ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

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Summary

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエメラノガスターにおける生体内実験の設計と性能を概説し、ヒト疾患に関連する希少遺伝子変異体の機能的影響を評価することです。

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Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H. T., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).

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Abstract

シーケンシング技術の進歩により、全ゲノムデータセットと全エキソメデータセットは、臨床診断と最先端のヒト遺伝学研究の両方でアクセスしやすくなりました。これらのデータセットで同定された変異体の病原性を予測するために多くのシリコアルゴリズムが開発されているが、特に誤った意味で、特定のゲノム変異体がタンパク質機能に与える影響を決定するには、機能的研究が重要である。バリアント。未診断疾患ネットワーク(UDN)およびその他の希少疾患研究コンソーシアムでは、ショウジョウバエ、C.エレガンス、ゼブラフィッシュ、マウスを含むモデル生物(MO)が、ヒト疾患を引き起こす原因の機能を評価するために積極的に使用されています。バリアント。このプロトコルは、UDNのモデル生物スクリーニングセンターショウジョウバエコアで使用される希少ヒト変異体の機能評価のための方法を説明する。ワークフローは、複数のパブリックデータベースから人間とMOの情報を収集することから始まり、MARRVELウェブリソースを使用して、バリアントが患者の状態に寄与する可能性があるかどうかを評価し、利用可能に基づいて効果的な実験を設計します。知識とリソース。次に、遺伝ツール(例えば、T2A-GAL4およびUAS-ヒトcDNAライン)が、ショウジョウバエに関心のある変異体の機能を評価するために生成される。これらの試薬の開発に際して、救助および過剰発現実験に基づく2極機能アッセイを行い、バリアント機能を評価することができます。救助分岐では、内因性フライ遺伝子は、直視性ショウジョウバエ遺伝子を参照または変異型ヒトトランスジーンに置き換えることによって「ヒト化」される。過剰発現分岐では、参照および変異体のヒトタンパク質は、種々の組織において外因性駆動される。いずれの場合も、任意の可視表現型(例えば、致死性、眼の形態、電気生理学)は、目的の疾患に関係なく、読み出しとして使用することができる。参照対立と変異対立性の間で観察された差異は、バリアント特異的効果を示唆し、したがって病原性の可能性が高い。このプロトコルは、既知および未知の機能を有する遺伝子の有病種のヒト疾患を引き起こす変異体の迅速な、生体内評価を可能にする。

Introduction

稀な疾患を持つ患者は、正確な診断1を得るために「診断オデッセイ」と呼ばれる困難な旅をしばしば受ける。ほとんどの希少疾患は、強い遺伝的起源を持っていると考えられています, 遺伝的/ゲノム分析は、臨床ワークアップの重要な要素を作ります.染色体マイクロアレイに基づく候補遺伝子パネルシーケンシングおよびコピー数変動解析に加えて、全エキソメ(WES)および全ゲノムシーケンシング(WGS)技術は、過去10年間でますます価値のあるツールとなっています2, 3.現在、WESおよびWGSにおける既知の病原性変異体を同定するための診断率は〜25%(小児症例では高い)4、5である。臨床WES/WGSの後に未診断のままであるほとんどの場合、一般的な問題は、多くの候補遺伝子と変異体があることです。次世代シーケンシングは、多くの遺伝子で新規または超希少な変異体を識別することが多く、これらの変異体が疾患発現型に寄与するかどうかを解釈することは困難です。例えば、遺伝子のほとんどのナンセンスまたはフレームシフト変異は、エンコードされた転写物のナンセンス媒介的な崩壊による機能喪失(LOF)の対遺物であると考えられているが、最後のエキソンで見つかった切り捨て変異はこのプロセスをエスケープし、良性または機能利得 (GOF) アエレ6.

さらに、誤った対立遺伝子の影響を予測することは、1930年代にハーマン・ミュラーによって最初に説明された多くの異なる遺伝的シナリオをもたらす可能性があるため、困難な作業です(すなわち、アモーフ、低型、高型、反形態、新形、または同位形)7.シリコプログラムおよび方法論の多数は、進化的保存、アミノ酸変化の種類、機能ドメイン内の位置、一般集団における対立遺伝子頻度に基づいて誤感変異体の病原性を予測するために開発された。およびその他のパラメータ8.しかし、これらのプログラムは、バリアント解釈の複雑な問題を解決するための包括的なソリューションではありません。興味深いことに、最近の研究では、5つの広く使用される変異原性予測アルゴリズム(ポリフェン9、SIFT10、CADD11、PROVEAN12、突然変異テイサー)が病原性〜80%の時間に同意することを実証しました8.特に、すべてのアルゴリズムが同意した場合でも、病原性の誤った予測を11%まで返します。これは、欠陥のある臨床解釈につながるだけでなく、研究者が良性として誤ってリストすることによって、新しい変異体のフォローアップを妨げる可能性があります。シリコモデリングにおける現在の限界を補完する1つの方法は、インビトロ、exvivo(例えば、培養細胞、オルガノイド)、または生体内での変異関数の効果を実証する実験データを提供することである。

MOにおける希少疾患関連変異体の生体内機能研究では、独自の強みを有し、米国および希少疾患ネットワーク(UDN)を含む世界中の多くの希少疾患研究イニシアチブで採用されている。カナダ、日本、ヨーロッパ、オーストラリアの疾病モデル&メカニズム(RDMM)ネットワーク14.MO研究者を全国規模で希少疾患診断と機械的研究のワークフローに統合するための協調的な取り組みに加えて、臨床研究者とMO研究者の間の個々の共同研究の数は、発見につながっています。多くの新しいヒト疾患を引き起こす遺伝子および変異体の特徴付け82,83,84.

UDNでは、集中型モデル生物スクリーニングセンター(MOSC)は、患者の状態の説明を含む候補遺伝子および変異体の提出を受け取り、その変異体がインフォマティクスツールと生体内で病原性である可能性があるかどうかを評価する。実験。UDNのフェーズI(2015-2018)では、MOSCはショウジョウバエコア(ベイラー医科大学(BCM))とゼブラフィッシュコア(オレゴン大学)で構成され、症例を評価するために協力しました。情報学分析とショウジョウバエとゼブラフィッシュのさまざまな実験戦略を使用して、MOSCはこれまでに132人の患者の診断、31の新しい症候群55の同定、いくつかの新しいヒトの発見に貢献してきました。疾患遺伝子(例えば、EBF315、ATP5F1D 16、TBX2 17、IRF2BPL 18、COG4 19、WDR37 20)および既知疾患の発現拡張遺伝子(例えば、CACNA1A21、ACOX122)。

UDN内のプロジェクトに加えて、MOSCショウジョウバエコア研究者は、メンデリアンゲノミクスセンターやその他のイニシアチブ(例えば、ANKLE2 23、TM2D3)と協力して新しい疾患遺伝子発見に貢献してきました。 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) 情報学と遺伝学の同じセットを使用してUDN のために開発された戦略。希少疾患診断に関するMO研究の意義を考えると、MOSCはUDNのフェーズII(2018-2022)のためのC.エレガンスコアと第2ゼブラフィッシュコア(セントルイスのワシントン大学の両方)を含むように拡張されました。

この原稿は、誤感変異体がヒトを発現するトランスジェニックハエを使用して目的のタンパク質に機能的な影響を及ぼすかどうかを判断するためにUDN MOSCショウジョウバエコアで積極的に使用されている生体内機能研究プロトコルについて説明します。タンパク質。このプロトコルの目的は、MO研究者が臨床研究グループと協力して、対象遺伝子の候補バリアントが機能的な結果を有し、臨床診断を容易にするという実験的証拠を提供するのを助けることを目的としています。このプロトコルは、ショウジョウバエの研究者が関心のある遺伝子に特定の候補変異体を有する稀な疾患患者を持つ臨床研究者によってアプローチされるシナリオで最も有用である。

このプロトコルは、(1)患者表現型に関与する関心のバリアントの可能性と、(2)収集における機能的研究の実現可能性を評価するための情報の収集という3つの要素に分けることができます。既存の遺伝的ツールを確立し、新しいものを確立し、(3)生体内で機能的研究を行う。3番目の要素は、対象のバリアントの関数を評価する方法に基づいて、さらに2つのサブエレメントに細分化することができます(救助実験または過剰発現ベースの戦略)。このプロトコルは、まれな単原性疾患研究以外の多くのシナリオ(例えば、一般的な疾患、遺伝子環境相互作用、および治療標的を同定するための薬理学的/遺伝的スクリーン)以外の多くのシナリオに適応および最適化できることに注意することが重要です。変異体の機能性と病原性を決定する能力は、正確な分子診断を提供することによって関心のある患者に利益をもたらすだけでなく、翻訳と基礎科学研究の両方に広範な影響を与えます。

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Protocol

1. ヒトおよびMO情報の収集:ショウジョウバエにおける疾患表現型と機能的研究の実現可能性に対する関心の変異体の可能性

  1. 広範なデータベースおよび文献検索を実行して、目的の特定の遺伝子および変異体が、対象患者の表現型を説明するのに適しているかどうかを判断する。具体的には、以下の情報を収集します。
    1. 目的の遺伝子が以前に他の遺伝性疾患(既知の疾患遺伝子の意味的な拡張)に関与しているか、または全く新しい疾患候補遺伝子であるかどうかを評価する[不確定意義の遺伝子変異体(GVUS)]。
    2. 疾患または制御集団データベースにおける関心の変異体の対立頻度を評価する。
    3. この遺伝子を疾患または制御集団データベースに含むコピー数変動(CNV)があるかどうかを評価します。
    4. マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、C.エレガンス、酵母を含む異なるMO種のオルソロゴス遺伝子がどのようなものであるかを評価し、これらのオルソロゴス遺伝子の既知の機能および発現パターンをさらに調べる。
    5. 目的の変異体がタンパク質の機能ドメインに存在するかどうか、および目的とするアミノ酸が進化的に保存されているかどうかを評価します。
      : これらの 5 つの質問 (手順 1.1.1-1.1.5) への回答は、多数の人間および MO データベースに個別にアクセスするか、または MARRVEL (希少バリアント探索用のモデル生物集約リソース) Web リソースを使用して取得できます (表を参照) 1オンライン リソース)30、 付随する記事31に詳述されています。具体的な例については、代表的な結果セクションを参照してください。モナーク・イニシアティブのウェブサイト32およびGene2Function33も有用な情報を提供する。
  2. 追加情報を収集して、タンパク質機能と構造の視点からバリアントが良好な疾患候補であるかどうかをさらに評価します。
    1. シリコ予測アルゴリズムに基づいて、対象のバリアントが損傷を受ける可能性があるかどうかを評価します。
      注:バリアント病原性アルゴリズムは、過去15年間に多くの研究グループによって開発され、一部はMARRVEL検索結果にも表示されます。以下に示す2つを含むより最近のプログラムは、複数の変異型病原性再生成アルゴリズムと機械学習アプローチを組み合わせて病原性スコアを生成する。バリアント予測アルゴリズムとそのパフォーマンスの詳細については、Ghosh, et al.8を参照してください。(i) CADD (アノテーション依存的な枯渇を組み合わせた): 60 以上のゲノム機能から構築された統合アノテーションツールは、ヒトSNVだけでなく、短い挿入および削除11のスコアを提供します。(ii) REVEL (まれなエキソメバリアントアンサンブル学習者): 複数の変異原発性アルゴリズム(MutPred、FATHMM、VEST、ポリフェン、SIFT、プロバン、変異評価者、変異評価者、変異テイスター、LRT、GERP、SiPhy、phyloP、およびphastCons)を組み合わせて、統合スコアを提供します。すべての可能な人間の誤解の変異体34.
    2. 対象のヒト遺伝子/タンパク質またはそのMOオルソログが、以前に遺伝病にリンクされていた遺伝子/タンパク質と遺伝的または物理的に相互作用することが示されているかどうかを判断する。もしそうなら、関心のある患者がこれらの障害と重なり合う型を示しているかどうかを評価する。
      注:MO出版物に基づいて遺伝的およびタンパク質とタンパク質の相互作用を分析するためにいくつかのツールが開発されているだけでなく、複数の種のスクリーンからの大規模なプロテオミクス。STRING(隣接遺伝子の反復インスタンスの検索ツール)35: 既知および予測されたタンパク質相互作用のためのデータベース。遺伝的相互作用と共発現データセットとテキストマイニングツールを統合し、様々な生物で一緒に機能する遺伝子やタンパク質を特定します。MIST(分子相互作用探索ツール)36:コア遺伝型MO(酵母、C.エレガンス、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、カエル、ラット、マウス)およびヒトからの遺伝とタンパク質相互作用データを統合したデータベース。また、オルソロゴス遺伝子/タンパク質(インターログ)から推測される相互作用の予測も表示されます。
    3. 目的のタンパク質の3-D構造が解けたか、モデル化されているかどうかを確認します。その場合は、主要な機能ドメインに対するインタレスト マップのバリアントの場所を決定します。
      注:X線結晶学、核磁気共鳴(NMR)、およびクライオ電子顕微鏡によって解決されたタンパク質構造は、PDB(タンパク質データバンク)およびEMDatabank37を含む公的データベースで見つけることができます。予測/モデル化されたタンパク質構造に関する単一のデータベースはありませんが、多くのアルゴリズム(SWISS-MODEL38、モデラー39、およびPhyre240)は、ユーザーがタンパク質モデリングを実行するために利用できます。
  3. 臨床共同研究者と連絡を取り、第1.1-1.2の情報分析から収集した情報について話し合います。臨床共同研究者も、対象とする変異体および遺伝子が患者に見られる型を説明するのに適した候補であると感じた場合は、セクション2に進む。患者の遺伝子型と表現型に関する特定の質問がある場合は、先に進む前に臨床共同作業者と話し合います。
    注:関心のバリアントが関心の表現型を説明する可能性が低いと感じられる場合(例えば、対照集団の高頻度で見つかった同一のバリアント)、これを臨床共同研究者と議論して、バリアントが良好であるかどうかを判断する。臨床表現型を解釈するための適切な専門知識がない可能性があるため、候補。

2. 既存の遺伝的ツールを収集し、関心のある特定の変異体を研究するための新しい試薬の確立

注:関心のバリアントが実験的に追求する良い候補が決定されたら、生体内機能研究で実行する試薬を収集または生成する。このプロトコルに記載されている機能的研究のために、いくつかの主要なショウジョウバエメラノガスター試薬が必要です:1)上流活性化配列調節ヒトcDNAトランスジェニック株は、参照またはバリアント配列を運ぶ、2)機能の喪失目的とするハエ遺伝子の対立遺伝子、および3)救助実験に使用できるGAL4ライン。

  1. UAS-ヒトcDNA構築物およびトランスジェニックハエの生成
    1. 適切なヒトcDNA構造を特定し、得る。多くのクローンはMGC(哺乳類遺伝子コレクション)43から入手可能であり、選択されたベンダーから購入することができる。代替スプライスされた遺伝子の場合は、どのアイソフォームcDNAがEnsemblまたはRefSeqを使用して対応しているかを確認してください。
      注:多くのcDNは、組換え媒介クローニングシステム互換試薬44で利用可能であり、サブクローニングステップを簡素化する。cDNは、「オープン(ストップコドンなし)」または「クローズド(内因性または人工ストップコドン付き)」形式で提供される場合があります。オープンクローンは、生化学的(例えば、ウェスタンブロット)および細胞生物学的(例えば、免疫染色)アッセイに有用なタンパク質のC'タグ付けを可能にするが、目的とするタンパク質の発現を監視し、場合によってはタンパク質機能を妨げる可能性がある。
    2. 基準および変異型cDNAをショウジョウバエ異性ベクターにサブクローンする。これは、参照および変異型cDNをゲノム45内の同じ位置に統合することができるので、φC31媒介トランスジェネシスシステムを使用する。このプロジェクトでは、MOSCショウジョウバエコアはpGW-HA.attBベクトル46を日常的に使用しています。
      : ヒト cDNA が組換え媒介性クローニング システム互換ベクター (pDONR221、pENTR221 など) にある場合は、セクション 2.1.4 にスキップして、cDNA を pGW-HA.attB にサブクローニングする LR 反応を説明します。
      1. ヒトcDNAが組み換え媒介クローニングシステム互換プラスミドにない場合は、標準的な分子生物学的技術を用いてヒトcDNAをゲートウェイエントリベクターにサブクローンする(そのようなプロトコルの例は以下に記載されている)。
        1. attB1およびattB2アームを導入するオーバーハング PCR を実行します。前方プライマーは、attB1配列5'-GGGGACAAGTTTAAAAAAAAAGCAGGCTTCACC-3'に続いて、標的cDNAの最初の22ヌクレオチドを持つべきである。逆プライマーは、attB2配列5'-GGGGAGACTTTAGAAAGGTGTCCTA-3'に続いて、目的のcDNAの最後の25ヌクレオチドの逆補数を有する必要があります。cDNAのストップコドンを除外し、クローンを「開く」必要がある場合はC'タグを追加するか、クローンを「閉じる」にストップコドンを追加します。
        2. 高忠実度PCRマスターミックスの50 μL、蒸留水の36 μL、ステップ2.1.2.1.1に記載されている各フォワードとリバースプライマーの5μLからなる高忠実度PCRミックスの100 μLを準備し、ターゲットcDNAの4 μL(150 ng/μL)を調製します。
        3. 標準の変異発生プロトコルを使用して PCR を実行し、目的の cDNA にattB1およびattB2アームを追加します。条件は、対象の構造体とバリアントによって異なります。
        4. ゲル電気泳動およびゲル抽出を介して追加された相同アームで標的cDNAを分離する。1%アガロースゲルを作成し、標準的な方法で電気泳動を行います。cDNAのサイズに加えて相同アームの追加の長さに対応するバンドを物品税を取り除きます。標準的な方法95を通してゲルからDNAを抽出する。市販のゲル抽出キットは、いくつかの企業から入手可能です。
        5. 使用されるシステムに従って組換後組換後クレボニングプロトコルに基づいてインビトロ組換ベニネーゼ反応を実行する。
        6. BP反応ミックスを化学的に有能な大腸菌細胞に変換します。有能なセルは、社内で作るか、商業ベンダーから購入することができます。コロニー選択のための適切な抗生物質を含むLBプレート上で一晩形質転換細胞を培養する。翌日、いくつかのコロニーを選択し、一晩独立した液体培養物でそれらを成長させます。
        7. ミニプレップを通じて一晩培養からDNAを分離します。サンガーシーケンス正極子は、cDNAが正しい配列96を持っていることを確認します。-80°Cで保存された25%グリセロールで所望の配列に陽性である培養物から細胞を維持する。
    3. 参照ヒトcDNA97を用いたゲートウェイプラスミドに関心の変異体を導入するために、部位指向変異形成を行う。この方法の詳細なプロトコルは、ベンダーの Web サイト48,49を参照してください。開いた読み取りフレーム全体(ORF)のサンガー配列決定を介して変異プラスミド中の変異体の存在を検証し、この変異発生ステップを通じて導入される追加の変異体がないことを確認します。
    4. LRクロナーゼ反応を介して、ドナープラスミド(attL1およびattL2部位を含むゲートウェイプラスミド)の参照および変異型ヒトcNをトランスジェニックプラスミド(例えば、attR1およびattR2部位を持つpGW-HA.attB)にサブクローンする。
      注:制限酵素法を介してヒトcDNをサブクローネすることが好ましい場合は、従来の制限酵素ベースのサブクローニング用に設計されたUAS φC31ベクター(例えば、pUAST.attB50)があります。
    5. UAS-ヒトcDNAトランスジーンを統合するφC31ドッキング部位を選択します。ドッキングサイトの数は、いくつかの研究所によって生成され、ストックセンター50、52、53から公的に利用可能です。
      注:目的の遺伝子のフライオルトログを含まない染色体上にヒトトランスジーンを持つことは便利なので、フライオルトログがX上にある場合は、第2染色体ドッキング部[VK37(BDSCストック#24872]を使用することをお勧めします。、第3、または第4染色体、およびフライオルトログが第2染色体上にある場合に第3染色体ドッキング部[VK33(BDSCストック#24871)を用いる。
    6. UAS-ヒトcDNA構築物を、生殖細胞系でφC31インテグラーゼを発現するハエに注入する(例えば、vas-φC31、nos-φC31)。
      注:マイクロインジェクションは、社内で行うことができるか、トランスジェネシスのためのコア施設または商業エンティティに送ることができます。トランスジェニックハエを生成するための詳細なプロトコルは、引用された本の第51章で見つけることができます。
    7. 注入された胚から安定したトランスジェニック株を確立する。構築物あたり〜100-200胚を注入する 94.第2染色体ドッキング部位(VK37)へのトランスジーン挿入のための代表的な交差スキームを図1Aに示す。基本的なショウジョウバエ遺伝学情報については、引用された書籍54,55を参照してください。
  2. 救助ベースの機能アッセイを容易にするT2A-GAL4ラインを取得または生成する(図 2およびセクション 3.1 を参照)。
    : この行は 2 つの目的を果たします。まず、試験されたほとんどのT2A-GAL4ラインは、遺伝子トラップ対立遺伝子として機能することにより、強力なLOF対立遺伝子として振る舞う。第二に、T2A-GAL4ラインは、対象遺伝子56、57(図2A-C)の内因性調節要素の下でUAS構築物(例えばUAS-GFP、UAS-ヒトcD)の発現を可能にするGAL4ドライバとして機能する。
    1. ドロソフィラ遺伝子破壊プロジェクト(GDP)58を含む利用可能なT2A-GAL4ラインの公開在庫コレクションを検索し、約1,000 T2A-GAL4ラインが59行生成された。これらの株は現在ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC)から入手可能であり、GDPとBDSCの両方のウェブサイトを通じて検索可能です。
    2. 対象のフライ遺伝子のT2A-GAL4ラインが利用できない場合は、組換え媒介カセット交換(RMCE)を用いてT2A-GAL4ラインへの変換に適したコーディングイントロニックMiMIC(ミノス-媒介インテグレーションカセット)ラインが利用可能かどうかを確認します。)60 (図 2A)
      : RMCE は、ドナー構造体のマイクロインジェクションを通じて、2 つのコーディング エキソンの間にあるイントロニック MiMIC 要素を T2A-GAL4 ラインに変換することを可能にします (クロススキームの例は図 1Bに示されています) または一連の十字架は、詳細に記載されているように57、59.
    3. T2A-GAL4 回線が利用でき、適切な符号化イントロニック MiMIC が存在しない場合は、CRIMIC (CRISPR 媒介型インテグレーション カセット) システム59を介して T2A-GAL4 回線を生成する可能性を探ります。
      注:この方法論では、CRISPR媒介DNA切断および相同性修復(HDR)を使用して、MiMICのようなカセットを目的の遺伝子のコーディングイントロンに統合します。
    4. 目的の遺伝子が大きなイントロン(>150 bp)を欠いている場合、またはイントロンを持たない場合は、記載されている20、61、62のHDRを使用してCRISPR/Cas9システムを用いて、GAL4トランスジーンをフライ遺伝子にノックインしようとします。
      注:T2A-GAL4またはGAL4ノックイン対立遺伝子の生成が困難な場合は、記載された92(REF)のように、これらの既存の対立遺伝子またはRNAiラインおよびユビキタスまたは組織特異的GAL4ドライバを用いて救助実験を行おうとする。

3.ショウジョウバエにおける生体におけるヒト変異体の機能解析の実施

: 第 2 項で収集または生成されたツールを使用して、ショウジョウバエにおける生体内の関心の変異体の結果を評価するために、レスキューベースの分析(セクション3.1)と過剰発現研究(セクション3.2)を実行します。この 2 つは補完的であるため、両方のアプローチを使用することを検討してください。

  1. レスキューベースの実験による機能解析の実行
    メモ: ヘテロロゴス救助ベースの実験Drosophilaヒトタンパク質を用いて、2つの直交遺伝子の分子機能が約5億年以上の進化を保存されているかどうかを決定します。彼らはまた、ヒトタンパク質の文脈における変異体の機能を評価する63.何百もの遺伝子ペアを研究する系統的な分析は報告されていないが、数十のヒトおよび哺乳類(例えば、マウス)遺伝子の機能を置き換えることができるDrosophila遺伝子13.
    1. レスキューベースのアプローチでは、バリアントの機能を評価する前に、フライオルトログのLOF変異体に明白で、コーレータ可能で再現可能な型が存在するかどうかを最初に判断します。
      注:フライ遺伝子の以前の文献は、最初にデータマイニングに適した場所であり、FlyBaseやPubMedなどのデータベースを使用して見つけることができます。MARRVEL、モナーク・イニシアティブ、Gene2Funcionなどの追加のデータベースも、この情報を収集するのに役立ちます。
    2. ホモ接性およびヘミツィゴウスにおける斜体型の世界的な調査を行う(T2A-GAL4対立遺伝子は、特にT2A-GAL4対立遺伝子が特定の遺伝子に対して特徴付けられる最初の変異である場合に、分子定義された染色体欠乏動物に対してT2A-GAL4対立遺伝子である。致死性、不妊症、長寿、形態学的(例えば、眼の大きさや形態)および行動(例えば、求愛、飛行、登山、および強打感受性欠陥)などの表現型を評価する。
      注:この一次画面から同定された主要な表現型がない場合、電気生理学的記録によって測定された神経学的欠陥などのより微妙な表現型は、非常に再現性が高く、特異的である場合に使用することができる。一例として、エレクトレトノグラム(ERG)を用いった機能的研究について、ステップ3.2.3に記載されている。scorable 表現型の検出に失敗した場合は、セクション 3.2 に移動し、過剰発現ベースの機能スタディを実行します。
    3. フライLOF変異体で可視表現型が同定されたら、ヒトcDNAを使用して変異型フライラインを救出することにより、参照ヒトcDNAがフライオルトログの機能を置き換えることができるかどうかをテストします。ここで行われる表現性アッセイは、ステップ3.1.2の結果に依存し、研究対象の遺伝子に特異的になります。
      注:フライ遺伝子の「ヒト化」が成功した場合、参照遺伝子と比較して、関心のある変異体の救助の効率を比較するプラットフォームが存在するようになりました。参照人間のcDNAで見られる救助は完全である必要はない。ヒトcDNAを用いたフライ変異型の部分的な救助は、ヒトcDNA株を用いて比較研究を行う基準点を依然として提供する。
    4. ステップ3.1.2で選択されたアッセイシステムを使用して、参照ヒトcDNAと観察された救助を、変異型ヒトcDNAで観察された救助と比較し、目的の変異が目的の遺伝子に影響を及ぼすかどうかを判断する。
      注:ヒトcDNAの変異体が参照対立遺伝子よりも悪い場合、これは、目的の変異体がタンパク質機能に有害であることを示唆する。バリアントおよび参照が機能的に区別できない場合、1)対立遺伝子は同形(タンパク質機能に影響を与えない変異体)であり得る(タンパク質機能に影響を与えない変異体)、または2)アッセイは微妙な違いを検出するのに十分な感受性ではない。
    5. 変異体が有害な対立遺伝子であることが判明した場合、さらに、ウェスタンブロット、免疫蛍光染色、または他の方法介して生体内で目的とする参照および変異体タンパク質の発現および細胞内局在化を評価する93。
      注:UAS-ヒトcDNAがpGW-HA.attBベクターのオープンクローンから生成される場合は、抗HA抗体を使用してこれらの生化学的および細胞性アッセイを実行します。元のクローンがクローズドクローンである場合、ヒトタンパク質に対する市販抗体がこれらのアッセイに使用できるかどうかをテストします。発現レベルと細胞内局在度の違いは、目的の変異体がタンパク質機能にどのように影響するかを明らかにするかもしれない。
  2. 過剰発現スタディを通じた機能解析の実行
    注:そうでなければ野生型ハエにおけるヒトcDNAのユビキタスまたは組織特異的過剰発現は、セクション3.1で議論される救助ベースの実験に補完的な情報を提供することができる。レスキューベースのアッセイは、主にLOF変異体(非晶質、低体型)を検出するように設計されていますが、過剰発現ベースのアッセイでは、評価が難しい機能ゲイン(GOF)バリアント(多形、反型、新生物)が明らかになる場合があります。
    1. 目的の人間の cDN をオーバーエクステンシングする GAL4 ドライバーのセットを選択します。ユビキタスおよび組織/ステージ固有のGAL4ドライバの数は、公共のストックセンター(例えば、BDSC)から入手可能であり、その一部は他のものよりも頻繁に使用されています。まず、ユビキタスドライバーと簡単に可聴型(致死性、無菌性、形態学的型)に焦点を当て、次に組織特異的なドライバとより特定の型に移動します。
      注: GAL4 ドライバの式をレポーターライン(UAS-GFPなど)で検証し、実験で使用する前に式パターンを確認します。
    2. 同じ条件(例えば、温度)の下で同じドライバを使用して、同じドライバを使用して、3-5の処女メスをGAL4ライン(例えば、眼の虚円式のey-GAL4)とUASラインから3-5オスハエと交付することによって、参照および変異体ヒトcNを表現する[例えば、温度]。単一バイアルのセクション 4.2] に示す例のUAS-TBX2(+)またはUAS-TBX2(p.R305H)。
      1. 1つの十字架から多くの動物を閉じ込めるために2〜3日ごとに十字架を転送します。
    3. 子孫を調べ、解剖顕微鏡下で参照株と変異株(例えば、眼の形態)の違いを検出する。解剖顕微鏡に取り付けられたカメラを使用してハエを画像化し、表現型を文書化します。
      注:表現型が参照でのみ見られるが、バリアントラインに見られない場合、バリアントは非晶質または強い非型対立遺伝子である可能性があります。表現型が両方の遺伝子型で見られるが、参照がより強い欠陥を引き起こす場合、変異体は軽度から弱い低型対立遺伝子である可能性がある。参照が表現型を示さないか、弱い表現型のみを示すが、バリアントが強い欠陥を示す場合、バリアントはGOF対立遺伝子である可能性があります。
    4. 表現型が標準的な培養条件で見られない場合(RTまたは25°Cで、UAS/GAL4系は温度感受性64,65であることが知られているので、18〜29°Cの異なる温度で十字架を設定する)。典型的には、UASトランスジーンの発現は、より高い温度で高い。
  3. 目的の遺伝子とタンパク質に関連する追加の機能的研究を実行します。.
    メモ:一般的な欠陥を調べることに加えて、遺伝子および変異体の分子機能を調べるためのアッセイシステムを選択することができる。代表的な結果で議論された一例では、TBX2症例)、ERG記録は、目的のフライ遺伝子(目的のフライ遺伝子以来、光受容体機能に対する変異体の効果を決定するために使用された)bifid)は、視覚システム開発の文脈で広範囲に研究されていました。ERG の詳細なプロトコルDrosophila以前に公開されたものとして見つけることができます66,67,68.
    1. ハエを生成して、視覚システムの機能上の欠陥をテストします。ロドプシン1(Rh1)-GAL4ラインからヒトに対するクロスバージンメスは、R1-R6光受容体に関心のあるヒトタンパク質を発現する参照または変異体UAS-ヒトcDNAトランスジーンを有する。
      注:3-5処女雌を単一のバイアルで3-5オスのハエに渡し、1つの十字架から多くの動物を閉じ込めるために2〜3日ごとに十字架を転送します。一貫した結果を得るためには、すべての十字架を実験温度に設定したインキュベーターに保管する必要があります。
    2. ハエが閉じ始めたら(25°Cで、最初の十字架を設定してから〜10日後)、子孫を集める(Rh1-GAL4/+);。UAS-ヒトcDNA/+)を新鮮なバイアルに戻し、視覚系が成熟するためにさらに3日間実験温度で設定されたインキュベーターに戻します。
      注:ERGは1~2日前のハエで行うことができますが、新たに閉じたハエはERG信号に大きな変動を持つ可能性があります。年齢依存型を調べたい場合、これらのハエは、湿った食べ物に溺れないように、定期的に(例えば、5日ごと)新しいバイアルに移される限り、数週間熟成することができる。
    3. 最初にCO2を使用してハエを麻酔するか、氷上のバイアルに入れることによって、ERG記録のためのハエを準備します。ハエの片側をガラス顕微鏡スライドにそっと接着し、固定します。
      注:複数の参照とバリアントハエは、単一のスライドに接着することができます。すべてのハエをほぼ同じ方向に配置し、片目を記録電極にアクセスできるようにします。目に接着剤を取得し、プロボシスを自由に残すように注意してください。
    4. 記録電極と参照電極を準備します。1.2mmのガラスキャピラリーを針引きに入れ、活性化します。毛細管を破り、鋭いテーパー電極を2本得る。得られた電極は中空で、<0.5 mmの最終的な直径を持つ必要があります。
    5. 毛細血管に生理食液(100mM NaCl)を充填し、気泡がないことを確認します。ガラス毛細血管を銀線電極(記録電極と参照電極の両方)の上にスライドさせ、キャピラリーを所定の位置に固定します。
    6. 刺激器とアンプを設定します。詳細なセットアップは、ラウワース、ら67で見つけることができます。UDNショウジョウバエMOSCセットアップは、材料セクションに記載されている機器で構成されています。
      1. アンプを0.1Hzのハイパスフィルタ、300Hzローパスフィルタ、100ゲインに設定します。
      2. 刺激器を1秒、500ミリ秒のパルス幅、500ミリ秒のパルス遅延、ランモード、7アンペアに設定します。
      3. 光刺激用の光源を準備します。ハロゲン光源を使用して、フライ光受容体を活性化します。
      4. ERG セットアップに接続されているコンピュータで記録ソフトウェアを準備します。取得モデル「固定長イベント」と20sの持続時間を持つ刺激プロトコルを作成します。
    7. ERG録音を開始する前に、暗闇を完了するためにハエに順応します。実験を開始する前に、少なくとも10分間完全な暗闇の中にハエを置きます。
      注:ハエは赤色光を検出できないため、暗い居住期間中は赤色光源を使用してください。
    8. ハエを含むスライドを記録装置に置き、参照および記録電極を運ぶマイクロマニピュレータをスライド上の目的のフライに近いポイントに移動します。電極の先端を見て、参照電極をハエの胸部に慎重に配置します(キューティクルを貫通します)。基準電極が安定して挿入されたら、記録電極を眼の表面に置きます。
      注:この参照電極の正確な位置は、ERG信号に大きな影響を与えません。ERGは細胞内記録ではなくフィールドポテンシャル記録であるため、記録電極は眼の表面に配置する必要があります。記録電極に加えられる圧力の適切な量は、目を貫通することなく小さなディンプルを引き起こす。
    9. ハエを暗い環境に順応させるために、さらに3分間すべてのライトをオフにします。
    10. 記録ソフトウェアを設定し、信号の記録を開始します。手動シャッター付きのハロゲン光源を使用する場合は、シャッターを閉じたまま光源をオンにします。信号の記録を開始します。
    11. 1回の走行で20sの間、1sごとにシャッターを開閉することにより、フライアイを光にさらします。
      注:ハロゲン光源のオン/オフは手動で制御するか、白色LED光源を使用して自動化するようにプログラムすることができる。より堅牢で信頼性の高いERGは、ハロゲン光源から放出される光スペクトルが広いため、白色光LEDに比べてハロゲン光源を用いることで得られる。
    12. ガラススライドに取り付けられているすべてのハエからERGを記録します。条件ごとに遺伝子型ごとに 15 ハエから ERG を実行します。
      注:参照 cDN とバリアント cDN の間の堅牢な差異を示す条件を見つけるために変更できるパラメータには、温度、年齢、または環境条件 (例えば、明暗サイクルまたは一定の明暗期で飼育される) が含まれます。
    13. データ分析の実行: 参照、バリアント、およびコントロールの ERG を比較して、相違点があるかどうかを判別します。ERG データを評価して、オントランジェント、脱ポロライゼーション、オフトランジェント、および再分極69 (図 4B)の変化を評価します。
      注:脱分極と再分極は、光受容体内の光伝達カスケードの活性化と不活性化を反映し、オントランジェントとオフトランジェントは、からの信号を受信するシナプス後細胞の活動の尺度である光受容体。振幅の減少と再偏光の変化運動は、しばしば光受容体機能と健康の欠陥に関連するが、オンとオフトランジェントの欠陥は、欠陥のあるシナプスの発達、機能、またはメンテナンスを伴う変異体に見られる。70.
    14. 参照対変異体ヒトcDNAの過剰発現を伴うERG表現型の相違を同定する際に、この電気生理学的表現型が光受容体およびその構造上の欠陥と関連しているかどうかを判断する。組織学的分析および透過電子顕微鏡を行うことによってシナプス。
      注:ERG欠陥および構造/超構造解析の解釈に関するさらなる議論は、以前に69について説明した。

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Representative Results

神経発達型に関連するEBF3におけるデノボミスセンス変異体の機能的研究
低血圧、運動失調、世界的な発達遅延、発現性言語障害を含む神経発達表現型を有する7歳の男性において、国立衛生研究所の医師およびヒト遺伝学者(UDP)。EBF3(早期B細胞因子3)15におけるデノボ誤知覚変異体(p.R163Q)を同定し、COE(コリアー/嗅覚-1/早期B細胞因子)ファミリー転写因子をコードする遺伝子を同定した。このケースは、機能的研究のために2016年3月にUDN MOSCに提出されました。この遺伝子がこの場合の良い候補であるかどうかを評価するために、MOSCはOMIM、ClinVar、ExAC(現在はgnomADに拡張)、ジェノ2 MP、DGV、およびDECIPHERからヒトの遺伝的およびゲノム情報を収集しました。さらに、主要なMO種のオルソロゴス遺伝子は、DIOPTツールを用いて同定された。その後、個々のMOデータベース(ワームベース、フライベース、ZFIN、MGIなど)からの遺伝子発現および表現可能性情報が得られた。UDN MOSCにおけるEBF3および他の先駆的研究のために行われた情報学分析は、MARRVELリソース30の後の開発のための基礎を形成した。

この方法論を用いて収集された情報は、EBF3が分析時に既知のヒト遺伝性疾患と関連していないことを示し、p.R163Q変異体は以下の情報に基づいて良好な候補であると結論付けた。(1)この変異体は、コントロール集団データベース(ExAC)および疾患集団データベース(Geno2MP)において以前に報告されていなかったが、これは非常にまれな変異体であることを示す。(2)ExACに基づくと、この遺伝子のpLI(LOF不耐性の確率)スコアは1.00(pLIスコアは0.00~1.00)である。これは、一般集団におけるこの遺伝子のLOF変異体に対する選択的圧力があることを示し、この遺伝子のハプロインの充足が疾患を引き起こす可能性があることを示唆している。pLIスコアとその解釈の詳細については、JoVE31と関連論文のMARRVELチュートリアル記事に付属の詳細30、71を提供しています。

p.R163Q変異体は、(3)このタンパク質の進化的に保存されたDNA結合ドメインに位置し、DNA結合または他のタンパク質機能に影響を与える可能性があることを示唆しているため、良好な候補と考えられていた。(4)p.R163残基は、C.エレガンスおよびショウジョウバエからヒトに進化的に保存され、種間のタンパク質機能にとって重要である可能性を示唆している。(5)EBF3オルソログは、C.エレガンス73、ショウジョウバエ74、キセノプス75、およびマウス76を含む複数のMO72における神経発達に関与している。 (6)マウスの脳発達中に、Ebf3はArx(アリスタレス関連ホームボックス)77、いくつかのてんかんおよび知的障害に関連する遺伝子の下流で機能することが示されている。 ヒトの症候群78.したがって、これらのデータは、EBF3がヒト神経発達に重要である可能性が非常に高く、p.R163Q変異体が機能的な結果を持つ可能性があることを示唆している。

p.R163QがEBF3機能に影響を与えるかどうかを評価するために、結び目のためのT2A-GAL4ライン(kn;ヒトEBF379のフライオルトログ)は、コーディングイントロニックMiMIC挿入15のRMCEを介して生成された。knT2A-GAL4ラインは劣性致死であり、古典的なkn対立遺伝子(kn col-1)の致死性とkn[Df(2R)BSC429]80を覆う分子定義された欠乏を補完することができなかった. GAL4の発現パターンはまた、翼の虚数ディスク15と同様に脳内のkn発現の以前に報告されたパターンを反映した。その後、UASトランスジェニックハエを生成し、ヒトEBF3 cDNAおよび野生型フライkn cDNAの発現を可能にした。3つのタンパク質はすべてC末端3xHAタグでタグ付けされた。重要なことに、UAS野生型フライkn(kn+)または参照ヒトEBF3(EBF3 +)トランスジェネはkn T2A-GAL4/Df(2R)BSC429の致死性を同様の程度に救出した(図 3C、左パネル)81.

対照的に、P.R163Q変異体(EBF3p.R163Q)を伴うUAS-ヒトEBF3トランスジーンは、この変異体を救出すべらず、p.R163Q変異体が生体内15におけるEBF3機能に影響を及ぼすことを示唆した。 興味深いことに、抗HA抗体を用いて評価した場合、EBF3p.R163Qタンパク質はハエ組織で正常に発現され、そのレベルと細胞内局在化(主に核)はEBF3+およびそれと区別がつかない。Kn+.これは、変異体がタンパク質の不安定性または誤局在化のためにLOF表現型を引き起こしていないことを示唆している。p.R163Q変異体がEBF3の転写活性化機能に影響を与えたかどうかをさらに評価するために、LUCiferaseベースのレポーターアッセイはHEK293細胞15で行った。培養ヒト細胞におけるこの実験は、EBF3p.R163Q変異体がレポーター構築物の転写を活性化できなかったことを明らかにし、ショウジョウバエ実験から得られたLOFモデルを支持した。

実験研究と並行して、BCMの医師、ヒト遺伝学者、および遺伝カウンセラーとの共同研究は、同様の症状を持つ2人の追加の個人の同定につながった。1人の患者は同一のp.R163Q変異体を運び、別の患者は同じ残渣に影響を与える誤った変異体を運んだ(p.R163L)。p.R163L変異体はまた、この対立遺伝子もEBF3機能に影響を与えたことを示唆するフライkn変異体93を救出することができなかった。興味深いことに、この研究は、デノボの誤解、ナンセンス、フレームシフト、および同様にリンクされたEBF3のスプライシング変異体を持つ追加の個体を報告した2つの独立したヒト遺伝学研究で連続して出版されました。神経発達型82,83.その後、3つの追加論文が発表され、ノボEBF3バリアントおよびコピー番号削除84、85、86の追加事例が報告された。この新しい神経発達症候群は、ヒトのオンラインメンデリアン遺伝(OMIM、ヒトの遺伝子型表現型関係の権威データベース)において、低血圧、運動失調、遅延発達症候群(HADDS、MIM#617330)として知られています。

シンドロミック心血管および骨格発達障害に関連するTBX2における支配的に遺伝したミスセンス変異体の機能的研究
頭蓋骨の異形、心臓の異常、骨格奇形、免疫不全、内分泌異常、発達障害の重なり合うスペクトルに罹患した小さな家族では、UDNデューク臨床部位は誤った変異体を同定した。(p.R20Q)疾患のフェノタイプ87と分離するTBX2で.4人の家族のうち3人(息子、娘、母親)がこの状態の影響を受け、息子は最も重篤な表現型を示した。臨床的に、彼は「完全なディジョージ症候群」の診断に会いました, 多くの場合、TBX1のハプロインの充足によって引き起こされる状態.このファミリーではTBX1で同定された変異はなかったが、マウスの以前の研究では、これらの遺伝子が発達88の間に重複する機能を有することを示したので、臨床医およびヒト遺伝学者はTBX2の変異体に焦点を当てた。.TBX1とTBX2はいずれも、コンテキストに応じて転写リプレッサおよび活性化剤として作用できる転写因子のT-box(TBX)ファミリーに属する。

以前は、TBXファミリー遺伝子の17人中12人の変異体がヒト疾患に関連していた。MOSCは、MARRVELやその他のリソースを通じて収集された以下の情報に基づいて、このバリアントを実験的に追求することに決めました。(1) このバリアントは、gnomADで約90,000人の「コントロール」個体のコホートで一度だけ報告されました(このバリアントは、カバレッジ読み取りが低いため、デフォルトビューでフィルタリングされました)。母親の穏やかな表現型の提示を考慮すると、これはまだ病気の表現型を担当する可能性のあるまれな変異体と考えることができます。(2) ExAC/gnomAD のTBX2の pLI スコアは 0.96/0.99 で、これは高い (最大 = 1.00) です。さらに、gnomAD の o/e(観察/期待)LOF スコアは 0.05 です (gnomAD では期待 LOF バリアントが 1/18.6 のみ)。これらの数字は、この遺伝子のLOF変異体が一般集団において選択されていることを示唆している。

さらに、(3)p.R20は、C.エレガンスおよびショウジョウバエからヒトに進化的に保存され、これはTBX2機能にとって重要な残留物である可能性を示唆している。(4) 複数のプログラムは、バリアントが損傷を受けやすいと予測します(ポリフェン:おそらく/おそらく有害、SIFT:有害、CADDスコア:24.4、REVELスコア:0.5)。(5)MO変異体は、患者に罹患した組織に欠陥を示す(例えば、心臓血管系、消化器系/血管系、頭蓋骨、四肢/桁の欠陥を示すノックアウトマウス)。したがって、TBX1とTBX2との間の生物学的リンクと、これらの患者とディジョージ症候群との間の発現性リンクと共に、ショウジョウバエを用いてこの遺伝子の変異体の機能的研究を行うことが最適であった。

p.R20QバリアントがTBX2関数に影響を与えるかどうかを評価するために、ビフィドのT2A-GAL4ライン(bi;ヒトTBX2ショウジョウバエオログロログ)は、コードイントロニックMiMIC(図2)87のRMCEを介して生成された。この対立遺伝子、bi T2A-GAL4は、劣性プパル致死物であり、以前に報告されたbi LOF対立遺伝子(例えば、bi D2、bi D4;)と同様に、強いLOF変異体として振る舞った。図 2E)これらの古典的で新たに生成されたバイアレルの致死性は、バイ遺伝子座全体を運ぶ〜80kbゲノム救助構造によって救出され、これらの試薬が実際にクリーンなLOF対類であることを示す。biT2A-GAL4ラインにおけるGAL4の発現パターンは、翼の虚円を含む複数の組織における以前に報告されたバイ発現パターンとよく一致した(図2D)。

並行して、参照または変異体(p.R20Q)配列を運ぶTBX2のUAS-トランスジェニックラインが生成された。残念ながら、いずれのトランスジーンもbi T2A-GAL4ラインの致死性を救うにはならなかった。重要なことに、野生型フライUAS-biトランスジーンはまた、この遺伝子の投与感受性に起因する可能性が高いbi T2A-GAL4対立遺伝子を救出することができなかった。実際、UAS-bi+およびUAS-TBX2+の過剰発現は、野生型動物で過剰発現した場合、ある程度の致死性を引き起こした。このbi/TBX2過剰発現の毒性効果は、p.R20Q変異体がTBX2機能に影響を与えるかどうかを評価する機能的アッセイとして利用された。ショウジョウバエバイ遺伝子は視覚系の文脈で広範囲に研究されてきたので[遺伝子は光運動ブラインド(omb)とも呼ばれる]、視覚系に関連する表現型が広範囲に研究された。視覚系に関連する眼および脳の一部にUAS-トランスジェネを発現するey-GAL4ドライバを用いて参照TBX2を発現した場合、致死率〜85%(図3C、右パネル)と有意眼の大きさの減少(図4B)が認められた。この表現型は、野生型フライUAS-biトランスジーンが発現されたときに観察された表現型よりも強く、ヒトTBX2が過剰発現するとハエに対してより有害であることを示唆した。

興味深いことに、p.R20Q TBX2は致死性(図3C、右パネル)を引き起こし、同じ条件87の下で同じドライバを使用して小さな目の表現型(図4B)を誘導するにはあまり強力ではなかった、と示唆している。その変異体がタンパク質機能に影響を与えることを。また、異なるGAL4ドライバを用いて参照および変異型TBX2を過剰発現する光受容体の機能は、R1-R6光受容体においてUASトランスジーンを特異的に発現する(Rh1-GAL4)、変異型TBX2が発現していることを明らかにした。参照TBX2(図4B)87に比べてはるかに穏やかなERG表現型。興味深いことに、p.R20Q TBX2タンパク質のほとんどは、参照タンパク質と同様に核内にまだ見つかり、その変異体が核局在化に影響を及ぼさなかったことを示唆している。HEK293T細胞におけるルシフェラーゼベースの転写抑圧アッセイは、p.R20QがパリドロミックTボックス部位87を用いたレポーター構築物の転写を効果的に抑圧できなかったことを示した。さらに、TBX2p.R20Qのタンパク質レベルの低下は、TBX2+と比較して観察され、変異体がTBX2の翻訳またはタンパク質安定性に影響を与える可能性があることを示唆し、細胞内のその豊富さに影響を与える。

TBX2の希少変異体を有する追加の患者は、これらの実験研究と並行してUDNデューク臨床部位の臨床医によって同定された。 無関係な家族からデノボミスセンス(p.R305H)変異体を持つ8歳の少年は、最初の家族87で見つかった特徴の多くを示しました。ショウジョウバエとヒト細胞株の追加機能研究は、p.R305H変異体がTBX2機能およびタンパク質レベルにも影響を及ぼすことを明らかにし、この遺伝子の欠陥が2つのファミリーに見られる多くの発現型の背後にある可能性が高いことを強く示唆した。この疾患は最近、OMIMで「脊椎異常および可変内分泌およびT細胞機能障害」(VETD、MIM#618223)としてキュレーションされた。重なり合う表現型を持つTBX2の有害な変異体を有する追加の個体の同定は、ヒト疾患におけるこの遺伝子の遺伝子型表現型関係の全スペクトルを理解するために重要である。

Figure 1
図 1: UAS-ヒトcDNAおよびT2A-GAL4ラインを生成する注入および交差スキーム。(A) マイクロインジェクションと交差を介したUAS-ヒトcDNAトランスジーンの生成第1および第2世代の雄ハエを用いてトランス遺伝子を第2染色体ドッキング部位(VK37)に統合する交差スキームを例に示す。ヒトcDNA φC31トランスジェニックコンストラクト(pGW-HA.attB)を早期胚に注入すると、φC31インテグラーゼ(3xP3-GFPおよび3xP3-RFPで標識)およびVK37ドッキング部位[黄色+(y+)で標識された)の生源源を含む初期胚に注入する)マーカー]]]トランスジェニックイベントは、トランスジェニックベクター中に存在する白+(w+)ミニジーンと共に続けることができる。GFPとRFPでハエを選択してφC31インテグラーゼを横切ることをお勧めします。染色体が第2の部位致死的/無菌ヒット変異を運ぶ場合、最終的な安定したストックはホモ接合品として、またはバランスの取れたストックとして保つことができる。トランスジェニック構造体上の第2部位致死/無菌変異の存在は、通常、これらのトランス遺伝子がヘテロザイゴウス状態で使用される限り、機能的研究の結果に影響を与えない(図3)。(B) マイクロインジェクションと十字を介したT2A-GAL4ラインの生成。第2染色体MiMIC挿入をT2A-GAL4素子に変換する交差スキームを例として示す。T2A-GAL4(pBS-KS-attB2-SA-T2A-Gal4-Hsp70)に対してφC31インテグラーゼおよびRMCEベクターの発現ベクターをマイクロ注入することにより、目的のMiMICに適した読み取りフレームが選択される。以下の論文を参照してください57,59は、対象遺伝子のコードイントロンでMiMICを運ぶ胚に、1つは、元のMiMICをT2A-GAL4ラインに変換することができる。図 2Aは、RMCE 変換の概略図を示しています。変換イベントは、元のMiMICカセット60のy +マーカーに対してスクリーニングすることによって選択することができる。RMCEは2方向に発生できるため、成功した変換イベントの50%のみがGAL4の生産に成功し、次世代のUAS-GFPレポータートランスジーンによって検出されます。遺伝子のLOFが致死的/無菌である場合、最終的な安定したストックはホモ接合として、またはバランスの取れたストックとして保つことができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: RMCE を介して MiMIC 要素を T2A-GAL4 ラインに変換します。(A) φC31 インテグラーゼは、フライ内の 2 つのattP部位 (上) と、円形ベクトル (下) として示される T2A-GAL4 カセットを横切る 2 つのattB部位との間の組み換えを容易にします。(B) 成功したRMCEイベントは、選択可能なマーカー(黄色+)の喪失および目的の遺伝子の同じ向きのT2A-GAL4カセットの挿入につながる。RMCEイベントは2つの方向で起こり得るので、RMCE反応の50%だけが所望の製品を得る。反対方向に挿入されたRMCE産物は、遺伝子トラップ対立遺伝子またはEXPRESS GAL4として機能しません。コンストラクトの指向性は、サンガーシーケンスを介して確認する必要があります。(C) 目的の遺伝子の転写(上)および翻訳(下)は、T2A-GAL4カセットの3'末端に存在するポリAシグナルによる切り捨てられたmRNAおよびタンパク質の生成につながる。T2Aはリボソームスキップ信号であり、リボソームがこの信号の後に翻訳を停止し、再開始することを可能にする。これは、目的の切り捨てられた遺伝子産物に共存的に付着していないGAL4要素を生成するために使用されます。GAL4は核に入り、UAS元素の制御下にあるトランスジーンの転写を容易にする。UAS-GFPは遺伝子発現レポーターとして使用でき、UAS-ヒトcDNAは遺伝子「ヒト化」による救助実験に利用できます。(D)示すのは、UAS-GFP(上)のバイ駆動式におけるT2A-GAL4素子の一例である。この発現パターンは、同じ遺伝子(biomb-GAL4;底)に対して以前に生成されたエンハンサートラップラインに似ています。(E) 以前に報告されたLOFバイ対立遺伝子との比T2A-GAL4対立遺伝子の比較。この図は、以前の出版物57、87から採用され、修正されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: レスキューベース(左)と過剰発現(右)研究を用いたヒト変異体の機能解析(A) (左パネル): EBF3変異体の機能は、致死性/生存率に焦点を当てたハエ結び目(kn)LOF対立遺伝子の救助ベースの分析で評価された。(右パネル):TBX2における変異体の機能は、野生型ハエにおけるヒトTBX2トランスジーンの過剰発現を行い、致死性/生存率、眼形態、および電気生理学表現型に焦点を当てて評価した(図4).(B)機能的研究で試験されるハエを得るための交差スキーム。対照実験として常に中性UAS素子(例えば、UAS-lacZ、UAS-GFP)を使用することをお勧めします。 (C) EBF3p.R163QおよびTBX2 p.R20Q変異体の機能的研究の代表的な結果と、その結果を解釈するために必要な適切な対照実験が行われる。救助ベースの分析と過剰発現の両方の研究は、バリアントが非定型または非型の対向性として振る舞うことを明らかにします。ここに示す致死性/生存率データは、以前の出版物15,87で提示された実験データ基づいている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4:ショウジョウバエにおける眼の形態とエレクトレキノグラムに基づくヒトTBX2におけるまれな誤感変異体の機能解析(A) フライアイ上の記録および参照電極の典型的な配置を示す概略図と、4つの主要成分(オントランジェント、脱分極、オフトランジェント、再分極)。(B) TBX2バリアント(p.R20Q)は、視覚系に特有のGAL4ドライバ(ey-GAL4およびRh1-GAL4)を用いたフライアイにおける過剰発現研究に基づく部分的なLOF対立遺伝子として機能する。これは、参照TBX2が変異タンパク質と比較して強い形態学的および電気生理学的表現型を引き起こしたことを示した。(トップパネル):UAS-TBX2 +ey-GAL4の過剰発現時に目のサイズが大幅に減少します。UAS-TBX2p.R20Q.ey-GAL4で駆動すると、目も小さくなりますが、表現型ははるかに穏やかです。(下パネル):UAS-TBX2+がRh1-GAL4を用いてコアR1-R6光受容体で発現すると、オン/オフトランジェントの損失、脱分極の低減、電位(PDA)表現型後の大きな異常長期脱分極が生じ、コントロールハエには見られない。これらの表現型は、UAS-TBX2p.R20Qが同じRh1-GAL4を使用して発現される場合ほど深刻ではありません。この図は、以前の出版物69、87から採用され、修正されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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https://zfin.org
http://www.informatics.jax.org
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
遺伝とタンパク質
インタラクション データベース
文字列
https://string-db.org
http://fgrtools.hms.harvard.edu/MIST/
タンパク質構造
データベースと
モデリングツール
WWPBD
スイスモデル
モデラー
フィレ2
http://www.wwpdb.org
https://swissmodel.expasy.org/
https://salilab.org/modeller/
http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2
患者のマッチメイキング
プラットフォーム
マッチメーカー交換
ジーン・マッチャー
AGHA アーカイブ
マッチ 箱
解読
マイジーン2
フェノーム・セントラル
http://www.matchmakerexchange.org
https://www.genematcher.org
https://mme.australiangenomics.org.au/#/home
https://seqr.broadinstitute.org/matchmaker/matchbox
https://decipher.sanger.ac.uk
https://www.mygene2.org/MyGene2
https://phenomecentral.org
人間の成績証明書
ア釈と cDNA
情報のクローンを作成する
哺乳類遺伝子コレクション
エンセンブル
Refseq
https://genecollections.nci.nih.gov/MGC
http://useast.ensembl.org
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq

表 1: このプロトコルに関連するオンライン リソース。

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Discussion

ショウジョウバエメラノガスターを用した実験的研究は、疾患関連ヒト変異体の結果を評価するための堅牢なアッセイシステムを提供する。これは、過去1世紀89年にフライフィールドの多くの研究者によって生成された知識と多様な遺伝的ツールの大規模なボディによるものです.しかし、他の実験システムと同様に、存在する注意事項と制限事項を認識することが重要です。

データ マイニングに関連する注意事項
このプロトコルの最初のステップは、対象遺伝子に関連する情報のためにデータベースをマイニングすることですが、出発点としてのみ使用することが重要です。例えば、バリアント関数のシリコ予測では貴重な洞察を提供しますが、これらのデータは常に注意して解釈されるべきです。すべての主要なアルゴリズムは、ヒトの変異体が良性であると予測するいくつかの例がありますが、ショウジョウバエの機能的研究は明らかにそのような変異体24の有害な性質を実証しました。同様に、タンパク質とタンパク質の相互作用、共発現、および構造モデリングデータはすべて洞察に満ちた情報ですが、これらの大きなオミクスデータセットに擬似陽性および疑似陰性の情報が存在する可能性があります。例えば、以前に同定または予測されたタンパク質-タンパク質相互作用の一部は、人工的であるか、または特定の細胞および組織タイプでのみ見られる。

さらに、特定のタンパク質とタンパク質の相互作用が一過性であるため、これらのデータセットに捕捉されない偽陰性相互作用が多数存在する可能性があります(例えば、酵素基質相互作用)。実験的検証は、特定の遺伝子またはタンパク質が目的の生物学的文脈で生体内で遺伝的または物理的に相互作用することを実証するために重要です。同様に、相同性モデリングに基づいて予測される構造は、解析された構造ではなくモデルとして扱われるべきである。この情報は、目的とするアミノ酸がタンパク質の構造的に重要な部分に存在することが判明した場合に有用であるが、陰性データは、変異体が損傷を与える可能性を排除しない。最後に、以前に報告された遺伝子型表現型情報の一部は、パブリックデータベースにアーカイブされた一部の情報が正確でない可能性があるため、注意して扱う必要があります。たとえば、MO データベースの一部の情報は、適切に制御され、厳密に実行された実験に基づいていますが、それ以上のフォローアップ研究や厳格な制御を行っていない大画面用紙から取得される情報もあります。

T2A-GAL4戦略を用いて「人間化」実験が必ずしも成功するとは限らない
ヒトcDNを用いての救助および過剰発現ベースの機能的研究は、ヒトタンパク質の文脈における変異体の評価を可能にするが、このアプローチは必ずしも成功するとは限らない。参照ヒトcDNAがフライ変異型を救出できない場合、2つの考えられる説明があります。第1の可能性は、ヒトタンパク質が機能しないか、フライセルのコンテキストで活性が著しく低下していることです。これは、1)タンパク質発現の低下、安定性、活性および/または局在化、または2)多タンパク質複合体で働くフライタンパク質との互換性の欠如が原因である可能性があります。UAS/GAL4システムは温度に敏感であるため、ハエは比較的高温(例えば、29°C)で上昇し、この状態で救助の可能性を確認することができます。さらに、正の対照としてUASフライcDNA構築およびトランスジーンを生成することができる。関心のある変異体が保存されたアミノ酸に影響を与える場合、類似変異体は、フライオルトログのコンテキストにおける変異体の機能的研究のためにフライcDNAに導入することができる。これは必要ありませんが、ヒトcDNAトランスジェニックラインを使用すると、否定的または決定的な結果を与える場合の研究大いに役立ちます(図3)。

第二の可能性は、ヒトタンパク質の発現が細胞レベルまたは生物レベルの毒性を引き起こすことである。これは、抗型(例えば、支配的な負のタンパク質として作用する)、多形(例えば、あまりにも多くの活性)、または新生性(例えば、遺伝子の内因性機能に常に関連しないタンパク質凝集などの新規な毒性機能のゲイン)に起因する可能性がある。利息)効果。この場合、ハエを低温(例えば、18°C)に保つことは、これらの問題の一部を緩和する可能性がある。最後に、フライcDNAの過剰発現がTBX2例に見られるようにフライT2A-GAL4ラインを救出しない可能性のあるいくつかのシナリオがあり、遺伝子産物のトリクト投与量依存性に起因する可能性が高い。目的とするタンパク質の過剰発現を避けるために、目的とするフライ遺伝子をCRISPRを介して直接改変することができ、目的の変異体を含むゲノム救助構造体を設計することができ、またはLOF対立遺伝子21を用いて救助実験を行うことができる。小さな遺伝子の場合、フライゲノム救助構造体を「ヒト化」し、非保存アミノ酸24に影響を与えるヒト変異体を試験すると考えることができる。要約すると、ヒューマライゼーション実験が対象のバリアントの機能評価を許可しない場合、代替戦略を考慮する必要があります。

否定的な結果と肯定的な結果の解釈
1)参照と変異体の両方のヒトcNAが同様の程度にフライ変異型を救出し、2)試験されたすべての条件で観察される差がない場合、その変異体はショウジョウバエで機能的に区別されないと仮定することができる。生 体内。しかし、ショウジョウバエアッセイは十分に敏感でないか、目的の遺伝子/タンパク質のすべての潜在的な機能を捕捉する可能性があるため、この情報は、目的の変異体が非病原性であることを除外するのに十分ではないことに注意することが重要です。人間に関連する。一方、陽性データは、変異体がタンパク質機能に有害な影響を及ぼすことを強く示していますが、このデータだけでは病原性を主張するには不十分です。米国医学遺伝学・ゲノミクスカレッジ(ACMG)は、ヒト疾患関連遺伝子の変異体を「良性」、「可能性が高い良性」、「未知の有意性の変異体(VUS)」、「病原性の可能性が高い」に分類するための一連の基準とガイドラインを公表した。"病原性"90.この分類は、確立された疾患関連遺伝子にのみ適用され、「不確定な意義の遺伝子」(GUS)の変異体に直接適用されるものではないが、ヒト変異機能研究に関与するすべての個人は、バリアント機能を報告する際に、このガイドラインに従ってください。

MO型がヒト疾患状態をモデル化しない場合の有用な生物学的情報の抽出
特に、スコア付けされる表現型の一部は、関心のある疾患状態とほとんど関連性がない可能性があるため、過剰発現ベースの機能アッセイには限界があることに留意することが重要です。同様に、救助実験を通じて評価されている型の型は、関心のある疾患に直接的な関連性を持たない場合があります。これらの実験は無脊椎動物系の内因性の文脈の外で行われるため、疾患モデルではなく、ショウジョウバエを「生きた試験管」として用いる遺伝子機能試験として考えるべきである。

モデル生物がヒトの疾患状態を模倣していない場合でも、救助実験で使用される可似性の型は、しばしば疾患状態に有用な生物学的洞察を提供することができる。「フェノログ(非明白な相同性発動型)」91の概念は、ショウジョウバエとヒトの発動型との間の基礎となる分子的接続をさらに決定するために使用することができる。例えば、フライウィング、胸部、脚、および目の形態学的挙動は、ノッチシグナル伝達経路の欠陥に対する優れた先天性読み出しであり、心血管欠損を含む多くの先天性障害に関連する進化的に保存された経路である。人間で 62.ショウジョウバエにおける特定の現象の背後にある分子論理を理解することにより、まだ理解されていないヒトの遺伝子と現象型の間の隠された生物学的リンクを同定することができる。

臨床協力者との継続的なコミュニケーション
臨床医と協力して、患者に見られる稀な変異体の機能を研究する場合、強固な協力関係を確立することが重要です。臨床および基本的な生物医学研究者は、同じ遺伝子/遺伝的経路に興味を共有するかもしれませんが、臨床分野と科学分野の間には大きな文化的および言語的(例えば、医学専門用語、モデル生物特異的命名法)のギャップがあります。両当事者間の強固な信頼関係は、広範なコミュニケーションを通じて構築することができます。さらに、双方向通信は、この関係を確立し、維持するために不可欠です。例えば、代表的な結果セクションに記載された2つの症例において、類似のゲノタイプおよび表現型を有する追加の患者の同定、ならびにその後の機能的研究は、目的の変異体の病原性を証明するために重要であった。強力な機能データを持っていても、研究者や臨床医は、多くの場合、「n =1」症例で同定された変異体が病気の真の原因であると人間の遺伝学者を説得するのが難しい。

MO研究者は、関心のバリアントが有害であることを特定したら、他の臨床医やヒト遺伝学者とのネットワークを通して積極的に一致する症例を特定できるように、できるだけ早く臨床協力者に連絡することが重要です。Geno2MP [メンデリアン表現型に対するジェノタイプ: ワシントン大学メンデリアンゲノミクス研究41に登録された9,650人の非同定データベース;遺伝性疾患を有する]を持つことは、同じ障害を有する可能性のある個人を評価するために検索することができる。その後、リード臨床医は、メッセージング機能を使用して連絡することができます。

あるいは、GeneMatcherを使用して、臨床医、基礎研究者、および同じ遺伝子に興味を持つ患者のためのマッチメイキングウェブサイトを使用して、希少な変異体を運ぶ追加の患者を特定することができます。GeneMatcherはマッチメーカー交換42と呼ばれるマッチメイキングウェブサイトのより大きな統合ネットワークの一部であるため、オーストラリアのゲノミクスヘルスアライアンス患者アーカイブ、ブロードマッチボックスを含む世界中の追加のデータベースを検索することができます、単一のGeneMatcher遺伝子提出におけるDECIPHER、MyGene2、およびフェノメセントラル。GeneMatcherへの参加は「研究者」として可能ですが、試合後に他の臨床医とのコミュニケーションには一定のレベルの医療が必要なため、基本的な科学者は臨床協力者と共にこのウェブサイトを利用することをお勧めします。専門 知識。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

私たちは、原稿の批判的な読み取りのためにホセサラザール、ジュリア王、カレン・シュルツ博士に感謝します。我々は、ここで議論したTBX2変異体の機能特性に関して、ニン・リウ博士とXi Luo博士を認める。未診断疾患ネットワークモデル生物スクリーニングセンターは、国立衛生研究所(NIH)共通基金(U54 NS093793)を通じて支援されました。H. T. C. はさらに、NIH[CNCDP-K12 および NINDS(1K12 NS098482)]、米国神経学アカデミー(神経科学研究助成金)、バロウズウェルカム基金(医学科学者キャリア賞)、児童神経学会および小児神経学財団()PERFエルターマン助成金)とNIHディレクターの早期独立賞(DP5 OD026426)。M.F.W.はサイモンズ財団(SFARI賞:368479)によってさらに支援されました。S.Y.はさらに、NIH(R01 DC014932)、サイモンズ財団(SFARI賞:368479)、アルツハイマー病協会(新研究者研究助成金:15-364099)、ナマン家族基礎研究基金、キャロライン・ウィーズ研究のための法律基金によってさらに支援されました。分子医学BCMの共焦点顕微鏡検査は、NIHグラントU54HD083092によって知的発達障害研究センター(IDDRC)神経可視化コアに一部サポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator

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