圧力筋グラフを用したマウス生殖系の二軸基底音と受動的試験

Bioengineering

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Summary

このプロトコルは、市販の圧力ミオグラフシステムを利用して、マウス膣および子宮頸部の圧力筋グラフ試験を行った。カルシウムの有無にかかわらず培地を利用して、平滑筋細胞(SMC)基底色および受動細胞外マトリックス(ECM)の寄与は、推定生理学的条件下で臓器に対して単離された。

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White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

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Abstract

女性の生殖器官、特に膣および子宮頸部は、様々な細胞成分とユニークな細胞外マトリックス(ECM)で構成されている。平滑筋細胞は、膣および頸部壁内の収縮機能を示す。生化学的環境と臓器壁の機械的膨張に応じて、平滑筋細胞は収縮状態を変化させる。ベースライン生理条件下での平滑筋細胞の寄与は、基底トーンとして分類される。より具体的には、基底トーンは、ホルモンおよび神経刺激がない場合の平滑筋細胞のベースライン部分収縮である。さらに、ECMは器官の壁のための構造サポートを提供し、生化学的手がかりのための貯蔵所として機能する。これらの生化学的手がかりは、成長を刺激し、恒常化を維持するなど、様々な臓器機能に不可欠です。各器官のECMは、主にコラーゲン繊維(主にコラーゲンタイプI、III、およびV)、弾性繊維、およびグリコサミノグリカン/プロテオグリカンで構成されています。ECMの組成および組織は、各器官の機械的特性を決定する。ECM組成物の変化は、骨盤臓器脱出や早期子宮頸部改造などの生殖病理学の発症につながる可能性がある。さらに、ECM微細構造および剛性の変化は、平滑筋細胞活性および表現型を変化させ、したがって収縮力の喪失をもたらす。

この研究では、報告されたプロトコルは、妊娠していないマウス膣および子宮頸部の基底トーンおよび受動的な機械的特性を、エストラスの生後4〜6ヶ月で評価するために使用される。器官は市販の圧力ミオグラフに取り付けられ、圧力直径および力長の両方のテストが行われた。生殖器官の機械的特徴付けのためのサンプルデータおよびデータ分析技術が含まれる。このような情報は、数学的モデルを構築し、女性の健康病理のための治療介入を合理的に設計するのに役立つ可能性があります。

Introduction

膣壁は、上皮、層体プロプリア、筋肉、およびアドベンティシアの4つの層で構成されています。上皮は、主に上皮細胞から構成される。ラミナプロプリアは、弾性およびフィブリルコラーゲン繊維を大量に有する。筋肉はまた、エラスチンとコラーゲン繊維で構成されていますが、平滑筋細胞の量が増加しています。このアドベンティシアは、前の層と比較して濃度が低下するが、エラスチン、コラーゲン、および線維芽細胞で構成される。平滑筋細胞は、臓器の収縮性の役割を果たしているので、生体力学的に動機づけられた研究グループに関心があります。そのため、平滑筋細胞領域分画と組織を定量化することは、機械的機能を理解する上で重要である。以前の研究は、膣壁内の平滑筋含有量が主に円周軸と縦軸で組織されたことを示唆している。組織学的分析は、平滑筋領域の分率が壁1の近位部および遠位部の両方に対して約35%であることを示唆している。

子宮頸部は非常にコラーゲン構造であり、最近まで、平滑筋細胞含有量最小限に抑えるものと考えられていた2,3.しかし、最近の研究は、平滑筋細胞が子宮頸部4、5においてより多くの存在と役割を持つことが示唆されている。子宮頸部は、平滑筋細胞の勾配を示す。内部osは、外部osが10%しか含まれている50-60%の平滑筋細胞が含まれています。しかし、マウス研究は、10〜15%の平滑筋細胞と85〜90%の線維性結合組織で構成される子宮頸部を報告し、局所的な差は言及しない6、7、8である。マウスモデルが頻繁に報告されるヒトモデルと異なっていることを考えると、マウス子宮頸部に関するさらなる調査が必要である。

このプロトコルの目的は、マウス膣および子宮頸部の機械的特性を解明することであった。これは、ネイティブの細胞マトリックス相互作用と器官形状を維持しながら、円周方向と軸方向の機械的特性の評価を同時に可能にする圧力筋グラフ装置を使用することによって達成されました。器官は2つのカスタムカニューレに取付けられ、絹の6-0縫合糸で固定された。圧力直径試験は、推定生理軸ストレッチの周りに行われ、コンプライアンスおよび接線モジュリ9を決定した。力長試験は、推定軸伸縮性を確認し、機械的特性が生理学的範囲で定量化されたことを確認するために行われた。実験プロトコルは、妊娠4~6ヶ月の妊娠4~6ヶ月で非妊娠マウス膣および子宮頸部に対して行われた。

プロトコルは、基礎音と受動試験の2つの主要な機械試験セクションに分かれています。基底トーンは、滑筋細胞のベースライン部分収縮として定義され、外部局所、ホルモン、および神経刺激10が存在しない場合でも。膣および子宮頸部のこのベースライン収縮性は、その後圧力筋グラフシステムによって測定される特徴的な機械的挙動をもたらす。受動的特性は、収縮のベースライン状態を維持する細胞間カルシウムを除去することによって評価され、平滑筋細胞の弛緩をもたらす。受動的な状態では、コラーゲンおよびエラスチン繊維は、器官の機械的特性に対する支配的な寄与を提供する。

マウスモデルは、女性の生殖健康の病理を研究するために広く使用されています。マウスは、生殖システム11、12、13、14内のECMと機械的特性との間の進化する関係を定量化するためのいくつかの利点を提供する。これらの利点は、短く、よく特徴付けられたエストルースサイクル、比較的低コスト、取り扱いの容易さ、および比較的短い妊娠時間15を含む。さらに、実験用マウスのゲノムは十分にマッピングされ、遺伝子組み換えマウスは、機械的仮説16、17、18をテストするための貴重なツールである。

市販の圧力ミオグラフシステムは、様々な組織や器官の機械的応答を定量するために広く使用されています。圧力筋グラフシステムで分析されたいくつかの注目すべき構造は、弾性動脈19、20、21、22、静脈および組織工学的血管移植片23、24、を含む食道25、および大腸26。圧力筋グラフ技術は、ネイティブセルECM相互作用と生体内ジオメトリを維持しながら、軸方向と周囲方向の特性を同時に評価することを可能にします。軟部組織および臓器力学におけるミオグラフシステムの広範な使用にもかかわらず、圧力ミオグラフ技術を利用するプロトコルは、これまで膣および子宮頸部のために開発されていなかった。膣および子宮頸部の機械的特性に関する以前の調査は、単一軸27、28を評価した。しかし、これらの器官は、体内で多軸負荷を経験し、従って、その二軸機械的応答を定量化することが重要である。

さらに、最近の研究は、平滑筋細胞が軟部組織病理5、28、31、32において潜在的な役割をたす可能性があることを示唆している。これは、ネイティブの細胞マトリックス相互作用を維持するので、圧力筋グラフ技術を利用するもう一つの魅力を提供し、したがって、平滑筋細胞が生理学的および病態生理学的に果たす貢献の線引きを可能にする条件。本明細書では、基底音と受動条件の両方下で膣および子宮頸部の多軸機械的特性を定量するプロトコルを提案する。

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Protocol

この研究には、エストラウスにおける4〜6ヶ月メスC57BL6Jマウス(29.4±6.8グラム)を用いた。すべての手順は、トゥレーン大学の研究所動物ケアと使用委員会によって承認されました.分娩後、マウスは安楽死の1週間前に順応し、標準的な条件下で収容された(12時間の光/暗いサイクル)。

1. エストラスでのマウスの犠牲

  1. エストルースサイクルを決定する:エストルースサイクルは、以前の研究15、33、34に従って視覚的評価によってモニターされた。エストラウスサイクルは、前駆体、エストラス、メテストラス、およびダイストラスの4つの段階で構成されています。前駆期の間に性器は腫れ、ピンク、しっとり、しわになる。エストロス相はしわが多いが、腫れが少なく、ピンク色で湿っている。メテストラスとダイストラは、いずれも腫れやしわを示さない、ピンクの色合いに欠け、乾燥した34、35を示すとして報告されている。
  2. エストラスで実験を行う:これは視覚化が最も簡単で、一貫性のある反復可能なタイムポイントを提供するので、マウスがエストラテスにいる間にすべての機械的試験が行われました。
  3. 基底トーンテストを受けているマウスの場合は、ギロチンを介して安楽死させる。受動的な条件下でのみ試験したマウスの場合は、二酸化炭素(CO2)吸入を用いて安楽死させる。ギロチンは、CO2ガスが平滑筋細胞36、37、38の収縮特性を変化させるので、生殖管の平滑筋細胞の機能を維持するのに役立ちます。 39、404142.細胞アポトーシスの可能性を最小限に抑えるために、30分以内に解剖を行うことが不可欠です。

2. 生殖器系解剖

  1. セットアップ:ワークステーションに吸収パッドを置き、4 °Cハンクのバランス塩溶液(HBSS)溶液でペトリ皿と注射器を充填します。脂肪組織の処分のためのワイプを使用してください。マウスの腹部側を上に置き、足と尾をテープで留えます。顕微鏡のライトを点けて、マイクロハサミ、はさみ、2組のストレートピンセット、2組の曲面ピンセットを取り出します。
  2. 斜めのピンセットとはさみを使用して、腹部の周りに皮膚を持ち上げ、恥骨の上に腹部の基部に切開を行います。切開は、腹筋壁を穿刺しないように十分に浅くする必要があります。はさみを使い続け、肋骨のケージに向かって優れた切り取り、腹部の筋肉を深く切ります。
  3. 曲がったピンセットとマイクロハサミで脂肪を軽く引っ張って表面脂肪を取り除きます。脂肪組織は、光のような外観で不均一に光を反射します。取り除いた脂肪と組織をすべて拭き取りに置きます。子宮角と恥骨の両方を識別します。
  4. 膣壁と恥骨の間に閉じたはさみを置きます。恥骨の真ん中を慎重に切る(陰部交響性)。切り取られた恥骨の両端に曲面ピンセットを置きます。生殖器官へのよりよいアクセスを可能にするために、両切れ端を横に引く。
  5. 膣壁から膀胱と尿道を取り除きます。これは、ストレートピンセットとマイクロハサミを使用して行うことができます。ストレートピンセットで膀胱を保持し、緊張を作成し、周囲の組織を膣から分離するために鈍い解剖技術を使用します。膀胱と尿道を解剖したら、ベースを切り取り、体腔から取り除きます。
  6. 生殖器系を同定する:子宮頸部から分岐する子宮角。子宮頸部は、形状および剛性の違いのために膣から識別することができる。子宮頸部の外径は膣より小さい。子宮頸部は膣よりも硬く、ビーズに似ていると感じます(図1)。
  7. インクとキャリパーを使用して、臓器に沿って 3 mm のドットをマークします。子宮管の卵巣の下から始め、子宮頸部に到達するためにドットを劣ってマークします。中心の子宮頸部ドットを使用して、膣内視にドットパスを開始します。
  8. インクを乾燥させ、周囲の脂肪組織、結合組織、および結腸から生殖器官を分離できるようにします。可能な限り膣内炎に近い膣をきれいにします。はさみを使って、膣内皮の周りを切る。
    注:このプロセス中に臓器が乾燥する可能性があります。これが懸念される場合は、4°C HBSSで満たされた注射器を使用して臓器に水分を加えることができます。
  9. 子宮角を卵巣より直ちに切る。結合組織が除去され、臓器が反動するにつれて、臓器は移植後の長さから後退します。解剖した生殖器官を4°C HBSSで満たされたペトリ皿に入れます。この長さの変化は、生体内長(セクション5)で推定を計算するために使用することができる。
    注:解剖およびカヌレーション中にこの温度でHBSSを使用しても、平滑筋細胞の生存率に影響しないことが確認されました。しかし、7.4のpHを維持することは、平滑筋細胞の生存率を維持するために不可欠である。この温度では、HBSSのpHレベルは7.4です。
  10. 4°C HBSSで15分の平衡期間を経て、キャリパーを用いてドット間のスペースを測定する。各距離の測定値をスプレッドシートに記録します。これらの値は、インビボストレッチ比(元の長さ/植え付けられた長さ)を計算するために使用されます。
  11. マウスの内側に向かって余分な組織を持つ腹部領域に廃棄された組織を含むワイプを設定し、4 °C HBSSで拭き取ります。マウスと余分なティッシュをホイルで包み、-20°Cに保管する冷凍庫の金庫袋に入れます。膣上の受動的な機械的挙動は、1回の凍結融解サイクル43後に有意に異なることを見出さなかった。試験されたすべての臓器は、安楽死直後または1回の凍結解凍サイクル後に使用された。

3. カネルト

  1. 臓器タイプの適切なカニューレサイズを決定します。典型的なC57BL6Jマウスでは、膣は直径3.75mmとリベットの両方であるカニューレを使用しています。子宮頸部は、膣端に3.75mmのカニューレ1個、子宮端に直径0.75mmのカニューレを1つ使用します(図2)0.75mmカニューレは滑らかです。
    注:上記の直径サイズは、典型的な無骨4〜6ヶ月C57BL6マウス、C57BL6 x 129SvEv、および7〜9ヶ月齢の非同性マウスに使用される。しかし、脱出や妊娠などの特定の状況は、より大きなサイズのカニューレを必要とする場合があります。
  2. 各器官で、カナンセ装置の力トランスデューサ部に頸部側を取り付けます。装置のマイクロメートル部分に器官(膣または子宮)の反対側の端を取付す。両端を縫合糸で締めます。
  3. 膣と子宮頸部の間の厚さと収縮度の違いにより、様々な技術が最も効果的なカニテーションを行うために利用されてもよい。膣の場合は、カニューレの2番目と3番目のリベットの間に2つの縫合糸を「X」の方法で置きます。子宮頸部をカナレートする場合、カニューレはリベットされないので、子宮の端に3つの水平縫合糸と外部osに4つの縫合糸を持つカニューレの背面に臓器を置くのが最適です。両方の器官について、最大長は縫合糸の間に7mm以下でなければなりません(図3)。

4. 圧力ミオグラフの設定

  1. 圧力ミオグラフシステムをセットアップするために、試験システムの電源を入れ、HBSSの200 mLで貯水池ボトルを充填します(図4)。熱を「オン」にし、貯水池のボトル内のHBSSが加熱できるようにします。次に、顕微鏡の電源を入れ、コンピュータプログラムを開きます。カニューレドオルガン、圧力インターフェイス、流量計の読み取り値、シーケンサー機能ツールの画像がすべて表示されていることを確認します(図5)。

5. 基礎音機械試験

注:子宮頸部は、テストの初期段階でファシックな性質を示しました。しかし、これは予めコンディショニング後に減少しました。基底トーンテストは、DMTデバイスの流域でクレブスリンガーバッファ(KRB)を利用して行われます。バッファは95%O2および5%CO2で通気される。基底調部が完成すると、カルシウムフリーKRBが利用される。

  1. アンロードされたジオメトリを見つける: 壁が張力にならないようにオルガンを伸ばします。膣の場合は、膣壁の溝を観察します。子宮頸部の場合は、中央子宮頸部マークの上下にあるインクドットのすぐ下をカットします。これは6 mm44の頚部の長さの頚部のための反復可能な方法を考案する。キャリパーで縫合糸から縫合までの長さを測定する
  2. 荷を降ろした圧力(UP):圧力を0から10 mmHgまで1mmHg単位で増やします。臓器が崩壊しなくなった圧力を決定します。これは、プログラムモニタに示されているように、所定の圧力で外径の最大のジャンプとして判断することができます。圧力と外径を記録した後、臓器が崩壊していない最初の点として注意し、力をゼロにします。
  3. 生体内ストレッチで推定:生体内で測定された長さを測定後の長さで割ることによって、生体内ストレッチで推定を計算します。
    Equation 1
  4. 圧力直径プリコンディショニング:圧力を0mmHgに設定し、生体内長Equation 2とグラデーションの推定までの長さを1.5 mmHg/sに設定し、0 mmHgからインインインインインインインインインインインインインインインロード(表1)に圧力を取るシーケンスを実行し、30のために保持します秒、および30秒のホールド期間で0 mmHgに圧力を取る。合計5サイクル繰り返した後、コンピュータプログラムの[停止]を押してファイルを保存します。
  5. 生体内ストレッチでの実験を見つける:アンロードされた圧力で、インロードされた圧力で推定される生体内の長さである臓器を調整し、スタートを押します。荷下圧から最大圧力までの圧力値の圧力と力の値を評価します (1)。コンピュータプログラムの[停止]ボタンを押し、ファイルを保存します。
    注: 測定されたストレッチ値は、その地で計算されます。これは、陰部の交和を解消した後にのみ測定できるという制限を伴う。その結果、自然なテザリングが失われ、長さが変わるかもしれません。しかし、理論的なストレッチは、エネルギー節約するために生理的圧力にさらされた場合、器官は力の最小限の変化を経験するという以前に導入された理論に基づいています45。プロトコルでは、生体内ストレッチで測定されるストレッチ値は、生理的範囲の圧力にさらされる場合の力の変化が最小限に抑えられる実験的に同定された長さを使用して計算されるストレッチ値となる。
  6. 圧力直径の事前調整: 圧力を 0 mmHg に設定し、生体内の長さに長さを設定し、1.5 mmHg/s の勾配を 1.5 mmHg/ に設定し、0 mmHg から最大圧力 +UP まで圧力を取るシーケンスを実行し、30 秒間保持し、広告で 0 mmHg に戻します。30秒の保留期間。これを合計5サイクル繰り返した後、プログラムインターフェイスの[停止]ボタンを押してファイルを保存します。
    注:5.4は圧力の増加とより一貫した軸力の読書を達成するために不可欠である。このステップは、多くの場合、視覚的な手がかりに基づいて過小評価されている生体内ストレッチで正しいを見つけるのに役立ちます。5.6はヒステリシスを最小限に抑え、臓器の一貫した、反復可能な、数学的に解釈可能な応答を達成するための予防措置として機能する。
  7. 力の長さの事前調節:入口および出口圧力の両方のための1/3の最大圧力+UPを入力する。インビボの長さの -2% にオルガンを調整し、[開始]を押します。生体内の長さを+2%に調整し、10 μm/sで-2%に戻します。コンピュータプログラムで停止を押してファイルを保存します。
  8. 平衡:生体内の長さで決定された器官で、入口と出口圧力の両方を最大圧力+UPの1/3に設定します。器官を10分間平衡化します。グラデーションを 1.5 mmHg/s に設定して、両方の圧力を 0 mmHg にゆっくりと戻します。
  9. アンロードされたジオメトリを再評価する: オルガンをインビボの長さとアンロードされた圧力に対する圧力に設定します。力の変化が最小限になるまで、推定アンロード長さに向かって軸長を10 μm/sの割合で減らします。この対応する長さは、アンロードされた長さ、またはオルガンが張力または圧縮されていない場合と呼ばれます。フォースをゼロにする前に、アンロードされた長さ、外径、およびフォース値を記録します。
    注: 以前にアンロードされたジオメトリは、純粋に定性的な視覚的な手がかりによって決定されました。定量的な方法と、事前調整中に発生する可能性のある長さの変化を考慮するために、再評価が必要です。このジオメトリはセクション 8 で使用されます。
  10. 超音波セットアップ:一般的なイメージング腹部パッケージを使用して、検査装置内の器官を視覚化します。(図6)。テストの前に、圧力ミオグラフ金属流域の底部からのアーティファクトを最小限に抑えます。カニューレを底からの最大距離である高さに調整し、組織が試験液に完全に沈んでいる。カスタムホルダーは、イメージング中にトランスデューサを垂直位置に安定させるために3Dプリントされています。
  11. 超音波イメージング:力トランスデューサの近くのカニューレを識別し、組織の長さに沿って画像に顕微鏡の段階を調整します。テストプロセス全体を通して、長さに沿った中央領域が追跡されます (図 6A,C)。イメージングの後、一連の B モード フレームで構成されるイメージ "Cine ストア" ループを確認し、最大の外径のフレームを識別します。作られた厚さの計算はセクション8で使用される。
  12. 圧力径試験(生体内長で-2%):開始を押して器官を調整し、生体内の長さの-2%に設定し、圧力を0 mmHgに設定し、勾配を1.5 mmHg/sに設定します。20秒のホールド期間で圧力を0 mmHgに戻します。これを5サイクル繰り返します。
  13. 圧力径試験(生体内の長さ):開始を押して器官を調整し、生体内の長さにあるように調整し、圧力を0 mmHgに設定し、勾配を1.5 mmHg/sに設定します。20秒のホールド期間で圧力を0 mmHgに戻します。これを5サイクル繰り返します。
  14. 圧力径試験(生体内長+2%):器官を調整して生体内長+2%、圧力を0mmHgに設定し、1.5mmHg/sに勾配を設定し、圧力を0mmHgから最大圧力に上げ、20秒のホールド期間で0mmHgに戻します。これを5サイクル繰り返します。3 つの長さすべてからの圧力データは、セクション 8 で使用されます。
  15. 力長試験(公称圧力):アンロードされた圧力と器官への圧力を生体内長の-2%に設定します。器官を生体内の長さの+2%に伸ばし、10 μm/sの速度で生体内長を-2%に戻します。
  16. 力の長さのテスト(1/3の最高圧力+UP):圧力を最高圧力+UPの1/3に設定し、器官を-2%にインビボ長さに調整します。開始を押した後、生体内の長さを+2%に伸ばし、10 μm/sの速度で生体内の長さの-2%に戻します。合計3サイクル繰り返した後、[停止]を押してデータを保存します。
  17. 力の長さのテスト(2/3の最高圧力+UP):圧力を最高圧力+UPの2/3に設定し、器官を-2%にインビボ長さに調整します。開始を押し、インビボの長さを+2%に伸ばし、10 μm/sの速度で生体内の長さの-2%に戻します。合計3サイクル繰り返した後、[停止]を押してデータを保存します。
  18. 力の長さのテスト(最高圧力+UP):圧力を最高圧力+UPに設定し、器官を-2%の生体内長に調整します。10 μm/sの速度で、器官を生体内長の+2%に伸ばし、生体内の長さの-2%に戻します。合計 3 サイクルを繰り返した後、データを保存します。すべての力データはセクション8で使用されます。
  19. KRB試験培体を取り外し、カルシウムフリーのKRBで洗浄します。2 mM EGTAを補充したカルシウムフリーKRB溶液で培方を置き換えます。組織を30分間インキュベートする。溶液を取り出し、新鮮なカルシウムフリーKRBでメディアを交換します。

6. パッシブ機械試験

注: パッシブ テストから開始する場合は、手順 1 から開始します。基底トーン試験がステップ6で受動的開始する前に行われた場合。凍結組織から始める場合は、臓器をカナントする前に室温で30分の平衡期間を許可する。

  1. アンロードされたジオメトリを見つける:オルガンの壁が緊張しないようにオルガンを伸ばします。縫合から縫合にカニューレドオルガンを測定し、アンロードされた長さとして記録します。
  2. 荷を降ろした圧力を見つける:開始を押した後、圧力を0から10 mmHgに1 mmHg単位で増やします。このプロセスを経ている間、器官が緊張していない圧力を決定します。コンピュータプログラムモニタを使用して、これは外径の最大のジャンプから決定することができる。力をゼロにした後、この圧力と外径を記録し、臓器が崩壊しない最初の点として注意してください。
  3. 生体内ストレッチで推定:生体内で測定された長さを、生体内で測定した長さを、生体内で測定した後の長さで割ることによって、生体内ストレッチで推定を計算します。
  4. 圧力直径プリコンディショニング:開始を押した後、圧力を0mmHgに設定し、生体内の長さで推定される長さ、および勾配を1.5 mmHg/sに設定し、圧力を0mmHgから最大圧力に戻すシーケンスの実行を開始します。Mmhg。このプロセスを 30 秒間のホールド時間で 5 サイクル繰り返します。
  5. 力の長さの予備調節:生体内の長さに器官を調整し、手動で両方の圧力のためのコンピュータプログラムのアンロードされた圧力を入力します。[スタート]を押した後、グラデーションを 2 mmHg に設定し、圧力を最大値の 1/3 に設定します。オルガンを +2% まで伸ばし、10 μm/s で -2% ストレッチまで戻します。
  6. 生体内長での実験の発見:インビボ長の-2%、生体内長の-2%、生体内長の+2%で力値を見つけてプロットします。0 mmHg から最大圧力までの均等な間隔の圧力で力を取ります。生体内ストレッチの実験は、圧力の範囲にわたって比較的平坦な線を示すストレッチ値になります。
  7. 生体内の新しい長さで圧力直径と軸の事前調整ステップを繰り返します。
  8. 平衡:生体内の長さで決定された器官で、インレットと出口圧力をアンロードされた圧力に設定します。器官を15分間再平衡させます。15分後、入口と出口の圧力をゆっくりと0mmHgに戻します。
  9. アンロードされた構成を再評価する: オルガンをアンロードされた長さに戻し、アンロードされた長さを再見積もります。圧力が0 mmHg、アンロードされた圧力、および最大圧力の1/3である間、荷下ろしの長さと外径を記録します。荷を降ろした圧力で力をゼロにする。荷下ろし圧力の直径は生体内直径である。
    注:プリコンディショニング後の軟質生物組織では、以前に小さな塑性変形が観察されていたため、アンロードされた長さを再推定する必要があります。このアンロードされた構成は、セクション 8 で使用される構成になります。
  10. 超音波:アンロードされた長さと圧力で超音波Bモードイメージングを実行します。
  11. 圧力直径試験:生体内長で実験的に決定されたオルガンの-2%で、0mmHgの圧力で、開始を押します。圧力を 0 mmHg から最大圧力に上げ、0 mmHg に戻します。2-0 mmHg ステップを 20 秒間保持します。合計5回繰り返した後、インターフェイスの[停止]ボタンを押してファイルを保存します。
    注:生体内長での実験で繰り返し、生体内長で実験の+2%を繰り返す。
  12. 力長試験:わずかな圧力に圧力を設定し、生体内の長さの-2%に器官を調整します。生体内の長さの+2%までオルガンを伸ばし、10 μm/sの割合で生体内長の-2%に戻します。合計3回繰り返した後、データを保存します。1/3最大圧力、2/3最大圧力、最大圧力でこれを繰り返します。
  13. 超音波画像Bモード画像からアンロードされた厚さを計算します。イメージング ソフトウェアを使用して、貫通深さを示す線を引きます。スケールを線の長さに設定します(図 6B および 6Dに示すように、2000 μm)。
  14. 壁の厚さの計算: コンピュータ ソフトウェアを使用して、臓器の内径と外径をトレースおよび測定します。次に、直径間の線を描画して測定します。合計 25 本のトランスムラール線を描画します。すべてのデータ ポイントを平均し、合計 3 回繰り返します。

7. クリーンアップ

  1. 圧力が 0 mmHg でオフになっていることを確認します。両方の三方弁のメイン入口と出口を閉じます。カンヌレーション装置の流域から残りの液体を吸引する。
  2. ステージからオルガンを取り出し、排水で貯水池のボトルを満たします。注射器を使用して、水でカニューレをすすいでください。チューブを接続してカニューレをバイパスします。
  3. 圧力と流れをオンにし、入口圧力を200 mmHgに設定し、出口圧力を0mmHg、勾配を10mmHg/sに設定し、流れを5分間流します。貯水池のボトルが空の間にシステムを動かし、空気を5分間、またはラインが乾くまで動かします。

8. データ分析

  1. 圧力直径試験の場合は、圧力が最小値から最大値まで増加し始める場所からデータを収集します。力の長さのテストでは、力が減少しなくなるまで、最大ピークのすぐ下からデータを収集します。
  2. 各圧力直径検定のデータファイルを開き、平均圧力タブを選択します。外径、入口圧力、出口圧力、力、温度、pH、フロータブで同じ領域を選択し、各項目を同じドキュメントに配置します。
  3. フォース長テストごとにデータを開きます。カーブの読み込み領域 (-2% ~ +2%) に移動し、データをスプレッドシートにドラッグ アンド ドロップします。他の測定変数に対して同じ領域を選択し、各項目を同じスプレッドシートに配置します。
  4. 圧力直径と力の長さのテストでは、すべての圧力値からUPを減算します。
  5. 圧力直径データを 1 mmHg ごとに平均します(つまり、0+/- 0.5、1+/-0.5、2+/- 0.5)。
  6. オルガン (V) のアンロードされたボリュームを検索します。式1は、R02が顕微鏡で測定されたアンロードされた外半径であり、Lがアンロードされた長さであり、Hが超音波によって検出されたアンロードされた厚さであることを考えると、Vを見つけるために利用することができる。 非圧縮性の仮定は、変形を受けながら器官が体積を節約することを意味し、活用される。
    注:アンロードされた長さは縫合糸から縫合までのキャリパーで測定されます。アンロードされた直径は、顕微鏡、カメラ、およびソフトウェアを介して測定され、その後、半径の計算が行われます(図5)アンロードされた厚さは、超音波画像から計算されます(図6)。
    Equation 3方程式 1
  7. 非圧縮性を仮定して、アンロードされたボリューム、変形した外半径()、Equation 4および長さ()Equation 5を使用して、変形した内部Equation 6半径を決定します。
    Equation 7方程式 2
  8. 方程式 3、4、および 5 を使用して、それぞれの応力をそれぞれ計算します。式3〜5において、Pは、トランスデューサによって測定される力である、内ルミナル圧力とFtと定義される。
    Equation 8方程式 3
    Equation 9方程式 4
    Equation 10方程式 5
  9. 圧力直径関係、力圧関係、円周応力-円周ストレッチ関係、軸応力と円周ストレッチ値をプロットします(図7、図8)。ストレッチ値は、中壁半径を使用して計算できます。円周応力と軸応力の計算は、それぞれ式 6 と 7 で見つけることができます。
    Equation 11方程式 6
    Equation 12方程式 7
  10. 生理的圧力範囲の近くと生体内ストレッチでコンプライアンスを計算します。下圧バウンド(LPB)は、平均測定圧力より1標準偏差です。上圧バウンド(UPB)は、平均測定圧力9より1標準偏差です。
    Equation 13
  11. 接線モジュリを計算して、材料の剛性を定量化します。下圧バウンドと上限圧力に対応する計算された円周応力を識別します。インビボの長さで識別された応力範囲内の円周応力-円周ストレッチカーブに線形線を合わせる。ライン 9の勾配を計算します。

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Representative Results

女性の生殖器官の機械的特性の正常な分析は、適切な臓器解剖、カンヌレーション、およびテストに依存しています。子宮角を欠陥なく膣に植え付ける必要がある(図1)。臓器の種類によってカニューレの大きさが異なります(図2)。実験中に臓器が動くだけでなく、処置中に器官の壁を損傷しないように、カンヌレーションを行う必要があります(図3)。いずれかのステップの失敗は、容器が圧力を保持することができない結果になります。一貫性のある反復可能な結果を得るためには、プロシージャの標準化はプロトコルの成功に不可欠です。

臓器が解剖され、適切にカニューズされると、圧力筋グラフシステムに電力を供給します。圧力ミオグラフシステムのセットアップには、コントローラユニット、流量計、ステージが含まれます(図4)。圧力筋グラフシステムは、機械的検査を受ける臓器の様々な側面を監視するために使用されます(図5)。超音波システム、または同等のは、基底音の有無にかかわらずアンロード状態の器官の厚さを測定するために使用されます(図6)。機械的試験の後、接線率は、円周方向および軸方向に対して計算されてもよい(表2)。

基底トーン試験と受動試験の両方が、平滑筋細胞の収縮寄与の有無にかかわらず、生殖管の主要な機械的特性を生み出す(図7、図8)。臓器間のスケーリングは、子宮頸部と膣が生体内46-48で異なる負荷を経験するように、プロトコル(表1)にいくつかの調整を必要とします。このような変動は、圧力触媒などの技術を介して監視されてもよい。圧力触媒は、膣および子宮内の生体内状態を以前に監視するために使用される方法である49-53である。これまでの研究では、マウス、ウサギ、ヒトのモデルが多かった。同じ原理は、マウスモデルに特有の頸部および膣圧にも同様に適用されるであろう。しかし、どの臓器がテストされているかにかかわらず、プロトコルには同じ材料が必要です(表3)。

Figure 1
図1:マウス解剖図。生殖器官のマウス解剖:子宮角、子宮頸部、および膣の両方。図では、膀胱および尿道は膣の前部から取り除かれる。腸と腹筋が優れた反射を受けました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:2つのカニューレのサイズ比較。生殖器官のカニューレに使用される2つのカニューレのサイズ比較。より大きなカニューレ(D = 3.75 mm)は膣組織(A)に使用される。より小さいカニューレ(D = 0.75 mm)は、子宮頸部組織(B)のカナリングに使用される。子宮頸部カニューレは滑らかであり、膣カニューレには2つの溝がある。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:膣および子宮頸部のカナンス法。生殖器官の様々な形状と厚さのために、それらは最も効果的に明確な方法でカニューレされます。膣の場合は、2本の縫合糸を「X」の方法で配置します。子宮頸部をカナレートする場合は、子宮の端に3つの水平縫合糸を置き、外側のosに4つの縫合糸を置く。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:圧力筋グラフ装置のセットアップ。基礎試験と受動試験の両方に使用されるDMTデバイスのセットアップ。DMT は、ステージ (A)、コントローラ ユニット(B)、および流量計 (C) の 3 つの主要なハブで構成されます。コントローラーユニット内には、貯水池ボトルと廃棄物ボトルがあります。貯水池のびんは、実験が行われるにつれて空にする液体で最初に満たされる。廃棄物ボトルは、最初は空で、実験を通過する流体を収集します。コントローラユニットは、コンピュータ上のDMTソフトウェアとインターフェースし、圧力、温度、流れを制御します。コントローラユニットは、VGAインターフェイスケーブルを介してステージ内の力と圧力トランスデューサからの出力を読み取ります。システムのステージコンポーネントには、システムの入口および出口流れが含まれています。入口および出口の流れにシステムによって測定される対応する入口および出口圧力がある。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:圧力筋グラフプログラムのファイル設定。コンピュータソフトウェアのセットアップの表示。ボックスは、目的の領域の周りに描かれ、組織の外径は、リアルタイムで光学的に追跡されます(A) .機械的試験中に得られたデータは、外径、入口圧力、出口圧力、平均圧力、力、温度、pH、およびフロータブ(B)にリアルタイムで記録および表示されます。圧力界面圧力(mmHg)、勾配(mmHg/s)、および流れが制御されます。また、インライン力トランスデューサにより測定された軸力(mN)が表示される。流量(μL/min)は流量計タブ(C)で報告される。圧力シーケンスはシーケンサータブ(D)に表示および制御されます。機械試験中に記録されたデータは、外径、入口圧力、出口圧力、平均圧力、力、温度、pH、およびフロータブ(E)リアルタイムで記録および表示されます。膣の代表的な圧力直径試験は、外径タブに時間の関数として外径を示す表示されます。

Figure 6
図6:超音波イメージング。マウス生殖器官の超音波イメージング。すべての画像は、短軸Bモードで超音波システムを使用して撮影されました。荷を降ろした長さと圧力における膣の代表的な画像(A)。膣壁の厚さはImageJで計算した。深さスケール(mm)に沿って垂直線を描画し、μm あたりのピクセル数を調整しました。ポリゴン ツールを使用して、内側と外側の直径をトレースします。次に、トランスムラル線を描いて厚さを計算し、平均(B)を算出した。これを3回行った。荷を降ろした長さと圧力(C)での子宮頸部の代表的な画像。次に、壁の厚さは、画像Jとポリゴンツールを使用して、膣(D)と同様の方法で計算された。生殖複合体内では、外径は2つの異なる位置(E)で追跡されます。撮像プロセス全体を通して、トランスデューサは3Dプリントホルダー(F)によって安定化される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:膣検査の代表的な結果。膣基底および受動プロトコルの代表的な機械的検査結果。DMT システムによって得られたデータを使用すると、いくつかの機械的関係を導き出すことができます。A)基礎圧力直径, B)受動圧力直径, C)基礎力圧力, D)受動力圧, E)基礎周囲応力-周周ストレッチ, F)パッシブ周応力-円周ストレッチ、G)基底軸応力周ストレッチ、H)受動軸応力周ストレッチ。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:頸部検査の代表的な結果頸部基礎および受動プロトコルの代表的な機械試験結果。DMT システムによって得られたデータを使用すると、いくつかの機械的関係を導き出すことができます。A)基礎圧力直径, B)受動圧力直径, C)基礎力圧力, D)受動力圧, E)基礎周囲応力-周周ストレッチ, F)パッシブ周応力-円周ストレッチ、G)基底軸応力周ストレッチ、H)受動軸応力周ストレッチ。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

インビボ圧力 最大圧力 1/3 最大圧力 2/3 最大圧力 軸ストレッチ カニューレサイズ 推奨数
縫合糸の
7 mmHg 15 mmHg 5 mmHg 10 ミリガン -2%、生体内、+2% 3.75ミリメートル 2 -- "X"のファッションで
子宮 頸部 10 ミリガン 200 ミリガン 66 mmHg 133 ミリメートル -2%、生体内、+2% 子宮端のための0.75のmm
膣端のための3.75のmm
3つの水平縫合
子宮の端
上の4縫合糸
膣外付け os

表1:各臓器の機械的試験方法をスケーリングするための情報の要約。荷下ろし圧力値は、麻酔下での触媒法を用いて測定した(酸素100%で4%イソフルラン)。気球のカテーテルは、膣の測定および子宮頸部のための2Fカテーテルのために利用された。

子宮 頸部
基底
円周(kPa)
127.94 188
基底
軸(kPa)
56.8 75.44
パッシブ
円周(kPa)
246.03 61.26
パッシブ
軸(kPa)
112.74 19.26

表2:膣および子宮頸部の接線率表率表の代表的な結果。接線モジュリは、基底条件と受動条件の両方、および円周方向と軸方向の両方で計算されました。提供されるすべての測定はkPaの単位である。

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Discussion

この記事で提供されるプロトコルは、マウス膣および子宮頸部の機械的特性を決定する方法を提示する。このプロトコルで分析される機械的特性は、器官の受動的および基底調素状態の両方を含む。受動的および基底トーン条件は、器官が水没する生化学的環境を変化させることによって誘発される。このプロトコルでは、基底試験に関与する媒体にはカルシウムが含まれています。基底トーン条件を試験すると、女性の生殖器官54,55内の平滑筋細胞機械的寄与の単離が可能である。受動機械試験を行う場合、媒体はカルシウムを含まない。カルシウムの欠如は、収縮から平滑筋細胞を阻害します。.これにより、コラーゲンや弾性繊維などの他のECM成分の解明が可能となり、受動性の機械的特性が大きく左右されます。生化学的および組織学的分析と組み合わせることで、これらの結果はECM微構成と機械的機能との関係の解明を可能にする。これは、女性の生殖健康に関連する病理の構造的および機械的メカニズムの線引きを可能にする。

以前は、膣と子宮頸部は、単軸27、28で試験された。しかし、膣および子宮頸部は、対方性特性を示し、生体内29、30で多軸負荷を経験する。したがって、本明細書で使用される圧力筋グラフシステムは、生殖病理の病因の理解、ならびに潜在的な治療法のその後の設計を理解するのに役立つ多軸負荷に関する定量的情報を提供する。また、圧力筋造影は、生体内オルガン形状およびネイティブ細胞マトリックス相互作用56を維持しながら、多軸特性の評価を可能にする。生体内では、細胞は生体力学的および生化学的手がかり57、58、59の変化に応じて周囲のECMを積極的に改造する。本明細書で使用されるプロトコルは、生理学的に関連する条件下でバルク臓器特性の後続の変化のモニタリングを可能にするので有利である。これは、多軸アクティブおよびパッシブ機械的特性の系統的なデータセットを生成するためのプラットフォームを提供するのに役立ちます。さらに、これらの実験で収集されたデータは、微細構造的に動機付けられた非線形構成モデルを策定し、検証し、健康な女性の生殖器官の機械的応答を記述し、予測するために利用され得る。病理学的状態16,60.

プロトコルに有利であった追加のシステムコンポーネントは、臓器壁の厚さを測定するために超音波イメージングを使用していました。厚さは、テスト中に経験したストレスを計算するための重要な情報です。

実験的な設定では、この手順にはいくつかの制限があります。このプロトコルは現在、膣と子宮頸部の弾性応答のみを考慮し、粘弾性応答は考慮しない。将来的にこの制限を緩和する潜在的な方法は、クリープおよびストレス緩和アッセイ61を含むように既存のプロトコルを変更することです。第2の制限は、臓器が非圧縮性であると仮定することです。この研究の中で、厚さはアンロードされた構成でのみ測定され、非妊娠マウス組織を実証する以前の研究によって動機付けられ、浸透負荷62の間に体積の変化を最小限に抑える。さらに、さらなる研究は、非圧縮性44、60、63の同じ仮定の下で動作している。理想的には、非圧縮性の仮定の必要性を除去し、有限要素モデルをより良く知らせるために、実験全体に対して超音波が実行されます。最終的な制限は、ローディングプロトコルを通知する生体内頸部圧力で定量化されていないことです。文献は、人間の女性の子宮頸圧が37 mmHg53であることを示唆している。しかし、マウスはヒトとは異なる子宮頸圧を示す可能性がある。げっ歯類モデルとヒトサンプル64,65との間の膣圧の違いが実証された。非妊娠マウス子宮頸部の圧力を定量するためにさらなる研究が必要である。この目的に向かって、子宮内圧は最近妊娠49を通じて報告された。

この手順で利用される市販の圧力ミオグラフシステムは、弾性、中空器官の力特性を測定します。このプロトコルは、浴中の化学添加物、カニューレサイズ、縫合糸の厚さを改変することにより、他の様々な器官や組織に容易に適応可能です。

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Disclosures

なし。

Acknowledgments

この作品は、NSFキャリア賞助成金#1751050によって資金提供されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

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