Isolering av spytt epitelceller fra Human spyttkjertler for in vitro vekst som Salispheres eller Monolagere

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterer en metode for å isolere og dyrke primære menneskelige spyttkjertel-avledet epitelceller. Disse cellene utstillingen genuttrykk mønstre i samsvar med dem er av spytt epitel opprinnelse og kan dyrkes som salispheres på kjeller membran matriser avledet fra Engelbreth-Holm-Swarm tumorceller eller som monolagere på behandlet kultur retter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Beucler, M. J., Miller, W. E. Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers. J. Vis. Exp. (149), e59868, doi:10.3791/59868 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spyttkjertlene er et område av betydelig interesse for forskere som er interessert i flere aspekter av menneskelig sykdom. Et mål av forskere er å gjenopprette funksjon av kjertler skadet av strålebehandling eller på grunn av patologi forbundet med Sjögrens syndrom. Et annet mål av forskere er å definere mekanismer som virus gjenskape innenfor kjertel vev der de kan da få tilgang til spytt væsker viktig for horisontal overføring. Disse målene fremheve behovet for en robust og tilgjengelig in vitro spyttkjertel modell som kan utnyttes av forskere interessert i ovennevnte samt relaterte forskningsområder. Her diskuterer vi en enkel protokoll for å isolere epitelceller fra menneskelig spyttkjertler og spre dem in vitro. Vår protokoll kan bli ytterligere optimalisert for å møte behovene til individuelle studier. Kort, spytt vev er mekanisk og enzymatisk separert for å isolere enkeltceller eller små klynger av celler. Utvalg for epitelceller oppstår ved plating på en kjeller membran matrise i nærvær av medier optimalisert for å fremme epitel cellevekst. Disse resulterende kulturer kan opprettholdes som tredimensjonale klynger, kalt "salispheres", eller vokst som en monolag på behandlet plast vev kultur retter. Denne protokollen resulterer i utvekst av en heterogene befolkning av hovedsakelig epitelceller som kan spres for 5-8 passasjer (15-20 befolkning doublings) før gjennomgår cellulære senescence.

Introduction

I pattedyr i Spyttkjertlene er organisert i 3 par store spyttkjertler: den parotid, submandibular, og sublingual kjertler. Det finnes også en rekke mindre kjertler ligger på tungen og spredt over hele munnhulen1. De store kjertlene er ansvarlig for bulk volumet av spytt produsert2. I tillegg til å gi antimikrobielle beskyttelse gjennom utskilles faktorer, er spytt viktig i prosessen med å tygge og smøre mat når den passerer gjennom spiserøret2. Som sådan, spyttkjertel dysfunksjon representerer et medisinsk problem der lider som ikke er i stand til å produsere nok spytt er mer utsatt for å utvikle sykdommer som Dental hulrom eller oral candidiasis3. I tillegg, redusert spytt resulterer i større vanskeligheter med å spise og fordøye mat har en betydelig innvirkning på livskvalitet.

Spyttkjertel dysfunksjon er primært funnet hos pasienter som lider av sjögrens syndrom, en autoimmun lidelse, eller hos pasienter med hode og nakke kreft som har gjennomgått bestråling terapi3,4,5, 6i den. Skadet sekretoriske acini i kjertlene som følge av autoimmunitet eller strålebehandling ikke gjennomgår selv fornyelse, noe som resulterer i en pasient som lever med irreversible skader6. Studiet av spyttkjertler har også fått oppmerksomhet eller forskere er interessert i mekanismer for viral patogenesen. Noen patogener, slik som Human Cytomegalovirus (HCMV), vedvarende gjenskape i Spyttkjertlene, som deretter gir mulighet for overføring av begynnende virus til en ny vert via spytt7,8. Dermed er det en unmet behov for å utvikle robuste og reproduserbar in vitro modeller av spyttkjertel vev å takle og forstå et mangfoldig utvalg av medisinske problemer.

Flere modeller av murine spyttkjertel-systemet har blitt brukt som et utgangspunkt for å forstå og karakterisere de ulike epitelceller som danner spyttkjertler9,10. Det finnes åpenbare og store forskjeller mellom menneske og murine spyttkjertler11. Spesielt den menneskelige parotid kjertel er større i forhold til submandibular kjertel mens musen submandibular og parotid er mye lignende i størrelse1,2,11. Mens udødeliggjort menneskelige submandibular cellelinjer finnes, er det store bekymringer at de udødeliggjort cellene ikke nøyaktig opprettholde fenotype av primær vev og sekundær bekymring for at de udødeliggjort cellene er faktisk ikke avledet fra spytt epitel selv12. Av disse grunnene er det en interesse og et behov for å studere primære spytt vev fra mennesker.

Her beskriver vi en protokoll for å isolere primære epitelceller fra menneskelig spyttkjertler for vev kultur. Vår protokoll er basert på verkene til Pringle et al. og Tran et al. med modifikasjoner gjort for å generelt forenkle sine prosedyrer13,14. Først, mens Tran et al. ' s protokoll krever en lang fem-timers inkubasjons for enzymatisk fordøye spytt vevet, har vår modifiserte protokollen vært vellykket med så lite som en-Times inkubasjons, lik som i Pringle et al. For det andre bruker vi ulike enzymer for vev fordøyelsen, særlig vi ikke bruker Trypsin som brukes i den opprinnelige Tran et al. protokoll, men i stedet bruke en blanding av dispase og kollagenase. Vi foretrekker å unngå Trypsin i den innledende fordøyelsen trinnene som en fersk studie antydet at første fordøyelsen av spytt vevet ved Trypsin resulterer i redusert celle levedyktighet, muligens ved tap av en sjelden stilk cellen befolkning15. Til slutt, kultur vi salispheres på overflaten av kjelleren membran matrise (BMM) ved hjelp av en kommersielt tilgjengelige medier opprinnelig formulert for utbredelsen av bronkial epitelceller. Vår protokoll kan brukes til å isolere spytt celler fra parotid, submandibular, og sublingual kjertler. Disse cellene uttrykker spytt Amylase og andre spytt spesifikke gener som indikerer at de opprettholder en fenotype som ligner på spytt acinar epitelceller7. Vi har med hell generert spytt kulturer fra > 50 primære menneskelige vevsprøver ved hjelp av denne metodikken. Videre kan de primære spytt cellene lett bli embryo for bruk på et senere tidspunkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Disse protokollene og studier har blitt gjennomgått og godkjent av den institusjonelle Review Board ved Universitetet i Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, IRB protokoll 2016-4183). Spytt vevet er vanligvis resected i mange hode og nakke kirurgiske prosedyrer og er vanligvis uninvolved av den ondartede prosessen. Vanligvis er fersk resected spyttkjertel vev brukes innen 2-4 h etter fjerning fra pasienten (figur 1a).

1. forberedelse av reagens

  1. Bronkial epitel cellevekst medium (BEGM)
    1. Legg til komponenter fra settet som leveres av produsenten (se tabellen med materialer).
    2. Vask hvert rør én gang med basis mediene for å sikre full overføring av komponenter. Deretter legger trekull strippet fosterets storfe serum å lage en endelig konsentrasjon av 4% serum.
  2. Røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer
    1. For å gjøre 10x lager, tilsett 40,15 g av NH4Cl, 5,0 g av NaHCO3, og 0,186 g ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) og få opp til et endelig volum på 200 ml ved hjelp av dH2O. Deretter filtrerer du sterilisere og lagre ved 4 ° c.
    2. Fortynnet til en fungerende konsentrasjon på 1x i steril dH2O før bruk.
  3. Dissosiasjon løsning
    1. Til en 100 mL flaske dispase oppløsning (se tabell over materialer) tilsett 0,15 g av KOLLAGENASE type III. Etter at kollagenase er fullstendig oppløst, skal filteret sterilisere den nye løsningen og alikvot. Oppbevares ved-20 ° c.

2. vev fordøyelse

  1. Ved hjelp av en 100 mm vev kultur plate, mechanicallymince vevet i fine biter ~ 1-2 mm i størrelse ved hjelp av autoklav-sterilisert dissekere saks og kirurgisk tang (figur 1B,C). Bindevev mellom brikkene bør kuttes for å sikre riktig separasjon og lette i ytterligere trinn.
  2. Tilsett 6 mL dispase/kollagenase løsning på hakket vev. Deretter ruge ved 37 ° c i ca 30 min til 1 time.
  3. Forstyrre vevet ved pipettering med en 5 mL serologisk pipette 15-20 ganger.
  4. Ruge ved 37 ° c for ytterligere 30 min til 1 time.
  5. Gjenta trinn 2,3 og 2,4 to-tre ganger eller til vevet ligner en slurry og kan lett passere gjennom pipette åpningen (figur 1d).
    Merk: Startstørrelsen på vevsprøven og hvordan finhet av vevs hakking vil avgjøre hvor mange ganger man må gjenta trinn 2,3 og 2,4. Vanligvis får vi vev ca 1 cm x 1 cm i størrelse. I tillegg kan man overvåke vev dissosiasjon ved hjelp av en standard invertert vev kultur mikroskop for å spore fremdriften av celle dissosiasjon fra vevet. Små klynger av celler er ideelle for første utvekst av spytt celler som salispheres.

3. coating brønner med kjeller membran matrise

Merk: kjeller membran matrise (BMM) bør tint over natten ved 4 ° c dagen før den vil bli brukt. Når tint, BMM bør stadig opprettholdes på is eller ved 4 ° c som det vil raskt stivne (dvs. danne en gel) ved varmere temperaturer. I tillegg bør forsiktighet tas hvis prøvene har blitt kjølt på isen før plating på BMM som kald prøver vil "smelte" den BMM og utsette celler til plast parabolen.

  1. Sakte pipette BMM (se tabellen av materialer) i hver brønn for å være belagt. Fordel BMM jevnt og langsomt over brønnen.
    Merk: vanligvis bruker vi 500 μL per hver brønn av en seks-brønn plate, men dette volumet kan justeres for bruk på andre varianter av plater som 12-brønn eller 24-brønn, eller som ønsket for tykkere eller tynnere hydrogeler.
  2. Ruge belagt platene ved 37 ° c i minst 15 minutter før bruk for å la BMM-tiden stivne.

4. filtrering av ufordøyd vev, RBC lyse og celle plating

  1. Overfør vevs homogenate fra trinn 2,5 til et 15 mL konisk rør. Vask platen en gang med 6 mL Dulbecco ' s fosfat bufret saltvann (DPBS) for å overføre de resterende cellene.
  2. Filtrer homogenate inn i en 50 mL konisk rør gjennom en 70 μm nylon mesh celle sil for å fjerne ufordøyd vev. Sentrifuger anstrengte celler i 5 min ved 500 x g.
  3. Fortynne 10x RBC lyse buffer i sterile dH2O å lage en 1x arbeider løsning.
  4. Aspirer supernatanten. Deretter resuspend celle pellet i 10 mL 1x RBC lyseringsbuffer. Ruge for 5 min ved 37 ° c.
  5. Tilsett 20-25 mL DPBS for å nøytralisere RBC lyseringsbufferen og minimere lyse av spytt celler. Sentrifuger for 5 min ved 500 x g.
    Merk: etter behandling med RBC lyse buffer, bør cellen pellet være hvit. Rød farge i pellet indikerer at ikke alle RBC har blitt fullt lysert. Gjenta trinn 4,4 til og med 4,5 hvis nødvendig for fullstendig lyse av alle RBC.
  6. Aspirer supernatanten. Resuspend pellet i 1-2 mL BEGM per brønn og plasser deretter resuspendert celler på BMM-belagte brønner. Ruge ved 37 ° c.
  7. Når belagt på BMM, celler vil danne sfæriske strukturer eller "salispheres" over en 2-3-dagers periode. Celler kan opprettholdes som salispheres i ca 5-7 dager før BMM begynner å brytes ned slik at cellene til å få tilgang til og følge plast og vokse som en monolag.

5. Subculturing salispheres og vedlikehold på BMM

  1. Aspirer medier fra brønner, legg deretter til 1 mL dispase/kollagenase løsning på hver brønn og ruge ved 37 ° c i ~ 15 minutter eller til BMM har stort sett oppløst.
  2. Overfør celler til en 15 mL konisk rør og vask brønner én gang med DPBS for å få gjenværende celler. Sentrifuger for 5 min ved 500 x g.
  3. Aspirer supernatanten. Resuspend pellet i 2 mL Trypsin deretter ruge ved 37 ° c i 15 min.
  4. Nøytralisere Trypsin ved hjelp av et komplett medium som inneholder 10% serum. Sentrifuger for 5 min ved 500 x g.
  5. Aspirer supernatanten. Resuspend cellene i DPBS for å fjerne rester av medier, Trypsin og serum. Sentrifuger for 5 min ved 500 x g.
  6. Aspirer supernatanten. Resuspend i BEGM og plate resuspendert cellene til befestet BMM-belagt kultur retter. Resuspendert celler kan også være belagt direkte på cellekultur behandlet retter for spredning som en monolag. For mer informasjon om vekst av spytt celler som en monolag, se avsnitt 6. Celler dyrket på BMM eller på plast skal mates med fersk BEGM hver 2-3 dager.
  7. Kultur cellene i en fuktet inkubator opprettholdes ved 37 ° c med 5% CO2.

6. Subculturing salispheres på behandlet plast vev kultur retter

Merk: Hvis du opprettholder celler som monolag på plast, starter du på dette trinnet. Følgende protokoll gjelder for celler som vokser i en 100 mm rett.

  1. Aspirer mediene. Vask én gang med DPBS for å fjerne gjenværende utskriftsmateriale.
  2. Tilsett 2 mL Trypsin deretter ruge ved 37 ° c i 15 min, eller til cellene er helt løsrevet.
  3. Nøytralisere Trypsin ved hjelp av 4 mL av alle komplette medier som inneholder 10% serum. Overfør celler til et 15 mL konisk rør.
  4. Vask platen én gang med ca. 5 mL DPBS for å samle de resterende cellene. Sentrifuger for 5 min ved 500 x g.
  5. Aspirer supernatanten. Resuspend celler i 6-10 mL DPBS for å fjerne gjenværende utskriftsmateriale.
  6. Sentrifuger for 5 min ved 500 x g.
  7. Aspirer supernatanten og resuspend i BEGM. Plate celler på behandlet plast vev kultur retter. Mate med frisk BEGM enhver 2-3 dager.
  8. Kultur cellene i en fuktet inkubator opprettholdes ved 37 ° c med 5% CO2.

7. kryonisk bevaring av celler

Merk: kryonisk bevaring av celler kan oppnås fra en enkelt celle suspensjon stammer fra enten salisphere eller monolag vokst celler.

  1. Telle cellene i en hematocytometer for å beregne totalt antall celler som finnes.
  2. Sentrifuger for 5 min ved 500 x g.
  3. Aspirer supernatanten. Resuspend pellet i BEGM med 10% dimethyl sulfoxide (DMSO). Konsentrasjonen av celler bør være 2 x 106 celler/ml til 10 x 106 celler/ml.
  4. Alikvot celler i sterile kryogene lager rør. Plasser rørene i et isolert skum rack og ruge ved-80 ° c over natten for å fryse cellene langsomt.
  5. På neste dag, sted rør i flytende nitrogen for langtidslagring.
    Merk: cellene skal raskt tint ved 37 ° c. Ved tine, bør celler være pelleted på 500 x g og DMSO-inneholdende Media fjernet før plating.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To-tre dager etter plating celler fra fordøyd vev på BMM, celler vil lett danne små klynger som vil fortsette å ekspandere i størrelse opp til 15-20 celler per klynge (figur 2a). Cellular rusk og frittliggende døde celler er vanligvis sett og bør fjernes ved aspirating og påfyll med ferske medier. Celler vil fortsette å spre som salispheres i ca 3-10 dager, eller så lenge BMM laget forblir intakt. Av og til, på grunn av delvis nedbryting av BMM, vil celler bli knyttet til den underliggende plast og begynner å spre som en monolag. Salispheres dyrket på BMM vil vise variasjon i størrelse og strukturelle kompleksitet. Salispheres kan opprettholdes ved å sende dem til ferskt tilberedte BMM som beskrevet i protokollen. Innen 2-3 dager etter å ha passert på fersk BMM, vil cellene reformere inn i kuler. Salisphere celler kan også være belagt på cellekultur-behandlet plast og vokst som en monolag der de viser morfologi i samsvar med celler av epitel opprinnelse som vist i figur 2b. Mens salisphere celler dyrket på BMM som salispheres er sannsynlig å opprettholde en fenotype mer karakteristisk for spytt vev, cellene vokst som en monolag kan være fordelaktig for noen eksperimentelle protokoller. Mer omfattende karakterisering må utføres for å bestemme i hvilken grad cellene opprettholde en spytt fenotype når dyrket på en monolag i forhold til celler dyrket som salispheres.

Figure 1
Figur 1 : Første behandling av humant submandibular kjertler for salisphere forberedelser. Excised spyttkjertel vev ca 1 cm i diameter (A) er mekanisk hakket i mindre biter ved hjelp av skarpe saks (B) til kjertel er delt inn i fordøyelig biter på ca 1-2 mm i størrelse (C). Den kjertel brikkene er så inkubert i dispase/kollagenase løsning for 30-90 min med periodisk passasje gjennom serologisk Pipetter til prøven er fordøyd til det meste enkeltceller eller små klumper av celler (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Primær menneskelige salisphere celler kan være kultivert som kuler på kjelleren membran matrise eller som en monolag på behandlet cellekultur retter. Etter første fordøyelsen av spytt vev, den fordøyd kjertler er belagt direkte på BMM og kultivert for 3-10 dager. Celler fôres hver 2-3 dager for å gi ferske næringsstoffer. En gang det primære salispheres utvikle, det matriser kan oversikten inne dispase/kollagenase løsning, trypsinized å utvikle enkeltceller, og re-belagt onto frisk BMM der hvor de reformere i sfærer (en) eller belagt onto cellen kulturen fat der hvor de lett danne en Brostein morfologi typisk for en epitel monolag (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spytt dysfunksjon representerer en bekymring for livskvalitet for de som lider av sjögrens syndrom samt de gjennomgår strålebehandling for kreft ved siden av spyttkjertler3,4,5, 16i den. En foreslått terapi for å behandle disse pasientene er å vokse funksjonell spytt stamceller eller organoids in vitro, som deretter kan settes inn skadet spyttkjertel å erstatte berørte vev9. I tillegg spyttkjertler er ofte et nettsted for utholdenhet og overføring av menneskelige patogener. For eksempel menneskelige herpesviruses som menneskelige Cytomegalovirus (HCMV) er kjent for å infisere og bruke spyttkjertler og spytt til å overføre virus til nye verter7,8,17. Den molekylære mekanismer underliggende viral utholdenhet i spyttkjertel og bevegelse til spytt forbli ukjent. Utviklingen av in vitro spytt celle systemer vil gi et viktig modell system for å utforske denne mekanistisk informasjonen.

Vi rapporterer her en robust protokoll for generering primære spytt "salispheres" som kan dyrkes i vitro enten som klynger på BMM eller som monolagere på plast. Evnen til kultur og spredd primære menneskelige spyttkjertel epitelceller representerer en viktig plattform som forskere kan (1) potensielt utvikle erstatning terapi for pasienter med spyttkjertel mangler for hvem ingen andre alternativer finnes (2) bedre forstå grunnleggende fysiologi underliggende spyttkjertel utvikling, spredning, sekresjon, etc.; og (3) definere mekanismer som brukes av patogener å gjenskape og spre seg til nye verter.

Ved hjelp av disse spytt cellekulturer, har vi rapportert at HCMV krever pentameric glykoprotein kompleks for primær infeksjon, og også at viruset vedvarer i en lengre periode, minner om hva som skjer med HCMV in vivo7. Videre viste våre funksjonelle studier at spytt kulturene ikke inneholder forurensende fibroblaster som Fibroblast Tropic, Lab tilpasset virus ikke klarer å infisere og gjenskape i den primære spytt avledet celler7. Mens vi har brukt denne protokollen til å generere celler for evaluering av HCMV replikering og spredt i en primær spytt system, kan denne protokollen lett bli tilpasset for å generere spytt celler nyttig for det brede spekter av forsknings temaer nevnt ovenfor. I tillegg kan denne protokollen tilpasses behovene og budsjettet til hver enkelt forsker. Selv om vi ikke har validert andre forhold selv, har andre rapportert suksess voksende spytt epitelceller under ulike medie forhold. For eksempel, Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM): F12 blanding supplert med epidermal vekstfaktor og Fibroblast vekstfaktor-2 har blitt rapportert å fremme robust vekst av spytt celler18. Alternativt, Nam et al. bruker minimal essensielle medier supplert med fosterets storfe serum før overføring av celler til en serum-fri versjon av en Keratinocyte vekst Media og har rapportert robust vekst av spytt celler på plast15. Dermed ser det ikke ut til at spytt epitelceller viser et absolutt krav for en bestemt medietype, men ser ut til å vokse og sprer seg på en rekke kommersielt tilgjengelige medietyper.

I tillegg til Media formulering, kan ulike kjeller membran formuleringer evalueres for sine evner til å støtte robust spytt epitel cellevekst. Veksten av celler på kommersielt tilgjengelig kjeller membran-som inneholder matriser lett yield salispheres og gir en enkel, om enn dyrt dyrking system7,19. I likhet med som diskutert ovenfor om valg av medier for cellevekst, forskere har rapportert vekst og utvikling av salispheres på en rekke ulike matriser og hydrogel systemer. Hydrogeler laget av hyaluronsyre har den ekstra fordelen i å skape en ekstracellulære matrise krysskoblet med ønsket kjemiske bestanddeler til å studere deres interaksjoner og effekter på celler. Ved hjelp av primære menneskelige vev avledet spytt celler, Srinivasan et al. rapportert suksess i vekst og vedlikehold av et spytt Stamcelle befolkning i hyaluronsyre hydrogeler; økt Stamcelle vekst ble ytterligere observert da hydrogeler ble innlemmet med peptider avledet fra kjelleren membran proteiner som perlecan og laminin20. Et annet system nylig utviklet av Foraida et al. Report ved hjelp av "electrospinning" for å utvikle et nanofiber stillas laget av Poly (melkes-co-glykolsyre acid) (PLGA). Den PLGA hydrogeler med ekstra elastin ble funnet å lett fremme utviklingen av et polarisert submandibular celle system, som kan være nyttig i konstatere hvordan celle polarisering påvirker spytt biologi og biokjemi21.

I denne protokollen, har vi presentert en enkel metode for isolering og vekst av primære spyttkjertel-avledet epitelceller. Denne protokollen resulterer i den raske utvekst av en epitel celle befolkning som kan opprettholdes i gjennomsnitt for 5-8 passasjer. Det er viktig å overvåke vevet under behandling med dispase/kollagenase for å sikre riktig fordøyelse som nevnt i protokollen. Ufullstendig fordøyelse vil sterkt redusere antall salispheres som overlever. Det er også viktig å overvåke kulturer for utvekst av fibroblaster som har en langstrakt form og er svært forskjellig fra mangekantet epitelceller som vanligvis vokser i diskrete patcher eller klumper. Vi har brukt denne protokollen for isolering av epitelceller fra mennesker og mus, men det virker sannsynlig at det kan tilpasses for bruk med andre pattedyr systemer. Videre kan denne protokollen bli ytterligere endret ved hjelp av ekstra rensing trinn basert på celleoverflaten markør uttrykk og Flow flowcytometri som kan føre til generering av mer homogen første celle populasjoner. På samme måte kan denne protokollen brukes til å bestemme hvordan ulike medier eller matrise/hydrogeler formulering føre til utvekst av bestemte celletyper når du først generere salispheres. Avslutningsvis bør denne protokollen tjene som en robust Start plattform for isolering og vekst av primære spytt celler som lett kan tilpasses for en rekke eksperimentelle protokoller og forskningsområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke James P. Bridges for å gi betydelig veiledning om metodene som er involvert for dyrking primære celler. Matthew J. Beucler ble støttet av National Institutes of Health Training Grant T32-ES007250. Dette arbeidet ble også støttet av National Institutes of Health Grants R01-AI121028 og R21-DE026267 tildelt William E. Miller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm culture dishes Thermo Scientific 172931
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339651
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media Lonza CC-3171 Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh Fisher 22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum Gibco 12676-029
Collagenase type III Worthington LS004182 Store at 4 °C.
Cryogenic Tube Fisher 5000-0020
Dispase Cell Applications 07923 Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors Fisher 08-940
Dulbecco phosphate buffered saline Corning 55-031-PC
General Chemicals Sigma
PathClear Basement membrane extract Cultrex 3432-005-01 Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes Falcon 353046
Surgical forceps Fisher 22-079-742
Trypsin-EDTA solution Corning 25-052-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
  2. Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
  3. Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
  4. Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
  5. Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. (2018).
  6. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
  7. Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. (2018).
  8. Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
  9. Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
  10. Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
  11. Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. (2018).
  12. Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
  13. Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
  14. Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (2011).
  15. Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
  16. Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
  17. Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
  18. Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
  19. Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
  20. Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
  21. Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics