Presynapse dannelse analyse ved hjælp af Presynapse Organizer perler og "neuron Ball" kultur

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Presynapse dannelse er en dynamisk proces, herunder ophobning af synaptiske proteiner i ordentlig orden. I denne metode, presynapse dannelse udløses af perler konjugeret med en presynapse organisator protein på axonal plader af "neuron Ball" kultur, således at ophobning af synaptiske proteiner er let at blive analyseret under presynapse dannelse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Parvin, S., Takeda, R., Sasaki, Y. Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and “Neuron Ball” Culture. J. Vis. Exp. (150), e59893, doi:10.3791/59893 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Under neuronal udvikling, synapse dannelse er et vigtigt skridt til at etablere neurale kredsløb. For at danne synapser skal synaptiske proteiner leveres i passende orden ved transport fra celle organer og/eller lokal oversættelse i umodne synapser. Men, det er ikke helt forstået, hvordan synaptisk proteiner ophobes i synapser i ordentlig rækkefølge. Her præsenterer vi en ny metode til at analysere præsynaptisk dannelse ved at bruge kombinationen af neuron kugle kultur med perler til at fremkalde presynapse dannelse. Neuron bolde, der er neuronal celle aggregater giver axonal ark langt fra celle legemer og dendritter, således at svage fluorescerende signaler af præsynapser kan påvises ved at undgå overvældende signaler af celle organer. Som perler til at udløse presynapse dannelse, vi bruger perler konjugeret med leucin-rige gentage transmembran neuronal 2 (LRRTM2), en excitatoriske præsynaptic organisator. Ved hjælp af denne metode, vi viste, at vesikulær glutamat transporter 1 (vGlut1), en synaptisk vesikel protein, akkumuleret i præsynapser hurtigere end Munc18-1, en aktiv zone protein. Munc18-1 akkumuleret oversættelse-afhængigt af presynapse selv efter fjernelse af celle legemer. Dette fund indikerer Munc18-1 akkumulering ved lokal oversættelse i axons, ikke transport fra celle organer. Afslutningsvis, denne metode er egnet til at analysere ophobning af synaptiske proteiner i præsynapser og kilde til synaptisk proteiner. Som neuron Ball kultur er enkel, og det er ikke nødvendigt at bruge særlige apparat, denne metode kan anvendes til andre eksperimentelle platforme.

Introduction

Synapse dannelse er en af kritiske trin under udvikling af neurale kredsløb1,2,3. Dannelse af synapser, der er specialiserede rum bestående af præ-og post-synapser er en kompleks og flertrinsproces involverer passende anerkendelse af axoner og dendritter, dannelse af aktiv zone og postsynaptisk tæthed, og korrekt tilpasning af Ionkanaler og neurotransmitter receptorer1,2. I hver proces akkumuleres mange former for synaptiske proteiner til disse specialiserede segmenter i korrekt timing ved at transportere synaptiske proteiner fra celle organer og/eller ved lokal oversættelse i afdelingerne. Disse synaptisk proteiner anses for at være arrangeret i organiseret måde at danne funktionelle synapser. Dysfunktion af nogle synaptiske proteiner, der involverer synapse dannelse resultater i neurologiske sygdomme4,5. Men, det er stadig uklart, hvordan synaptiske proteiner ophobes i ordentlig timing.

At undersøge, hvordan synaptisk proteiner ophobes i organiseret måde, er det nødvendigt at undersøge ophobning af synaptiske proteiner i kronologisk rækkefølge. Nogle rapporter viste levende billeddannelse for at observere synapse dannelse i dissocieret kultur af neuroner6,7. Men, det er tidskrævende at finde neuroner, som bare starte synapse dannelse under mikroskopi. For at observere ophobning af synaptiske proteiner effektivt, skal synapse dannelse starte på det tidspunkt, hvor forskerne ønsker at inducere dannelsen. Den anden udfordring er at skelne ophobning af synaptiske proteiner på grund af transport fra celle organer eller lokal oversættelse i synapser. Til dette formål er oversættelses niveauet nødvendigt at blive målt under den betingelse, der ikke tillader transport af synaptiske proteiner fra celle organer.

Vi udviklede Novel presynapse formation assay ved hjælp af en kombination af neuron kugle kultur med perler til at inducere presynapse dannelse8. Neuron Ball kultur er udviklet til at undersøge axonal fænotype, på grund af dannelsen af axonal ark omgivende celle organer9,10. Vi brugte magnetiske perler konjugeret med leucin-rige gentage transmembran neuronal 2 (LRRTM2), der er en præsynaptisk organisator til at fremkalde excitatoriske presynapses (figur 1a)11,12,13. Ved hjælp af LRRTM2 perler starter presynapse dannelse på det tidspunkt, hvor perlerne påføres. Det betyder, at presynapse dannelse starter i tusindvis af axoner af en neuron kugle på samme tid, således at det gør det muligt at undersøge præcis tidsforløbet af ophobning af synaptiske proteiner effektivt. Desuden, neuron kugle kultur er let at blokere transport synaptisk proteiner fra Soma ved at fjerne celle legemer (figur 1b)8. Vi har allerede bekræftet, at axoner uden celle organer kan overleve og er sunde mindst 4 h efter fjernelse af celle organer. Således er denne protokol er egnet til at undersøge fra hvor synaptisk proteiner er afledt (celle legeme eller Axon), og hvordan synaptiske proteiner ophobes i organiseret måde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimenter, der er beskrevet i dette manuskript, blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er skitseret i det institutionelle dyrepleje-og anvendelses udvalg for Yokohama City University.

1. forberedelse af neuron bolde som hængende drop kultur (dage in vitro (DIV) 0-3)

Bemærk: de procedurer, der er beskrevet her til fremstilling af neuron Ball kultur er baseret på den metode, der tidligere er rapporteret af Sasaki gruppen med nogle modifikationer9,10. Vi har også vedtaget flere procedurer fra bank-metoden for dissocieret kultur14.

  1. Bekræfter følingerne, før dissektion påbegyndes
    1. Forbered alle de nødvendige løsninger og Steriliser dem ved autoklave/filtrering på forhånd.
    2. Hold klar alle de instrumenter og materialer, der skal anvendes i hvert trin i denne kortikale neuron kultur.
    3. Spray og tør laminar Air Flow kabinet, dissektion bord, Stage plade af stereomicroskop, saks, og pincet med 70% ethanol.
  2. Euthanize musen ved anvendelse af CO2 og dissekere maven for at opnå E16 embryoner.
  3. Fjern hjernen fra embryoner omhyggeligt ved hjælp af fine tips af pincet og overføre dem til 60 mm cellekultur retter, der indeholder 4 mL HEPES Buffered salt opløsning (HBSS).
    Bemærk: dissektion medium hbss indeholder 10 mm Hepes (pH 7,4), 140 mm NaCl, 5,4 mm KCl, 1,09 mm na2HPO4, 1,1 mm KH2po4, 5,6 mm D-glucose og 5,64 μM phenol rød.
  4. Fjern hovedbunden, skær den olfaktoriske pære, adskille corticer fra hver cerebral halvkugle ved hjælp af de fine spidser af pincet under stereomicroskop, og Overfør til en anden 60 mm retter indeholdende frisk hbss. Brug mindst 3-5 embryoner for hver separat neuron kugle kultur.
  5. Skær korticerne i små stykker med mikrodissecting fjeder saks i en laminar flowcelle kultur hætte.
  6. Der overføres hakket corticer til et 15 ml rør og trypsinerer de hakkede corticer i 4 ml 0,125% trypsin i hbss i 4,5 min i et vandbad ved 37 °c.
    Bemærk: denne trypsinisering tid er afgørende for effektiv neuron kultur som den stigende tid (> 4,5 min) fører til meget mere døde neuroner.
  7. Celle aggregaterne overføres til et nyt 15 mL rør, der indeholder 10 mL HBSS med en steril overførings pipette, og inkuberer ved 37 °C i 5 min. Gentag dette trin en gang til.
  8. Overfør celle aggregaterne til et nyt 15 mL rør indeholdende 2 mL Neurobasal Media indeholdende GlutaMax, B27 supplement (NGB medium), 0,01% DNase I og 10% hest serum.
  9. Triturate trypsinized corticer ved gentagne gange pipettering dem op og ned (3-5 gange) ved hjælp af brand-poleret fint glas Pasteur pipette.
    Bemærk: diameter af brand-poleret fint glas Pasteur pipette er meget vigtigt som beskrevet i bankmand metode papir14. Hvis pipetten er for smal til at passere cortices, skal du tilberede pipetter med 2-3 forskellige størrelser og prøve fra større pipette.
  10. For at forberede neuron bolde, tage ovenstående cellesuspension og justere celletætheden til 1 x 106 celler/ml ved hjælp af NGB medium.
  11. Kultur de kortikale neuroner som hængende dråber, der indeholder 10.000 celler/dråbe (1 dråbe er 10 μL) inde i de øvre låg af 10 cm kultur retter.
  12. Tilsæt 7 mL fosfat bufferet saltvand (PBS) til den nederste del af kultur retterne, og hold derefter i en inkubator i 3 dage ved 37 °C med 5% CO2 under befugtet tilstand for at give mulighed for neuron kugle dannelse.

2. placering neuron bolde på PLL-coated glas dæksedler og kultur vedligeholdelse (DIV 3-11)

Bemærk: før belægning af glas dæksedler med poly-L-lysin (PLL), vask coverglider ved hjælp af vaskemiddel er vigtigt. Glas dæksedler er nogle gange ikke så rene for neuronal kultur og ensartet belægning med PLL. Ikke-ensartet PLL belægning kan resultere i ujævn axonal forlængelse af neuron bolde.

  1. Læg dæksedlerne i 1/20 fortyndet neutralt ikke-phosphorfri rengøringsmiddel i keramiske stativer til 1-3 overnatninger.
  2. Afdækningen vaskes 8 gange i ultrarent vand, hvorefter den steriliseres i en ovn ved 200 °c i 12 timer.
    Bemærk: alle trinene herfra skal udføres i en laminar luft flowcelle kultur hætte.
  3. Overfør bagt dæksedler til 100 mm retter. Efter forsegling af skålen ved parafilm mellem et låg og en bund skål, kan bagte dæksedler opbevares til langtidsopbevaring.
  4. Valgfri Påfør paraffin prikker på dæksedlerne. Prikkerne gør plads til at forhindre neuron bolde løsne fra coverglider under immun farvning ved direkte kontakt af neuron bolde til plastik retter. Smelt paraffin i en passende flaske i et varmt vandbad ved ca. 90 °C. DIP en Pasteur pipette ind i paraffin, derefter hurtigt røre den for at gøre tre pletter nær kanten af en dækseddel.
  5. PLL (MW > 300.000) på de paraffin-beaded glas dæksedler i 60-mm retter med PLL-opløsning (15 μg/mL i boratbuffer), og opbevar dem i mindst 1 time i en CO2 -inkubator.
  6. Efter vask 4 gange med PBS, overføre PLL-belagte dæksedler til en 4-brønd plade indeholdende 350 μL NGB medium i hver brønd og cytosin β-D-arabinofuranoside hydrochlorid (AraC, 3 μM) til medierne til at dræbe dividere celler.
  7. Opbevar denne 4-brønd plade, der indeholder de PLL-belagte dæksedler i CO2 -inkubator, mindst i 20 minutter for at sikre, at temperaturen af mediet når 37 °c, før neuron bolde overføres.
  8. På DIV 3, når "neuron bolde" dannes meget godt, overføre dem til PLL-belagte dæksedler inde i 4-brønden plade (5 neuron bolde/brønd) holdes i CO2 inkubator.
  9. Efter 48 h, Udskift neuron bolden kulturmedium med frisk AraC-fri NGB medium. Brug en kogeplade i en laminar luft flowcelle kultur hætte, hvis temperatur holdes klar ved 37 °C umiddelbart før denne procedure.
    Bemærk: det er nødvendigt at udføre medium skiftende så hurtigt som muligt på en varm plade for at reducere den tid, at kulturerne er på yderside af CO2 inkubator.
  10. Hold denne neuron kugle kultur i CO2 inkubator for op til div 11.
    Bemærk: på DIV 11-12, neuron bolde udvide neurites op til 1-2 mm anvendes til eksperimenter.

3. anvendelse LRRTM2 perler på neuron kugle kultur med eller uden celle legemer (DIV 11-12)

Bemærk: før påføring af LRRTM2 perler på neuron kugle kultur, anbefales det at fjerne celle legemer. Derfor forberede LRRTM2 perler i første, derefter fjerne celle kroppe og senere anvende LRRTM2 perler til kultur så tidligt som muligt. Biotinylated LRRTM2 leveres af Nogi's Group (Yokohama City University) som konditioneret medium. De bruger en ekspressions vektor, herunder biotin acceptor sekvens og biotin ubiquitinligase fra E. coli BirA 15 , 16 for at vedhæfte biotin til LRRTM2, og ekspressions vektoren transficeret til Expi293F celler, der indgår i Expi293 udtryks systemet. Vektor informationen findes i supplerende figur 1. Biotinyleret LRRTM2-konjugeret streptavidin perler reduceret baggrund af immun farvning meget i forhold til LRRTM2-FC – konjugeret protein en perler, der anvendes til prototype LRRTM2 system8.

  1. Fremstilling af biotinylerede LRRTM2 perler
    1. For at fjerne overskydende biotin fra konditioneret medium af Expi293F celler, som udtrykker biotinyleret LRRTM2, anvende 1,7 mL af konditioneret medium blandet med 0,8 mL PBS (total 2,5 mL) til PD-10 gel filtrering kolonne. PD-10-søjlen er præ-ækvibreret med 25 ml ultrarent vand og 25 ml PBS.
    2. Elut med 3,5 mL PBS, og saml gennemstrømnings-gennemstrømningen som en LRRTM2 bestand.
      Bemærk: denne LRRTM2 bestand kan dispenseret til at aliquoter og opbevares ved-80 °c for langsigtet. Ekspressions niveauerne for biotinyleret LRRTM2 varierer sommetider fra lot til Lot. Således, korrekt volumen af LRRTM2 bestand til konjugat til perlerne bør fastsættes til at danne præsynapser nok på neuron bolde, når nye parti LRRTM2 bestand bruges på første gang.
    3. Tag 20 μL fra suspensionen af streptavidin-belagte magnetiske partikler (diameter: 4-5 μm) til et mikrocentrifuge glas. Immobilize perlerne til et håndlavet apparat fastgjort med neodym permanente magneter og vask tre gange med 100 μl PBS-mcbc i 1,5 ml mikrocentrifuge glas.
      Bemærk: PBS-MCBC indeholder PBS, herunder 5 mM MgCl2,3mm CaCl2, 0,1% BSA og 0,1% komplet EDTA-fri.
    4. Efter fjernelse helt PBS-MCBC fra perlerne, tilsættes forudbestemt volumen af LRRTM2 bestand (normalt 500-1000 μL, se note 3.1.2) til de vaskede perler. Blandingen inkubates ved hjælp af rotator ved 4 °C i 1-2 h.
    5. Perlerne vaskes to gange med 100 μL PBS-MCBC og senere med 100 μL NGB-medium.
    6. Resuspendere LRRTM2 perler i 50 μL NGB medium for ansøgning til Neuron Ball kultur.
    7. Brug samme fremgangsmåder til klargøring af kontrol perlerne (negativ kontrol) i et andet mikrocentrifuge glas, bortset fra tilsætning af biotinyleret-LRRTM2 proteiner.
  2. Fjernelse af celle kroppe fra neuron bolde på DIV 11-12 og anvende LRRTM2 perler
    1. Mærk brøndene på en 4-brønd plade som "celle legeme (+)" og "celle legeme (-)".
    2. Skær slutningen af en gul spids på 45 ° vinkel med et barberblad, der tidligere er sprøjtet med 70% ethanol under stereomicroskop (figur 1b).
    3. Sæt den gule spids ende på cellens krops område af en neuron kugle og fjern celle legemerne ved sugning (figur 1b).
    4. For at identificere hver bestemt tilstand af forsøget, etiketten brøndene igen som "LRRTM2 perler" og "kontrol perler".
    5. Påfør LRRTM2 og kontrol perler på neuron kugle kultur, og nedsænkes til bunden af pladerne for 1 min ved hjælp af ferrit magneter til at starte presynapse dannelse. Denne procedure sikrer at touchdown alle perler på samme tid. Især, det ville være effektivt for kort tid inkubation (f. eks 30 min og 1 h) med LRRTM2 perler synkront.
    6. For at udføre tidsforløb eksperimenter, etiket hver separat brønd som 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h og 18 h og anvende LRRTM2 perler på de angivne tidsintervaller.
    7. Efter tilsætning af LRRTM2 perler, inkubere neuron Ball kultur med perlerne for specificeret tid (0 min til 18 h) til dannelse af præsynapser.

4. immun farvning og mikroskopi

Bemærk: Fix cellerne for 4 h via inkubation med LRRTM2 perler i de eksperimentelle betingelser med og uden celle organer, som axoner tendens gradvist at dø i fravær af celle legemer efter 4 h. I tilfælde af tidsforløb med LRRTM2 perler, fastgør cellerne på det angivne specificerede tidspunkt.

  1. Fastsættelse og farvning neuroner i neuron kugle kultur efter presynapse dannelse med LRRTM2 perler
    1. Fjern NGB-mediet, og fastgør neuron-kuglerne med 4% PFA i PBS (250 μL/brønd) i 20 minutter ved stuetemperatur, og vask derefter med 500 μL PBS 4 gange hver 5 min.
    2. De faste celler vaskes med TBS (Tris-bufferet saltvand: 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) og 150 mM NaCl) i mere end 5 minutter.
    3. Permeabilize cellerne/axonerne af neuron kugle kultur med TBS, der indeholder 0,3% Triton X-100 i 5 min.
    4. Hold cellerne 1 h for blokering med blokerende buffer (0,1% Triton X-100 og 5% NGS (normalt gede serum) i TBS).
    5. Inkubatér cellerne med primære antistoffer; anti-kanin-vGlut1 (vesikulær glutamat transporter 1 (1:4000)) og anti-Mouse-Munc18-1 (1:300) fortyndet med antistof Fortynd i natten ved 4 °C.
    6. Vask dæksedlerne 4 gange med immunofluorescens (IF) buffer (0,1% Triton X-100 og 2% BSA i TBS) og Inkuber i 30 min med fluoroforet (Alexa Dye)-konjugeret 2nd antistoffer; anti-mus-IgG-Alexa 555 (1:500), anti-kanin-IgG-Alexa 488 (1:1000).
    7. Plette kerner af celle kroppe af neuroner i 5 min med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1 μg/mL) i PBS.
    8. Dækgliderne vaskes tre gange med PBS og monteres derefter på glas skred ved hjælp af monterings medier, der indeholder 167 mg/mL poly (vinyl) alkohol og 6 mg/mL N-propylgallat.
    9. Glas gliderne opbevares i køleskab ved-20 °C indtil mikroskopi. Lysstofrør af glassene er detekterbare i mindst 1 år, når slidene opbevares ved-20 °C.
  2. Optagelse af billeder under fluorescens mikroskop
    1. Optag differens interferens kontrast, og hvis billeder under et inverteret fluorescerende mikroskop med et afkølet CCD-kamera ved hjælp af 60X olie nedsænkning linse. For billed erhvervelse software, bruge et software installeret mikroskop system. Brug billede J som billedanalyse software.
    2. Mål hvis intensiteten i presynapser i Axon ved hjælp af følgende formel; Hvis intensiteter af region af interesse på perler (ROI)-off perler region intensitet/Axonal intensitet langs 20 μm fra perler-baggrunds intensitet. Denne ratio intensitet giver protein Akkumulerings indeks (figur 4a). Udfør målingerne på originale 16-bit-billeder ved hjælp af image J-software.
    3. For at kvantificere Akkumulerings niveauet for særligt protein i presynapse induceret med LRRTM2 perler, skal du altid vælge området væk fra 2-synsfelt eller mere bortset fra cellen krop med mikroskop (60X).
      Bemærk: udvælgelsen af området i neuron bolden til billeddannelse er afgørende, da tætte axoner er tæt på celle kroppen og periferien af neuron bolden kan give enkelt Axon.
    4. For nøjagtig måling, Vælg 5-forskellige axonal felt (lignende afstand fra celle legemer)/coverslip.
    5. Bevar identiske billedbehandlings forhold på forskellige dage og i mellem eksperimenter

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi repræsentative resultater af ophobning af præsynaptiske proteiner i LRRTM2-induceret presynapser af axonal ark af neuron kugle kultur. Som præsynaptiske proteiner analyserede vi excitatoriske synaptiske vesikle protein vGlut1 og den aktive zone protein Munc18-1. Vi undersøgte også tidsforløbet for akkumulering af vGlut1 og Munc18-1 i præsynapser, og opnåede resultater med angivelse af kilde til Munc18-1 i præsynapser ved hjælp af axoner, der fjerner celle legemer og en proteinsyntese hæmmer. For nylig har vi undersøgt en rolle af skrøbelige X mental retardering protein (FMRP) på akkumulering af Munc18-1 i presynapses8. Fmrp, som er et kausativ genprodukt af skrøbeligt X-syndrom (FXS), er et mRNA-bindende protein, der undertrykker oversættelse17,18,19. Vi undersøgte også inddragelsen af FMRP i Munc18-1 akkumulering ved hjælp af FXS model mus, som er mangelfuld i Fmr1 gen kodning fmrp.

Anvendelse af LRRTM2-perler i neuron Ball kultur på DIV11 induceret ophobning af Munc18-1 i præsynapser af axoner af neuron bolde (figur 2a). Selv i axoner, som er fjernet celle legemer, akkumulering af Munc18-1 blev observeret under perlerne ligner axoner af neuron bolde med celle legemer (figur 2b). I typisk tilfælde, over 80% af perler efter 4 h-inkubation med neuron bolde kan fremkalde ophobning af synaptiske proteiner i præsynapser, bedømt ved farvning Munc18-1 og vGlut-1. Da axoner er så overfyldte og overlappede i nærheden af celle legemer (figur 2AA, BA), blev der målt flere perifere områder af axonal ark, hvor axoner ikke er så overlappet (figur 2AB, BB, f. eks. perifert område væk fra 2-felt eller mere bortset fra celle legemet med mikroskop (60X)). Når perifert område af axonal ark blev analyseret ved høj forstørrelse objektiv linse (60X), vGlut1 og Munc18-1 akkumuleret klart i presynapser af axoner under perlerne (figur 3). Sommetider, fluorescerende signaler af synaptiske vesikulære proteiner som vGlut1 er svære at detekteres i axonal region uden for perlerne, fordi disse synaptiske vesikulære proteiner ophobes så meget under perlerne. I tilfælde af Munc18-1, kan fluorescerende signaler påvises svagt i axonal region uden for perlerne.

At kvantificere Akkumulerings niveau af synaptiske proteiner i præsynapser induceret af LRRTM2-perler, fluorescerende intensiteter af axoner under perlerne og uden for perlerne blev målt, og derefter beregnet som "protein akkumulering index" (figur 4a, og beskrevet i protokol afsnit i detaljer). Forsøg med tidsforløb viste, at akkumulering af vGlut1 i præsynapser steg markant ved 30 min (figur 4b). På den anden side, Munc18-1 ophobning begyndte at stige betydeligt ved 2 h, og nå et plateau på 4 h (figur 4c). Disse data indikerer, at det synaptiske vesikle protein vGlut1 ophobes i præsynapser tidligere end det aktive zone protein Munc18-1. Munc18-1-akkumulering i præsynapser af Fmr1-ko-neuroner steg 1,5 gange mere end i vildtype (WT) (figur 4c), hvilket indikerer involvering af fmrp i Munc18-1-akkumulering. Dernæst, at skelne Munc18-1 ophobning på grund af transport fra celle organer eller lokal oversættelse i axons, en effekt af proteinsyntese hæmmer anisomycin blev undersøgt på akkumulering i nærværelse af eller fravær af celle organer (figur 4d) . Anisomycin undertrykte Munc18-1 akkumulering signifikant i axoner (figur 4d), hvilket indikerer, at akkumuleringen er proteinsyntese-afhængig. Akkumulering i præsynapser af axoner uden celle legemer var ikke signifikant anderledes end med celle legemer (figur 4d). Disse resultater tyder på, at akkumulering af Munc18-1 i præsynapser er afledt mest fra axons, men ikke transport af Munc18-1 fra celle organer. Hvis ophobning af synaptiske proteiner er undertrykt i presynapser af axoner ved at fjerne celle organer, det anses for at dette fald skyldes transport fra celle organer. Faktisk, når vi undersøgte ophobning af samlede nysyntetiserede proteiner metabolisk mærket af fluorescerende farvestof, fjernelse af celle organer reduceret betydeligt ophobning af samlede nyligt syntetiserede proteiner, sammenlignet med presynapser af axoner med celle legemer8. Selv om Munc18-1-akkumulering i Fmr1-ko steg mere i forhold til WT, undertrykte anisomycin akkumulationen på samme niveau som WT, og fjernelse af celle legemer havde ingen effekt på akkumuleringen (figur 4d). Disse resultater tyder på, at FMRP er involveret i lokal oversættelse af Munc18-1 i axons.

Repræsentative resultater præsenteret her viser, at denne metode er egnet til at undersøge, hvordan synaptiske proteiner ophobes på organiseret måde ved tidsforløb eksperimenter, og til at undersøge kilden til synaptiske proteiner (transport fra celle organer eller lokale Oversættelse i axons) ved at fjerne celle legemer.

Figure 1
Figur 1. Arrangement af presynapse dannelse og fjernelse af celle kroppe fra neuron bolden.
(A) præsynapse dannelse analyse ved hjælp af biotinylated LRRTM2 konjugeret streptavidin perler til at fremkalde præsynapser i axoner af neuron kugle kultur fremstillet af E16 cortices. LRRTM2, et postsynaptisk protein, binder neurexin (NRXN) og fungerer som en presynapse organisator. Streptavidin perler konjugeret til biotinyleret LRRTM2 ekstracellulære regioner (LRRTM2 perler) blev anvendt på DIV11-12 til Neuron Ball kultur til at fremkalde presynapses. Dette tal er blevet ændret fra den foregående publikation8. (B) den gule spids ende blev skåret og placeret på cellen krop område af neuron kugle kultur ved 45 ° vinkel. Celle ligene blev fjernet ved sugning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Munc18-1 ophobning i præsynapser i tilstedeværelse og fravær af celle kroppe af neuron bolden.
(A) efter 4 h inkubation med LRRTM2 perler akkumuleret aktiv zone protein Munc18-1 ved de inducerede præsynaptiske steder i axoner (øvre panel; eksperimentel ordning, midten; fase billede, lavere; Hvis billeder af Munc18-1 ophobning). Billeder blev fanget som lav forstørrelse billeder ved hjælp af 10X linse og mellemliggende forstørrelse (1.5 X) for at se hele billedet består af en neuron kugle, axons, og perler. Stiplede kvadrater indikerer området af neuron bolden for nøjagtig billeddannelse placering af perler. Skala bjælke, 20 μm (venstre; originalt billede), 10 μm (højre; forstørret billede). (B) Munc18-1 akkumuleret meget godt, selv i fravær af celle organer på de inducerede præsynaptiske steder i axons. Dette resultat indikerer, at axoner kan overleve og danne præsynapser selv efter fjernelse af celle legemer i mindst 4 h. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Akkumulering af vGlut1 og Munc18-1 i præsynapser af axoner med og uden celle legemer.
Den excitatoriske præsynaptiske markør vGlut1 (grøn) og Munc18-1 (rød) akkumuleret i præsynapser 4 h efter tilsætning af LRRTM2 perler. (Øvre panel; med celle legemer, lavere; uden celle legemer). Billeder blev fanget ved hjælp af 60X olie Immersion linse for høj forstørrelse at måle fluorescerende intensitet. Stiplede cirkel skitseret placeringen af perler. Munc18-1 akkumuleret næsten samme omfang i tilstedeværelse og fravær af celle organer i præsynapser, men vGlut1 ophobning reduceres uden celle organer8. Skala bjælke, 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Procedure af IF intensitet måling og virkningen af celle organer fjernelse og proteinsyntese hæmmer på Munc18-1 ophobning i neuron bolde.
(A) diagram viste kvantificeringsmetoden for hvis intensitet på en induceret-præsynaptisk sted i Axon af neuron kugle kultur. Skala bjælke, 5 μm. Detaljerne er beskrevet i afsnittet protokol. (B) tidsforløb med vGlut1 akkumulering i præsynapser INDUCERET med LRRTM2 perler. De viste data er Mean ± SEM for n = 20. To-vejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligning test. * *p < 0,01. (C) tidsforløb af Munc18-1 akkumulering i WT og Fmr1-ko PRÆSYNAPSER under LRRTM2 perler. De viste data er Mean ± SEM for n = 20, to-vejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligningstest. n.s., ikke signifikant; * *p < 0,01, signifikant forskellig mellem WT og ko. D) bjælke grafen viste Munc18-1-Akkumulerings niveau i PRÆSYNAPSER af WT-og Fmr1-ko-neuron-kugler ved tilstedeværelse eller fravær af 25 μM Anisomycin (aniso) med (CB +) eller uden (CB-) celle organer. De viste data er Mean ± SEM for n = 20. To-vejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligning test. * *p < 0,01, n.s., ikke signifikant. # indikeret p < 0,01, signifikant anderledes med og uden anisomycin. Disse tal er blevet ændret fra den foregående publikation8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Bicystronisk ekspressions vektor for LRRTM2-ECR (ekstracellulær region) og BirA (biotin-ubiquitinligase fra E. coli ).
Mellem LRRTM2-ECR og BirA kodning sekvenser, der er en intern ribosomal Entry site (IRES) sekvens, der gør det muligt at co-Express begge proteiner fra enkelt mRNA. hEF1-HTLV Promoter driver expresson bicstronic mRNA, og begge proteiner udskilles af signal peptidsekvenser efter oversættelsen. LRRTM2-ECR-kodnings sekvens er knyttet til flere peptidtagsekvenser (DYKDDDDK, TEV, MYC og hans Tags) og biotin acceptor-sekvens (BAS). BirA er knyttet til DYKDDDDV tag. Udskillet BirA biotinylates lysin af BAS sekvens af LRRRTM2-ECR at binde til streptavidine perler. Venligst klik her for at downloade figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi udviklede nye metode til at undersøge presynapse dannelse stimuleret med LRRTM2-perler ved hjælp af neuron kugle kultur. I øjeblikket er de fleste af presynapse formation assay omfatter poly-D-lysin (PDL)-belagte perler og dissocieret kultur/microfluidic kammer20,21,22. En af fordelene ved denne metode er LRRTM2-perler. Mens LRRTM2 interagerer med neurexin at danne excitatoriske presynapser specifikt11,12,13, PDL-perler inducerer både excitatoriske og hæmmende presynapses nonspecifikt20. I denne metode, andre presynapse arrangører, hvis medlemmer er over 10 proteiner3, er gældende for at fremkalde præsynapser ved at ændre ekstracellulære domæne af biotinyleret protein afhængigt af eksperimentelle formål.

En anden fordel er neuron Ball kultur. I nogle tilfælde, konventionel dissocieret kultur blev brugt til at analysere presynapse dannelse20. Men dissocieret kultur er ikke egnet til at analysere lave niveauer af synaptiske proteiner inden for præsynapser, fordi overvældende signaler i celle legemer og dendritter forstyrre signaler i presynapses. I stedet bruger nogle grupper dissocieret kultur i mikrofluidisk kammer, der er særligt apparatur til kultur axoner og celle legemer separat i 2 comprtments21,22. Ved hjælp af mikrofluidisk kammer, axonal ark dannes i axonal rum, og celle legemer er i stand til at blive fjernet fra celle kroppen rum, svarende til Neuron Ball kultur. Men, mikrofluidisk kammer er særlige apparat, og kræver nogle færdigheder til at opretholde konstant kultur tilstand. Neuron Ball kultur er ikke nødvendigt at bruge særlige apparat, og er relativt let at blive introduceret som en ny Eksperimentel metode. Fordi essensen af neuron Ball kultur er bare at placere neuronal celle aggregater (neuron bolde) til glas-bund skål/kammer, det kan nemt kombineres med andre metoder. For eksempel er det opfattelsen, at neuron Ball kultur ved hjælp af LRRTM2-perler er gældende for høj indholds screening at måle fluorescens af 10-20 perler område på samme tid.

Kritisk trin i denne protokol er belægning med PLL. Hvis PLL belægning ikke er ensartet, axoner af neuron bolde ville ikke udvide ensartet i alle retninger. Dette forstyrrer en effektiv analyse af præsynapse dannelse. Vi bruger glas dæksedler og glasbund retter, men glas er nogle gange ikke så ren for neuronal kultur og ensartet belægning med PLL. I denne protokol, i første, glas dæksedler og glas-bund retter er gennemblødt i neutralt ikke-phosphorholdige rengøringsmiddel til 1-3 natten, og derefter vaskes 8 gange med ultrarent vand. Vi bruger PLL, hvis molekylvægt > 300.000 til at reducere koncentrationen (15 μg/mL) for lavere uønsket baggrund. Hvis der anvendes lavere molekylvægt af PLL (f. eks. 30000-70000), er det nødvendigt med en højere koncentration (100 μg/ml) for at forlænge axonerne.

Begrænsning af denne metode er, at neuron Ball kultur ikke kan opretholde > DIV15-16. Axoner af neuron bolde er fragmenteret efter DIV15-16. Fragmenterede axoner producerer ikke nogen presynapse efter LRRTM2 perler ansøgning. Således, denne metode er ikke anvendelig til at analysere modne neuroner (> DIV21). Men i de fleste tilfælde11,12,21,22, presynapse formation assay bruger yngre neuroner, der dyrkes indtil DIV14. En anden begrænsning er, at axoner uden celle organer ikke kan overleve i løbet af 4 h. Vi analyserede ophobning af 5 synaptiske proteiner i præsynapser hidtil, ophobning af alle proteiner vi tjekket nåede næsten plateau inden 4 h (ikke offentliggjort observation). Det anses, at synaptisk proteiner ophobes nok på 4 h til at analysere, hvor synaptisk proteiner er afledt af (celle legeme eller Axon).

Kombination af neuron kugle kultur med LRRTM2-perler er relativt enkel og fleksibel til at tilpasse mange eksperimentelle platforme. Vi har allerede anvendt denne metode til at måle præsynaptisk aktivitet ved hjælp af AM1-43 farvestof (ikke offentliggjort observation). Denne metode anses for at være anvendelig til høj gennemløbs screening. Presynapse formation assay er muligt at anvende høj indholds screening ved farvning synaptiske proteiner i præsynapser dannet under LRRTM2-perler. Denne metode vil bidrage til at finde nye forbindelser til helbredelse af neurologiske sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde støttes delvis af JSPS-tilskuddet til videnskabelig forskning (KAKENHI) (C) (nr. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Vi takker Dr. Terukazu Nogi og MS. Makiko Neyazaki (Yokohama City University) for venligt at give biotinylated LRRTM2 protein. Vi takker også Honami Uechi og Rie Ishii for teknisk assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent DAKO S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-545-152
mouse anti-Munc18-1 BD Biosciences 610336
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA) Nacalai Tesque 01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) Nunc 176740
Complete EDTA-free Roche 11873580001
cooled CCD camera Andor Technology iXON3
Coverslip Matsunami C015001 Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Nacalai Tesque 11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I) Wako pure chemicals 047-26771
Expi293 Expression System Thermo Fisher Scientific A14635
Horse serum Sigma-Aldrich H1270
image acquisition software Nikon NIS-element AR
Image analysis software NIH Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope Nikon Eclipse Ti-E
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Neurobasal media Thermo Fisher Scientific #21103-049
Normal Goat Serum (NGS) Thermo Fisher Scientific #143-06561
N-propyl gallate Nacalai Tesque 29303-92
Paraformaldehyde (PFA) Nacalai Tesque 26126-25

Paraplast Plus
Sigma-Aldrich P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) Nacalai Tesque 28359-54
poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns GE healthcare 17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 Synaptic Systems 135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) Nacalai Tesque 41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles Spherotech Inc SVM-40-10 diameter: 4-5 µm
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
Trypsin Nacalai Tesque 18172-94

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28, (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5, (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203, (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455, (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53, (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27, (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30, (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74, (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61, (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64, (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64, (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1, (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286, (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60, (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16, (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16, (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29, (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33, (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20, (13), 3085-3098 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics