לוציפראז-כתבת פלורסנט וירוס שפעת עבור הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

שפעת וירוסים (IAVs) הם פתוגנים הנשימה מדבקת הגורמות מגיפה שנתית ומדי פעם גיפות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר זיהומים ויראליים בvivo באמצעות רומן רקומביננטי לוציפראז והבעת הביטוי הדו-כתבת b IAV (בירפעת). גישה זו מספקת לחוקרים כלי מצוין כדי ללמוד IAV ב-vivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chiem, K., Rangel-Moreno, J., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection. J. Vis. Exp. (150), e59890, doi:10.3791/59890 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שפעת וירוסים (IAVs) לגרום למחלת הנשימה האנושית הקשורה להשלכות בריאותיות וכלכליות משמעותיות. כמו בווירוסים אחרים, לימוד IAV דורש שימוש בגישות משניות מפרך כדי לזהות נוכחות של הנגיף בתאים נגועים ו/או במודלים של בעלי חיים של זיהום. מגבלה זו בוטלה לאחרונה עם הדור של רקומביננטי IAVs המבטא בקלות הניתן למעקב פלורסנט או ביולוסנטי (לוציפראז) כתבת חלבונים. עם זאת, החוקרים נאלצו לבחור את הגנים פלורסנט או ללוציפראז העיתונאי בשל הקיבולת המוגבלת של הגנום iav לרבות רצפים זרים. כדי להתגבר על מגבלה זו, יצרנו רקומביננטי שכפול מוסמך bi-עיתונאי IAV (BIRFLU פעת) באופן מצער ביטוי הן פלורסנט ו לוציפראז כתבת גן כדי לעקוב בקלות זיהומים IAV ב מבחנה ובvivo. למטרה זו, מקטעי ויראלי שאינם מבניים (NS) ו hemagglutinin (HA) קטעים ויראליות של שפעת A/פורטו ריקו/8/34 H1N1 (PR8) שונו כדי לקודד את ונוס פלורסנט ואת ביולומיאואואוראז החלבונים לוציפראז, בהתאמה. כאן, אנו מתארים את השימוש BIRFLU במודל העכבר של זיהום IAV וזיהוי של שני גנים הכתב באמצעות מערכת הדמיה vivo. בעיקר, ראינו מתאם טוב בין הביטויים של כתבים ושכפול נגיפי. השילוב של טכניקות חדשניות בביולוגיה מולקולרית, מחקר בעלי חיים וטכנולוגיות דימות, מספק לחוקרים את ההזדמנות הייחודית להשתמש בכלי זה למחקר שפעת, כולל חקר האינטראקציות של וירוס-מארח ודינמיקה של זיהומים ויראליים. חשוב מכך, הכדאיות כדי גנטית לשנות את הגנום הנגיפי כדי לבטא שני גנים זרים מקטעים נגיפי שונים פותח את ההזדמנויות להשתמש בגישה זו עבור: (i) הפיתוח של הרומן IAV חיסונים, (ii) הדור של רקומביננטי Iav כי יכול לשמש כוקטורים החיסון לטיפול של זיהומים אחרים הפתוגן האנושי.

Introduction

שפעת וירוס (IAV) הוא מעטפת מחולקת אחד תקוע התחושה שלילית וירוס RNA של המשפחה Orthomyxo, 1,2,3. ארגון הבריאות העולמי (אשר) מעריך 3-5 מיליון מקרי שפעת שנתיים ומעל 250,000 מקרי מוות משפעת ברחבי העולם4,5,6. קבוצות החשופות במיוחד לשפעת הן הקשישים, האנשים הסובלים מחיסוני וילדים7,8,9,10,11. למרות החיסונים זמינים ומייצגים את ההתערבות הנפוצה והיעילה ביותר נגד זיהום נגיפי, iav מסוגל במהירות להתפתח ולברוח החסינות הקיימת3,12,13, מיכל בן 14 , 15. הופעתה מחדש של זן H1N1 מגיפה ב 2009 והופעתה של iav הפתוגני חוזר האיום המתמיד על בריאות הציבור האנושי ברחבי העולם4,16.

במהלך מגיפה או מגיפה, חיוני לקבוע במהירות את הפתוגניות ואת הקבילות של וירוסים מבודדים לאחרונה. טכניקות זמינות כיום כדי לזהות את הווירוס הם זמן רב ולפעמים דורשים שימוש בגישות מפרך, אשר יכול לעכב את השלמת הניתוחים17,18,19,20. יתר על כן, הנוכחות הנגיף הנוכחי קשה לשנות את היקף, אשר יכול להיות הכרחי במהלך האירוע של התפרצות. לבסוף, השימוש במודלים בעלי חיים מאומתים של זיהום, כגון עכברים, שרקנים וחמוסים משמשים באופן שגרתי והם חיוניים בלימוד דלקות שפעת, תגובות החיסון, ואת היעילות של חיסונים חדשים ו/או antivirals. עם זאת, מודלים אלה הם מגבילים בשל חוסר יכולת להתבונן הדינמיקה הנגיפית בזמן אמת; זה מגביל את המחקרים לדימות סטטי של זיהומים ויראליים21,22,23,24,25. בעלי חיים ששימשו באותם מוסר מורדמים גם על מנת לקבוע עומס נגיפי, ובכך להגדיל את מספר בעלי החיים הנדרשים להשלים את המחקרים26. כדי לעקוף את כל המגבלות האלה, חוקרים רבים להסתמך על השימוש רקומביננטי שכפול-המוסמכת, כתב iavs המבטא, אשר מסוגלים האצת virological בחני וגילוי עומס ויראלי הפצת ב vivo בזמן אמת26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. חשוב מכך, אלה ביטוי הכתב iavs מסוגלים לשכפל באופן דומה מסוג פראי (WT) iavs בתרבות התא במודלים של בעלי חיים של זיהום33,42.

חלבונים פלואורסצנט וביולומינטי הם שתי מערכות עיתונאי המשמשות בדרך כלל על ידי חוקרים בשל רגישותם, יציבותו וקלות השימוש. בנוסף, יש תמיכה עצומה וקידום בטכנולוגיית פלורסנט לגילוי חלבון biלומילנט43,44,45,46,47,48 . חלבונים פלורסנט ו לוציפראז יש מאפיינים שונים המאפשרים להם זוהר, במיוחד שונות כמה מדינות נרגש נוצרות וכיצד emittance מזוהה43,44,45, 46,47,48. חלבונים פלורסנט מתרגשים לראשונה על ידי קליטת אנרגיה, אשר שוחרר לאחר מכן כאור באורך הגל שונה כמו מולקולות ירידה למצב אנרגיה נמוכה43. מצד שני, הביולומינסנציה נגזרת מתגובת מיקרופון כימית המערבת מצע, חמצן, ולפעמים ATP כדי לייצר אור45. בשל המאפיינים השונים של שני סוגים אלה של חלבונים כתבת, אחד אולי יותר יתרון מהשני בהתאם לחקר העניין. בעוד חלבונים פלורסנט משמשים באופן נרחב כדי להתבונן לוקליזציה הסלולר28,41, שלהם אותות vivo יש עוצמה מספקת והם מטושטשים לעתים קרובות על ידי פלואורסצנטית אוטומטי ב-live רקמות49. לכן, החוקרים להסתמך על לוציטיות כדי להעריך דינמיקה נגיפית באורגניזמים חיים, למרות חלבונים פלורסנט יכול להיות מועדף עבור ex vivo לימודים50,51,52,53. בניגוד חלבונים פלורסנט, לוציפרטיות נוח יותר עבור במחקרים vivo וישימה יותר בגישות שאינן פולשנית26,27,28,29,30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. בסופו של דבר, מבוסס על סוג של המחקר, החוקרים חייבים לבחור בין השימוש של פלורסנט או חלבון עיתונאי לוציא כמו הבדיקה שלהם, אשר נושאים את המחקר שלהם לסחר-off של פונקציונליות ורגישויות, ובאופן חמור מגביל את התועלת של וירוסי העיתונאי הרקומביננטי. יתר על כן, יש חששות לגבי הקורלציה בין הביטוי של גנים עיתונאי שונים באמצעות מערכות האור או לוציפראז ויראלי שכפול או הפצה, אשר עלול לסכן את הפרשנות של הנתונים שהושגו עם הבעת הכתבת לכתב.

יש לנו להתגבר על מגבלה זו על ידי יצירת רקומביננטי שכפול מוסמך bi-עיתונאי iav (birflu פעת) כי מקודד עבור פלורסנט הן חלבון ללוציפראז באותו גנום נגיפי55 (איור 1). כאן, הננו לוציפראז (nluc), חלבון ביולומינינט קטן ובהיר48, הוכנס במעלה הזרם של הרצף hemagglutinin (ha) בקטע של ויראלי של שפעת a/פורטו ריקו/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. בנוסף, ונוס, חלבון פלורסנט monomeric בשימוש תכוף, הוכנס לתוך לא מבנית (NS) קטע נגיפי32,33,36,41,55. מאז בירשפעת מקודד עבור הגנים הן פלורסנט וללוציפראז כתבת, או האות חלבון הכתב יכול לשמש כבדיקה כדי לקבוע שכפול נגיפי והפצת במבחנה או vivo55. פרטים נוספים על הדור ובתחום החוץ או באפיון vivo של בירפעת ניתן למצוא בפרסום האחרון שלנו55. בירפעת ניתן להשתמש כדי לבחון את האפקטיביות של תרופות אנטי ויראליות או לנטרל נוגדנים באמצעות פלורסנט הרומן-ו ביולומינט מבוססי מיקרורומיליזציה שיטת55. יתר על כן, בירפעת יכול לשמש גם כדי להעריך דינמיקה נגיפית במודל העכבר של זיהום55. בכתב יד זה, אנו מתארים את ההליכים לאפיין BIRFLU55 בתחום החוץ הגופית וכיצד ללמוד זיהום בירפעת בעכברים באמצעות מערכות הדמיה vivo איננסנציה לאיתור nluc ב vivo או של ונוס ex vivo.

השילוב של טכניקות חדשניות בביולוגיה מולקולרית, מחקר בעלי חיים וטכנולוגיות הדמיה, מביא לחוקרים את ההזדמנות הייחודית להשתמש BIRFLU עבור מחקר IAV, כולל המחקר של האינטראקציות וירוס מארח, דינמיקה של זיהום נגיפי; התפתחות החיסון הרומן גישות לטיפול הטיפולית של זיהומים IAV או שימוש פוטנציאלי של IAV כמו וקטור החיסון לטיפול בדלקות פתוגן אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים הכרוכים בעכברים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש (IACUC) והוועד הביובטיחות המוסדי (IBC) באוניברסיטת רוצ'סטר, בית הספר לרפואה ורפואת שיניים. כל הניסויים שבוצעו בבעלי חיים בעקבות ההמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של מועצת המחקר הלאומית58. Vivarium והחטיבה של המעבדה לרפואת חיות מעבדה בבית הספר לרפואה ורפואת שיניים באוניברסיטת רוצ'סטר הוא מוכר על ידי האגודה להערכת והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה (aalac) אינטרנשיונל ו ציות לחוקי הפדרלי והמדיני ולמדיניות הלאומית לבריאות (NIH). ציוד הגנה אישית נאות (PPE) נדרש בעת עבודה עם עכברים. יש ליישם את המדיניות והדרישות הדומות בעת ביצוע ניסויים המתוארים בכתב יד זה בכל מוסד.

1. שימוש בבעלי חוליות קטנות

  1. לרכוש חמש כדי שבעה שבוע הנקבה בעכבר BALB/c ולשמור אותם במתקן טיפול בעלי חיים תחת תנאים מסוימים ללא פתוגן. עם עכברים הגיעו אל המתקנים הנחושים, לאפשר תקופת מנוחה עבור 4-5 ימים כדי לאפשר לבעלי חיים האקלים לסביבה החדשה שלהם.
  2. בעקבות פרוטוקולי IACUC, מניחים מקסימום 5 עכברים לכל כלוב.
    הערה: בסיום הניסוי, כדי להבטיח שהחיה מתה, העכברים הורתו בשני נהלים מאושרים, תוך התחשבות בכך שהשניה צריכה להיות שיטה פיזית. במחקר זה, לאחר הידבקות עכברים עם שפעת בvivo, בעלי חיים הם מורדמים עם מנה קטלנית של 2, 2, 2-tribromoethanol (TBE), ועל ידי חיתוך וריד הכבד כשיטה משנית פיזית כפי שראינו בעבר23.

2. ביו-בטיחות

הערה: בכתב יד זה, בירשפעת נוצר בעמוד השדרה של שפעת A/פורטו ריקו/08/34 H1N1 (PR8), שהוא העכבר המשותף מותאם מעבדה iav זן23,32,33,56. הווירוס נוצר באמצעות בעבר הגנטי המבוסס על הגנטיקה הפוכה גישות ותיאור מלא של הדור, ו בתחומי החוץ והאפיון vivo של בירפעת ניתן למצוא בפרסום האחרון שלנו55. כל ההליכים הכרוכים בדלקות IAV (בתוך מבחנה או בvivo) בוצעו בארון בטיחות ביולוגי תחת רמת בטיחות (BSL)-2 תנאים.

זהירות: יש לקבוע רמת בטיחות מתאימה בהתאם להערכת סיכונים ביולוגית. מידע נוסף על ביצוע הערכות סיכון אבטחה טיחות והקמת בלימה יעילה אבטחה טיחות יש להתייעץ עם המוסד שבו יבוצעו ניסויים.

  1. נקו את ארונות הביובטיחות עם 70% אתנול או תחמוצת כלור לפני ואחרי ביצוע כל ההליכים הניסיוניים. עבור עכברים לעבוד, לחטא את כל החומר לחיתוך (מספריים, לבתר מלקחיים, וכו ') ואת ההומוגניצר לפני ואחרי השימוש בהם.
  2. להיפטר כל החומר הביולוגי המיוצר במהלך ההליכים תחת הנחיות IBC ו IACUC תקין.

3. אפיון מחוץ למבחנה של בירפעת (איור 2)

הערה: עיין בטבלה 1 עבור כל קומפוזיציות המאגר והמדיה.

  1. ניתוח ביטוי חלבון על-ידי קרינה פלואורסצנטית (איור 2A) ו אימונולואוורנציה עקיפים (איור 2a)
    1. יום אחד לפני זיהום, זרעים 24-לוחיות היטב עם דין-דארבי כליה כליות (MDCK) תאים אפיתל (1 x 105 תאים/ובכן, טריליטים) במדיה תרבית רקמות ולשמור על לוחיות בחממה 37 ° c עם 5% CO2. הכינו מספיק בארות כדי להעריך את כל הנוגדנים שנבחרו בתאים שנפגעו מבוים ושפעת שנדבקו.
      הערה: אנו ממליצים להמחיש את התאים תחת מיקרוסקופ קל כדי לאשר מונאולייר לפני הפעלת הזיהום הנגיפי. מומלץ ל90% שליטה על תאי MDCK בזמן ההדבקה.
    2. הכנת דילול של WT או בירשפעת IAVs באמצעי זיהום ולהדביק את התאים הזרע MDCK עם ריבוי של זיהום (מוי) של 0.1 פלאק-יצירת יחידות (PFU) לכל תא בנפח הסופי של 0.25 mL/טוב של זיהום מדיה.
    3. הסר את המדיום תרבות הרקמה משלב 3.1.1 ולשטוף את התאים MDCK פעמיים עם מלוחים 1x פוספט באגירה (PBS). להוסיף את מדלל וירוס מ3.1.2 לתאי MDCK ולמקם את לוחיות על פלטפורמת נדנדה עבור 1 h בטמפרטורת החדר כדי לאפשר adsorption ויראלי.
      הערה: תאים נגועים מבוים הם מודבטים רק עם מדיה זיהום בהעדר וירוס.
    4. לאחר ספיחה ויראלי (שלב 3.1.3), להסיר את האינויוזיה ויראלי על ידי השאיפה ולהוסיף 1 מ ל של מדיה לאחר הזיהום המכיל 1 μg/mL של הטיפול במחלות tpck מטופלים לכל טוב. התאים הדגירה עבור 18 h ב 5% CO2 מחולל חממה ב 33 ° c.
    5. לאחר 18 h של זיהום, להסיר את תרבות הרקמה supernatant מלוחות 24-היטב (3.1.4). לתקן ולחלחל את התאים עם 0.25 mL/היטב של פתרון קיבעון/חדירות עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: הכינו את פתרון הקיבעון/היכולת החדיר של מכסה המנוע למניעת חשיפה לפורמלדהיד.
    6. הסר את הפתרון קיבעון/חדירות משלב 3.1.5, לשטוף את התאים פעמיים עם ה-PBS 1x, ו דגירה את התאים עם 0.25 mL/טוב של פתרון חסימה עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
      הערה: המשך לשלב הבא או לאחסון תאים בחסימת פתרון ב-4 ° c בלילה.
    7. הסר את פתרון חסימת (שלב 3.1.6) ולהוסיף 0.25 mL/גם (1 μg/mL) של נוגדן חד שבטיים של העכבר (MAb) נגד IAV nucleoprotein, NP (HB-65) או 1:1000 דילול של נוגדן שבטיים הארנב (pAb) נגד NLuc (לראות את הטבלה של חומרים), הן מדולל בתמיסה דילול הנוגדן (1x PBS, 2.5% BSA), ו מודלת את התאים עבור 1 h ב 37 ° c.
    8. הסר את הנוגדן העיקרי משלב 3.1.7, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם ה-PBS 1x ו-דגירה אותם עם 0.25 mL/טוב של טקסס אדום מצומן נגד העכבר או נגד הארנב השני נוגדנים (לראות את הטבלה של חומרים) מדולל 1:200 בנוגדן תמיסת דילול.
      הערה: גרעיני תא יכול להיות מוכתם באותו זמן על ידי הוספת 0.5 μg/mL של 4 ', 6 '-diamidino-2-פנילילינדול (DAPI) לאותו פתרון נוגדן משני. מודאת התאים במשך 1 h ב 37 ° c בחשיכה. נוגדנים משניים אחרים מצודרים עם fluorophores אחרים ניתן להשתמש.
    9. הסר את הנוגדן המשני ואת DAPI משלב 3.1.8, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x PBS. לאחר כביסה, להשאיר את התאים 0.25 mL/טוב של 1x PBS.
    10. מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ ניאון כדי לזהות את הביטוי כתבת ונוס Nluc, ו NP מתאים נגועים באמצעות מסנני פלורסנט נכונה. לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית (הגדלה 20x) ולמזג אותם באמצעות תוכנת עריכת תמונה (איור 2A, B).
  2. ניתוח הפעילות Nluc (איור 2C) ושכפול נגיפי (איור 2c).
    1. יום אחד לפני זיהום, זרעים 12-היטב צלחות עם התאים MDCK (2 x 105תאים/ובכן, מטריליטים) באמצעות מדיה תרבות הרקמה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 כדי להגיע כ 90% שליטה בזמן של זיהום.
      הערה: לפני ההדבקה, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לוודא מונאולייר של תאים MDCK.
    2. היום של זיהום להכין דילול של וירוסי WT ו BIRFLU במדיה זיהום להדביק את התאים MDCK (שלב 3.2.1.) ב טריליאט עם משרד הבין 0.001 PFU ב 0.5 mL/ובכן. הסר את המדיום תרבות הרקמה ולשטוף את התאים MDCK פעמיים עם 1x PBS.
    3. הוסיפו את מדלל הוירוס ל-MDCK monolayers והניחו לספיחה ויראלית בטמפרטורת החדר במשך 1 h על מצע נדנדה. לאחר adsorption ויראלי, להסיר את הווירוסים הנגיף ולהוסיף 1.5 mL של מדיה לאחר הזיהום המכיל 1 μg/mL של TPCK מטופל טריפסין, לכל טוב. התאים הנגועים דגירה ב 5% CO2 מחולל חממה ב 33 ° צ' ולאסוף supernatants בנקודות הזמן המצוין שצוין בשלב 3.2.4.
    4. ב 24, 48, 72, ו 96 h לאחר הזיהום (חוקר פרטי) לאסוף 150 μl של תרבות הרקמה supernatant מכל באר ולאחסן את הדגימות בצינור מיקרוצנטריפוגה ב-80 ° צ' כדי לבצע את הרישום nluc בחני אמר ו ויראלי.
    5. כדי לבצע את הטיפול בפעילות Nluc, פעל לפי הסימנים של היצרן. ראשית, להפשיר את תרבות הרקמה supernatant מאוחסן ב-80 ° צ' (שלב 3.2.4) על קרח.
      הערה: עיין בהמלצות של היצרן ומיטוב הספק במידת הצורך.
    6. להכין את הפתרון שיטת לוציפראז (לראות את הטבלה של חומרים) על ידי דילול המצע nluc 1:50 עם מאגר הדילול. ב לבן שטוח למטה 96-ובכן אימונולוגיה עבור ללוציפראז assays, לערבב 25 μl של הפתרון שיטת ללוציפראז עם 10 כדי 25 μl של התרבות רקמת שנאסף supernatant. מודארת את התערובת עבור 2 – 3 דקות לפני מדידת האור באמצעות לומימטר (איור 2C).
      הערה: הנוכחות של חלקיקים ויראלי זיהומיות בתרבית התרבות הרקמה נקבעת על ידי שיטת מיקוד החיסון פלואורסצנטית (ונוס) או החיסונית עקיפים עקיף (ויראלי אנטיגן כתמים) כפי שתוארה בעבר23,32, 33,56.
    7. יום לפני בעיות ויראליות, זרעים MDCK תאים בצלחת 96-באר (2 x 104 תאים/ובכן, טרילקטים) עם מדיה תרבות רקמות ולאפשר לתאים להגיע 90% המפגש בזמן הזיהום בחממה להגדיר ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
    8. השתמש בדוגמאות של תרבות הרקמה שהיו מופשרים על הקרח (שלב 3.2.4.). הוסף 90 μL של מדיה זיהום לכל הבארות בצלחת חדש 96-באר, לאחר מכן להוסיף 10 μL של התרבות רקמה מופורה supernatant (שלב 3.2.4) אל הבאר הראשונה (שורה A). השתמש בחיית מחמד רב-ערוצי כדי לערבב ולהעביר 10 μL משורה A לשורה B. שנה את העצות בין מדלל וערבב היטב.
      הערה: יש לחזור על הליך זה עד לשורה האחרונה (H). אנו ממליצים לבצע ביצוע שרשור ויראלי בטריליטים למדידה מדויקת של הטיטרים ויראליים.
    9. הסר את המדיום תרבות הרקמה מתאי MDCK ב 96-היטב צלחות (שלב 3.2.7) ולשטוף פעמיים עם 1x PBS. הוסף 50 μL של מדלל את העתק של העותק המשוכפל 96-צלחת באר המכילה את מדלל וירוס (שלב 3.2.8) לכל טוב בצלחת 96-באר המכיל תאים MDCK.
    10. מודקת את הצלחת 96-ובכן על פלטפורמת נדנדה עבור 1 h בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ספיחה ויראלי. לאחר adsorption ויראלי, להסיר את החיסונים ולהוסיף 100 μL/היטב של מדיה לאחר זיהום המכיל 1 μg/mL של הטיפול טריפסין TPCK. מודטה תאים נגועים 12 שעות בחממה 33 ° c עם 5% CO2.
    11. מאז BIRFLU מבטא ונוס, מספר התאים הנגועים ניתן לספור ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית. לחילופין, מגדל ויראלי יכול להיקבע על ידי immunofluorescence עקיף כמתואר בעבר באמצעות נוגדן נגד חלבון נגיפי23,56,57,59. לאחרונה, להמשיך לתקן/לחלחל את התאים ואת הכתם באמצעות אנטי NP mAb HB-65 כמתואר בסעיף 4.4.
    12. לקבוע את הטיטרים ויראלי על ידי ספירת מספר יחידות פלורסנט-יוצרי (FFU)/mL באמצעות הנוסחה: ((מספר FFU) x 20 x 1/דילול (איור 2D).

4. באפיון Vivo של בירפעת (איור 3 ואיור 4)

  1. זיהום עכבר
    הערה:
    Intranasal הידבקות בעכברים נעשתה כפי שתוארה בעבר23. עבור פרוטוקול מפורט יותר של זיהום IAV ב vivo באמצעות מודל העכבר של זיהום, אנו ממליצים להציג את הווידאו המשויך הפרסום הקודם23. סעיף זה מסכם רק את השלבים הדרושים להידבקות בעכבר באמצעות בירפעת.
    1. בדוק את העכברים כדי להעריך את בריאותם ואת המראה הגופני הכולל. הכינו את הדילול של בירפעת ב-1x PBS כדי לחסן עכברים עם 1 x 106 pfu של בירפעת בנפח כולל של 30 μl/עכבר. שמרו על הוירוס על הקרח. עד לחיסון העכבר
      הערה: עכברים נגועים מבוים (1x PBS) יהיה צורך כפקד פנימי עבור הדמיה. המקום עכברים נגועים מבוים בכלוב שונה מאשר בעלי חיים נגועים בשפעת.
    2. כאשר אתם מצוידים ב-intraperitoneally באמצעות הוספת המחט לתוך caudal 2/3 של הצד הימני של הבטן, יש להכניס את כל העכברים לגיל 5 עד שבע שבועות. ואז, להחזיר את העכבר לכלוב ולחכות בסביבות 5 דקות. בדוק כי העכבר מורדם לפני החיסון וירוס על ידי העדר רפלקס הבוהן.
      הערה: הרגעה להזרקה מומלצים על הרגעה שואף לדלקות שפעת ב vivo, כמו האחרון יכול לשנות את ההתנהגות ואת ספיגת הנגיף על ידי האפיתל דרכי הנשימה. יתר על כן, הם יכולים גם להשפיע על תגובות החיסון המקומי של הריאה להפריע הדמיה vivo של עכברים נגועים. לבסוף, הרגעה שאפה יש מופחתת משך ההשפעה, אשר תהיה בעיה עבור הדמיה vivo של בעלי חיים נגועים.
    3. איחסן את העכברים intranasally עם שלושים μL של דילול בירפעת הכין. בדוק כי העכברים נושמים כראוי לפני שהחזירו אותם לכלוב.
  2. ניטור ביולומינסנציה של עכברים נגועים בירפעת (איור 4A)
    הערה:
    בביטוי כתב היד הזה של Nluc או ונוס ושכפול נגיפי בריאות של עכברים נגועים בירפעת נקבעים ב 3 ימים לאחר ההדבקה. עם זאת, הטבע של הדמיה biלומינסנציה מאפשר ניטור חוזרות של ביטוי Nluc בבעלי חיים נגועים באופן אינדיבידואלי שפעת ללא צורך להרוג אותם עבור כל נקודת זמן ניסיוני. A במערכת הדמיה vivo עם סעפת הרדמה isofלוריאן הוא נדרש כדי לבצע את ההליכים הניסיוניים המתוארים. עיין ברשימת החומר לקבלת פרטים אודות כלי הדימות ותוכנת התמונה המשמשים לרכישת תמונות ולניתוח נתונים.
    1. לגלח את החזה העכברים כדי לשפר את האות ביולומינסנציה. פתח את תוכנת הדימות והקש על אתחל. לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים שישמשו, כולל הגדרת מצב הדימות לביולומינציה, שמירה אוטומטית, זמן חשיפה לאוטומטי, מסנן פתוח, וכו '.
    2. ברגע שהמכונה מאותחלת לגמרי, הפעל. את מערכת ההרדמה הטיפולית מניחים בעלי חיים. בתא ההרדמה עכברים בו מורדם בקלות עם תערובת של גז חמצן מתאדה 1 – 2% isofלוריאן.
    3. לאחר העכברים מורדם, לנהל את המצע Nluc (לראות את הטבלה של חומרים) מדולל 1:10 ב-1X PBS (נפח סופי 100 μl/עכבר) באמצעות מסלול רטרו מסלולית באמצעות מזרק עם מחט G 22.
    4. מיד לאחר לאחר Nluc מגיב הממשל, במקום בעלי החיים במכשיר הדמיה עם החזה שלהם כלפי מעלה, חוטם בתוך חרוט סעפת לשמור על חיות מורדם במהלך הדמיה. מיד לאחר סגירת דלת האימגר, לחץ לרכוש בתוכנית התוכנה (איור 4a, למעלה).
    5. לאחר הדמיה, להחזיר את העכברים לכלובים שלהם ניטור אותם עד שהם התאושש באופן מלא לכבות את האידוי isofלוריאן. ואז, להמשיך עם הדמיה vivo ex של הריאות עכברים כדי להעריך את הביטוי הגן של ונוס כתבת (סעיף 4.3).
    6. השתמש בכלי תוכנת הדימות כדי לנתח את הנתונים הביולומינציה הנרכשים. לנצל את הכלי ROI (אזור של עניין) כדי לייעד את האות הספציפי ולבצע מדידות השטף באזור הריבית (בדרך כלל סביב החזה) (איור 4a, למטה). למרות הצורה ROI אינו רלוונטי, ROIs גדול יותר הם בדרך כלל העדיפו ללכוד את אזור דיפוזיה האות כולו.
    7. לחץ על מדידה. הערכת הביולומינסנציה בפוטונים מאחר שהיא מספקת מדידה מוחלטת של פליטת פוטון הדומה למידות פלט שסופקו על-ידי פרמטרים או מכשירי דימות שונים.
  3. אנליזה פלואורסצנטית בעכברים נגועים בירפעת (איור 3 ואיור 4b)
    1. לאסוף את הריאות העכבר אחרי הדמיה vivo, כפי שתוארה בעבר23.
      1. בקצרה, המתת חסד עכברים עם מנה קטלנית של TBE (500 מ"ג/ק"ג). חטא את אתר החתך. עם 70% אתנול עם אזמל, לעשות חתך מעצם החזה לבסיס הבטן ולאחר מכן חותכים מהחלק התחתון של החתך לצדדים עם מספריים. לאחר מכן, חותכים את הווריד הכבד (שיטת המתת החסד השנייה) כדי לדמם את החיה.
        הערה: כדי להימנע מאותות רקע גבוהים במהלך ההדמיה, חשוב למזער את כמות הדם בריאות (ראה להלן).
    2. מניחים את העכבר בתוך שכיבה, ולהשתמש במספריים כדי לחתוך את pleura ולפתוח את כלוב הצלעות. לאחר מכן, להסיר את הריאות על ידי החיתוך של סוף קנה הנשימה עם מספריים תוך החזקת בעדינות את הריאות עם מלקחיים.
      1. מניחים את הריאות בצלחת שש-היטב עם 2 מ ל של 1x PBS ולשטוף את הריאות שלוש פעמים עם 1x PBS.
        הערה: כדי למנוע זיהום בין דגימות, לנקות ולחטא את הכלים הבתר בין כל חיה.
    3. הפעל את תוכנת רכישת התמונה על ידי לחיצה על לאתחל ולהגדיר את הפרמטרים עבור דימות, כולל הגדרת מצב הדמיה לקרינה פלואורסצנטית, שמירה אוטומטית, זמן חשיפה אוטומטי, עירור (500 nm) ופליטה (540 ננומטר) מסננים.
    4. כאשר המכונה מאותחלת, למקם את הריאות מגש רקע שחור, להבטיח כי הרקמות מופרדים זה מזה, להציג את המגש לתוך הצמידה, ולחץ לרכוש בתוכנית מערכת הדמיה לאחר סגירת הדלת צמידה ( איור 4B, למעלה).
    5. לאחר הדמיה, הסר את הרקמות מיד ואחסן אותן בקרח (4 ° c) אם הדגימות מעובדות באותו יום; או על שפופרת וקרח יבש כדי להקפיא אותם במהירות, לפני אחסונם ב-80 ° c, אם הדגימות יעובדו בהמשך ביום אחר.
    6. עבור עיבוד תמונה, בחר את הכלי ROI ולצייר rois סביב כל הריאות הפרט. לחץ על מדידה. לאחר מכן, באמצעות מדידות יעילות ממוצעת קורן, להפחית את הערכים מן העכברים נגועים מבוים (איור 4B, למטה).
      הערה: עם בירפעת, יש מתאם טוב של רמות הביטוי Nluc ו-ונוס, והפצת אותות. לכן, חשוב לנתח את Nluc (העכבר כולו) ואת ונוס (הריאות החוצה) ביטוי מאותה חיה, ולשמור על אותו אוריינטציה.
  4. הערכה של שכפול בירפעת הריאות עכברים (איור 3 ואיור 4c)
    1. הומוגון הריאות עכברים עבור טיטור ויראלי על ידי שיטת הפלאק כפי שתוארה בעבר23.
  5. מניחים את הריאות לתוך מכשיר הומוגניצר עם 1 מ ל של מדיה זיהום מקורר. המגון לסדר את הריאות עם הסחוס עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר עד שהוא התפורר לחלוטין ולאחסן את הדגימות בצינור סטרילי ב 4 ° c.
    1. צנטריפוגה את הדגימות ב 300 x g עבור 10 דקות ולאסוף את supernatant בצינור סטרילי. לאחסן את הדגימות על הקרח אם הם ישמשו באותו יום או להקפיא אותם ב-80 ° c כדי להעריך מגדל ויראלי במועד מאוחר יותר.
      הערה: יש להשתמש במכונת הומוגנידזר חדשה עבור כל דגימת ריאה.
    2. כדי לבצע את העיבוד הפלאק, היום לפני ביצוע titration ויראלי, זרע שישה לוחות היטב עם תאים MDCK (5 x 105 תאים/טוב) במדיה תרבות הרקמה. מודאת התאים לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 כדי להגיע 90% המפגש היום הבא. לפני זיהום, לאשר את התאים הטופס מונאולייר תחת מיקרוסקופ אור.
    3. הכינו 1:10 מדלל סדרתיות של הסופרנטאנט מדגימות הומוגניים (step 4.4.1) באמצעי הדבקה. הכנת צינורות מיקרוצנטריפוגה עם 540 μL של מדיה זיהום, להוסיף 60 μL מדגימת הריאות הומוגניים הצינור הראשון, לערבב ידי ליטוף למעלה ולמטה, ולאחר מכן באמצעות עצה חדשה, העברת 60 μL לצינור הבא. חזור על תהליך הדילול הטורי עד לדילול האחרון.
      הערה: בניסיון שלנו 7 מדלל מספיק כדי לקבוע מגדל ויראלי ידי שיטת הפלאק מן הריאות של עכברים נגועים.
    4. לשטוף את התאים MDCK (שלב 4.4.3) פעמיים עם 1x PBS ולהעביר 500 μL של דגימות מדולל באופן סדרתי לכל טוב בצלחת שש-היטב. מניחים את הצלחות על פלטפורמת נדנדה ומאפשרים ספיגה נגיפית להתרחש 1 h בטמפרטורת החדר.
    5. לאחר 1 h של ספיגת ויראלי, להסיר את האינויואה נגיפי, להוסיף 2 מ ל/טוב של שכבת-על בינונית המכילה 1 μg/mL של טריפסין מטופל TPCK, ולאחר מכן מארג את התאים ב 33 ° c תחת 5% CO2 עבור 3 ימים.
    6. תקן תאים נגועים (שלב 4.4.6) עם 1 mL/טוב של 4% פורמלדהיד מדולל 1x PBS בטמפרטורת החדר עבור 2 h, ולאחר מכן בזהירות להסיר את המדיום כיסוי ולהוסיף 1 מ ל של 1x PBS לכל טוב. להמחשה של ונוס, יש לדמות את ששת הצלחות עם מערכת דימות לאיתור הקרינה הפלואורסצנטית.
      הערה: שלטים ויראליים ניתן לצבוע באמצעות תוכנה לעריכת תמונה (לראות את הטבלה של חומרים).
    7. כדי להעריך את הביטוי Nluc, המחש את הפלאק הנגיפי באמצעות כתמים מבוססי אנטי-Nluc pAb. בשביל זה, להסיר את התאים 1x PBS, החדירות באמצעות 0.5 mL/באר של פתרון החדירות עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. הסר את הפתרון החדיר, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x PBS ולחסום עם 0.5 mL/טוב של פתרון חסימה עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
    9. הסר את פתרון חסימת משלב 4.4.9 ו מודלת את התאים עם 0.5 mL/טוב של pAb anti-Nluc מדולל 1:1000 בתמיסה דילול עבור 1 h ב 37 ° c.
    10. השתמש ב-ABC הקיט פוספטאז ערכת ו Peroxidase המצע לאחר היצרן המלצה על ויזואליזציה של Nluc-לבטא לוחיות.
      1. בקצרה, לשטוף את התאים מתוך 4.4.10 שלוש פעמים עם 1x PBS ו-דגירה אותם עם 0.5 mL/גם של האנטי-ארנבת ביולוגי נגד הארנב המשני עבור 1 h ב 37 ° c.
      2. להסיר את הנוגדן המשני, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x PBS, ו דגירה עם פתרון ABC עבור 1 h ב 37 ° c. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1x PBS ולדמיין את הפלאק ויראלי עם המצע Piece HRP Kit. סרוק את הפלאק ויטראז ' באמצעות סורק קונבנציונלי.
        הערה: ערכות דומות אחרות עבור כתמים חיסוני ניתן להשתמש.
    11. הכתם את הפלאק הנגיפי עם פתרון גביש סגול עבור 1 h בטמפרטורת החדר. להשליך את הגביש הסגול, לשטוף את הצלחות שלוש פעמים עם מים, לאפשר לוחות להתייבש, ולסרוק את הצלחות שוב.
    12. כדי לקבוע titers ויראלי, לספור את הפלאק חשף לאחר כתמים קריסטל סגול. סרוק את הלוחיות באמצעות סורק קונבנציונלי. חישוב סיכוייו וירוס כלוח להרכיב יחידות (pfu) לכל mL (pfu/mL).
    13. כדי להעריך את יציבות בירפעת ב vivo, לחשב את אחוז הווירוסים המבטא העיתונאי על ידי ספירת מספר שלטים קריסטל סגול מוכתם (מספר וירוסים זיהומיות, צעד 4.4.12) ולהשוות עם מספר ונוס-ו-Nluc-הבעת הפלאק ( שלב 4.4.7 וצעד 4.4.11, בהתאמה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יצירה ואפיון של בירפעת במבחנה (איור 1 ואיור 2)

רקומביננטי שכפול-IAV מוסמך המבטא שני גנים כתבת שונים (BIRFLU פעת) נבנה באמצעות המדינה של הביולוגיה המולקולרית של האמנות ו פלפריאמצע מבוססי גנטיקה הפוכה טכניקות (איור 1). כאן, אנחנו בחרנו להשתמש nluc בשל כמה יתרונות על פני לוציות אחרים, כולל גודל קטן שלה, ATP-עצמאות, עוצמה רבה יותר, ו ממוטבת מצע48,60. Nluc שוכפל לתוך קטע HA של iav PR8 ואחריו הווירוס חזירי (ptv) 2a המחשוף באתר (2a) מול מסגרת הקריאה הפתוחה (orf) של HA (איור 1). ORF של HA כללה מוטציות שקטות כדי להסיר את אותות האריזה המקורי ולהימנע כל שילוב מחדש אפשרי. אות האריזה המלאה HA התווסף לפני Nluc כדי לאפשר התאגדות נאותה של קטע שונה HA לתוך ולאחר והביטוי Nluc ו-HA מתוך אותו קטע RNA ויראלי (איור 1). בנוסף, חלבון פלורסנט ונוס שוכפל קטע iav PR8 NS שונה אשר מקודד את שני החלבונים נגיפי NS1 ו nep מתוך תעתיק יחיד32,36,41,54, 57. למטרה זו, ונוס היה התמזגו C-מסוף של NS1, NEP ORF כולו שוכפל במורד האתר PTV 2A המחשוף שהונחו בין NS1-ונוס ו NEP רצפים (איור 1). בסופו של דבר, אלה שני שונה HA ו-NS ויראלי בנייה מבנים שימשו בשילוב עם שאר IAV PR8 גנטיקה הפוכה לייצר בירשפעת (איור 1). הvivo בתחומי החוץ והאפיון של בירפעת תוארה בעבר55.

באיור 2, אנחנו מאופיינים בלתי מתורבת בירשפעת על ידי קביעת ונוס, nluc, ו-NP רמות ביטוי באמצעות מגישות אימונוofnornbnnnnnnnn עקיף ועקיפים (איור 2a, B). Confluent מונאולאיירס של תאים MDCK היו או מבוים נגוע או נגוע (מוי 0.1) עם וירוסים PR8 WT או בירפעת ו, ב 18 לאחר ההדבקה, ונוס ביטוי הוערך ישירות באמצעות מיקרוסקופ הזריחה (איור 2A, ב). Nluc (איור 2A) ו NP (איור 2a) הביטוי היו דמיינו על ידי immunofluorescence בעקיפין באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור כל חלבון. כפי שציפינו, ונוס Nluc הביטוי זוהו רק בתאים נגועים על ידי בירפעת ולא בתאים נגוע על ידי וירוס WT PR8. בנוסף, מיקרוסקופ אימונולוורנציה עקיף חשף ביטוי NP בשני WT ו בירפעת PR8-תאים נגועים. לא התגלו ביטוי של ונוס, נלוק או NP, כמצופה, בתאים נגועים בדמה (איור A, B).

כדי להעריך את הביטויים Nluc ביטויים בתוך מבחנה, תאים MDCK נדבקו (מוי 0.001) עם וירוסים או בירפעת PR8 ופעילות Nluc בתרבות רקמות supernatants הוערך ב 24, 48, 72 ו96 h לאחר ההדבקה (איור 2C). רק פעילות Nluc התגלתה בתרבית רקמות סופרנטנים של התאים MDCK נגוע בירפעת (איור 2C). פעילות nluc בתרבות רקמות supernatants זוהה מוקדם ככל 24 h לאחר זיהום עם רמות ביטוי גבוה יותר ב 96 h לאחר ההדבקה, כנראה בגלל האפקט אפקט ציטופתי (cpe) המושרה במהלך זיהום נגיפי שחרור החלבון nluc נשמר לתוך התא. כדי להעריך את הכושר של BIRFLU בתאים תרבותיים, הצמיחה קינטיקה של WT ו בירפעת PR8 וירוסים הוערכו גם (איור 2D) ואת הנוכחות של וירוס זיהומיות בתרבות רקמה supernatants נקבע על ידי מיקוד המערכת החיסונית (איור 2d ). בעיקר, הקינטיקה שכפול בירשפעת היו דומים לאלה של וירוס WT PR8, למרות שכפול בירפעת היה מתעכב מעט ולא להגיע מגדל נגיפי אותו כמו WT PR8. עם זאת, בירפעת היה מסוגל להגיע מגדל של 5 x 107 pfu/mL (איור 2d), המציין כי הביטוי של שני גנים עיתונאי בגנום נגיפי אינו מפריע באופן משמעותי עם שכפול בירפעת בתאי mdck.

מעקב זיהום בירפעת בעכברים (איור 3 ואיור 4)

איור 3 הוא תרשים זרימה סכמטי להערכת הדינמיקה של בירפעת במודל העכבר של זיהום iav. כאשר אתם מצוידים בעכבר בגודל של 5 עד 7 שבועות ועכברים היו נגועים ב-1x PBS או נגועים ב-1 x 106 pfu של בירפעת intranasally. ב 3 ימים לאחר זיהום, עכברים היו מורדם עם isof, ולאחר מכן הוזרק עם המצע Nluc רטרו-אורלאלי. כל העכברים הונחו מיד בכלי IVIS והאות Nluc הוערך בvivo באמצעות IVIS. בשלב הבא, עכברים הורדמים. והריאות נקצרו הריאות שעברו ניתוח מנותח לאחר מכן vivo ex באמצעות vivo צמידה כדי לקבוע את עוצמת הקרינה באמצעות ביטוי ונוס. לבסוף, ריאות העכברים היו הומוגניים, והטיטרים והיציבות הנגיפיים נקבעו על ידי שיטת הפלאק. שלטים העריכו על ידי הזריחה הישירה של ונוס, על ידי מכתים באמצעות נוגדנים ספציפיים Nluc ועל ידי כתמים קריסטל סגול.

תיאר בעבר שכפול-כתב מוסמך-המבטא IAVs לבטא גן עיתונאי יחיד, לעתים קרובות או פלורסנט או חלבון ביולומינטי, כתחליף לזיהום נגיפי ושכפול. עם זאת, בירפעת, הוא מסוגל לבטא את שני הסוגים של גנים עיתונאי על זיהום נגיפי. כדי להעריך את הקורלציה בין ביולומינסנציה (ב vivo הדמיה) ו הקרינה הפלואורסצנטית (ex vivo הדמיה) לאחר זיהום BIRFLU פעת, 5-עד-7-שבוע הנקבה בלאB/c עכברים היו מבוים-נגוע 1x PBS או מחוסן עם בירפעת (106 pfu) intranasally . Nluc פעילות (איור 4A) הוערך על ידי ניהול של מצע nluc הוזרק רטרו-אורבאלי ב 3 ימים לאחר זיהום באמצעות מכשיר הדמיה vivo. בחרנו להעריך את ביולומינסנציה ביום 3 משום שמחקרים קודמים הצביעו על כך ששכפול iav, כולל PR8, פסגות בין ימים 2 ו-4 לאחר זיהום24,54. ביולומינסנציה היה מפוקח (איור 4A, למעלה) ומשמש כדי לחשב את השטף הכולל הממוצע (שטף (יומן10 p/s) (איור 4a, למטה). כפי שחזוי, עכברים מחוסן עם BIRFLU פעת הציג פעילות ביולומינסנציה גבוהה אבל לא התגלתה אות בעכברים נגועים מבוים. לאחר מכן, הריאות של עכברים נגועים נקצרו הביטוי ונוס הוערך באמצעות vivo ex הדמיה (איור 4B, למעלה). יתר על כן, את היעילות הקורנת ממוצע זוהר מחושב (איור 4B, למטה). הריאות עכברים המגורש היו גם הומוגניים כדי לקבוע את מגדל נגיפי ואת היציבות הגנטית של בירפעת בvivo (איור 4c, D). היציבות הגנטית של בירפעת היתה מנותח באמצעות שימוש בעזרת וירוסים מבודדים מפני הריאות עכברים מיקרוסקופ פלורסנט (ונוס, למעלה), חיסוני (Nluc, באמצע) ו קריסטל סגול כתמים (למטה). BIRFLU התאושש הריאות עכברים הצליחו ליצור לוחיות באופן מידי מבטא הן גנים הכתב (איור 4C). בעיקר, הבחנו מתאם טוב בין הביולומינסנציה ואותות זריחה עם שכפול נגיפי.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של IAV PR8 WT ומבנה וויריריה ומקטעי הגנום. IAV הם מוקפים bilayer ליפיד המכיל את שני הגליקוטיטין הגדולות ויראלי (HA; שחור) ועצבי (NA; כחול). IAV מכילים שמונה יחיד תקועים, שלילי הגיון, מקטעי RNA (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, ו-NS). כל קטע נגיפי מכיל אזורים שאינם מצפינה לקידוד (סי אר) בקצוות של 3 ו -5 (תיבות שחורות). גם, ב 3 ' ו 5 ' הקצה של ויראלי (v) RNAs הם אותות האריזה, אחראי encapsidation היעיל של vRNAs לתוך הריסונים המתהווה (תיבות לבנות). IAV PR8 HA ו-NS קטעי ויראלי ומוצרים מצוינים בשחור. רצפי Nluc, ונוס, ו-PTV 2A מסומנים בתיבות אדום, ירוק ופסים, בהתאמה. הייצוג הסכמטי של הקטעים השונה המבטאים את Nluc ונוס, בהתאמה, ב BIRFLU מצוינים גם. הדמות הזאת הותאמה מן Nogales ואח '55. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: באפיון חוץ גופית של בירפעת. (א, ב) ניתוח של ביטוי חלבון על-ידי. קרינה פלואורסצנטית ישירה ואימונולובורנציה תאים MDCK היו מבוים נגועים או נגועים (מוי 0.1) עם וירוסים PR8 WT או בירפעת. תאים נגועים תוקנו ב 18 h לאחר ההדבקה כדי להמחיש באופן ישיר את ביטוי ונוס על ידי מיקרוסקופ פלורסנט ישיר לדמיין Nluc (א) ו ויראלי NP (ב) ביטוי באמצעות נוגדנים ספציפיים ומוחיסאוליים עקיפים. גרעינים היו מוכתמים DAPI. תמונות מייצגות (הגדלה של 20x) מוצגות. קנה מידה של סרגלים = 100 μm. (ג, ד) קינטיקה מגדילה של PR8 WT ובירפעת. Nluc פעילות (C) ו-מגדל נגיפי (D) בתרבות רקמות supernatants מ-mdck תאים נגועים (מוי 0.001) עם WT ו בירפעת PR8 וירוסים העריכו בזמנים המצוינים לאחר ההדבקה. הנתונים מייצגים את האמצעים ± SD של טריפליטים. טיטרים ויראליות נקבעו על ידי שיטת המיקוד החיסונית (FFU/mL). קו מנוקד מציין את מגבלת הזיהוי (200 FFU/ml). הדמות הזאת הותאמה מן Nogales ואח '55. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ייצוג סכימטי לחקר בירפעת בעכברים. ביטוי של Nluc ונוס גנים העיתונאי הוערך עכברים נגועים 1 x 106 pfu של בירפעת באמצעות vivo או ex vivo הדמיה. בקצרה, ביום 1, 5 כדי 7 בשבוע הנקבה בעכבר BALB/c עכברים היו מבוים נגועים (1x PBS) או מחוסן עם 1 x 106 pfu של בירפעת intranasally. ביום 3 לאחר ההדבקה, עכברים היו מורדם במקצת באמצעות isof, המצע Nluc הוזרק רטרו-אורלביאן. אות nluc הוערך ישירות באמצעות הדמיה vivo. מיד לאחר הדמיה, עכברים היו מורדמים וביטוי של ונוס בריאות מחפירה כולה נותחו באמצעות הדמיה לשעבר vivo. הריאות עכברים התאושש היו הומוגניים כדי להעריך שכפול ויציבות ויראלית על ידי שיטת הפלאק. חיצים מצביעים על קורלציה בין הקרינה הפלואורסצנטית (ונוס), חיסוני (Nluc) וכתמים קריסטל סגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: בvivo יולומינציה וביטוי הזריחה. הנקבה מחמש עד שבע שבוע עכברים בלB/c היו נגועים ללעוג (1x PBS) או מחוסן עם 1 x 106 pfu של בירפעת intranasally. ביום 3 לאחר ההדבקה, פעילות Nluc (א) בעכבר כולו נקבע. תמונות מייצגות של עכבר בודד המציגה סולם זוהר (p/שניה/cm2/sr). ביולומינסנציה ערכי הזוהר היו כימות השטף הכולל הממוצע מוצג (השטף (Log10 p/s). לאחר הדמיה Nluc, הריאות נקצרו עבור לשעבר vivo הדמיה (ב). תמונות מייצגות מהריאות השלמה מוצגות. כדי לכמת את הביטוי ונוס, ערכי הממוצע של אזורים מעניינים (ROIs) היו מנורמלות לריאות באופן אוטומטי מפני עכברים נגועים מבוים ושינויי קיפול חושבו. כדי לנתח את היציבות הגנטית של בירפעת בvivo, וירוסים ששוחזרו מהריאות של עכברים נותחו על-ידי שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית (ונוס, למעלה), חיסוני (Nluc, אמצע) וכתמים סגול קריסטל (למטה) (C). תמונות מייצגות מעכבר אחד מוצגות. כדי להעריך שכפול וירוס, הריאות שלמות היו הומוגניים לאחר הדמיה והשתמשו כדי להדביק את התאים mdck ולקבוע מגדל נגיפי על ידי שיטת הפלאק (pfu/mL) (D). חיצים מצביעים על קורלציה בין הקרינה הפלואורסצנטית (ונוס), חיסוני (Nluc), וכתמים קריסטל סגול. ברים מייצגים את ממוצע ± SD של titers וירוס ריאות. איור זה הותאם מ Logales ואח '.55. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מדיה ופתרונות לתרבות הרקמה רכב אחסון השתמש
מדיה לתרבות רקמות: בינונית של הנשר השונה של dulbecco (DMEM), 10% סרום של שור עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין-L-גלוטמין (PSG) (Dmem 10% FBS 1% PSG). 445 מ"ל DMEM 50 מ ל של FBS ו 5 מ ל של 100x PSG. 4 מעלות צלזיוס תחזוקת תאי MDCK
מדיה לאחר הידבקות: dmem 0.3% פרה אלבומין (ba), 1% Psg (dmg 0.3% BA 1% psg). 491 מ"ל DMEM 4.2 מ ל של 35% BA ו 5 מ ל של 100x PSG 4 מעלות צלזיוס תחזוקת תאים MDCK לאחר זיהום נגיפי
מלוחים באגירה 10x פוספט (PBS) 80 g של הנאל, 2 גרם של KCl, 11.5 g של Na2hpo4. 7h2O, 2 גרם KH2פו4. הוסף את ה-ddH2O עד 1 ל. התאם את ה-pH ל 7.3 טמפרטורת החדר להכנת 1x PBS
1x PBS דלל 10x PBS עם ddH2O טמפרטורת החדר שטוף תאים
מדיה לזיהום: 1X PBS, 0.3% BA, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (ps) (PBS/BA/ps). 487 מ"ל 1x PBS סטרילי, 4.2 mL של 35% BA ו 5 מ ל של 100x 1% PS (100 U/mL) 4 מעלות צלזיוס זיהומים ויראליים
קיבוע/פתרון החדירות: 4% פורמלדהיד, 0.5% טריטון X-100 מדולל 1X PBS. 400 מ"ל באגירה נייטרלית של 10%, 5 מ ל של טריטון X-100 ו 595 mL של 1x PBS טמפרטורת החדר תיקון והחדירות של תאי MDCK.
חסימת הפתרון: 2.5% בסרום (bsa) בערוץ 1x. 2.5 גרם של BSA ב 97.5 מ ל של 1x PBS 4 מעלות צלזיוס חסימת מענה לאימונולובורנציה והפלאק.
תמיסת דילול תמיסה (1% BSA ב-1x PBS) 1 גרם של BSA ב 99 מ ל של 1x PBS 4 מעלות צלזיוס דילול של נוגדנים ראשוניים ומשניים.
0.1% הפתרון של קריסטל סגול 1 גר' קריסטל סגול ב 400 מ ל של מתנול. הוסף 600 מ ל של ddH2O טמפרטורת החדר כתמים של תאים MDCK בתוך הפלאק אומר.
טוסיסולולאיל פנילאלאניל כלורומאתיל קטון (מטופל)-טריפסין הכנת פתרון מניות 1, 000x ב 1 מ"ג/mL ב ddH2O -20 ° c. לזיהומים ויראליים.

שולחן 1: מדיה ופתרונות לתרביות רקמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החוקרים סמכו על רקומביננטי עיתונאי-הבעת וירוסים ככלי מולקולרי חיוניים כדי להבין ולהרחיב על ההבנה הנוכחית של שכפול נגיפי הפתוגנזה26,27,28, בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. גנים העיתונאי המועדף ביותר הם לוציטיות וחלבונים פלורסנט, בעיקר בשל ההתקדמות הטכנולוגית בזיהוי שלהם, פיתוח של גרסאות משופרות, ואיתור על ידי טכנולוגיות הדמיה43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. רקומביננטי וירוסים העיתונאי משמשים לעתים קרובות כדי להאיץ virological assays, ללמוד את הדינמיקה של וירוסים בתחום החוץ ובvivo, וכיצד לבדוק את האפקטיביות של החיסון כרגע או חדש וגישות טיפוליות26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. למרבה הצער, במקרה של iav, מחקרים בעבר הוגבלה לביטוי של גן עיתונאי יחיד, אשר מעכבת את סוג המחקר שיכול להתבצע 26,27,28,29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. כדי למנוע מגבלה זו, יצרנו iav שכפול מוסמך bi-כתב כי מבטא nluc לוציפראז ו חלבון פלורסנט של ונוס (בירפעת).

בדוח זה, אנו מתארים את האפיון של מבחנה בירפעת וגישות ניסיוני להשתמש BIRFLU לעקוב אחר זיהום נגיפי בvivo באמצעות מודל העכבר של זיהום IAV. בירשפעת נלוק ו ונוס בקורלציה עם titers נגיפי. בנוסף, בירפעת נשאר יציב והמשיך לבטא את שני גנים העיתונאי לאחר שהחלים מן הריאות של עכברים נגועים. גישה זו מספקת לחוקרים הזדמנות מצוינת ללמוד IAV בתאים מתורבתים ובדגמי בעלי חיים, כולל זיהוי ופיתוח חלופות טיפוליות חדשות לטיפול בדלקות IAV.

למרות בירשפעת נוצר באמצעות עמוד השדרה של PR8, אחרים רקומביננטי iav באמצעות סוג שונה, סוג או נגיפי הזנים שדרות יכול להיווצר באמצעות אותה גישה ניסויית. כמו כן, בדוח זה תיארנו את ההליכים הניסיוניים לשימוש ב בירפעת במודל העכבר של IAV. עם זאת, בירפעת יכול להיות טכנולוגיה רבת ערך להערכת זיהום IAV במודלים אחרים בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר על וירוס שפעת במעבדה LM-S ממומן באופן חלקי על ידי ניו יורק שפעת מרכז המצוינות (NYICE) (NIH 272201400005C), חבר מרכזי NIAID של מצוינות עבור מחקר שפעת ומעקב (CEIRS) חוזה לא. HHSN272201400005C (NYICE) ועל ידי משרד הביטחון (משרד ההגנה) עמית נבדקו תוכנית מחקר רפואי (PRMRP) מענק W81XWH-18-1-0460.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 665102
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Adobe Photoshop CS4 Adobe This software is used in 3.1.10 and 4.4.7
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4 ° C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell Culture dishes 100mm Greiner Bio-one 664-160
ChemiDoc MP Imaging System BioRad This instrument is used in 4.4.7
Crystal Violet Thermo Fisher Scientific C581-100 Store at Room temperature
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
5 to 7 week-old female BALB/c mice National Cancer Institute (NCI) 555
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at Room temperature
IVIS Spectrum PerkinElmer 124262 This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)
IX81 Motorized Inverted Microscope Olympus Olympus IX81
Living Image 4.7.2 software PerkinElmer This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3)
Lumicount Packard This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATCC H16-L10-4R5 Store at -20 °C
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x Corning 30-00-CI Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
Retiga 20000R Fast1394 Camera Qimaging Retiga 2000R
Scanner HP
Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies Jackson 715-075-150 Store at -20 °C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20 °C
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. 5th edition, Lippincott Williams and WIlkins. (2007).
  2. Martinez-Sobrido, L., Peersen, O., Nogales, A. Temperature Sensitive Mutations in Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complex Responsible for the Attenuation of the Live Attenuated Influenza Vaccine. Viruses. 10, (10), (2018).
  3. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. International Journal of Molecular Sciences. 18, (1), (2016).
  4. Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459, (7249), 931-939 (2009).
  5. Louie, J. K., et al. A review of adult mortality due to 2009 pandemic (H1N1) influenza A in California. PLoS One. 6, (4), e18221 (2011).
  6. Barr, I. G., et al. Epidemiological, antigenic and genetic characteristics of seasonal influenza A(H1N1), A(H3N2) and B influenza viruses: basis for the WHO recommendation on the composition of influenza vaccines for use in the 2009-2010 Northern Hemisphere season. Vaccine. 28, (5), 1156-1167 (2010).
  7. Simonsen, L., et al. Impact of influenza vaccination on seasonal mortality in the US elderly population. A.M.A. archives of internal medicine. 165, (3), 265-272 (2005).
  8. McLean, H. Q., Peterson, S. H., King, J. P., Meece, J. K., Belongia, E. A. School absenteeism among school-aged children with medically attended acute viral respiratory illness during three influenza seasons, 2012-2013 through 2014-2015. Influenza and Other Respiratory Viruses. 11, (3), 220-229 (2017).
  9. Principi, N., Esposito, S. Protection of children against influenza: Emerging problems. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 1-8 (2017).
  10. Falsey, A. R., Treanor, J. J., Tornieporth, N., Capellan, J., Randomized Gorse, G. J. double-blind controlled phase 3 trial comparing the immunogenicity of high-dose and standard-dose influenza vaccine in adults 65 years of age and older. Journal of Infectious Diseases. 200, (2), 172-180 (2009).
  11. Fuller, J. D., et al. Influenza vaccination of human immunodeficiency virus (HIV)-infected adults: impact on plasma levels of HIV type 1 RNA and determinants of antibody response. Clinical Infectious Diseases. 28, (3), 541-547 (1999).
  12. Carrat, F., Flahault, A. Influenza vaccine: the challenge of antigenic drift. Vaccine. 25, (39-40), 6852-6862 (2007).
  13. Doherty, P. C., Kelso, A. Toward a broadly protective influenza vaccine. Journal of Clinical Investigation. 118, (10), 3273-3275 (2008).
  14. Fiore, A. E., et al. Prevention and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 2010. MMWR Recommendations and Reports. 59, (RR-8), 1-62 (2010).
  15. Pica, N., Palese, P. Toward a universal influenza virus vaccine: prospects and challenges. Annual Review of Medicine. 64, 189-202 (2013).
  16. To, K. K., Chan, J. F., Chen, H., Li, L., Yuen, K. Y. The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities. Lancet Infectious Diseases. 13, (9), 809-821 (2013).
  17. Baker, S. F., Nogales, A., Santiago, F. W., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Competitive detection of influenza neutralizing antibodies using a novel bivalent fluorescence-based microneutralization assay (BiFMA). Vaccine. 33, (30), 3562-3570 (2015).
  18. He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. (2015).
  19. Kayali, G., et al. Testing human sera for antibodies against avian influenza viruses: horse RBC hemagglutination inhibition vs. microneutralization assays. Journal of Clinical Virology. 43, (1), 73-78 (2008).
  20. Stephenson, I., et al. Reproducibility of serologic assays for influenza virus A (H5N1). Emerging Infectious Diseases. 15, (8), 1252-1259 (2009).
  21. Maher, J. A., DeStefano, J. The ferret: an animal model to study influenza virus. Lab Animal (NY). 33, (9), 50-53 (2004).
  22. Webster, R. G., Cox, N., Stoehr, K. WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev. 1. (2002).
  23. Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  24. Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. Journal of Virology. 89, (6), 3421-3426 (2015).
  25. Steel, J., Lowen, A. C., Mubareka, S., Palese, P. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathogens. 5, (1), e1000252 (2009).
  26. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87, (24), 13321-13329 (2013).
  27. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nature Communications. 6, 6600 (2015).
  28. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107, (25), 11531-11536 (2010).
  29. Perez, J. T., Garcia-Sastre, A., Manicassamy, B. Insertion of a GFP reporter gene in influenza virus. Current Protocols in Microbiology. Chapter 15 Unit 15G 14 (2013).
  30. Reuther, P., et al. Generation of a variety of stable Influenza A reporter viruses by genetic engineering of the NS gene segment. Scientific Reports. 5, 11346 (2015).
  31. Tran, V., et al. Multi-Modal Imaging with a Toolbox of Influenza A Reporter Viruses. Viruses. 7, (10), 5319-5327 (2015).
  32. Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Perez, D. R., Martinez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A and B Viruses Expressing a Fluorescent Dynamic Timer Protein for In Vitro and In Vivo Studies. PLoS One. 11, (1), e0147723 (2016).
  33. Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 206-216 (2014).
  34. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2015).
  35. Avilov, S. V., et al. Replication-competent influenza A virus that encodes a split-green fluorescent protein-tagged PB2 polymerase subunit allows live-cell imaging of the virus life cycle. Journal of Virology. 86, (3), 1433-1448 (2012).
  36. Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A Viruses Expressing Reporter Genes. Viruses. 8, (7), (2016).
  37. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PLoS One. 9, (5), e97695 (2014).
  38. Karlsson, E. A., et al. Visualizing real-time influenza virus infection, transmission and protection in ferrets. Nature Communications. 6, 6378 (2015).
  39. Czako, R., et al. In Vivo Imaging of Influenza Virus Infection in Immunized Mice. MBio. 8, (3), (2017).
  40. Harding, A. T., Heaton, B. E., Dumm, R. E., Heaton, N. S. Rationally Designed Influenza Virus Vaccines That Are Antigenically Stable during Growth in Eggs. MBio. 8, (3), (2017).
  41. DiPiazza, A., et al. Pandemic 2009 H1N1 Influenza Venus reporter virus reveals broad diversity of MHC class II-positive antigen-bearing cells following infection in vivo. Scientific Reports. 7, (1), 10857 (2017).
  42. Yan, D., et al. Replication-Competent Influenza Virus and Respiratory Syncytial Virus Luciferase Reporter Strains Engineered for Co-Infections Identify Antiviral Compounds in Combination Screens. Biochemistry. 54, (36), 5589-5604 (2015).
  43. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, (Pt 24), 4247-4260 (2007).
  44. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  45. Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Current Opinion in Pharmacology. 12, (5), 592-600 (2012).
  46. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (8), (2012).
  47. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10, (4), 41210 (2005).
  48. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (7), 1-13 (2013).
  49. Vintersten, K., et al. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40, (4), 241-246 (2004).
  50. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12, (7), 1-13 (2013).
  51. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (36), 14610-14615 (2012).
  52. Pan, W., et al. Visualizing influenza virus infection in living mice. Nat Commun. 4, 2369 (2013).
  53. Heaton, N. S., et al. In vivo bioluminescent imaging of influenza a virus infection and characterization of novel cross-protective monoclonal antibodies. J Virol. 87, (15), 8272-8281 (2013).
  54. Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476, 206-216 (2015).
  55. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent Bi-Reporter influenza A virus (BIRFLU) to evaluate viral infections. Journal of Virology. (2019).
  56. Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. Journal of Virology. 88, (18), 10525-10540 (2014).
  57. Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. Journal of Virology. 90, (14), 6291-6302 (2016).
  58. National Research Council (U.S.). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn, National Academies Press. (2011).
  59. Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Chiem, K., Topham, D. J., DeDiego, M. L. Functional Evolution of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus NS1 and PA in Humans. Journal of Virology. 92, (19), (2018).
  60. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7, (11), 1848-1857 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics