En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

Genetics

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Gevedon, O., Bolus, H., Lye, S. H., Schmitz, K., Fuentes-González, J., Hatchell, K., Bley, L., Pienaar, J., Loewen, C., Chtarbanova, S. In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59720, doi:10.3791/59720 (2019).

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Abstract

Hay mucho que entender sobre la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo los genes subyacentes responsables. El cribado genético hacia adelante utilizando mutágenos químicos es una estrategia útil para mapear fenotipos mutantes a genes entre Drosophila y otros organismos modelo que comparten vías celulares conservadas con los seres humanos. Si el gen mutado de interés no es letal en las primeras etapas de desarrollo de las moscas, se puede llevar a cabo un ensayo de escalada para detectar indicadores fenotípicos de disminución del funcionamiento cerebral, como bajas tasas de escalada. Posteriormente, el análisis histológico secundario del tejido cerebral se puede realizar con el fin de verificar la función neuroprotectora del gen mediante la puntuación de fenotipos de neurodegeneración. Las estrategias de mapeo genético incluyen mapeo meiótico y deficiencia que se basan en estos mismos ensayos pueden ser seguidos por la secuenciación del ADN para identificar posibles cambios de nucleótidos en el gen de interés.

Introduction

Las neuronas son en su mayor parte post-mitotica sin dividir1,2. En la mayoría de los animales, existen mecanismos neuroprotectores para mantener estas células a lo largo de la vida útil del organismo, especialmente a la edad anterior cuando las neuronas son más vulnerables al daño. Los genes subyacentes a estos mecanismos se pueden identificar en mutantes que presentan neurodegeneración, un indicador fenotípico para la pérdida de neuroprotección, utilizando un protocolo genético directo. Las pantallas genéticas delanteras que utilizan mutágenos químicos como el metanoesulfonato etílico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU) son particularmente útiles debido a las mutaciones de puntos aleatorios que inducen, lo que resulta en un enfoque inherentemente imparcial que ha arrojado luz sobre numerosas funciones genéticas en los organismos modelo eucariotas3,4,5 (en contraste, la mutagénesis de rayos X crea roturas de ADN y puede dar lugar a reorganización en lugar de mutaciones puntuales6).

La mosca fruta común Drosophila melanogaster es un tema ideal para estas pantallas debido a su alta calidad, secuencia de genoma bien anotada, su larga historia como organismo modelo con herramientas genéticas altamente desarrolladas, y lo más significativo, su compartido historia evolutiva con los seres humanos7,8. Un factor limitante en la aplicabilidad de este protocolo es la letalidad temprana causada por los genes mutados, lo que impediría las pruebas a la edad de9años. Sin embargo, para las mutaciones no letales, un ensayo de escalada, que aprovecha la geotaxis negativa, es un método simple, aunque extenso, para cuantificar el funcionamiento motor deteriorado10. Para exhibir suficiente reactividad locomotora, las moscas dependen de las funciones neuronales para determinar la dirección, detectar su posición y coordinar el movimiento. Por lo tanto, la incapacidad de las moscas para subir lo suficiente en respuesta a los estímulos puede indicar defectos neurológicos11. Una vez que se identifica un fenotipo de escalada defectuoso en particular, se pueden utilizar más pruebas utilizando una pantalla secundaria como el análisis histológico del tejido cerebral para identificar la neurodegeneración en moscas que escalan. La cartografía genética posterior se puede utilizar para revelar la región genómica en el cromosoma que lleva el gen neuroprotector defectuoso de interés. Para reducir la región cromosómica de interés, se puede realizar un mapeo meiotico utilizando líneas volantes mutantes que transportan genes marcadores dominantes con ubicaciones conocidas en el cromosoma. Los genes marcadores sirven como punto de referencia para la mutación, ya que la frecuencia de recombinación entre dos loci proporciona una distancia medible que se puede utilizar para mapear la ubicación aproximada de un gen. Por último, el cruce de las líneas mutantes con líneas que llevan deficiencias equilibradas en la región cromosómica meiotamente mapeada de interés crea una prueba de complementación en la que se puede verificar el gen de interés si se expresa su fenotipo conocido5. Las secuencias de nucleótidos polimórficos en el gen identificado, lo que puede resultar en secuencias de aminoácidos alteradas, se pueden evaluar secuenciando el gen y comparándolo con la secuencia del genoma de Drosophila. La caracterización posterior del gen de interés puede incluir pruebas de alelos mutantes adicionales, experimentos de rescate de mutaciones y examen de fenotipos adicionales.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Major equipment
Fume hood for histology
Light Microscope Nikon Eclipe E100 Preferred objective for imaging is 20x
Imaging software Nikon
Microscope Camera Nikon
Thermal cycler Eppendorf
Fly pushing and climbing assay
VWR® Drosophila Vial, Narrow VWR 75813-160
VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-912
Standard mouse pad
Stereoscope Motic Model SMZ-168
CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) Genesee Scientific 54-104, 59-121, 59-172 Doesn’t iinclude CO2 tank
Fine-Tip Brushes SOLO HORTON BRUSHES, INC.
Drosophila Incubator VWR 89510-750
Gene mapping
CantonS Bloomington Drosophila Stock Center 9517
w1118 Bloomington Drosophila Stock Center 5905
yw  Bloomington Drosophila Stock Center 6599
Drosophila line used for recombination mapping Bloomington Drosophila Stock Center 3227 Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3
CyO/sno[Sco]  Bloomington Drosophila Stock Center 2555 Drosophila balancer line used for recombination mapping
Deficiency Kit for chromosome 2L Bloomington Drosophila Stock Center DK2L Cook et al., 2012
Histology analysis
Ethanol, (100%) Thermo Fischer Scientific A4094
Chloroform Thermo Fischer Scientific C298-500
Glacial Acetic Acid Thermo Fischer Scientific A38-500
Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Thermo Fischer Scientific 05-408-129
Histochoice clearing agent 1x VWR Life Sciences 97060-934
Harris Hematoxylin VWR 95057-858
Eosin VWR 95057-848
Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium Thermo Scientific™ 4112 22-110-610 CyO/sna[Sco]
Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus Azer Scientific
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles Fisherbrand 12-545M Dimensions: 24 mm x 60 mm
Traceable timer VWR
Slide Warmer Barnstead International model no. 26025
Slide tray and racks DWK Life Sciences Rack to hold 20 slides
Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps Fisherbrand 10-316A
Kimwipes™ Kimberly-Clark™ Professional 
6 inch Puritan applicators Hardwood Products Company, Guilford, Maine 807-12
VWR® Razor Blades VWR 55411-050
Tupperware or glass containers for histology liquids 16 + 1 for running water
High Profile Coated Microtome Blades VWR 95057-834
Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4 L Corning™
Beaker Or other container for ice water and cassettes
Tissue Bath Precision Scientific Company 66630
Microtome Leica Biosystems
Molecular analysis
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9282
Ex Taq DNA polymerase TaKaRa 5 U/μl
Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain   Invitrogen™
UltraPure™ Agarose  Invitrogen™
1 Kb Plus DNA Ladder  Invitrogen™
ApE-A plasmid Editor software Available for free download
Statistical analysis
R software package
Further analysis
y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] Bloomington Drosophila Stock Center 59967

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References

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