. Først er det avgjørende å velge riktig forsøksdyr i løpet av designprosessen siden musen vekt, belastning, og helsetilstand kan påvirke vanskeligheten av de kirurgiske trinnene og eksperimentelle resultater. Vårt laboratorium anbefaler å bruke 8 til 12-ukers gamle mus med over 25 g vekt å redusere dødelighet som kan være forårsaket av blødning. For det andre, under milten innhøstingen, kan for mye manipulering av milten fartøy lett føre til avl eller vasospasme og potensielt føre til mikro trombose i milten pode. Bli kjent med anatomi av musen magen før operasjonen vil være nyttig å akselerere læringsprosessen. For det tredje, under mottakeren kirurgi, bør milt pode alltid opprettholdes fuktig og kjølig. Riktig beskyttelse av milt av milten kan redusere transplantasjon iskemi/reperfusion (I/R) skade og hindre pode svikt etter transplantasjon. I tillegg, med tanke på at donor fartøyene for anastomose er forholdsvis lange, er det viktig å posisjonere milten før anastomose er avgjørende for å hindre vridning av fartøyene. Videre bør diameteren på mottakeren aortotomy og venotomy av IVC alltid sammenlignes med de av donor aorta og Portal vene for å sikre riktig blodstrøm og forebygge trombose.

Den gjennomsnittlige lagringstiden for en mengde milt i 4 ° c saltvann er rundt 10 min. Den totale iskemiske tiden bør begrenses til mindre enn 50 min for å sikre minimum transplantasjon svikt. Vi anbefaler å bruke University of Wisconsin (UW) kald lagring løsning for å bevare milten pode, hvis over 1 h kaldt, iskemiske tid er nødvendig i studier. Det bør bemerkes at en liten del av bukspyttkjertelen nært feste med milten, og forsøke å fjerne det hele fra milten, ville det lett føre til pode eller vaskulær komplikasjoner og markant øke operasjonstiden. Vi observerte at bukspyttkjertelen vevet festet til milten pode ville gjennomgå atrofi på POD 7 om noen forble levedyktig med milten hud. Om ikke å fjerne bukspyttkjertel vevet festet med milt hud er avhengig av forskningsformål.

Tilgjengeligheten av congenic mus har gjort det mulig å spore opprinnelsen til milten celler, donor versus mottaker etter transplantasjon. I denne studien brukte vi BALB/c CD 45.2 og BALB/c CD 45.1 congenic mus som milt givere og mottakere for å lage en syngeneic milt transplantasjon modell. Orgel eller vev transplantasjon mellom disse congenic mus stammer har vært mye brukt til å spore opprinnelse og utvikling av immunforsvaret. Til tross for den nylige rapporten om et punkt mutasjon forbundet med CD-45.1 som påvirker NK celle respons24, ble ingen transplantasjon avvisning rapportert mellom disse belastnings kombinasjonene. Vi observerte en betydelig tilstrømning av mottaker celler i milt, som forekom så snart som POD 1. Det er sannsynlig at mottaker celler reagerte på transplantasjon I/R skade som flertallet av mottakeren cellene var granulocytter. Våre resultater viste at en relativt høy andel av milt lymfocytter forble av donor opprinnelse. Mer interessant, disse lymfocytter migrert til (repopulated) i andre lymfoide rom (lymfeknuter, benmarg, og sirkulasjon). Disse funnene ber oss om å spekulere i at lymfocytter som stammer fra spleens er svært viktig i adaptive immunitet. Men, flere undersøkelser er nødvendig for å avgrense de forskjellige rollene til milt lymfocytter i adaptive versus medfødt immunitet (Figur 4, supplerende figur 1 og supplerende figur 2).

Den store begrensningen av denne protokollen er at det krever omfattende mikrokirurgisk opplæring for personer med begrenset mikrokirurgisk erfaring til å mestre denne teknikken. Basert på vår erfaring i generelle mus solid organ transplantasjon modeller (f. eks mus hjerte, lunge eller nyre transplantasjon), kan det ta 6-10 måneder for en nylig utdannet person (uten eksperimentell mikrokirurgisk teknikk) for å dyktig mestre dette Teknikk. Sammenlignet med musen modeller av hjertet, eller nyre transplantasjon, kan denne modellen være mer utfordrende siden det innebærer ekstra vev disseksjon skritt for å isolere milten pode under donor prosedyrer. Videre er diameteren av donor portalen vene (rundt 0,6 mm) mindre enn IVC, noe som gjør det vanskeligere for anastomose. En annen begrensning er at det ikke er klart om podet milt ville bli massivt invadert av mottakerens celler ved senere transplantasjon fase (f. eks POD 60). Imidlertid er denne modellen også svært attraktivt for sine flere iboende fordeler. For det første, mus og mennesker deler et betydelig spekter av lignende genomer, og dermed gir en relativt nøyaktig representasjon av en realistisk anvendelse. Videre, sammenlignet med musen modell av ikke-vascularized milt autotransplantation bruker deler av milt vev, denne vascularized milt transplantasjon modellen er mindre sannsynlighet for å utvikle komplikasjoner som aseptisk nekrose av milt vev og liten tarm obstruksjon på grunn av postoperativ adhesjon.

Musen modell av milt transplantasjon har vært tidligere rapportert av Swirski FK et al. Den detaljerte informasjonen ble imidlertid ikke beskrevet.  Vår studie gir en omfattende trinn-for-trinn protokoll av mus milt transplantasjon for interesserte forskere til å følge og mater denne teknikken. Videre eliminerer denne protokollen flere unødvendige trinn som er beskrevet i rapporten av Swirski FK et al. (f. eks, galle duct ligation) og introduserer 11-0 Sutur for anastomose, noe som ville hjelpe forkorte kirurgisk tid og hindre blødning.

Som konklusjon, kan denne modellen være et kraftig verktøy for å utforske mekanismer av milt celle befolkningen i reaksjoner på patogener, skade, betennelse, eller transplantasjon avvisning og er verdifullt for testen av terapeutisk potensialet i milten Transplantasjon. Med riktig trening og praksis, kan denne prosedyren utføres med > 90% suksess.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfattere takker Northwestern University omfattende Transplant Center og Feinberg School of Medicine Research Cores program for ressurs-og finansierings støtte. Nærmere bestemt, flyt flowcytometri og histologi tjenester ble levert av Northwestern University Flow flowcytometri Core Facility og Mouse histologi og bestemmelse av fenotype Laboratory, henholdsvis, som begge er støttet av NCI P30-CA060553 tildelt Robert H Lurie omfattende Cancer Center. Vi takker Mr. Nate Esparza for korrekturlesing dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Wyeth 206205-01
Xylazine Lloyd Laboratories 139-236
Heparin solution Abraxis Pharmaceutical Products 504031
Injection grade normal saline Hospira Inc. NDC 0409-4888-20
70% Ethanol Pharmco Products Inc. 111000140
ThermoCare Small Animal ICU System Thermocare, Inc.
Adson Forceps Roboz Surgical Instruments RS-5230
Derf Needle Holder Roboz Surgical Instruments RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instruments RS-5881
Micro-clip Roboz Surgical Instruments RS-5420
7-0 silk Braintree Scientific SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle Sharpoint DR4 AK-2119
Ms CD45.2 antibody BD Bioscience 553772
Ms CD45.1 antibody BD Bioscience 553776
Ms CD11b antibody BD Bioscience 557657
Ms B220 antibody BD Bioscience 553089
Ms Ly6C antibody eBioscience 48-5932-80
Ms Ly6G antibody BD Bioscience 561236
Ms F4/80 antibody BD Bioscience 565614
Ms CD11c antibody BD Bioscience 558079
Ms CD3 antibody eBioscience 48-0032-82
Ms CD4 antibody BD Bioscience 552051
Ms CD8 antibody BD Bioscience 563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L34955

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cesta, M. F. Normal structure, function, and histology of the spleen. Toxicologic Pathology. 34, (5), 455-465 (2006).
  2. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5, (8), 606-616 (2005).
  3. Misiakos, E. P., Bagias, G., Liakakos, T., Machairas, A. Laparoscopic splenectomy: Current concepts. World Journal of Gastrointestinal Endoscopy. 9, (9), 428-437 (2017).
  4. Kristinsson, S. Y., Gridley, G., Hoover, R. N., Check, D., Landgren, O. Long-term risks after splenectomy among 8,149 cancer-free American veterans: a cohort study with up to 27 years follow-up. Haematologica. 99, (2), 392-398 (2014).
  5. Thai, L. H., et al. Long-term complications of splenectomy in adult immune thrombocytopenia. Medicine (Baltimore). 95, (48), e5098 (2016).
  6. Sinwar, P. D. Overwhelming post splenectomy infection syndrome - review study. International Journal of Surgery. 12, (12), 1314-1316 (2014).
  7. Rorholt, M., Ghanima, W., Farkas, D. K., Norgaard, M. Risk of cardiovascular events and pulmonary hypertension following splenectomy - a Danish population-based cohort study from 1996-2012. Haematologica. 102, (8), 1333-1341 (2017).
  8. Crary, S. E., Buchanan, G. R. Vascular complications after splenectomy for hematologic disorders. Blood. 114, (14), 2861-2868 (2009).
  9. Di Carlo, I., Pulvirenti, E., Toro, A. A new technique for spleen autotransplantation. Surgical Innovation. 19, (2), 156-161 (2012).
  10. Holdsworth, R. J. Regeneration of the spleen and splenic autotransplantation. British Journal of Surgery. 78, (3), 270-278 (1991).
  11. Tzoracoleftherakis, E., Alivizatos, V., Kalfarentzos, F., Androulakis, J. Complications of splenic tissue reimplantation. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 73, (2), 83-86 (1991).
  12. Kato, T., et al. Transplantation of the spleen: effect of splenic allograft in human multivisceral transplantation. Annals of Surgery. 246, (3), discussion 445-436 436-444 (2007).
  13. Aronovich, A., et al. Correction of hemophilia as a proof of concept for treatment of monogenic diseases by fetal spleen transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (50), 19075-19080 (2006).
  14. Cohen, E. A. Splenosis; review and report of subcutaneous splenic implant. Archives of surgery. 69, (6), 777-784 (1954).
  15. Coburn, R. J. Spleen transplantation in the rat. Transplantation. 8, (1), 86-88 (1969).
  16. Lee, S., Orloff, M. J. A technique for splenic transplantation in the rat. Surgery. 65, (3), 436-439 (1969).
  17. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, (5940), 612-616 (2009).
  18. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. Journal of Clinical Investigation. 128, (7), 2833-2847 (2018).
  19. Robbins, C. S., et al. Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions. Circulation. 125, (2), 364-374 (2012).
  20. Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34, (8), 1411-1419 (2014).
  21. Bronte, V., Pittet, M. J. The spleen in local and systemic regulation of immunity. Immunity. 39, (5), 806-818 (2013).
  22. Wang, N. P., et al. Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18, (2), 1470320317706653 (2017).
  23. Tian, Y., et al. The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE. Basic Research in Cardiology. 111, (6), 62 (2016).
  24. Jang, Y., et al. Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection. Journal of Immunology. 200, (6), 1982-1987 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics