בציר הטונים הבזליים ובדיקות פסיביות של מערכת הרבייה מורנה באמצעות לחץ מיוגרף

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה ניצל מערכת לחץ זמין מסחרית לבצע הלחץ מיוגרפיה בדיקות על הנרתיק murine וצוואר הרחם. באמצעות מדיה עם ובלי סידן, התרומות של תאי השריר החלקה (SMC) הטון בסיס מטריצה פסיבית (ECM) היו מבודדים עבור האיברים תחת תנאים פיסיולוגיים מוערך.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

איברי הרבייה הנשיים, במיוחד הנרתיק וצוואר הרחם, מורכבים מרכיבים סלולאריים שונים ומטריצה ייחודית לחילוץ (Ecm). תאי שריר החלקה מציגים פונקציה בתוך קירות הנרתיק וצוואר הרחם. בהתאם לסביבה הביוכימית והדינסיון המכני של קירות העוגב, תאי השריר החלקים משנים את תנאי הקונקטילה. התרומה של תאי שריר חלקה תחת תנאים פיסיולוגיים בסיסית מסווג כטון בסיס. באופן ספציפי יותר, הטון הבסיסי הוא מכווץ חלקית בסיסית של תאי שריר חלקה בהעדר גירוי הורמונלי ועצבי. בנוסף, ה-ECM מספקת תמיכה מבנית לדפנות האיברים ומשמשת כמאגר לאותות ביוכימיים. הרמזים הביוכימיים הללו חיוניים לתפקודי איברים שונים, כגון הסתה לצמיחה ושמירה על הומאוסטזיס. ECM של כל איבר מורכב בעיקר של סיבי קולגן (בעיקר סוגי קולגן אני, III, ו-V), סיבים גמישים, ו גליקוזאינואנגליקנים/פרוטאוגליקנים. ההרכב והארגון של ה-ECM מכתיבים את התכונות המכאניות של כל איבר. שינוי בקומפוזיציה ECM עשוי להוביל להתפתחות של הפתווגיות הרבייה, כגון התפתחות איבר האגן או שיפוץ צוואר הרחם מוקדם. יתרה מזאת, שינויים במיקרו-מבנה ECM ונוקשות עשויים לשנות את הפעילות החלקה של תאי השריר ואת הפנוטיפים, ובכך לגרום לאבדן כוח התנועה.

בעבודה זו, הפרוטוקולים שדווחו משמשים כדי להעריך את הטון בסיס מאפיינים פסיבי מכני של הנרתיק מורצין שאינו בהריון ואת צוואר הרחם בשנת 4-6 חודשים של גיל estrus. האיברים היו מורכבים בלחץ מסחרית זמין, ושניהם בקוטר הלחץ ובדיקות אורך הכוח בוצעו. נתונים לדוגמה טכניקות ניתוח נתונים עבור האפיון המכני של איברי הרבייה נכללים. מידע כזה עשוי להועיל לבניית מודלים מתמטיים ולעצב באופן רציונלי התערבויות טיפוליות לפתווגיות בריאות הנשים.

Introduction

קיר הנרתיק מורכב מארבע שכבות, האפיתל, לאמנה קינאה, מוסקולריס, ו אדואדטיה. האפיתל מורכב בעיקר של תאים אפיתל. לאמינה קינפה יש כמות גדולה של סיבי קולגן גמישים וfibrillar. המוקולאריס מורכב גם מאלסטין ומסיבי קולגן, אך יש לו כמות מוגברת של תאי שריר חלקים. האדואדטיה מורכבת מאלסטין, קולגן ופיברותקיעות, אם כי בריכוזים מופחתים בהשוואה לרבדים הקודמים. התאים השרירים החלקים הם עניין של קבוצות מחקר ביוחנונית מוטיבציה כפי שהם משחקים תפקיד בטבע הקונקטילה של האיברים. ככזה, לכמת את החלק באזור התא שריר חלקה והארגון הוא המפתח להבנת הפונקציה מכני. חקירות קודמות מצביעים על כך שהתוכן השרירי החלק בתוך קיר הנרתיק מאורגן בעיקר בציר האורכי והאורך. ניתוח היסטולוגית עולה כי השבר החלק באזור השריר הוא כ 35% עבור שני סעיפים הקרוב ביותר של הקיר1.

צוואר הרחם הוא מבנה הקולגן מאוד, כי עד לאחרונה, היה נחשב להיות מינימלי שרירים חלקים תא תוכן2,3. מחקרים אחרונים, עם זאת, הציעו כי תאים שריר חלק עשוי להיות שפע גדול תפקיד בצוואר הרחם4,5. צוואר הרחם מציג הדרגתי של תאים שריר חלק. מערכת ההפעלה הפנימית מכילה 50-60% תאי שריר חלקים שבהם מערכת ההפעלה החיצונית מכילה רק 10%. לימודי העכבר, עם זאת, לדווח על צוואר הרחם להיות מורכב של 10-15% תאים שריר חלקה ו 85-90% סיבי רקמת חיבור ללא אזכור של הבדלים אזוריים6,7,8. בהתחשב בכך שמודל העכבר שונה מהמודל האנושי המדווח לעתים קרובות, יש צורך בחקירות נוספות הנוגעות לצוואר הרחם של העכבר.

מטרת פרוטוקול זה הייתה להבהיר את התכונות המכאניות של הנרתיק המורין וצוואר הרחם. זה הושג על ידי שימוש במכשיר לחץ מיוגרף המאפשר הערכה של תכונות מכניות בכיוונים מכניים וצירית בו תוך שמירה על אינטראקציות תאים מטריצה מקורית וגיאומטריה של איברים. האיברים נטענו על שני צינורית מותאמת אישית ומאובטחת בתפרים מ6-0 משי. בדיקות בקוטר הלחץ נערכו סביב מתיחה פיסיולוגיים מוערך כדי לקבוע את התאימות ואת המשיק מודוללי9. בדיקות באורך הכוח נערכו על מנת לאשר את המתיחה המשוערת של הציר ולהבטיח שתכונות מכניות כללו את הטווח הפיזיולוגי. הפרוטוקול הניסיוני בוצע על הנרתיק מורצין שאינו בהריון וצוואר הרחם ב 4-6 חודשים של גיל ב estrus.

הפרוטוקול מחולק לשני סעיפים עיקריים של בדיקות מכניות: הטון בסיס ובדיקות פסיביות. צליל בסיס מוגדר כחלק בסיסי של תאי השריר החלקים, גם בהיעדרויות של גירוי מקומי, הורמונלי ועצבי חיצוני10. הטבע הבסיסי הזה של הנרתיק וצוואר הרחם תשואות התנהגויות מכניות אופייני אשר נמדד אז על ידי מערכת הלחץ מיוגרפיה. המאפיינים פסיבי מוערך על ידי הסרת הסידן הבין-תאית אשר שומר על מצב הבסיסית של התכווצות, וכתוצאה מכך הרפיה של תאים שריר חלק. במצב פסיבי, סיבי קולגן ואלסטין לספק את התרומות דומיננטי עבור המאפיינים המכניים של האיברים.

מודל murine משמש בהרחבה כדי ללמוד פתווגיות בבריאות הרבייה של נשים. העכבר מציע מספר יתרונות לכמת את היחסים המתפתחים בין התכונות ecm ו מכני בתוך מערכת הרבייה11,12,13,14. יתרונות אלה כוללים מחזורים קצרים ומאופיינים היטב, עלות נמוכה יחסית, קלות הטיפול, וזמן הריון קצר יחסית15. בנוסף, הגנום של עכברי מעבדה הוא היטב ממופה ומהונדסים גנטית עכברים הם כלים יקרי ערך כדי לבדוק השערות מכניסטיות16,17,18.

מערכות לחץ מסחרית זמינים משמשים באופן נרחב כדי לכמת את התגובות המכאניות של רקמות שונות ואיברים. כמה מבנים בולטים שנותחו על מערכת הלחץ מיוגרפיה כוללים עורקים גמישים19,20,21,22, ורידים ורקמות הנדסה כלי דם שתלי23,24, הוושט25, ואת המעי הגדול26. טכנולוגיית הלחץ מיוגרפיה מאפשרת הערכה בו של נכסים בצירי הציר והכיוון ההיקפי תוך שמירה על אינטראקציות התא-ECM המקוריות ובגיאומטריה vivo. למרות השימוש הנרחב במערכות מיוגרפיה ברקמות רכות ובמכניקה של איברים, פרוטוקול ניצול טכנולוגיית הלחץ מיוגרפיה לא פותחה בעבר עבור הנרתיק וצוואר הרחם. חקירות קודמות לתוך תכונות מכניות של הנרתיק וצוואר הרחם העריכו uniaxially27,28. האברים הללו, לעומת זאת, חווים העמסה רב-צירית בתוך הגוף29,30, ובכך מכמת את התגובה המכנית הביוצירית שלהם.

יתר על כן, העבודה האחרונה מציע תאים שריר חלק עשוי לשחק תפקיד פוטנציאלי בפתווגיות רקמות רכות5,28,31,32. זה מספק עוד משיכה של ניצול הטכנולוגיה מיוגרפים הלחץ, כפי שהוא משמר את האינטראקציה מקורית של תאים מטריקס, ובכך לאפשר תיחום של התרומה כי תאים שרירים חלקה לשחק פיסיולוגיים ופתופסולוגית תנאים. בזאת, אנו מציעים פרוטוקול לכמת את התכונות המכאניות רב-צירית של הנרתיק וצוואר הרחם תחת שני הטונים הבזליים והתנאים הפאסיביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

באיון parous 4-6 חודשים נשים עכברים (29.4 ± 6.8 גרם) ב ייחום שימשו למחקר זה. כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ולשימוש באוניברסיטת טוליין. לאחר הלידה, העכברים הועברו למשך שבוע לפני המתת חסד ושוכנו תחת תנאים סטנדרטיים (מחזורי אור/כהות של 12 שעות).

1. הקרבת עכבר ב ייחום

  1. לקבוע את המחזור האסטלי: המחזור האחרון היה מפוקח על ידי הערכה חזותית בהתאם למחקרים קודמים15,33,34. המחזור מורכב מארבעה שלבים: proestrus, ייחום, metestrus, ו diestrus. במהלך השלב הפרואסטרוס, אברי המין נפוחים, ורודים, לחים ומקומטים. שלב ייחום הוא מקומט אבל פחות נפוח, ורוד, לח. Metestrus ו diestrus שניהם מדווחים כהצגת לא נפיחות וקמטים, חסר גוון ורוד, ו יבש34,35.
  2. בצע ניסוי estrus: כל הבדיקות מכני בוצעו בזמן העכברים היו estrus, כמו זה הוא הקל ביותר להמחיש ומספק נקודת זמן עקבית ולאחר השחזור.
  3. עבור עכברים העוברים בדיקות טון בסיס, המתת חסד דרך הגיליוטינה. עבור עכברים נבדק רק תחת התנאים פסיבי, המתת חסד באמצעות פחמן דו חמצני (CO2) שאיפת. הגיליוטינה משמש כדי לשמר את הפונקציה של תאי שריר החלקה של מערכת הרבייה, כמו2 גז משנה את המאפיינים הקונקטילה של התאים השריר חלקה36,37,38, 39,40,41,42. זה הכרחי לבצע את הניתוח בתוך 30 דקות כדי למזער את הסיכוי של ואפופטוזיס התא.

2. ניתוח מערכת הרבייה

  1. הגדר: המקום משטח סופג על תחנת העבודה ולמלא צלחת פטרי ומזרק עם 4 ° c האנק מאוזן פתרון מלח (HBSS) פתרון. . השתמש במחיקה כדי לנקות את רקמת השומן מניחים את העכבר בצד הגחוני למעלה והקלטת את הכפות ואת הזנב. הפעל את אורות המיקרוסקופ והגדר מיקרו-מספריים, מספריים, שני זוגות של מלקחיים ישרים, ושני זוגות של פינצטה מעוקל.
  2. שימוש בפינצטה ומספריים זוויתיים, מרימים את העור סביב הבטן ועושים חתך בבסיס הבטן, מעל עצם החיק. החתך צריך להיות רדוד מספיק כדי לא לנקב את הקיר שריר הבטן. המשיכו להשתמש במספריים כדי לקצץ בחלק הטוב ביותר לכיוון כלוב הצלעות ועמוק בשרירי הבטן.
  3. להסיר שומן שטחי על ידי משיכת בקלילות על השומן עם פינצטה מעוקל מיקרו מספריים. רקמת אדיפוז תשקף הטרוגנזה בהיר עם מראה שדומה לנצנצים. מניחים את כל השומן והרקמה שהוסרו על הניגוב. זיהוי שתי קרניים הרחם ועצם החיק.
  4. מניחים מספריים סגורים בין קיר הנרתיק לעצם החיק. לחתוך בזהירות את אמצע עצם החיק (סימטרי הערווה). מניחים מלקחיים עקומים בשני קצותיו של עצם החיק החתוך. כדי לאפשר גישה טובה יותר. לאיברי הרבייה
  5. הסר את שלפוחית השתן ואת השופכה מהקיר הנרתיק. ניתן לעשות זאת באמצעות מלקחיים ישרים ומיקרו-מספריים. להחזיק את שלפוחית השתן עם פינצטה ישר כדי ליצור מתח להשתמש בטכניקות לנתיחה קהה להפריד את הרקמה המקיפה מהנרתיק. לאחר שלפוחית השתן ואת השופכה הם גזור, לחתוך את הבסיס ולהסיר מחלל הגוף.
  6. לזהות את מערכת הרבייה: קרניים הרחם bifurcate מצוואר הרחם. צוואר הרחם ניתן לזהות מן הנרתיק בשל הבדלים בגיאומטריה ונוקשות. הקוטר החיצוני של צוואר הרחם הוא קטן יותר מהנרתיק. צוואר הרחם הוא מוזר יותר הנרתיק ומרגיש דומה לזה של חרוז (איור 1).
  7. להשתמש בדיו ומחוגות כדי לסמן 3 מילימטר נקודות לאורך האיברים. התחל מתחת השחלות על שפופרות הרחם ולסמן נקודות כדי להגיע צוואר הרחם. השתמש בנקודה צוואר הרחם של המרכז כדי להתחיל בנתיב נקודה מטה אל הווגינה האינטרוטוס.
  8. הניחו לדיו להתייבש ולהפריד בין איברי הרבייה לבין רקמת השומן שמסביב, רקמת החיבור והמעי הגס. נקו את הנרתיק בקרבת מציג הנרתיק ככל האפשר. באמצעות מספריים, לחתוך סביב האינטרוטוס הנרתיק.
    הערה: ניתן לייבש את האיברים במהלך תהליך זה. אם זה חשש, מזרק מלא 4 ° c HBSS עשוי לשמש כדי להוסיף לחות לאיברים.
  9. חותכים את קרני הרחם באופן מיידי נחות השחלות. שים לב כי האיברים יהיה לסגת מן הזמן לחקור את אורך כמו רקמת החיבור מוסר ואת האיברים מתגלגלות. מניחים את איברי הרבייה בצלחת פטרי מלא 4 ° c HBSS. ניתן להשתמש בשינוי זה באורך לחישוב האומדן באורך vivo (סעיף 5).
    הערה: זיהינו כי השימוש ב-HBSS בטמפרטורה זו במהלך הניתוח והצינורית אינו משפיע על הכדאיות החלקה של תאי השריר. שמירה על pH של 7.4, עם זאת, היא הכרחית לשמירה על הכדאיות של תאי השריר החלק. בטמפרטורה זו, HBSS יש רמת pH של 7.4.
  10. לאחר תקופה של 15 דקות בשיעור של ארבע ° c, למדוד את הרווח בין נקודות באמצעות מחוגות. תעד את המידות עבור כל מרחק בגיליון אלקטרוני. ערכים אלה ישמשו לחישוב יחס המתיחה vivo (אורך מקורי/הסבר).
  11. הגדר את המחיקה המכילה את הרקמה שהושלכו על אזור הבטן עם הרקמה העודפת הפונה אל תוך העכבר ומשרים את המחיקה ב-4 ° צלזיוס HBSS. לעטוף את העכבר ואת הרקמה העודפת בנייר ומקום בשקית בטוח המקפיא להיות מאוחסן ב-20 ° c. התנהגות מכנית פסיבית על הנרתיק לא נמצא להיות שונה באופן משמעותי לאחר מחזור אחד להפשיר ההקפאה43. כל האיברים שנבדקו שימשו מיד לאחר המתת חסד או לאחר מחזור אחד להפשיר ההקפאה.

3. קננולגדירוג

  1. קבע את גודל הצינורית המתאים לסוג האיבר. בC57BL6J טיפוסי בעכבר, הנרתיק משתמש בצינורית של שניהם 3.75 מ"מ בקוטר ומסמרות. צוואר הרחם משתמש בצינורית אחת שהיא 3.75 מ"מ לסוף הנרתיק וצינורית ה0.75 מ"מ בקוטר הרחם (איור 2) הצינורית של 0.75 מ"מ היא חלקה.
    הערה: גודל הקוטר המוצג לעיל משמשים עבור באיון אופייני 4-6 חודשים העכברים C57BL6, C57BL6 x 129SvEv, ועכברים nonparous בגילאי 7-9 חודשים. עם זאת, נסיבות מסוימות, כגון מעידה או הריון, עשויות לדרוש צינורית בגודל גדול יותר.
  2. עם כל איבר, הר את הצד הצווארי על חלק הכוח מתמר של מתקן הצינורית. הר את הקצה הנגדי של האיבר (הנרתיק או הרחם) על החלק המיקרומטר של המכשיר. הדקו את שני הקצוות בתפרים.
  3. בשל השוני בעובי ובמידת השימוש בנרתיק ובצוואר הרחם, ניתן לעשות שימוש בטכניקות משתנות לביצוע הצינורית האפקטיבית ביותר. עבור הנרתיק, מניחים 2 תפרים בין מסמרות2 ו -3 של הצינורית באופנת "איקס". כאשר מניחים את צוואר הרחם, הצינורית אינה מרותקת כך האיבר ממוקם הטוב ביותר בחלק האחורי של צינורית עם 3 תפרים אופקיים על קצה הרחם 4 תפרים על מערכת ההפעלה החיצונית. עבור שני האיברים, אורך מירבי צריך להיות לא יותר מ -7 מ"מ בין התפרים (איור 3).

4. מיוגרף הלחץ הוגדר

  1. על מנת להגדיר את הלחץ מיוגרפיה מערכת, כוח על מערכת הבדיקה ולמלא את בקבוק המאגר עם 200 mL של HBSS (איור 4). להפוך את החום "על" ולאפשר HBSS בבקבוק המאגר כדי לחמם. לאחר מכן, הפעל את המיקרוסקופ ופתח את תוכנת המחשב. ודא כי התמונה של האיבר canנולה, ממשק הלחץ, הזרמת מד קריאות, ואת הכלי פונקציה ברצף נראים כולם (איור 5).

5. הטון בסיס בדיקות מכניות

הערה: צוואר הרחם הציג טבע phasic במהלך השלבים הראשונים של בדיקות. עם זאת, זה פחתה לאחר התניה מראש. בדיקות הטון בסיס נעשה ניצול מאגר קרבס צלצול (KRB) באגן של התקן DMT. המאגר הוא גז עם 95% O2 ו 5% CO2. לאחר החלק הבסיס הטון הושלם, סידן חינם KRB מנוצל.

  1. מציאת הגיאומטריה הפורקים: למתוח את האיבר כך שהקיר לא יהיה במתח. עבור הנרתיק, שימו לב לחריצים על קיר הנרתיק. עבור צוואר הרחם, גזור מיד מתחת נקודות הדיו הממוקם מעל ומתחת לסימן צוואר הרחם המרכזי. זה מהווה שיטה לשחזור עבור צוואר הרחם במשך באתרו של 6 מ"מ44. למדוד את האורך מתפר תפר עם מחוגה
  2. מציאת הלחץ הטעון (למעלה): הגדל את הלחץ מ -0 עד 10 מיליון בהפרשים של 1 Mhg. לקבוע את הלחץ שבו האיבר כבר לא מתמוטט. ניתן לקבוע זאת כקפיצה הגדולה ביותר בקוטר החיצוני בלחץ נתון, כפי שהוצג בצג התוכנית. לאחר הקלטת הלחץ והקוטר החיצוני, שים לב לכך כנקודה הראשונה שבה האיבר אינו מתמוטט ואפס את הכוח.
  3. המשוער מתיחה vivo: לחשב את האומדן בvivo מתיחה על ידי חלוקת האורך הנמדד vivo על ידי באורך לאחר שנמדדו ההודעה:
    Equation 1
  4. מיזוג מראש בקוטר הלחץ: הגדר את הלחץ על 0 mmHg, את האורך עדEquation 2המשוער vivo אורך ואת מעבר הצבע ל 1.5 mmhg/s. להריץ רצף שלוקח את הלחץ מ 0 mmhg לתוך vivo לחץ + פרוק (טבלה 1), להחזיק 30 שניות, ולקחת את הלחץ ל 0 מ מ עם 30 הזמן ההמתנה השנייה. לאחר שחזור על סך של 5 מחזורים, לחץ על Stop בתוכנית המחשב ושמור את הקובץ.
  5. מציאת הניסוי במתיחה vivo: כוונן את האיבר כך שיהיה באורך vivo המשוער בזמן שהוא נמצא בלחץ הטעון ולחץ על התחל. הערכת ערכי לחץ לעומת כוח לערכי הלחץ החל מהלחץ שנטען ללחץ המקסימלי (טבלה 1). לחץ על לחצן העצירה בתוכנית המחשב ושמור את הקובץ.
    הערה: ערך המתיחה הנמדד מחושב באתרו. הדבר מלווה במגבלה שניתן למדוד רק לאחר שהיא מפירה את המצב הערווה. כתוצאה מכך, הקשירה הטבעית אובדת, דבר שעשוי לשנות את האורך. המתיחה התיאורטית, עם זאת, מבוססת על התיאוריה שהוצגה קודם לכן האיבר יחוו שינויים מינימליים בכוח כאשר הם חשופים ללחצים פיזיולוגיים כדי לחסוך באנרגיה45. בפרוטוקול, המדידה הנמדדת בvivo תהיה הערך המתוח המחושב באמצעות האורך המזוהה, שבו יש שינוי מינימלי בכוח כאשר הם חשופים לטווח פיזיולוגי של לחצים.
  6. מיזוג מראש בקוטר הלחץ: הגדר את הלחץ על 0 mmHg, את האורך אל הניסוי באורך vivo, ואת הדרגתי של 1.5 mmHg/s. הפעל רצף שלוקח את הלחץ מ -0 Mhg ללחץ המקסימלי + למעלה, להחזיק 30 שניות, ובחזרה ל 0 מ ל עם מודעה . המשך 30 שניות לאחר שחזור על זה עבור סך של 5 מחזורים, לחץ על לחצן עצור בממשק התוכנית ולשמור את הקובץ.
    הערה: 5.4 הכרחי להשגת קריאה בכוח צירית עקבי יותר בלחץ גובר. שלב זה מסייע למצוא את הנכון במתיחה vivo, אשר לעיתים קרובות לא העריכו בהתבסס על רמזים חזותיים. 5.6 משמש כצעד אמצעי זהירות כדי למזער היסטרזיס ולהשיג תגובה עקבית, מקנה לשחזור ומתרגם של העוגב.
  7. אורך כוח מיזוג מראש: הזן 1/3 מקסימום הלחץ + למעלה עבור הלחץ לשקע הן. כוונן את האיבר ל-2% מהאורך הvivo והקש על התחל. התאם את האורך ל-+ 2% באורך vivo ולאחר מכן אל-2% ב-10 μm/s. חזור על הארכה של צירית עבור סך של 5 מחזורים. לחץ על Stop בתוכנית המחשב ושמור את הקובץ.
  8. שיווציה: עם האיבר שנקבע באורך vivo, להגדיר הן את הלחץ השקע ואת העומס ב 1/3 של הלחץ המקסימלי + למעלה. . באמצעות האיבר במשך 10 דקות העבר לאט את שתי הלחצים למטה ל-0 Mhg עם הדרגה שנקבעה כ-1.5 mmHg/s.
  9. הערכה מחדש של הגיאומטריה שאינה מתבטלת: הגדר את האיבר בvivo האורך והלחץ על הלחץ הטעון. הפחת את אורך הציר לקראת אורך הטעינה המשוער בקצב של 10 μm/s עד שיהיה שינוי מינימלי בכוח. אורך זה מוכר כאורך שאינו טעון, או כאשר האיבר אינו נמצא במתח או בדחיסה. לפני שתמקדים את הכוח, הקלט את האורך הפרוק, את הקוטר החיצוני ואת ערך הכוח.
    הערה: הגיאומטריה המוקדמת מראש נקבעה על ידי רמזים חזותיים, שהיא איכותית לחלוטין. הערכה מחדש נחוצה עבור שיטה כמותית ולחשבון לגבי שינויים אפשריים באורך העלול להתרחש במהלך המיזוג. גאומטריה זו תהיה בשימוש בסעיף 8.
  10. ההתקנה אולטרסאונד: להשתמש בחבילה הכללית הדמיה הבטן כדי להמחיש את האיברים במכשיר בדיקה. (איור 6). לפני בדיקה, למזער את חפצי האמנות מהחלק התחתון של הלחץ מיוגרף אגן מתכת. התאימו את הצינורית לגובה שהוא המרחק המקסימלי מלמטה עם הרקמה שעדיין נמצאת מתחת לשלמות בפתרון הבדיקה. בעל מותאם אישית הוא 3D המודפס לייצב את מתמר במצב אנכי במהלך הדמיה.
  11. הדמיה אולטרסאונד: לזהות את הצינורית ליד מתמר הכוח ולהתאים את השלב של המיקרוסקופ לתמונה לאורך הרקמה. במהלך תהליך הבדיקה, מתבצע מעקב אחר האזור האמצעי לאורך האורך (איור 6A, C). בעקבות הדמיה, לסקור את התמונה "Cine store" לולאה המורכבת מסדרה של מסגרות במצב B ולזהות את המסגרת עם הקוטר החיצוני הגדול ביותר. חישובי העובי שבוצעו ישמשו בסעיף 8.
  12. בדיקת קוטר הלחץ ( -2% באורך vivo): לחץ על התחל וכוונן את האיבר כך שהוא-2% מאורך vivo, הגדר את הלחץ על 0 mmhg והדרגה ל 1.5 mmhg/s. להגדיל את הלחץ מ 0 mmhg ללחץ המרבי. החזר את הלחץ ל -0 מ מ. עם 20 שניות של המשך חזור על הפעולה במשך 5 מחזורים.
  13. בדיקת קוטר הלחץ (באורך vivo) : לחץ על התחל וכוונן את האיבר כך שיהיה באורך vivo, הגדר את הלחץ על 0 mmhg, והדרגה ל 1.5 mmhg/s. להגדיל את הלחץ מ 0 mhg ללחץ המרבי. החזר את הלחץ ל -0 מ מ. עם 20 שניות של המשך חזור על הפעולה במשך 5 מחזורים.
  14. בדיקת קוטר הלחץ (+ 2% באורך vivo): כוונן את האיבר כך שהוא + 2% באורך vivo, הגדר את הלחץ ל -0 mmHg, והדרגתי ל-1.5 mmHg/s. להגדיל את הלחץ מ 0 Mhg ללחץ המקסימלי ולאחר מכן חזרה אל 0 mmHg עם 20 שניות להחזיק. חזור על הפעולה במשך 5 מחזורים. נתוני הלחץ מכל שלושת האורכים ישמשו בסעיף 8.
  15. בדיקות באורך כוח (לחץ נומינלי): הפעילו את הלחץ על הלחץ הטעון והאיבר ל -2% מהאורך הvivo. למתוח את האיבר ל + 2% של vivo אורך ולחזור ל-2% באורך vivo בקצב של 10 μm/s. חזור על סך של 3 מחזורים.
  16. בדיקות באורך כוח (1/3 מקסימום לחץ + למעלה): להגדיר את הלחץ כדי 1/3 של הלחץ המקסימלי + למעלה ולהתאים את האיבר ל-2% ב vivo אורך. לאחר לחיצה על התחל, למתוח את האיבר ל + 2% באורך vivo ו-2% באורך vivo בקצב של 10 μm/s. לאחר שחזור על סך של 3 מחזורים, לחץ על עצור ושמור את הנתונים.
  17. בדיקות באורך כוח (2/3 מקסימום לחץ + למעלה): להגדיר את הלחץ כדי 2/3 של הלחץ המקסימלי + למעלה ולהתאים את האיבר ל-2% ב vivo אורך. לחץ על התחל ומתח את העוגב ל-+ 2% באורך vivo ובחזרה ל-2% באורך vivo בקצב של 10 μm/s. לאחר שחזור על סך של 3 מחזורים, לחץ על עצור ושמור את הנתונים.
  18. בדיקות באורך כוח (לחץ מרבי + למעלה): להגדיר את הלחץ על הלחץ המקסימלי + למעלה ולהתאים את האיבר ל-2% vivo אורך. בקצב של 10 μm/s, למתוח את האיבר ל + 2% של vivo length ו-2% באורך vivo. לאחר שחזור על סך של 3 מחזורים, שמור את הנתונים. כל נתוני הכוח ישמשו בסעיף 8.
  19. הסר מדיית בדיקת KRB ושטוף בעזרת KRB ללא סידן. להחליף את המדיה עם סידן חינם KRB פתרון בתוספת עם 2 מ"מ EGTA. מודטת את הרקמה. למשך 30 דקות הסר את הפתרון והחלף את המדיה באמצעות KRB טרי ללא סידן.

6. בדיקות פסיבי מכני

הערה: אם תתחיל בבדיקה פסיבית מתחיל בשלב 1. אם בדיקת טון בסיס בוצעה לפני התחלה פסיבית בשלב 6. אם נתחיל ברקמה קפואה, הניחו לתקופה של 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני שהיא מאפשרת את העוגב.

  1. מציאת הגיאומטריה הפרוק: למתוח את האיבר כך שהקיר של האיבר אינו מתוח. למדוד את האיבר canנולה מתפר תפר לתפור ולהקליט את זה כאורך פרוק.
  2. מציאת לחץ בוטלה: לאחר הקשה על התחל, להגדיל את הלחץ בין 0 ל 10 מיליון בהפרשים של 1 מ מ. במהלך תהליך זה, לקבוע את הלחץ שבו האיבר אינו מתוח. באמצעות צג תוכנת המחשב, ניתן לקבוע זאת מהקפיצה הגדולה ביותר בקוטר החיצוני. לאחר שתמקדים את הכוח, הקלט את הלחץ הזה, כמו גם את הקוטר החיצוני, וציין זאת כנקודה הראשונה שבה האיבר אינו מתמוטט.
  3. מתיחה vivo: לחשב את האומדן בvivo מתיחה על ידי חלוקת האורך הנמדד vivo על ידי האורך הנמדד לאחר ההסבר.
  4. קוטר הלחץ טרום מיזוג: לאחר לחיצה על התחל, להגדיר את הלחץ להגדיר 0 mmhg, את האורך כמו המשוער vivo length, ואת הדרגתי ל 1.5 mmhg/s. בגין הפעלת רצף שלוקח את הלחץ מ 0 mmhg ללחץ המרבי בחזרה ל 0 מ"מ כספית. חזור על תהליך זה עד 5 מחזורי עם 30 הזמן ההמתנה השנייה.
  5. התניה באורך כוח: כוונן את האיבר לאורך vivo והזן באופן ידני את הלחץ בתוכנית המחשב עבור שני הלחצים. לאחר הקשה על התחל, הגדר את מעבר הצבע ל-2 mhg והלחץ ל1/3 של המקסימום. למתוח את האיבר עד + 2% ובחזרה אל-2% למתוח ב 10 μm/s. חזור על מחזור זה במשך 5 פעמים ולחץ על Stop.
  6. מציאת הניסוי באורך vivo: למצוא ולהתוות ערכי כוח ב-2% מאורך vivo, באורך vivo, ו-2% מאורך vivo. קח כוחות לחצים מרווחים באופן שווה החל מ-0 Mhg ללחץ המקסימלי. הניסוי במתיחה vivo יהיה ערך מתיחה המוצגים קו שטוח יחסית על מגוון של לחצים.
  7. חזור על קוטר הלחץ והשלבים הבאים של התניה מראש באורך החדש vivo.
  8. שאקליציה: עם העוגב שנקבע באורך vivo, הגדר את הלחץ על השקע ולחץ הפורקן ללחץ הטעון. תנו לאיבר לחזור. בחזרה ל -15 דקות לאחר 15 דקות, לאט להביא את הלחץ משקע ולאפס בחזרה למטה ל 0 Mhg.
  9. הערכה מחדש של התצורה שטעינתו התבצעה: הביאי את האיבר לאורך הטעינה והערכת מחדש את האורך הפרוק. הקלט את האורך הפרוק והקוטר החיצוני בזמן שהלחץ הוא 0 Mhg, הלחץ שנטען, ו1/3 הלחץ המקסימלי. . מאפס את הכוח בלחץ הטעון הקוטר על הלחץ הטעון הוא בקוטר vivo.
    הערה: הערכת מחדש את אורך הביטול הפרוק נחוצה בעוד שדתצורות פלסטיק קטנות נצפו בעבר ברקמות ביולוגיות רכות בעקבות התניה מראש. תצורה זו שאינה מתבטלת תהיה זו שנוצל בסעיף 8.
  10. אולטרסאונד: ביצוע אולטרסאונד לבצע הדמיה במצב B באורך הטעינה והלחץ.
  11. בדיקות בקוטר הלחץ: עם העוגב ב-2% של הניסוי שנקבע באורך vivo והלחץ על 0 Mhg , לחץ על התחל. הגדילו את הלחץ מ -0 מיליון. ללחץ המקסימלי ובחזרה ל -0 מיליון החזק את הצעד ה2-0. למשך 20 שניות לאחר שחזור על סכום כולל של 5 פעמים, לחץ על לחצן עצור בממשק ושמור את הקובץ.
    הערה: חזור על הניסוי באורך vivo, + 2% מהניסיוני באורך vivo.
  12. בדיקות באורך כח: הפעילו את הלחץ על הלחץ הנומינלי והתאימו את העוגב ל -2% מהאורך הvivo. למתוח את האיבר עד + 2% של vivo אורך ו-2% של באורך vivo בקצב של 10 μm/s. לאחר שחזור על סכום כולל של 3 פעמים, שמור את הנתונים. חזור על זה עבור 1/3 מקסימום לחץ, 2/3 מקסימום לחץ, ועל הלחץ המרבי.
  13. לחשב את עובי פרוק מתמונות אולטרסאונד תמונה במצב B. שימוש בתוכנת דימות, למתוח קו כדי לציין את עומק החדירה. קבע את הסולם לאורך הקו (כלומר, 2000 יקרומטר כפי שמוצג באיור 6b ו - 6b).
  14. חישובי עובי הקיר: שימוש בתוכנת מחשב, איתור ומדידת הקוטר הפנימי והחיצוני של העוגב. לאחר מכן, ציירו ומדדו קו בין הקטרים. צייר סך של 25 קווי ציור קיר. ממוצע כל נקודות הנתונים וחזור על סך של 3 פעמים.

7. ניקוי

  1. ודא שהלחץ הוא 0 מ מ וכבוי. סגרו את השקע הראשי ומלא כיבוי עבור שסתומים שלושה כיוון. מחלק את הנוזלים הנותרים. מאגן מתקן הצינורית
  2. הסירו את האיבר מהבמה ומלאו את בקבוק האגירה במים מפוהים. , בעזרת מזרק. תשטוף את הצינורית במים חברו את הצינורות. כדי לעקוף את הצינורית
  3. להפעיל את הלחץ ולזרום, להגדיר את הלחץ על כניסת ל200 mmHg, את הלחץ לשקע 0 mmHg, הדרגתי ל 10 Mhg/s, ולתת לזרום לרוץ 5 דקות. אפשר למערכת לפעול כאשר בקבוק המאגר ריק ולתת לאוויר לפעול 5 דקות או עד שהקווים יבשים.

8. ניתוח נתונים

  1. לבדיקת קוטר הלחץ, לאסוף נתונים מהמקום שבו הלחץ מתחיל להגדיל את הערך המינימלי עד למקסימום. לקבלת בדיקות באורך כוח, לאסוף נתונים מתוך השיא המקסימלי בכוח עד הפסקת הכוח הפסיק.
  2. פתח את קובץ הנתונים עבור כל בדיקה בקוטר הלחץ ובחר את לשונית הלחץ הממוצע. נווט לאזור הטעינה של העקומה האחרונה, 0 mmHg ללחץ המרבי ושחרר את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני. בחר את אותו אזור בקוטר החיצוני, לחץ האוויר, לחץ על שקע, כוח, טמפרטורה, pH וכרטיסיית זרימה הצבת כל פריט באותו מסמך.
  3. פתח את הנתונים עבור כל מבחן באורך כוח. נווט לאזור הטעינה של העקומה,-2% ל-+ 2% וגרור ושחרר את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני. בחר באותו אזור עבור המשתנים האחרים שנמדדו ומלא כל פריט באותו גיליון אלקטרוני.
  4. עבור קוטר הלחץ מבחן אורך הכוח להפחית את כל ערכי הלחץ.
  5. ממוצע הנתונים בקוטר הלחץ כל 1 (כלומר, 0 +/-0.5, 1 +/-0.5, 2 +/-0.5).
  6. מצא את הנפח שנטען בוטלה של האיבר (V). משוואה 1 יכול להיות מנוצל כדי למצוא V, בהתחשב בכך R02 הוא הרדיוס החיצוני פורקים שנמדד על ידי המיקרוסקופ, L הוא באורך פרוק, ו- H הוא עובי פרוק כפי שזוהה על ידי אולטרסאונד. ההנחה של בלתי מנוצחת היא ממונפת, כלומר האיבר חוסך בנפח בזמן נתון לדפורמציות.
    הערה: האורך ללא הטעינה נמדד עם מחוגות מתפר לתפר. הקוטר הפרוק ממנו נמדד בעזרת המיקרוסקופ, המצלמה והתוכנה ולאחריו חישוב הרדיוס (איור 5) עובי הטעינה מחושב מתמונות האולטרסאונד (איור 6).
    Equation 3משוואה 1
  7. תוך שימוש בהנחה של בלתי מנוצח, השתמש באמצעי האחסון שנטען מראש, ברדיוס החיצוני המעוות (Equation 4) ובאורך (Equation 5) כדי לקבוע את הרדיוס Equation 6 הפנימי המעוות.
    Equation 7משוואה 2
  8. השתמש במשוואות 3, 4, ו -5 כדי לחשב כל לחץ, בהתאמה. ב משוואות 3-5, P מוגדר כלחץ intraluminal ו-Ft הוא הכוח הנמדד על ידי מתמר.
    Equation 8משוואה 3
    Equation 9משוואה 4
    Equation 10משוואה 5
  9. מתווה את הקשר בקוטר הלחץ, בלחץ כוח היחסים, המתח ההיקפי-קשר מתיחה למתוח, ואת המתח צירית וערכי מתיחה העוקף (איור 7, איור 8). ניתן לחשב את ערכי המתיחה באמצעות הרדיוס midwall. חישובים של מדגיש העוקף והצירית ניתן למצוא משוואות 6 ו 7, בהתאמה.
    Equation 11משוואה 6
    Equation 12משוואה 7
  10. חישוב תאימות ליד טווח הלחץ הפיזיולוגי ובמתיחה vivo. הלחץ הנמוך המאוגד (LPB) הוא סטיית תקן 1 מתחת ללחץ הנמדד. הלחץ העליון מאוגד (UPB) הוא 1 סטיית התקן מעל הממוצע מנמדד לחץ9.
    Equation 13
  11. לחשב את הטנגנס מודלי כדי לכמת את קשיות החומר. זהה את הלחץ ההיקפי המחושב המתאים ללחץ התחתון המאוגד ולחץ המאוגד העליון. להתאים קו ליניארי הלחץ ההיקפי עקומת למתוח בתוך טווח הלחץ המזוהה ב vivo length. חשב את השיפוע של קו9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח מוצלח של התכונות המכאניות של איברי הרבייה הנשיים מותנה בניתוח מתאים, בצינורית ובבדיקות. חובה לחקור את קרני הרחם אל הנרתיק ללא פגמים (איור 1). בהתאם לסוג האיבר, גודל הצינורית ישתנה (איור 2). הצינורית חייבת להיעשות כך שהעוגב לא יוכל לנוע במהלך הניסוי, אלא גם לא לפגוע בקיר העוגב במהלך ההליך (איור 3). כישלון של אחד הצעדים יגרום לחוסר יכולת של כלי להחזיק לחץ. בדיקת סטנדרטיזציה של הליכים חיונית להצלחת הפרוטוקול על מנת להניב תוצאות עקביות ולשחזור.

לאחר האיבר הוא גזור כראוי, כוח על מערכת הלחץ מיוגרפיה. הכיוונון של מערכות הלחץ מיוגרפים כרוך ביחידת הקונטרולר, במד הזרימה והבמה (איור 4). מערכת הלחץ מיוגרפיה משמשת לניטור היבטים שונים של האיבר כפי שהוא עובר בדיקה מכנית (איור 5). מערכת אולטרסאונד, או שוות ערך, משמשת כדי למדוד את עובי האיברים במצב ללא טעינה עם וללא הטון הבזאלי (איור 6). לאחר בדיקות מכניות, ניתן לחשב את הטנגנס המודוללי עבור הכיוונים הפרציריים והצירית (שולחן 2).

הן בדיקת טון בסיס בדיקה פסיבית התשואה תכונות מכניות של מערכת הרבייה, עם ובלי את התרומה הקונקטילה של תאי שריר חלקה (איור 7, איור 8). שינוי גודל בין האיברים דורש מספר התאמות לפרוטוקולים (טבלה 1), כמו צוואר הרחם והנרתיק לחוות המון שונים vivo46-48. וריאציות כאלה עשויות להיות מנוטרים באמצעות טכניקות כגון הלחץ התרמוזציה. הלחץ מהווה שיטה המשמשת בעבר כדי לפקח על התנאים vivo בתוך הנרתיק והרחם49-53. מודלים במחקרים קודמים מגוון מעכברים, ארנבים ובני אדם. אותם עקרונות היו מוחלים באופן דומה על הלחץ הצווארי והנרתיק הספציפי לדגם murine. למרות זאת, ללא קשר לאיבר שנבדק, החומרים נחוצים לפרוטוקולים (שולחן 3).

Figure 1
איור 1: דיאגרמת מוריין לחיתוך. העכבר לנתיחה עבור איברי הרבייה: הן קרני הרחם, צוואר הרחם, ואת הנרתיק. בדמות, שלפוחית השתן ואת השופכה יוסרו מן החלק הקדמי של הנרתיק. המעיים ושרירי הבטן שיקפו את הסופראורלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השוואת גודל של שתי הצינורית. השוואת גודל של שתי הצינורית המשמשות לצינורית של איברי הרבייה. הצינורית הגדולה (D = 3.75 מ"מ) משמשת לרקמת הנרתיק (א). הצינורית הקטנה יותר (D = 0.75 מ"מ) משמשת לרקמת צוואר הרחם קאננולטינג (B). צינורית צוואר הרחם היא חלקה בעוד צינורית הנרתיק יש שני חריצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שיטת הצינורית לנרתיק ולצוואר הרחם. בשל הגאומטריה והעובי השונים של איברי הרבייה, הם הינם הדבר היעיל ביותר בנימוסים נפרדים. לנרתיק, הניחו שני תפרים באופנת איקס. כאשר canנולה צוואר הרחם, במקום 3 התפרים אופקיים על קצה הרחם 4 תפרים על מערכת ההפעלה החיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ההתקנה עבור התקן מיוגרף לחץ. ההתקנה של התקן DMT מנוצל עבור בדיקה בסיס ופסיבי. DMT מורכב משלושה רכזות עיקריות: השלב (א), יחידת הקונטרולר (B) וממד הזרימה (C). בתוך יחידת הבקר, יש בקבוק מאגר ובקבוק פסולת. בקבוק המאגר מתמלא בתחילה בנוזלים הריקים כפי שהניסוי מבוצע. בקבוק הפסולת, שהוא ריק בתחילה, אוסף את הנוזל העובר דרך הניסוי. יחידת הקונטרולר ממשקים עם תוכנת DMT במחשב ושולטת על הלחץ, הטמפרטורה והזרימה. יחידת הקונטרולר קוראת את התפוקות מהחיישני הכוח והלחץ בתוך השלב באמצעות כבל ממשק VGA. רכיב הבמה של המערכת מכיל זרם משקע וזרימה של המערכת. זרם הים והשקע יש לחצים מקבילים ולשקע לצוף הנמדד על ידי המערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הגדרת הקובץ בתוכנית הלחץ מיוגרף. הצגת הגדרת תוכנת מחשב. התיבה מצוירת סביב אזור הריבית והקוטר החיצוני של הרקמה מתבצע בזמן אמת (א). נתונים שהושגו במהלך בדיקות מכניות מוקלט ומוצגים בזמן אמת בקוטר החיצוני, לחץ על הזרם, לחץ שקע, ממוצע לחץ, כוח, טמפרטורה, pH וכרטיסיית זרימה (ב). בתוך לחץ ממשק הלחץ (mmHg), הדרגתי (mmHg/s), וזרימה נשלטת. יתר על כן, הכוח הצירי (mN) שנמדד על-ידי מתמר הכוח הנמצא בשורה מוצג. קצב הזרימה (μL/min) מדווח בכרטיסיה מד הזרימה (C). רצף הלחץ מוצג ונשלט בכרטיסיה ברצף (D). נתונים שנרשמו במהלך בדיקות מכניות מוקלט ומוצגים בזמן אמת בקוטר החיצוני, לחץ הזרם, לחץ שקע, מתכוון לחץ, כוח, טמפרטורה, pH, וכרטיסיית זרימה (E). מבחן בקוטר הלחץ המייצג של הנרתיק מוצג בקוטר החיצוני כפונקציה של זמן על הלשונית בקוטר החיצוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הדמיה אולטרסאונד. דימות אולטרסאונד של איברי. הרבייה של המורין כל התמונות נלקחו באמצעות מערכת אולטרסאונד במצב קצר ציר-B. דמות ייצוגית של הנרתיק באורך ובלחץ הפורקים (א). עובי דופן הנרתיק היה מחושב ב-ImageJ. קו אנכי צויר לאורך סולם העומק (mm) כדי לכייל את מספר הפיקסלים לכל μm. כלי המצולע שימש לאיתור הקוטר הפנימי והחיצוני. לאחר מכן קווי העברה לקיר נמשכו כדי לחשב את עובי ואת הממוצע (ב). . זה בוצע 3 פעמים תמונה מייצגת של צוואר הרחם על האורך והלחץ הפורקים (C). עובי הקיר החושב לאחר מכן באמצעות Image J והכלי מצולע בצורה דומה לזו של הנרתיק (D). בתוך מתחם הרבייה, הקוטר החיצוני מתבצע בשני מיקומים שונים (E). במהלך תהליך הדימות, מתמר מיוצב על ידי מחזיק מודפס תלת-ממדי (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תוצאות הנציג לבדיקת וגינאלית. מייצג את התוצאות בדיקות מכניות של הנרתיק ופרוטוקולים פאסיביים. עם הנתונים שהושגו על ידי מערכת DMT, כמה קשרים מכניים ניתן לגזור. A) לחץ בסיס בקוטר, B) לחץ פסיבי קוטר, C) כוח בסיס-לחץ, D) כוח פסיבי-לחץ, E) בסיס הלחץ הבסיס-מתיחה למתוח, F) פסיבי לחץ-מתיחה, למתוח, G) מתח צירית בסיס-מתח מתיחה, H) הלחץ הפסיבי מתיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תוצאות הנציגים של בדיקות צוואר הרחם. מייצג תוצאות בדיקות מכניות של הפרוטוקולים הבזליים הצווארי ו פסיבי. עם הנתונים שהושגו על ידי מערכת DMT, כמה קשרים מכניים ניתן לגזור. A) לחץ בסיס בקוטר, B) לחץ פסיבי קוטר, C) כוח בסיס-לחץ, D) כוח פסיבי-לחץ, E) בסיס הלחץ הבסיס-מתיחה למתוח, F) פסיבי לחץ-מתיחה, למתוח, G) מתח צירית בסיס-מתח מתיחה, H) הלחץ הפסיבי מתיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בלחץ Vivo לחץ מרבי 1/3 מקסימום לחץ 2/3 מקסימום לחץ מתיחה צירית גודל צינורית מספר מומלץ
של תפרים
נרתיק 7 כספית כספית 15 5 כספית 10 כספית -2%, ב vivo, + 2% 3.75 ממ ' 2--באופנת איקס
רחם 10 כספית 200 כספית 66 כספית 133 כספית -2%, ב vivo, + 2% 0.75 מ"מ לסוף הרחם
3.75 ממ לקצה הנרתיק
3 התפרים אופקיים על
סוף הרחם
4 תפרים ב
מערכת הפעלה חיצונית מהנרתיק

טבלה 1: תקציר מידע לשינוי קנה מידה של שיטות הבדיקה המכנית עבור כל איבר. ערכי הלחץ שטעיורו נמדדו באמצעות טכניקות הרדמה מתחת להרדמה (4% איזופלוריין ב-100% חמצן). קטטר בלון היה מנוצל עבור מדידות הנרתיק ו קטטר 2F עבור צוואר הרחם.

נרתיק רחם
בזליים
פרפרימי (kPa)
127.94 188
בזליים
צירית (kPa)
56.8 75.44
פסיבי
פרפרימי (kPa)
246.03 61.26
פסיבי
צירית (kPa)
112.74 19.26

שולחן 2: תוצאות הנציג עבור המשיק מודלי של הנרתיק וצוואר הרחם. הטנגנס המודוללי חושבו הן לתנאים פאסיביים והן לתנאי פסיבי, כמו גם לכיוונים הפוכים והצירית. כל המדידות המסופקות הן ביחידות של kPa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המסופק במאמר זה מציג שיטה לקביעת תכונות מכניות של הנרתיק מורין וצוואר הרחם. התכונות המכאניות שנותחו בפרוטוקול זה כוללות גם את תנאי הטון הפסיבי והבזליים של האברים. תנאי הטון הפסיבי והבזליים ממושרה על ידי שינוי הסביבה הביוכימית שבה האיבר מתחת לגוף. עבור פרוטוקול זה, התקשורת המעורבת בבדיקות בסיס מכילה סידן. בדיקת המצב בסיס הטון מאפשר בידוד של התרומה שרירים חלקה תא מכני בתוך איברי הרבייה נקבה54,55. בעת ביצוע בדיקות פסיבי מכני, התקשורת אינה מכילה סידן. חוסר סידן מעכב את תאי השריר חלק מקבלנות. זה מאפשר להבהיר רכיבי ECM אחרים, כגון קולגן וסיבים אלסטיים, אשר בעיקר להכתיב את התכונות המכני פסיבי. בשילוב עם אנליזה ביוכימית והיסטולוגית, תוצאות אלה מאפשרות להבהיר את היחסים בין הרכב מיקרוקונסטרוקטיבי של ECM ופונקציה מכנית. זה מאפשר להתוות של מנגנונים מבניים ומכניים של הפתווגיות רלוונטי לבריאות הרבייה של נשים.

בעבר, הנרתיק וצוואר הרחם נבדקו uniaxially27,28. הנרתיק וצוואר הרחם, לעומת זאת, להדגים את המאפיינים אניסוטרופי ולחוות העמסה רב-צירית ב vivo29,30 . מכאן, מערכות לחץ מיוגרפים המשמשים בזאת לספק מידע כמותי על העמסה מרובת צירי שעשוי לסייע בהבנת התופעות של הפתווגיות הרבייה, כמו גם את העיצוב הבא של טיפולים פוטנציאליים. עוד, הלחץ myography מאפשרת הערכה של תכונות רב-צירית תוך שמירה על הגיאומטריה עוגב vivo ואינטראקציה מטריצה התא יליד56 . בשנת vivo, התאים לשפץ באופן פעיל את ecm המקיפים בתגובה לשינויים ביומכאני ומרמזים ביוכימיים57,58,59. הפרוטוקול המשמש בזאת הוא יתרון כפי שהוא מתיר ניטור של שינויים הבאים בתכונות איברים בצובר בתנאים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. הדבר מסייע במתן פלטפורמה ליצירת מערכות נתונים שיטתית של תכונות מכניות אקטיביות ופסיביות. יתר על כן, הנתונים שנאספו בניסויים אלה עשויים להיות ממונפת לנסח ולאמת מיקרובנית מודלים בעלי מוטיבציה בלתי לינארית לתאר ולחזות את התגובה המכנית של איברי הרבייה הנשי בריאים ו מצבים פתולוגיים16,60.

רכיב מערכת נוסף שהיה יתרון על הפרוטוקול היה שימוש בדימות אולטרסאונד כדי למדוד את עובי קירות האיברים. עובי הוא מידע חיוני לחישוב הלחץ מנוסים בעת שעברו בדיקות.

, עם כל ניסוי שהוגדר. יש כמה מגבלות להליך הזה פרוטוקול זה רואה כרגע רק את התגובה האלסטית של הנרתיק וצוואר הרחם ולא את התגובה הגמישה. שיטה פוטנציאלית להפחתת מגבלה זו בעתיד היא לשנות את הפרוטוקול הקיים כך שיכלול חריגה ומצוקה מרגיעהבחני. הגבלה שנייה היא בהנחה. שהאיברים לא מאורגנים בתוך מחקר זה, עובי נמדד בלעדית על הגדרת התצורה, כפי שהיה מונע על ידי מחקרים קודמים הממחישים רקמות murine שאינם בהריון מציג שינויים מינימליים בנפח במהלך אוסמוטי טעינת62. יתרה מזאת, מחקרים נוספים פעלו תחת אותה הנחה של חוסר הבהירות44,60,63. באופן אידיאלי, אולטרסאונד יבוצע לקראת כולו של הניסוי כדי להסיר את הצורך הנחה בלתי מנוצחת וליידע טוב יותר מודלים של אלמנט סופי. המגבלה הסופית היא חוסר כימות בלחץ צוואר הרחם vivo כדי ליידע את פרוטוקולי הטעינה. הספרות מרמזת כי לחץ צוואר הרחם בנשים האדם הוא 37 mmHg53. עכברים, לעומת זאת, עשויים להפגין לחץ צוואר שונה של בני אדם. ההבדל בלחץ נרתיקי הוכח בין מודלים מכרסמים ודגימות אדם64,65. מחקרים נוספים נחוצים כדי לכמת את הלחץ בצוואר הרחם murine שאינו בהריון. לקראת סוף זה, לחץ פנים רחמי נמסר לאחרונה במהלך ההריון49.

הלחץ הזמין מסחרית משמש מערכת מנוצל בהליך זה מודד את התכונות כוח של האיברים אלסטי, חלול. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות לאיברים ורקמות שונים אחרים על ידי שינוי התוספים הכימיים באמבט, בגודל צינורית, ועובי תפר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא.

Acknowledgments

העבודה ממומנת על ידי המענק NSF פרס קריירה #1751050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
  2. Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53, (4), 541-560 (1947).
  3. Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
  4. Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75, (2), 240-243 (1990).
  5. Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215, (4), e471-e478 (2016).
  6. Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23, (23), 907-912 (2014).
  7. Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43, (43), 433-439 (2000).
  8. Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
  9. Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140, (5), (2018).
  10. Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. The McGraw-Hill Companies. (2006).
  11. Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
  12. Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143, (4), 429-438 (2012).
  13. Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193, (3), 1149-1155 (2005).
  14. Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24, (7), 838-849 (2017).
  15. Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27, (2), 327-339 (1982).
  16. Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92, (2), 287-295 (2011).
  17. Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224, (1), 33-44 (2011).
  18. Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198, (5), (2009).
  19. Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12, (108), 20150280 (2015).
  20. Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
  21. Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49, (8), 867-879 (2011).
  22. Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44, (10), 1941-1947 (2011).
  23. Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11, (9), 1419-1428 (2003).
  24. Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
  25. Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9, (12), 9379-9391 (2013).
  26. Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32, (12), 1969-1982 (2011).
  27. Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13, (3), 317-337 (2010).
  28. Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120, (2), 224-232 (2012).
  29. Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
  30. Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. 689-690 (2010).
  31. Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39, (1), 549-558 (2010).
  32. Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46, (12), 2036-2047 (2018).
  33. Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8, (4), 491-494 (1973).
  34. Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7, (4), e35538 (2012).
  35. McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
  36. Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36, (2), 133-140 (2006).
  37. Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
  38. Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103, (2), 443-447 (2006).
  39. de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 6364821 (2018).
  40. Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
  41. Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110, (1), 251-257 (1996).
  42. Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
  43. Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
  44. Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139, (10), 104504 (2017).
  45. Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14, (4), 181-201 (1977).
  46. Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19, (4), 404-417 (2015).
  47. House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28, (6), 745-749 (2006).
  48. Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
  49. Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
  50. Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64, (2), 183-186 (1985).
  51. Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67, (8), 711-716 (1988).
  52. Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9, (1), 27-37 (1997).
  53. Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
  54. Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
  55. Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
  56. Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126, (6), 787-795 (2005).
  57. Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (11), 6180-6185 (2001).
  58. Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
  59. Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36, (8), 1322-1334 (2008).
  60. Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141, (2), 021011 (2018).
  61. Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  62. Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132, (2), 021003 (2010).
  63. Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138, (5), 051008 (2016).
  64. Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
  65. van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25, (6), 799-805 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics