Ensaio de coincubação para quantificar interações competitivas entre isolados de Vibrio fischeri

Immunology and Infection

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Summary

As bactérias codificam mecanismos diversos para acoplar na competição interbacteriana. Aqui, apresentamos um protocolo baseado na cultura para caracterizar interações competitivas entre isolados bacterianos e como eles impactam a estrutura espacial de uma população mista.

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Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

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Abstract

Este manuscrito descreve um ensaio de coincubação à base de cultura para detectar e caracterizar interações competitivas entre duas populações bacterianas. Este método emprega plasmíos estáveis que permitem que cada população seja diferencialmente marcada com capacidades de resistência a antibióticos distintas e proteínas fluorescentes para seleção e discriminação visual de cada população, respectivamente. Aqui, nós descrevemos a preparação e a coincubação de tensões competindo do fischeri do Vibrio , a imagem latente da microscopia de fluorescência, e a análise quantitativa dos dados. Essa abordagem é simples, produz resultados rápidos e pode ser usada para determinar se uma população mata ou inibe o crescimento de outra população, e se a competição é mediada por uma molécula diffusible ou requer contato direto com células celulares. Como cada população bacteriana expressa uma proteína fluorescente diferente, o ensaio permite a discriminação espacial de populações concorrentes dentro de uma colônia mista. Embora os métodos descritos sejam realizados com a bactéria simbiótica V. fischeri utilizando condições otimizadas para esta espécie, o protocolo pode ser adaptado para a maioria dos isolados bacterianos culturáveis.

Introduction

Este manuscrito descreve um método baseado em cultura para determinar se dois isolados bacterianos são capazes de interações competitivas. Ao estudar populações mistas, é importante avaliar em que medida os isolados bacterianos interagem, particularmente se os isolados estão competindo diretamente através de mecanismos de interferência. A competição de interferência refere-se a interações em que uma população inibe diretamente o crescimento ou mata uma população concorrente1. Essas interações são importantes para se identificar, pois podem ter efeitos profundos sobre a estrutura e a função de uma comunidade microbiana2,3.

Os mecanismos para a competição microbiana foram descobertos extensamente nos genomas das bactérias dos ambientes diversos que incluem bactérias host-associadas e Free-Living4,5,6,7, 8,9. Uma variedade de estratégias da competição foi descrita10,11 que incluem mecanismos diffusible, tais como produtos químicos bactericida1,12 e peptídeos antimicrobianos secretado13 , bem como mecanismos dependentes de contato que necessitam de contato celular para transferir um efetor inibitório para as células-alvo9,14,15,16,17 ,18.

Embora as coincubações baseadas na cultura sejam comumente usadas na microbiologia5,8,19, este manuscrito descreve como usar o ensaio para caracterizar o mecanismo de competição, bem como sugestões para adaptar o protocolo para uso com outras espécies bacterianas. Além disso, este método descreve múltiplas abordagens para analisar e apresentar os dados para responder a diferentes questões sobre a natureza das interações competitivas. Embora as técnicas descritas aqui fossem usadas previamente para identificar o mecanismo interbacteriano da matança que subjacente a competição intraespecífica entre tensões simbiótica de bactérias coisolated do fischeri do Vibrio 19, são apropriadas para muitas espécies bacterianas que incluem isolados ambientais e micróbios patogénicos humanos, e podem ser utilizadas para avaliar mecanismos competitivos Contact-dependent e diffusible. As etapas no protocolo podem exigir otimização para outras espécies bacterianas. Dado que mais sistemas modelo estão expandindo seus estudos além do uso de organismos isogênicos para incluir diferentes genótipos10,16,20,21, este método será um recurso valioso para os investigadores que procuram compreender como a concorrência Impacta os sistemas multiestirpe ou multiespécies.

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Protocol

1. Prepare cepas para coincubação

  1. Escolha uma cepa de referência apropriada que servirá como alvo para a competição bacteriana durante o ensaio de coincubação. Consulte a discussão sobre as melhores práticas ao selecionar uma deformação de referência e como a deformação de referência impactará os resultados. Neste protocolo, V. fischeri Strain ES114 servirá como a cepa de referência.
  2. Determinar quais métodos de seleção e triagem serão usados para distinguir entre os isolados em coincubação
    1. Tipicamente, as cepas de transformação com plasmídos estáveis contendo diferentes genes de resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina ou cloranfenicol) para selecionar para cada cepa, bem como os genes que codificam diferentes proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP ou RFP) para visualmente diferenciando tipos de estirpe na cocultura.
      Nota: O uso de plasmídeo estáveis é necessário, pois se uma cepa perde o plasmídico na ausência de seleção, então os números desta cepa serão subestimados quando quantificados, e não serão visualmente detectáveis usando microscopia de fluorescência.
    2. Tag coincubado cepas V. fischeri diferencialmente de tal forma que uma cepa contém o plasmídeo pVSV102, que expressa uma proteína verde fluorescente (GFP) e resistência ao antibiótico canamicina (KanR), e a segunda estirpe contém plasmídeo pVSV208, que expressa uma proteína vermelha fluorescente (dsRed) e resistência ao antibiótico cloranfenicol (cmR)22.
      Nota: Outras seleções diferenciais podem ser usadas para distinguir cepas coincubantes. Consulte discussão para obter métodos adicionais.
    3. Inclua o seguinte controle durante a otimização inicial do ensaio de coincubação para garantir que a seleção seja robusta. Placa de cada cepa que é diferencialmente marcada em placas de agar contendo o antibiótico que deve selecionar contra ele (ou seja, tensão de placa 1 na mídia que seleciona para a tensão 2, e vice-versa).
  3. Dois dias antes do ensaio de coincubação, estirpe de referência pVSV102, estirpe de referência pVSV208 e cada estirpe concorrente pVSV208 de-80 ° c em placas de agar LBS contendo o antibiótico adequado (por exemplo, 100 μg/mL de canamicina ou 2 μg/mL cloranfenicol) e incubar durante a noite a 24 ° c. A seleção de antibióticos é necessária para garantir que todas as células contenham o plasmídeo no início do experimento.
  4. Um dia antes do ensaio, escolha e restreak quatro colônias individuais por tipo de deformação (repetições biológicas) em placas de agar libras frescas com antibiótico adequado e incubadas durante a noite a 24 ° c.
    Nota: Esta etapa pode exigir a optimização para outras espécies bacterianas, porque uns tempos mais longos ou mais curtos da incubação podem ser exigidos para obter pilhas suficientes dependendo da taxa de crescimento do organismo do interesse.

2. coincubar cepas bacterianas

  1. Preparação de cada cepa bacteriana para incubação (Figura 1a)
    1. Usando um palito de dente estéril, raspar as células da placa de agar (tanto quanto o tamanho de um grão de arroz) e re-suspender as células em um tubo de microcentrífuga 1,5 mL contendo 1 mL de caldo LBS. Quebre os aglomerantes de células pressionando-os para o lado do tubo e pipetando para cima e para baixo vigorosamente.
    2. Tampe o tubo e o Vortex para 1-2 s. Se os grupos de células ainda estiverem visíveis, continue a vórtice ou pipeta para cima e para baixo até que a amostra seja visualmente uniforme.
    3. Repita os passos 2.1.1-2.1.2 para todas as amostras.
  2. Medir e gravar a densidade óptica em 600 nm (OD600) para todas as amostras. As amostras provavelmente precisarão ser diluídas até dez vezes usando o caldo LBS para obter uma medição de OD precisa. Normalize cada amostra para o OD desejado600. As cepas são tipicamente normalizadas para um OD600 ~ 1,0, que se traduz em ~ 106 bactérias/ml para V. fischeri.
    Nota: Esta etapa pode exigir otimização para diferentes espécies bacterianas, pois a densidade de células de ininoculantes Impacta os resultados da coincubação, dependendo do mecanismo de competição. Veja a discussão para otimização.
  3. Estirpes Coincubantes (Figura 1b, C)
    1. Misture a cepa de referência e a cepa concorrente em uma proporção de 1:1 (v/v) adicionando 100 mL de cada cepa (normalizada a OD 1,0) a um tubo de centrífuga de 1,5 mL rotulado. Como controle, misture a cepa de referência com uma versão diferencialmente marcada de si mesma (deformação de referência pVSV102 + deformação de referência pVSV208). Esse controle é necessário para posterior análise estatística para determinar se a presença de uma cepa concorrente impacta o crescimento da cepa de referência. Vórtice da cultura de estirpe mista para 1-2 s.
      Nota: Esta etapa pode exigir a otimização, pois a razão inicial pode afetar significativamente os resultados e pode precisar ser ajustada. Veja a discussão para otimização.
    2. Repita o passo 2.3.1 para cada repetição biológica. Após completar esta etapa, deve haver um total de oito tubos de deformação mista: quatro repetições biológicas com cepas de referência diferencialmente marcadas (controle) e quatro repetições biológicas com referência diferencialmente marcada e cepas concorrentes ( experimental).
    3. Spot 10 mL de cada controle e mistura experimental para placas de Petri contendo Agar LBS; Estes pontos da cultura serão usados para a microscopia de fluorescência após a incubação.
    4. Deixe os pontos secar completamente no banco até que todo o líquido tenha sido absorvido no agar e incubar as placas de Petri a 24 ° c por 24 h. Um mínimo de 15 h é necessário para cepas de V. fischeri marcadas com PVSV102 e pVSV208 para crescer para uma densidade de células suficientemente alta para visualizar GFP e RFP, respectivamente, no nível da população usando um microscópio de dissecação de fluorescência. Aqui, usamos uma incubação de 24 h para pontos de imagem misturados.
      Nota: É importante usar as placas que não são demasiado húmidas ou demasiado secas. Se as placas estiverem demasiado húmidas, os pontos de coincubação não serão absorvidos na placa de agar; Evite usar as placas derramadas no mesmo dia. Se as placas estiverem muito secas, pequenas ondas ou rachaduras podem se formar na superfície do ágar, tornando os pontos de coincubação irregulares em forma.
    5. Usando as mesmas suspensões bacterianas como na etapa 2.3.3, Spot 10 mL de cada controle e misturas experimentais em 24-bem placas contendo 1 mL de LBS Agar por poço. Como na etapa 2.3.3, assegure-se de que o ágar em 24 placas do poço tenha a umidade apropriada. Deixe as manchas secar completamente e incubar a 24 ° c por 5 h. Esses pontos de cultura serão utilizados para quantificar as unidades formadoras de colônias (CFUs) para cada cepa no final do experimento.
      Nota: A detecção de suspensões bacterianas para o crescimento em poços individuais permite a reressuscita mais fácil no ponto de tempo final. Esta etapa pode ser conseguida usando as partes estéreis quadradas do filtro como uma aproximação mais econômica a usar 24 placas do poço. As partes quadradas estéreis do filtro podem ser coloc em uma placa do agar e 10 mL de cada mistura experimental podem ser manchadas nestes filtros, um pouco do que em 24 placas do poço. Após o tempo de coincubação, os filtros podem ser transferidos para um tubo de centrifugação de 1,5 mL e o ponto de coincubação pode ser ressuspenso por vortexing ou pipetagem para cima e para baixo. Um tempo de incubação de 5 h é suficiente para detectar a matança interbacteriana entre os isolados de V. fischeri 19, no entanto, esse tempo de coincubação pode precisar ser mais curto ou mais longo para outras espécies ou mecanismos competitivos. Consulte a discussão para obter mais detalhes.
  4. Diluição em série para o início do inum
    1. Para executar uma diluição em série de misturas de coincubação de partida, gire uma placa 96-well 90 ° assim que há oito colunas e doze fileiras. Cada linha conterá uma amostra da mistura não diluída na primeira coluna seguida de diluições seriadas de 7 10 vezes nos poços restantes da linha (Figura 2a).
    2. Rotule cada linha com o ID de deformação, o número replicada e a hora (invacinação inicial = T0). Rotule as placas de agar LBS suplementadas com o antibiótico apropriado para detectar a série de diluição. Certifique-se de identificar qual cepa cada placa antibiótica está selecionando para.
    3. Usando uma pipeta multicanal, adicione 180 mL de caldo LBS a cada poço, deixando a primeira coluna vazia para a mistura de coincubação não diluída.
      Nota: Os pesquisadores podem optar por usar soro tamponado de fosfato (PBS) para ressuscitam manchas de coincubação e executar a diluição em série se trabalhar com uma espécie bacteriana particularmente rápido crescimento ou consistentemente realizando grandes experimentos onde diluições seriais podem tomar um longo tempo para executar. Usando PBS nestes casos impedirá o conseqüência significativo das bactérias durante o processo de executar diluições de série. No entanto, é importante ser consistente com qual solução é usada (por exemplo, PBS ou LBS) em todos os experimentos, independentemente de seu tamanho ou duração.
    4. Utilizando uma pipeta de canal único de 200 mL, transfira 100 mL da mistura de coincubação do tubo para a primeira coluna bem. Descarte a ponta e repita para todas as misturas de coincubação.
    5. Usando uma pipeta multicanal, transfira 20 mL da coluna 1 para a 2 e misture pipetando para cima e para baixo. Descarte as pontas e repita para cada coluna de modo que, no final, cada linha contenha uma diluição em série de dez vezes da mistura inicial de coincubação.
      Nota: Seja consistente com o número de vezes que as diluições são pipetadas para cima e para baixo. Por exemplo, pressione a alça da pipeta cinco vezes para que cada diluição seja consistente em toda a série de diluição.
    6. Usando uma pipeta multicanal equipada com oito pontas, aspirar 5 mL de cada poço em uma série de diluição (ou seja, uma fileira de oito poços) e Spot-lo na placa de agar LBS que seleciona para a cepa de referência (suplementado com canamicina). Repita este passo para a seleção da placa para a estirpe concorrente (suplementada com cloranfenicol) (Figura 2b). Deixe as manchas secar completamente antes de colocar na incubadora.
      Nota: As mesmas pontas podem ser usadas para manchar uma série da diluição da repetição nas placas que selecionam para a referência e a tensão do concorrente, mas devem ser mudadas entre repetições. Evite tocar no final da ponta da pipeta para as placas de agar LBS, pois isso pode criar uma depressão que pode se assemelhar a uma colônia bacteriana e distorcer os resultados durante contagens de placas. Se a ponta toca na placa, faça uma nota e não inclua a depressão em contagens da colônia.
  5. Tendo T medições finais
    1. Após os pontos de coincubação nas placas de 24 poços terem sido incubados por 5 h a 24 ° c, adicionar 1 mL de caldo LBS a cada poço e ressuscitar os pontos de coincubação por pipetagem para cima e para baixo até que todas as células sejam resrepended. Seja consistente com o vigor em que as células são ressuscipended em todas as repetições. Por exemplo, pressione a alça da pipeta oito vezes para suspender totalmente cada amostra.
    2. Uma vez que cada ponto de coincubação é reativado, prepare uma placa de 96 poços para uma diluição serial e placas de agar LBS com os antibióticos apropriados para detectar a diluição da mesma forma que o passo 2.4.1.
    3. Execute as etapas 2.4.2-2.4.6 para concluir a diluição serial para medições finais T.
      Nota: Um importante controle deve ser incluído durante a otimização inicial do ensaio de coincubação. No final do período de coincubação, a placa de cepas mistas para a mídia que inclui ambos os antibióticos. Nenhuma estirpe deve poder crescer a menos que 1) uma mutação espontânea ocorra, ou 2) os marcadores selecionáveis são trocados entre tensões.

3. visualizando Coincubações usando microscopia de fluorescência

  1. Imagem cada ponto de coincubação em placas de Petri de agar LBS das etapas 2.3.3 e 2.3.4 usando um microscópio estéreo equipado para detecção de fluorescência verde e vermelha, que correspondem com as proteínas de fluorescência sendo expressas nos plasmímetros estáveis.
  2. Comece tomando imagens do ponto de coincubação de controle (cepa de referência pVSV102 + deformação de referência pVSV208).
    1. Ajuste a ampliação para que o ponto esteja em foco.
    2. Usando a luz e o filtro apropriados da excitação para observar GFP, ajuste o tempo da exposição assim que somente a fluorescência do ponto da coincubação é detectável e toda a fluorescência do fundo dos meios é baixa ou não visível.
    3. Mude a luz e o filtro da excitação para observar RFP, ajustando o tempo da exposição para minimizar o fundo do meio.
  3. Para cada ponto de coincubação dos tratamentos experimentais, imagem para a cepa de referência utilizando o filtro GFP e o tempo de exposição determinado na etapa 3.2.2.
  4. Imagem a cepa concorrente usando o filtro RFP, ajustando o tempo de exposição para que a fluorescência só é observada a partir do ponto de coincubação e fluorescência de fundo do meio é mínima. Salve ambas as imagens e nomeie-as para incluir ambas as IDs de deformação, o número replicando, o tempo de incubação quando a imagem foi tirada (por exemplo, 24 h). Repita para todas as repetições.
    Nota: O tempo de coincubação pode necessitar de ser ajustado para diferentes plasmíos ou espécies bacterianas. Veja a discussão para otimização.

4. análise de dados

  1. Calculando CFUs para cada controle e tratamento experimental em cada ponto temporal (T início e T final)
    1. Uma vez que as colônias são visíveis em placas de diluição seriais (por exemplo, 24 h a 24 ° c para V. fischeri), identifique o fator de diluição onde as colônias individuais podem ser contadas e não cresceram juntas em grandes aglomerados Multicolônias (Figura 2b). Para cada repetição, conte e registre o número de colônias individuais para uma determinada diluição. Esse número representa o CFUs para essa replicação.
    2. Converter CFUs para a diluição para CFUs total para cada cepa na coincubação usando a fórmula abaixo:
      [CFUs ÷ (fator de diluição x Vol. de ponto de diluição)] x Vol. da amostra não diluída = CFUs total
      Exemplo: T0: [(6 CFUs) ̧ (10 ^-6 x 0, 5 mL)] x [0, 1 mL] = 1,2 E7 CFUs total da cepa 1 no ponto misto no início do experimento
      T5: [(4 CFUs) ̧ (10 ^-3 x 0, 5 mL)] x [1,0 mL] = 8,0 E5 CFUs total da cepa 1 no ponto misto após 5 h de coincubação
      Os valores de CFU para cada cepa em cada ponto de tempo são os dados brutos que podem ser usados para várias análises e testes estatísticos diferentes (ver seção 4,2 abaixo).
  2. Realize as seguintes transformações de dados para determinar se uma cepa concorrente supera a deformação de referência por: (i) determinar se a proporção da deformação de referência diminui na presença da cepa concorrente, ou (II) calcular o índice competitivo relativo do registro (RCI). Essas análises convertem os dados brutos em rácios e podem ser úteis para determinar o resultado competitivo de uma interação, mas não conseguem determinar o mecanismo da concorrência (ou seja, matar vs inibição do crescimento).
    1. Calculando a proporção de cada cepa para cada ponto de tempo durante a coincubação
      1. Converta dados CFU para a proporção de cada cepa em um tratamento. Para a cepa de referência (RS) em T0, divida o CFUs total para a cepa de referência em T0 pela soma dos CFUs totais para a cepa de referência e o concorrente (CS) em T0:
        RST0 cfus ÷ (RST0 Cfus + csT0 cfus) = proporção de deformação de referência em T0.
        Realize o mesmo cálculo para determinar a proporção da cepa concorrente em T0:
        CST0 cfus ÷ (RST0 Cfus + csT0 cfus) = proporção de deformação de referência em T0
        Repita esse processo para cada ponto de tempo e replicar para o tratamento experimental e o tratamento de controle (coincubação de deformação de referência diferencialmente marcada).
      2. Gráfico a proporção média de cada tipo de deformação em T0 e T5 em um gráfico de barras empilhadas (Figura 3a).
      3. Certifique-se de que a razão inicial desejada das cepas foi obtida. Para as coincubações em que as cepas foram inicialmente misturadas 1:1, cada tipo de deformação deve incluir ~ 0,5 da população em T0 e não deve ser estatisticamente diferente entre si usando o teste t de Student (P > 0, 5). Se a proporção de uma estirpe for significativamente maior do que a da outra estirpe em T0, repita o experimento até que seja alcançada uma razão de partida de 1:1.
      4. Determine se a cepa concorrente compreende uma proporção significativamente maior da população após 5 h. realize um teste t de Student comparando a proporção de cada cepa no tratamento experimental em T0 e T5. Se a proporção de estirpe concorrente for significativamente diferente da estirpe de referência em T5 (P < 0, 5), este resultado sugere que a competição de estirpe pode ter ocorrido. Prossiga para o passo 4.2.1.5.
      5. Para determinar se a presença da cepa concorrente reduziu a proporção da cepa de referência após 5 h, realize um teste t de Student comparando a proporção da cepa de referência no controle com a proporção da cepa de referência no tratamento experimental (cepa de referência v estirpe concorrente).
        Nota: se a proporção da cepa de referência for estatisticamente menor no tratamento experimental em relação ao controle (P < 0, 5), a cepa concorrente reduziria significativamente a proporção da cepa de referência após 5 h e superou a cepa de referência.
    2. Calculando o valor do log RCI para cada tratamento (incluindo o controle)
      Nota: O índice competitivo relativo, ou RCI, é um único valor que compara como a proporção final de tipos de deformação difere da taxa inicial. O valor de RCI é transformado em log de tal forma que um valor de log RCI maior que zero indica que a cepa concorrente (CS) superou a cepa de referência (RS), um valor de log RCI menor que zero indica que a cepa de referência superou a cepa concorrente, e um log RCI valor de zero indica que nenhuma cepa foi supercompetida.
      1. Calcule os valores de log RCI para cada controle e tratamento experimental usando a seguinte equação:
        Log [(CST5 CFU ̧ RST5 cfus) ̧ (csT0 CFU ̧ RST0 cfus)] = log RCI
      2. Os valores de RCI de log de gráfico usando uma caixa separada & plotagem de bigodes onde os dados são representados graficamente na direção horizontal (Figura 3B).
      3. Determine se cada tratamento foi significativamente diferente de zero realizando o teste t de um aluno comparando os valores de log RCI de cada tratamento (incluindo o controle) a um conjunto de dados comparando o mesmo número de repetições todos com um valor zero. Se os valores do log RCI para o tratamento experimental são estatisticamente maiores que zero (P < 0, 5), então a cepa concorrente superou a cepa de referência.
        Nota: O controle não deve ser estatisticamente diferente de zero (P > 0, 5), pois as cepas de referência diferencialmente marcadas são isogênicas.
      4. Realize o teste t de Student para determinar se os valores de RCI de log para o tratamento experimental foram significativamente maiores que o controle (P < 0, 5). Se os valores do log RCI do tratamento experimental são estatisticamente maiores do que o tratamento de controle, a cepa concorrente superou a cepa de referência.
  3. Realize a seguinte análise estatística para determinar o mecanismo pelo qual a cepa concorrente supera a cepa de referência: (i) analisar dados brutos de CFU total, ou (II) examinar a porcentagem de recuperação da cepa de referência. Essas análises podem ser mais complicadas para ver em relação àquelas da etapa 4,2, mas identificarão se a cepa concorrente supera a cepa de referência ao superá-la, inibindo o crescimento da deformação de referência ou eliminando ativamente a deformação de referência.
    1. Analisando dados totais brutos do CFU
      1. Dados brutos totais do CFU do gráfico para ambas as cepas usando um gráfico de dispersão intercalada, onde as réplicas são mostradas como pontos de dados individuais (figura 4a). Exiba dados em uma escala de log e adicione uma linha horizontal indicando o CFUs T0 médio para ambas as cepas.
      2. Para determinar se a presença da cepa concorrente afetou negativamente a cepa de referência, realize um teste t de Student comparando os CFUs de referência para os tratamentos de controle e experimentais em T5. Se a cepa de referência CFUs no tratamento experimental for estatisticamente menor do que no controle (P < 0, 5), então a presença da cepa concorrente afetou significativamente a cepa de referência.
      3. Para determinar se a presença da cepa concorrente inibiu o crescimento ou eliminou a cepa de referência, realize um teste t de Student comparando a cepa de referência CFUs em T0 e T5 para os tratamentos de controle e experimentais.
        Nota: Na ausência de um concorrente, a cepa de referência deve mostrar um aumento significativo na CFU quando comparado T0 e T5 para o tratamento de controle. Ao analisar o tratamento experimental, se a cepa de referência CFUs em T5 não for estatisticamente diferente comparada ao T0 (P > 0, 5), a cepa concorrente inibiu o crescimento da cepa de referência. Se a cepa de referência T5 CFUs for significativamente menor que os CFUs T0 (P < 0, 5), então a cepa concorrente matou a cepa de referência.
    2. Calculando a recuperação percentual da cepa de referência
      1. Transforme dados totais do CFU para a cepa de referência (RS) em dados de recuperação por cento usando a equação abaixo:
      2. (RST5 cfus ̧ RST0 cfus) x 100 =% recuperação de deformação de referência
      3. Exiba a porcentagem de recuperação da deformação de referência usando um gráfico de barras separado, onde cada barra representa o controle ou o tratamento experimental (Figura 4B). Adicione uma linha tracejada em y = 100 para indicar 100% de recuperação de deformação de referência (sem aumento ou diminuição na cepa de referência CFUs de 0 h a 5 h).
      4. Para determinar se a cepa concorrente afetou negativamente a cepa de referência, realize um teste t de Student comparando a recuperação de porcentagem de referência para o tratamento de controle para o tratamento experimental. Se a recuperação percentual é significativamente menor do que o controle (P < 0, 5), em seguida, a cepa concorrente afetou negativamente a cepa de referência.
      5. Para identificar se a cepa concorrente inibiu o crescimento ou eliminou a cepa de referência, realize um teste t de Student comparando a recuperação de porcentagem de referência para o tratamento experimental e um conjunto de dados com o mesmo número de repetições, todos com um valor de 100.
        Nota: Se o tratamento experimental não for estatisticamente diferente de 100 (P > 0, 5), a cepa concorrente inibiu o crescimento da cepa de referência. Se a recuperação por cento de deformação de referência no tratamento experimental for significativamente menor que 100 (P < 0, 5), então a cepa concorrente matou a cepa de referência.
    3. Interpretar imagens de microscopia de fluorescência
      1. Uma vez que as imagens da microscopia de fluorescência são tomadas, determine se cada tensão é visivelmente detectável no ponto de coincubação. Para a coincubação de controle (cepa de referência pVSV102 + cepa de referência pVSV208), tanto a GFP quanto a RFP devem ser visíveis a partir de um ponto de coincubação. Se esse não for o caso, configure o experimento novamente, garantindo que as cepas sejam corretamente rotuladas e coincuficadas em placas sem antibióticos.
      2. Para cada ponto de coincubação experimental, verifique se há possíveis resultados.
        Nota: Se a cepa concorrente for visível, mas a cepa de referência não for detectada, isso sugere que a cepa concorrente matou ou inibiu o crescimento da cepa de referência. Se ambas as cepas estiverem presentes e uniformemente misturadas (GFP e RFP presentes ao longo do ponto de coincubação), esses dados sugerem que a cepa concorrente não compete com a cepa de referência e ambas as cepas coexistem. Se ambas as cepas estão presentes, mas são separadas espacialmente (microcolônias de GFP ou RFP estão presentes ao longo do ponto de coincubação), que sugere a cepa de referência e a cepa concorrente pode estar engajando em interações competitivas e modificações para pode ser necessária a estirpe de referência ou a relação inicial de coincubação. Consulte a discussão para obter mais detalhes.

5. determinando se a interação é dependente do contato

Nota: Se você achar que uma cepa mata ou inibe a cepa de referência, a interação pode ser diffusible ou dependente do contato. Para determinar se a interação é dependente do contato da célula-célula, realize um ensaio de coincubação conforme descrito acima para as etapas 1-2 com as seguintes modificações.

  1. Execute as etapas 1.1-2.2.
  2. Uma vez que as cepas são normalizadas, fisicamente separar cepas usando um filtro de nitrocelulose com um tamanho de poros de 0,22 mm. Este tamanho de poros permite a difusão de antimicrobianos e pequenas moléculas, mas previne o contato físico entre as células V. fischeri .
    Nota: Se a interação for dependente do contato célula-celular, a separação da cepa de referência da cepa concorrente com o filtro deve revogar o fenótipo de morte ou inibição e a cepa de referência não deve ter reduzido cfus. Se a interação não é dependente do contato da célula-pilha, e é um mecanismo diffusible, separar as tensões não deve impedir que a tensão do concorrente mate a tensão da referência.
    1. Spot 5 mL da cepa de referência para o centro de um filtro e Spot 5 mL da cepa concorrente para o centro de um filtro diferente. Coloque o filtro que contém a deformação de referência na superfície de uma placa de agar LBS. Coloque o filtro que contém a estirpe concorrente directamente sobre o filtro com a estirpe de referência.
      Nota: Cada cepa é manchada em filtros, em vez de a tensão inferior manchado diretamente sobre a placa de agar para que as cepas podem ser mais facilmente colocados diretamente em cima um do outro.
    2. Se houver preocupação de que as cepas não sejam empilhadas diretamente em cima uma da outra, diminua o volume de infiltra de deformação de referência manchado no filtro. Isso garantirá que a área do ponto de deformação de referência seja menor e totalmente acima ou abaixo da cepa concorrente. Alternar qual cepa está no topo e na parte inferior para dar conta de diferenças na difusão de nutrientes do meio de agar.
    3. Para garantir que o filtro permite a difusão de pequenas moléculas, inclua um tratamento de controle onde a cepa de referência é manchada em um filtro e um antibiótico que é sensível a (cloranfenicol) é manchado para o outro. Empilhe os filtros diretamente em cima um do outro e coloque em uma placa de agar LBS. O antibiótico deve ser capaz de difundir através do filtro e deve matar a cepa de referência.
  3. Incubar as placas com filtros a 24 ° c por 5 h. Não inverta a placa de agar durante a incubação para evitar a movimentação dos filtros.
  4. Realize diluições seriais para o ininoculado inicial de acordo com a etapa 2,4.
  5. Tendo T medições finais
    1. Usando pinças estéreis, transfira cada conjunto de filtros para um tubo Falcon de 50 mL contendo 5 mL de caldo LBS. Assegure-se de que os filtros estejam fisicamente separados dentro do tubo para permitir a ressuspensão completa de cada tipo de deformação.
    2. Ressuscitar as cepas de filtros por pipetagem para cima e para baixo até que os filtros são claras de todas as células. Use pinças para girar os filtros e limpar o material celular de ambos os lados. Esterilize pinças com etanol entre as amostras.
    3. Realize a diluição em série para T final de acordo com a etapa 2,5. Ao calcular o CFUs total para T final, ajuste o "volume total da amostra não diluída" de 1 mL a 5 mL.

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Representative Results

A fim de avaliar as interações competitivas entre populações bacterianas, foi desenvolvido um protocolo de ensaio de coincubação e otimizado para V. fischeri. Este método utiliza plasmíos estáveis que codificam genes de resistência a antibióticos e proteínas fluorescentes, permitindo a seleção diferencial e a discriminação visual de cada cepa. Analisando os dados coletados a partir do ensaio de coincubação, pode-se identificar o desfecho competitivo de uma interação e o mecanismo da interação. Como exemplo, os experimentos a seguir foram realizados com isolados de V. fischeri . As estirpes coincubadas abrigaram um de dois plasmídos estáveis: pVSV102 expressando a resistência do canamicina e o GFP +, ou pVSV208 expressando a resistência do cloranfenicol e o dsred +. Nos dados amostrais, as cepas foram misturadas em uma proporção de 1:1 e incubadas em placas de agar LBS por 5 h. Como tratamento controle, as versões diferencialmente marcadas da cepa de referência foram coincubadas entre si. Os tratamentos experimentais foram realizados com a cepa de referência (harboring pVSV102) e a cepa concorrente 1 ou a cepa concorrente 2 (abrigando pVSV208). As culturas de cada cepa foram preparadas e coincubadas como descrito acima e como mostrado na Figura 1 e na Figura 2.

Na Figura 3, os dados analisados para determinar se a cepa concorrente 1 ou 2 ultrapassam a cepa de referência são apresentados de duas maneiras. Na Figura 3a, a proporção de cada tipo de deformação para cada ponto de tempo durante o experimento foi calculada de acordo com a etapa 4.2.1. Nos tratamentos experimentais, os dados amostrais mostram a cepa de referência e a cepa concorrente 1 estão presentes em uma proporção de 0,5 no início (0 h) e final (5 h) do experimento, o que é consistente com o observado no tratamento controle. Esses dados mostram que a proporção das cepas não se modificou após uma coincubação de 5 h e, portanto, nenhuma competição foi observada. Em contrapartida, quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 2, a cepa de referência estava presente em uma proporção de 0,5 no início (0 h), e uma proporção < 0,01 no final (5 h) do experimento, que foi significativamente menor do que o controle tratamento (teste t de Student: P < 0, 1). Esses dados indicam que a proporção da cepa de referência diminuiu na presença da cepa concorrente 2 e, portanto, sugere competição entre a cepa concorrente 2 e a cepa de referência ocorreu. Esse tipo de análise deve ser aplicado ao determinar como a proporção de cepas dentro de uma comunidade muda ao longo do tempo, mas não pode ser usada para determinar o mecanismo da interação competitiva e, portanto, deve ser combinada com análise adicional. Por exemplo, a proporção da cepa de referência que diminui na presença da cepa concorrente 2 pode ser atribuída a vários tipos de interações: (i) a cepa 2 cresceu mais rapidamente do que a cepa de referência, (II) a cepa 2 inibiu o crescimento da referência estirpe, ou (III) estirpe 2 eliminou a estirpe de referência através da matança.

Na Figura 3B, o índice competitivo relativo ao log (RCI) foi calculado para cada tratamento de acordo com o passo 4.2.2. Quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 1, os valores de log RCI não foram estatisticamente diferentes do zero ou do tratamento controle (P > 0, 5), sugerindo que a competição entre as cepas não foi observada. No entanto, quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 2, os valores de log RCI foram significativamente maiores que zero e o tratamento controle (teste t de Student: P < 0, 1). Esses dados sugerem que a cepa 2 superou a cepa de referência. A análise de valores de log RCI fornece um método simples para determinar se uma cepa superou a outra durante o período de incubação. Como essa análise incorpora a proporção de cepas no final (5 h) e o início (0 h) do experimento, a razão inicial pode impactar drasticamente o resultado. Portanto, a razão inicial deve ser examinada e considerada ao derivar conclusões de dados de log RCI. Além disso, esta análise não fornece informações sobre o mecanismo competitivo e simplesmente relata como a proporção de cepas mudam durante a incubação.

A Figura 4 exibe dois métodos de análise de dados para determinar o mecanismo de competição para uma determinada interação. Na figura 4a, os cfus totais para cada deformação em cada ponto de tempo do experimento são exibidos. Quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 1, o CFUs de ambas as cepas aumenta ao longo do curso de 5 h e os CFUs para a cepa de referência não foram significativamente diferentes da cepa 1 ou do controle a 5 h (P > 0, 5). Esses dados indicam que a cepa de referência cresceu na presença de estirpe 1, e sugerem que nenhuma competição ocorreu. No entanto, quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 2, a cepa 2 CFUs aumentou após 5 h, mas o CFUs para a cepa de referência diminuiu. A cepa de referência CFUs foi significativamente menor do que a cepa 2 CFUs e o controle a 5 h (teste t de Student: P < 0, 2). Esses dados indicam que a cepa de referência CFUs diminui na presença da cepa 2 e sugere que a cepa 2 mata as células de deformação de referência. Se a cepa de referência não mostrasse uma diminuição nos CFUs, mas não houve alteração (não houve diferença estatística entre a cepa de referência CFUs a 0 h e 5 h), esses dados sugeririam que a cepa 2 superasse a cepa de referência inibindo o crescimento da cepa de referência. A análise de dados CFU totais não transformados é particularmente informativa, pois os CFUs para ambas as cepas em cada ponto de tempo são exibidos de forma independente e podem ser usados para identificar o mecanismo de concorrência.

A Figura 4B mostra a porcentagem de recuperação da cepa de referência para determinar como a presença de uma cepa concorrente afeta a cepa de referência. Quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 1, observou-se uma recuperação de ~ 3.200%, o que não foi estatisticamente diferente do controle e indica que a cepa 1 não afetou a porcentagem de recuperação da cepa de referência. Quando a cepa de referência foi incubada com a cepa concorrente 2, observou-se uma recuperação de ~ 4%, que foi significativamente menor do que o controle (teste t de Student: P < 0, 2). A recuperação percentual também foi significativamente menor que 100 (teste t de Student: P < 0, 2), indicando que a cepa 2 superou a cepa de referência matando células de deformação de referência. Se a recuperação percentual não foi estatisticamente diferente de 100, esses dados sugerem que a cepa 2 inibiu o crescimento da cepa de referência. Os dados de recuperação por cento fornecem uma maneira simplificada de caracterizar o mecanismo da concorrência examinando como a população de deformação de referência responde à presença de uma cepa concorrente. No entanto, exibindo os dados desta forma exclui informações sobre a relação inicial, bem como a forma como a abundância da cepa concorrente mudou ao longo da incubação.

Figure 1
Figura 1: fluxograma ilustrando o ensaio de coincubação. (A) as estirpes bacterianas que abriam pVSV102 (estirpe de referência indicada ref. estirpe ou RS) ou pVSV208 (estirpe concorrente indicada comp. Strain ou C.S.) são cultivadas separadamente em meios selectivos para a estirpe de referência (lbs Kan) ou tensão concorrente (LBS CAM). As cepas são então ressuscipended no caldo LBS e normalizadas para um OD = 1,0. B) a estirpe de referência e a estirpe concorrente são misturadas a uma proporção de 1:1 por volume. Uma diluição serial é realizada com esta mistura para determinar CFUs para ambas as cepas em 0 h. (C) a mistura de deformação é então manchado em 24 placas bem contendo Agar lbs. Cada repetição é manchada em seu próprio poço. Os pontos são autorizados a secar e depois incubados a 24 ° c por 5 h. Após 5 h, uma diluição serial é realizada para quantificar CFUs para cada cepa. (D) a mistura de estirpe do painel B também é manchada em placas de Petri de agar lbs autorizadas a secar e incubadas a 24 ° c durante 24 h. Em 24 h, o ponto de coincubação é imaged usando um microscópio de dissecação da fluorescência que seja adaptado para detectar a fluorescência verde (da tensão da referência) e do vermelho (tensão do concorrente). Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: imagens representativas de placas necessárias para uma diluição em série. (A) placa 96-well usada para executar a diluição de série. A placa é girada de tal forma que existem 12 linhas e 8 colunas. Os descritores de cada tratamento incluem as cepas usadas e os plasmíos que eles abrigam (por exemplo, deformação de referência com pVSV102 e cepa concorrente com pVSV208) e o número replicado para cada linha (R1, R2, R3 ou R4). A primeira coluna é a amostra não diluída e cada coluna à direita representa uma diluição de 10 vezes da coluna anterior (fator de diluição listado acima). (B) lbs Agar Plate usado para determinar cfus para a tensão de referência em libras Kan placas (topo) e concorrente tensão em lbs Cam placas (fundo) a partir do tratamento experimental. Cada linha é uma réplica em um tratamento (por exemplo, R1) e o fator de diluição de cada ponto é listado na parte superior da placa. O número de CFUs contados para cada repetição é listado para a direita. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: dados de amostra para avaliar se as estirpes concorrentes ultrapassam a estirpe de referência. (A) a proporção de estirpes de coincubação que abrigando pVSV102 (cinza escuro) ou pVSV208 (cinza claro). O RS indica a cepa de referência e o C.S. indica a cepa concorrente. Linha horizontal tracejada indica uma proporção de 0,5. O asterisco indica que a cepa de referência fez uma proporção estatisticamente menor da população do que a cepa concorrente ou a cepa de referência no controle a 5 h (teste t de Student: P < 0, 1); NS indica não significativo (P > 0, 5). (B) registro de índice competitivo relativo (RCI) para ensaios de coincubação. Linha tracejada vertical indica log RCI = zero. O asterisco indica que o valor do log RCI é estatisticamente maior que zero e o controle (teste t de Student: P < 0, 1). As barras de erro indicam SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: dados de amostra para determinar o mecanismo de concorrência. (A) contagens totais de CFU para ensaios de coincubação realizados com isolados de V. fischeri que foram marcados diferencialmente com pVSV102 ou pVSV208. Os CFUs foram coletados no início do experimento (0 h) e após 5 h de incubação. O RS indica estirpe de referência e C.S. indica estirpe concorrente. A linha horizontal tracejada indica a média de 0 CFUs h para ambas as cepas; asterisco indica que a cepa de referência CFUs foi estatisticamente menor no tratamento experimental em relação ao tratamento de controle a 5 h (teste t de Student: P < 0, 2). (B) percentagem de recuperação da estirpe de referência. Linha tracejada horizontal indica 100% de recuperação (sem aumento ou diminuição de CFUs); asterisco indica que a recuperação percentual foi estatisticamente inferior a 100% e o tratamento controle (teste t de Student: P < 0, 2). As barras de erro indicam SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: dados de amostra para tempo de incubação e otimização de imagem. (A) cfus total para ensaios de coincubação onde os cfus foram coletados no início do experimento (0 h), após 5, 12 e 24 h de incubação. O RS indica estirpe de referência e C. S. 2 indica a estirpe concorrente 2. A linha horizontal tracejada indica a média de 0 CFUs h para ambas as cepas; Os asteriscos indicam que a cepa de referência CFUs foi estatisticamente menor no tratamento experimental em relação ao tratamento controle no momento determinado (teste t de Student: P < 0, 2). As barras de erro indicam SEM. (B) imagens de microscopia fluorescente correspondentes aos dados do CFU no painel a. barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Dados de amostra para otimização da razão de coincubação. Experimentos de coincubação foram realizados entre a cepa de referência (RS) que abrigando pVSV102 (verde, fileira superior) e a cepa concorrente (C.S.), abrigando pVSV208 (vermelho, fileira inferior) e as imagens de microscopia fluorescente foram tiradas às 24 h. (A) cepas foram misturados em uma proporção de 1:1 ou (B) uma relação 1:5 em que a cepa de referência, contendo pVSV102, foi superada pela cepa concorrente contendo pVSV208. Barra de escala = 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O ensaio de coincubação descrito acima fornece um método poderoso para descobrir a competição interbacteriana. Essa abordagem permitiu a identificação da competição intraespecífica entre os isolados de V. fischeri e a caracterização do mecanismo competitivo19. Embora o método descrito foi otimizado para a bactéria Marinha V. fischeri, pode ser facilmente modificada para acomodar outras espécies bacterianas, incluindo isolados clínicos e ambientais. É importante notar que os mecanismos competitivos são frequentemente regulados condicionalmente5,6,23,24,25,26,27 , 28, assim, pequenas diferenças nas condições de crescimento (por exemplo, agitação versus cultura permanente, temperatura, etc.) e tipo de mídia (por exemplo, teor de sal) podem afetar drasticamente os resultados. Portanto, a otimização das condições de coincubação é provavelmente necessária para diferentes espécies bacterianas, bem como diferentes mecanismos competitivos. É melhor escolher as condições de cultura que refletem de perto o ambiente natural dos isolados. Por exemplo, ensaios de coincubação entre cepas de V. fischeri foram realizados com mídia lbs a 24 ° c, para refletir a salinidade e a temperatura do ambiente marinho. No entanto, algumas bactérias são naturalmente competentes em seu ambiente27,28 e, portanto, poderiam pegar material genético liberado por células lisadas durante interações antagônicas29. Para evitar que tais transferências de DNA impactem os resultados de coincubação, é importante usar condições que não promovam a competência ou cepas que não são competentes, seja naturalmente ou através da inativação de máquinas de captação de DNA. Além disso, parâmetros experimentais como fase de crescimento celular, densidade de cultura, tempo de incubação ou relação de deformação inicial também podem requerer otimização para diferentes espécies bacterianas ou mecanismos competitivos. Por exemplo, a densidade de cultura inicial ditará a quantidade de contato célula-celular entre as cepas, o que pode afetar a capacidade das bactérias para implantar mecanismos dependentes de contato da concorrência.

A Figura 5a apresenta o processo de otimização dos ensaios de coincubação com isolados de V. fischeri . Aqui, um intervalo de tempos de incubação para a coleta de CFU e a imagem de microscopia fluorescente foram avaliados para determinar o tempo ideal para cada métrica a ser coletada. Os CFUs foram coletados imediatamente após a mistura da cepa de referência e a cepa 2 do concorrente foi manchada em placas de agar LBS (0 h), e as medidas de CFU e as imagens de microscopia fluorescente foram tomadas imediatamente e após 5, 12 e 24 h. Esses dados de amostra destacam a importância da otimização completa antes de tirar conclusões sobre a interação entre duas cepas. Por exemplo, duas conclusões diferentes sobre o mecanismo de interação podem ser deduzados com base em quando os CFUs são coletados: CFUs de 5 ou 12 h indicam que a cepa 2 matou a cepa de referência, enquanto os CFUs coletados em 24 h sugerem que a cepa 2 inibe o crescimento da tensão de referência.

O tempo ideal para visualização de manchas de coincubação através de microscopia fluorescente pode ser diferente do tempo ideal para a coleta de CFU. A Figura 5b apresenta imagens de microscopia fluorescente de manchas de coincubação em 0, 5, 12 e 24 h. Aos 0 e 5 h, os pontos de coincubação não são visíveis com microscopia fluorescente. Para as imagens tiradas em 12 h, ambas as cepas no tratamento de controle são visíveis, mas o RFP (deformação de referência pVSV208) é notavelmente dimmer. No tratamento experimental em 12 h, a tensão 2 do concorrente é visível (contudo Dim) e a tensão da referência não é detectável. As diferenças específicas de deformação entre isolados bacterianos podem afetar a expressão de proteínas fluorescentes e, assim, o brilho das células no local misto. Como a RFP é notavelmente mais dimmer do que a GFP no controle, os pontos de coincubação devem continuar a ser incubados e ser fotografados novamente em um momento posterior. Em imagens tiradas a 24 h, ambas as cepas são visivelmente detectáveis e com um brilho semelhante no experimento de controle. Na cepa de tratamento experimental 2 é visível enquanto a cepa de referência não é observada dentro do ponto de coincubação. o tempo de incubação de 15-24 h é suficiente para visualizar GFP e RFP para V. fischeri usando plasmíos estáveis PVSV102 e pVSV208, respectivamente, mas o tempo de incubação pode precisar ser ajustado para diferentes plasmíos ou espécies bacterianas. Embora o tempo ideal para visualização de pontos de coincubação e coleta de dados de CFU sejam diferentes, a imagem a 24 h é uma boa maneira de rapidamente fazer a interação com V. fischeri, pois o resultado obtido da imagem a 24 h (alvo é visível ou não) reflete os dados quantitativos mais tempo-intensivos obtidos do chapeamento CFUs em 5 ou 12 h.

A relação inicial pode impactar significativamente os resultados, especialmente quando incubando duas cepas inibitórias, e pode precisar ser ajustado para dar conta de diferenças específicas de deformação na eficiência de matança ou taxa de crescimento. Por exemplo, a Figura 6a exibe imagens de microscopia fluorescente de experimentos em que a cepa de referência foi coincubada com si mesma (controle) e três outros isolados de V. fischeri a partir de uma proporção de 1:1. Nesses dados de amostra, a cepa de referência é visivelmente detectada quando incubada com ela própria, a cepa concorrente 1 e a cepa concorrente 3 após 24 h. No entanto, quando o rácio inicial foi ajustado para 1:5 (i.e., 50 mL de estirpe de referência misturado com 250 mL de estirpe concorrente) a estirpe de referência só é visivelmente detectada quando coincubada com si e estirpe 1, indicando que tanto a estirpe 2 como a estirpe 3 ultrapassam a estirpe de referência. Este ajustamento impede a taxa de crescimento mais rápida da estirpe de referência de obscurear o efeito de quaisquer mecanismos de concorrência de interferência expostos pelas estirpes concorrentes. Com base nos resultados da Figura 6a, uma proporção de 1:5 (cepa de referência: cepa concorrente) deve ser usada para a tela de cepas adicionais de V. fischeri para a capacidade de matar a cepa de referência.

Este protocolo discrimina entre estirpes coincubating por tensões diferencialmente de rotulagem com os plasmídeos que contêm genes da resistência do canamicina ou do cloranfenicol. No entanto, diferentes antibióticos ou outros métodos de seleção podem ser mais adequados para diferentes espécies bacterianas. Outros métodos de seleção diferencial podem incluir: 1) explorar uma cepa/auxotroféu específico de espécie para fatores de crescimento específicos (por exemplo, DAP ou timidina), 2) requisitos de crescimento condicional (por exemplo, uma cepa cresce a 37 ° c, enquanto a outra não), ou 3) marcadores de contrseleção que eliminam ou inibem o crescimento da cepa marcada quando cultivadas condições apropriadas para expressar um gene Kill (por exemplo, ccdB ou sacb).

A seleção da cepa de referência apropriada é fundamental para a obtenção e interpretação de resultados reprodutíveis do ensaio de coincubação. Uma cepa de referência deve ser bem estudada (ou seja, ter um amplo corpo de literatura científica), não ter aparente matança ou capacidade inibitória, e idealmente ter um genoma seqüenciado. Por exemplo, certas cepas de Escherichia coli são cepas de referência comuns para muitos experimentos de coincubação bacteriana30,31. No entanto, a E. coli pode não ser ecologicamente relevante para um determinado mecanismo competitivo ou concorrente, o que pode afetar os resultados. Por exemplo, algumas bactérias podem ter evoluído mecanismos especificamente visando espécies estreitamente relacionadas ou concorrentes para o mesmo nicho ecológico e seu mecanismo competitivo não seria eficaz contra uma cepa de referência de e. coli .

Em suma, o método descrito aqui tem como objetivo fornecer uma abordagem facilmente modificada e robusta para avaliar interações interbacterianas e concorrência. Este método pode ser aplicado a isolados bacterianos relevantes para pesquisas ambientais ou clínicas, podendo ser utilizado para explorar diversos mecanismos de interação microbiana que têm sido previamente desconhecidos ou difíceis de investigar.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer aos revisores por seu feedback útil. A.N.S. foi apoiado pela Fundação Gordon e Betty Moore através de Grant GBMF 255, 3 para a Fundação de pesquisa de ciências biológicas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1,000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg/mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
Forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
Petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8, (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2, (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8, (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6, (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4, (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198, (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12, (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7, (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198, (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25, (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427, (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24, (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25, (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71, (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72, (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287, (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9, (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4, (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80, (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12, (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310, (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347, (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82, (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

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