Biaksiale basal tone og passiv testing av murine reproduktive system ved hjelp av en Pressure Myograph

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen benyttet et kommersielt tilgjengelig trykk myograph system for å utføre trykk myograph testing på murine vagina og cervix. Bruker Media med og uten kalsium, bidrag av glatt muskelceller (SMC) basal tone og passiv ekstracellulære matrise (ECM) ble isolert for organene under estimerte fysiologiske forhold.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den kvinnelige reproduktive organer, spesielt vagina og cervix, er sammensatt av ulike cellulære komponenter og en unik ekstracellulære matrise (ECM). Glatte muskelceller viser en kontraktile funksjon innenfor vaginal og cervical vegger. Avhengig av biokjemiske miljø og mekaniske distensjon av orgel veggene, de glatte muskelceller endre kontraktile forhold. Bidraget av den glatte muskelceller under Baseline fysiologiske forhold er klassifisert som en basal tone. Mer spesifikt, en basal tone er Baseline delvis innsnevring av glatte muskelceller i fravær av hormonelle og neural stimulering. Videre gir ECM strukturell støtte til orgel veggene og fungerer som et reservoar for biokjemiske signaler. Disse biokjemiske Stikkordene er avgjørende for ulike organ funksjoner, for eksempel oppfordre vekst og opprettholde homeostase. ECM av hvert organ består hovedsakelig av kollagen fibre (for det meste kollagen typer I, III og V), elastiske fibre, og glykosaminoglykaner/proteoglycans. Sammensetningen og organiseringen av ECM dikterer de mekaniske egenskapene til hvert organ. En endring i ECM sammensetning kan føre til utvikling av reproduktive patologi, slik som bekken orgel prolaps eller prematur cervical remodeling. Videre kan endringer i ECM-mikrostruktur og stivhet endre jevn muskel celle aktivitet og fenotype, noe som resulterer i tap av kontraktile kraft.

I dette arbeidet, de rapporterte protokollene brukes til å vurdere basal tone og passive mekaniske egenskaper av nonpregnant murine vagina og cervix på 4-6 måneders alder i estrus. Organene ble montert i et kommersielt tilgjengelig trykk myograph og både trykk-diameter og Force-lengde tester ble utført. Eksempel data og dataanalyse teknikker for mekanisk karakterisering av reproduktive organer er inkludert. Slik informasjon kan være nyttig for å konstruere matematiske modeller og rasjonelt designe terapeutiske intervensjoner for kvinners helse patologi.

Introduction

Den vaginal veggen består av fire lag, epitel, lamina propria, muscularis, og adventitia. Epitel er hovedsakelig sammensatt av epitelceller. Lamina propria har en stor mengde elastiske og fibrillær kollagen fibre. Muscularis er også sammensatt av elastin og kollagen fibre, men har en økt mengde glatte muskelceller. Adventitia består av elastin, kollagen og fibroblaster, riktignok i reduserte konsentrasjoner sammenlignet med tidligere lag. Den glatte muskelceller er av interesse for å biomekanisk motiverte forskningsgrupper som de spiller en rolle i kontraktile natur organer. Som sådan, Kvantifisere det glatte muskelen cellen område brøk og organisasjon er nøkkel å forståelse det mekanisk funksjonen. Tidligere undersøkelser tyder på at glatt muskel innhold i vaginal veggen er primært organisert i circumferential og langsgående aksen. Histologiske analyse tyder på at den glatte muskelområdet brøkdel er ca 35% for både proksimale og de flate delene av veggen1.

Livmorhalsen er en svært Collagenous struktur, som inntil nylig ble antatt å ha minimal glatt muskel celleinnhold2,3. Nyere studier har imidlertid antydet at glatte muskelceller kan ha en større overflod og rolle i livmorhalsen4,5. Livmorhalsen utstillinger en gradient av glatte muskelceller. Det indre OS behersker 50-60% glatte muskelen celler der hvor det ekstern OS bare behersker 10%. Mus studier imidlertid rapportere cervix å være sammensatt av 10-15% glatte muskelceller og 85-90% fiber bindevev uten omtale av regionale forskjeller6,7,8. Gitt at musen modellen er forskjellig fra den ofte rapporterte menneskelige modellen, videre undersøkelser om musen cervix er nødvendig.

Hensikten med denne protokollen var å belyse de mekaniske egenskapene til murine vagina og cervix. Dette ble gjort ved hjelp av en trykk myograph enhet som muliggjør vurdering av mekaniske egenskaper i circumferential og aksial retninger samtidig samtidig som innfødte celle-matrise interaksjoner og organ geometri. Organene ble montert på to tilpassede kanyler og sikret med silke 6-0 sting. Trykk-diameter testene ble utført rundt estimert fysiologisk aksial strekk for å bestemme samsvar og tangent moduli9. Force-lengde testene ble gjennomført for å bekrefte estimert aksial strekk og for å sikre at mekaniske egenskaper ble kvantifisert i det fysiologiske området. Den eksperimentelle protokollen ble utført på nonpregnant murine vagina og cervix på 4-6 måneders alder i estrus.

Protokollen er delt inn i to viktigste mekaniske test seksjoner: basal tone og passiv testing. En basal tone er definert som baseline delvis innsnevring av glatte muskelceller, selv i fravær av eksterne lokale, hormonelle, og neural stimulering10. Denne Baseline kontraktile natur vagina og cervix gir karakteristisk mekanisk adferd som deretter måles ved trykk myograph systemet. De passive egenskapene er vurdert ved å fjerne intercellulære kalsium som opprettholder den opprinnelige tilstanden av sammentrekning, noe som resulterer i avslapping av glatte muskelceller. I passiv tilstand, kollagen og elastin fibre gir den dominerende bidrag for mekaniske egenskaper av organene.

Den murine modellen brukes mye for å studere patologi i kvinners reproduktive helse. Musen har flere fordeler for å kvantifisere de utviklende relasjonene mellom ECM og mekaniske egenskaper innenfor reproduksjonssystemet11,12,13,14. Disse fordelene inkluderer korte og godt preget estrous sykluser, relativt lav kostnad, enkel håndtering, og en relativt kort svangerskaps tid15. I tillegg er det Genova av laboratoriet mus godt kartlagt og genetisk modifiserte mus er verdifulle verktøy for å teste mekanistisk hypoteser16,17,18.

Kommersielt tilgjengelige trykk myograph systemer brukes i stor utstrekning for å kvantifisere de mekaniske reaksjonene til ulike vev og organer. Noen bemerkelsesverdige strukturer analysert på trykk myographsystemet inkluderer elastisk arterier19,20,21,22, årer og vev konstruert vaskulær hud på23,24, spiserøret25, og den store tarmen26. Trykket myograph teknologien tillater samtidig vurdering av egenskaper i aksial og circumferential retninger samtidig opprettholde den innfødte Cell-ECM interaksjoner og in vivo geometri. Til tross for utstrakt bruk av myograph systemer i bløtvev og organ mekanikk, en protokoll utnytte trykket myograph teknologi hadde ikke tidligere blitt utviklet for vagina og cervix. Tidligere undersøkelser av mekaniske egenskaper i skjeden og cervix ble vurdert uniaxially27,28. Disse organene, men opplever multiaxial lasting i kroppen29,30, og dermed kvantifisere deres biaksiale mekanisk respons er viktig.

Videre antyder nyere arbeid glatte muskelceller kan spille en potensiell rolle i bløtvev patologi5,28,31,32. Dette gir en annen attraksjon for å utnytte trykket myograph teknologi, som det bevarer den innfødte celle-matrise interaksjoner, og dermed tillater avgrensning av bidraget som glatte muskelceller spille i fysiologiske og patofysiologiske Forhold. Heri, foreslår vi en protokoll for å kvantifisere multiaxial mekaniske egenskaper av vagina og cervix under både basal tone og passive forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nulliparous 4-6 måneder kvinnelige C57BL6J mus (29,4 ± 6,8 gram) ved estrus ble brukt for denne studien. Alle prosedyrer ble godkjent av instituttet Animal Care og use Committee ved Tulane University. Etter fødselen acclimated musene i en uke før døds aktiv og ble plassert under standard forhold (12-timers lys/mørke sykluser).

1. mus offer på estrus

  1. Bestem estrous syklusen: estrous syklusen ble overvåket av visuell vurdering i henhold til tidligere studier15,33,34. Den estrous syklus består av fire trinn: proestrus, estrus, metestrus, og diestrus. Under proestrus fasen kjønnsorganene er hovne, rosa, fuktig og krøllete. Den estrus fasen er rynkete, men mindre hoven, rosa og fuktig. Metestrus og diestrus er begge rapportert som viser ingen hevelse og rynker, mangler i en rosa nyanse, og tørr34,35.
  2. Utfør eksperiment på estrus: alle mekaniske tester ble utført mens musene var på estrus, da dette er lettest å visualisere og gir en konsistent og repeterbar timepoint.
  3. For mus som gjennomgår basal tone testing, euthanize via giljotinen. For mus som bare testes under passive forhold, euthanize ved hjelp av karbondioksid (CO2) inhalasjon. Den giljotinen tjener til å bevare funksjonen av glatte muskelceller av reproduktive tarmkanalen, som co2 gass endrer kontraktile egenskapene til glatt muskelceller36,37,38, 39,40,41,42. Det er viktig å utføre disseksjon innen 30 minutter for å minimere sjansen for celle apoptose.

2. Disseksjon av reproduksjonssystemet

  1. Sett opp: Plasser en absorberende pute på arbeidsstasjonen og fyll en Petri parabol og sprøyte med 4 ° c Hank ' s balansert salt Solution (HBSS) løsning. Bruk en tørk for fettvev avhending. Plasser musen ventrale side opp og tape poter og hale. Slå på mikroskopet lyser og satt ut mikro-saks, saks, to par rett pinsett, og to par buet pinsett.
  2. Ved hjelp av vinklet pinsett og saks, løft huden rundt magen og gjøre et snitt ved foten av magen, over skam beinet. Snittet skal være grunt nok til å ikke punktering av magemusklene veggen. Fortsett å bruke saksen til å skjære superiorly mot rib bur og dypt gjennom magemusklene.
  3. Fjern overfladisk fett ved å trekke lett på fettet med den buede pinsett og mikro-saks. Fettvev vil reflektere lys heterogeneously med en glitter-lignende utseende. Plasser alle fjernet fett og vev på tørk. Identifiser både livmor horn og kjønnshår benet.
  4. Plasser lukket saks mellom vaginal veggen og skam beinet. Forsiktig kutte midten av skam beinet (kjønnshår symphesis). Plasser buet pinsett på begge ender av kuttet skam beinet. Trekk begge kutt endene sidelengs for å gi bedre tilgang til reproduksjons organene.
  5. Fjern blæren og urinrøret fra vaginal veggen. Dette kan gjøres ved hjelp av rett pinsett og mikro-saks. Hold blæren med rett pinsett for å skape spenninger og bruke Butt disseksjon teknikker for å skille det omliggende vevet fra skjeden. Når blæren og urinrøret er dissekert bort, kutt basen og fjerne fra kroppen hulrom.
  6. Identifiser reproduksjonssystemet: livmor hornene bifurcate fra livmorhalsen. Livmorhalsen kan identifiseres fra skjeden på grunn av forskjeller i geometri og stivhet. Den ytre diameter av cervix er mindre enn vagina. Livmorhalsen er stivere enn vagina og føles som ligner på en perle (figur 1).
  7. Bruk blekk og markører for å markere 3 mm prikker langs organene. Start under eggstokkene på livmor rørene og Merk prikker forsiktig å nå livmorhalsen. Bruk sentrum livmorhalsen prikken å starte en prikk sti ned til vagina Introitus.
  8. La blekket tørke og skille reproduktive organer fra omkringliggende fettvev, bindevev, og kolon. Rengjør skjeden så nær vaginal Introitus som mulig. Ved hjelp av saks, kuttet rundt vaginal Introitus.
    Merk: det er mulig for organer å tørke ut under denne prosessen. Hvis dette er en bekymring, en sprøyte fylt med 4 ° c HBSS kan brukes til å legge fuktighet til organene.
  9. Skjær livmor hornene umiddelbart dårligere enn eggstokkene. Merk at organene vil trekke fra innlegget explant lengde som bindevev er fjernet og organ tilbakestøt. Plasser dissekert reproduktive organer i en Petri rett fylt med 4 ° c HBSS. Denne endringen i lengde kan brukes for beregning av anslått in vivo lengde (avsnitt 5).
    Merk: vi har identifisert at bruk av HBSS ved denne temperaturen under disseksjon og kanyleringen ikke påvirker glatt muskel celle levedyktighet. Opprettholde en pH på 7,4, derimot, er avgjørende for å opprettholde levedyktigheten til den glatte muskelceller. Ved denne temperaturen har HBSS en pH-grad på 7,4.
  10. Etter en 15 minutters likevekts periode i 4 ° c HBSS, måler du mellomrommet mellom prikkene ved hjelp av markører. Registrer målingene for hver avstand i et regneark. Disse verdiene vil bli brukt til å beregne in vivo stretch ratio (opprinnelig lengde/eksplanterte lengde).
  11. Still inn tørk som inneholder det kasserte vevet på abdominal region med overflødig vev vendt innsiden av musen og sug til tørk i 4 ° c HBSS. Vikle musen og overflødig vev i folie og plasser i en fryseboks trygg pose som skal oppbevares ved-20 ° c. Passiv mekanisk atferd på vagina ble ikke funnet å være signifikant forskjellig etter en fryse-tine syklus43. Alle organer testet ble brukt umiddelbart etter døds aktiv eller etter en fryse-tine syklus.

3. Cannulating

  1. Bestem riktig kanyle størrelse for organ type. I en typisk C57BL6J mus, skjeden bruker kanyler som er både 3,75 mm i diameter og naglet. Livmorhalsen bruker en kanyle som er 3,75 mm for vaginal enden og en kanyle 0,75 mm i diameter for livmor enden (figur 2) den 0,75 mm kanyle er glatt.
    Merk: diameter størrelsene betegnet ovenfor brukes for typiske nulliparous 4-6 måneder C57BL6 mus, C57BL6 x 129SvEv, og nonparous mus i alderen 7-9 måneder. Men visse omstendigheter, for eksempel prolaps eller graviditet, kan kreve en større størrelse kanyle.
  2. Med hvert organ monterer du livmorhalsen på Force svinger delen av den kanyleringen enheten. Monter den motsatte enden av orgelet (vaginal eller livmor) på den mikrometer delen av enheten. Stram begge ender med sting.
  3. På grunn av forskjellen i tykkelse og grad av contractility blant vagina og cervix, varierende teknikker kan utnyttes til å utføre de mest effektive kanyleringen. For vagina, sted 2 sting i mellom 2nd og 3Rd nagler av kanyle i en "X" Fashion. Når cannulating i livmorhalsen, er kanyle ikke naglet så orgelet er best plassert på baksiden av kanyle med 3 horisontale sting på livmor enden og 4 sting på det eksterne operativsystemet. For begge organene bør maksimal lengde ikke være mer enn 7 mm mellom sting (Figur 3).

4. Trykk myograph satt opp

  1. For å sette opp trykket myograph systemet, slå på test systemet og fylle beholderen flasken med 200 mL HBSS (Figur 4). Snu varmen til "på" og la HBSS i reservoaret flasken å varme opp. Deretter slår du på mikroskopet og åpner dataprogrammet. Sørg for at bildet av kanylert organ, trykk grensesnitt, strømningsmåler opplesninger, og Sequencer funksjonen verktøyet er alle synlige (figur 5).

5. basal tone mekanisk testing

Merk: livmorhalsen utstilt en phasic natur i begynnelsen stadier av testing. Men dette redusert etter preconditioning. Basal tone testing er gjort utnytte Krebs ringer buffer (KRB) i bassenget på DMT enheten. Bufferen er luftet med 95% O2 og 5% co2. Etter basal tone delen er fullført, er kalsium gratis KRB utnyttet.

  1. Finne losset geometri: strekk orgelet slik at veggen ikke er i spenning. For vagina, observere sporene på vaginal veggen. For livmorhalsen, kuttet rett under blekk prikkene som ligger over og under den sentrale cervix merke. Dette devises en repeterbar metode for en cervical in situ-lengde på 6 mm44. Mål lengden fra Sutur til Sutur med markører
  2. Finne losset trykk (opp): øke trykket fra 0 til 10 mmHg i trinn på 1 mmHg. Bestem trykket der orgelet er ikke lenger kollapset. Dette kan fastslås som det største hoppet i den ytre diameter ved et gitt trykk, som utstilt på programmet skjermen. Etter innspillingen trykket og ytre diameter, Merk dette som det første punktet hvor orgelet ikke er kollapset og null kraften.
  3. Beregnet in vivo stretch: Beregn estimert in vivo stretch ved å dele lengden målt i vivo med lengden målt post explant:
    Equation 1
  4. Trykk-diameter pre-condition: sett trykket til 0 mmHg, lengden til estimert in vivo lengdeEquation 2og gradient til 1,5 mmHg/s. Kjør en sekvens som tar trykket fra 0 mmHg til in vivo-trykket + losset (tabell 1), hold i 30 sekunder, og ta trykket til 0 mmHg med en 30 sekunders Hold periode. Etter gjentatt for totalt 5 sykluser, trykk Stopp i dataprogrammet og lagre filen.
  5. Finne den eksperimentelle in vivo strekk: Juster orgelet å være på anslått i vivo lengde mens ved losset trykk og trykk Start. Vurder trykk kontra kraft verdier for Trykk verdier som strekker seg fra det losset trykket til maksimums trykket (tabell 1). Trykk på Stopp -knappen i dataprogrammet og lagre filen.
    Merk: den målte strekk verdien beregnes in situ. Dette er ledsaget av begrensningen at det bare kan måles etter disarticulating kjønnshår symphesis. Som et resultat, den naturlige tethering er tapt, som kan endre lengden. Den teoretiske strekningen, derimot, er basert på den tidligere innførte teorien om at orgelet vil oppleve minimale endringer i kraft når de utsettes for fysiologisk press for å spare energi45. I protokollen, den målte in vivo strekningen vil være strekningen verdien beregnes ved hjelp av eksperimentelt identifisert lengde hvor det er minimal endring i kraft når de utsettes for et fysiologisk spekter av trykk.
  6. Trykk-diameter pre-condition: sett trykket til 0 mmHg, lengden til den eksperimentelle in vivo lengde, og gradient på 1,5 mmHg/s. Kjør en sekvens som tar trykket fra 0 mmHg til maksimal trykk + opp, hold i 30 sekunder, og tilbake til 0 mmHg med en annonse betinget 30 sekunders holde periode. Etter å ha gjentatt dette for totalt 5 sykluser, trykk på Stop -knappen i programmet grensesnittet og lagre filen.
    Merk: 5,4 er avgjørende for å oppnå en mer konsistent aksial styrke avlesning med økende trykk. Dette trinnet hjelpemidler for å finne riktig in vivo Stretch, som ofte undervurderes basert på visuelle stikkord. 5,6 fungerer som et sikkerhetstiltak for å minimere hysterese og oppnå en konsistent, repeterbar, matematisk interpretable respons av orgelet.
  7. Force-lengde pre-condition: Angi 1/3 maks trykk + UP for både innløp og utløp trykk. Juster orgelet til-2% av in vivo lengde og trykk Start. Juster lengden til + 2% in vivo lengde deretter ned til-2% ved 10 μm/s. Gjenta aksial forlengelse for totalt 5 sykluser. Trykk på Stop i dataprogrammet og lagre filen.
  8. Likevekts: med orgelet på den fastsatte in vivo lengde, sett både innløp og utløp trykk ved 1/3 av maksimal trykk + UP. Likevekt orgelet i 10 minutter. Sakte bringe begge trykk ned igjen til 0 mmHg med gradient satt som 1,5 mmHg/s.
  9. Evaluer geometrien som ikke er lastet inn på nytt: sett orgelet til in vivo-lengde og trykket til det losset trykket. Reduser aksial lengden mot estimert losset lengde med en hastighet på 10 μm/s til det er minimal endring i kraft. Denne tilsvarende lengde er kjent som losset lengde, eller hvor orgelet ikke er i spenning eller kompresjon. Før nullstilling av kraften, ta opp losset lengde, ytre diameter og kraftverdi.
    Merk: den tidligere losset geometri ble bestemt av visuelle signaler, som er rent kvalitative. En ny evaluering er nødvendig for en kvantitativ metode og for å gjøre rede for mulige endringer i lengden som kan forekomme under preconditioning. Denne geometrien vil bli brukt i avsnitt 8.
  10. Ultralyd oppsett: Bruk den generelle Imaging abdominal pakken for å visualisere organene i test enheten. (Figur 6). Før testing, minimere artefakter fra bunnen av trykket myograph metall bassenget. Juster kanyle til en høyde som er den maksimale avstanden fra bunnen med vevet fortsatt fullstendig nedsenket i test løsningen. En egendefinert holder er 3D-trykt for å stabilisere svingeren i vertikal posisjon under bildebehandling.
  11. Ultralyd avbildning: Identifiser kanyle nær kraft svingeren, og Juster scenen i mikroskopet til bildet langs lengden av vevet. Gjennom hele testprosessen spores den midtre regionen langs lengden (figur 6a, C). Etter Imaging, se bildet "Cine store" loop som består av en serie med B-modus rammer og identifisere rammen med den største ytre diameter. Tykkelsen beregningene som er gjort vil bli brukt i punkt 8.
  12. Testing av trykk diameter (-2% in vivo lengde): Trykk Start og Juster orgelet slik at det er-2% av in vivo lengde, sette trykket til 0 mmHg og gradient til 1,5 mmHg/s. Øk trykket fra 0 mmHg til maksimalt trykk. Bring presset tilbake ned til 0 mmHg med en 20 sekunders Hold periode. Gjenta dette i 5 sykluser.
  13. Testing av trykk diameter (in vivo-lengde): Trykk Start og Juster orgelet slik at det er på vivo-lengde, sett trykket til 0 mmHg, og gradient til 1,5 mmHg/s. Øk trykket fra 0 mmHg til maksimalt trykk. Bring presset tilbake ned til 0 mmHg med en 20 sekunders Hold periode. Gjenta dette i 5 sykluser.
  14. Testing av trykk diameter (+ 2% in vivo-lengde): Juster orgelet slik at det er + 2% i vivo-lengde, sett trykket til 0 mmHg og gradering til 1,5 mmHg/s. Øk trykket fra 0 mmHg til maksimalt trykk og deretter tilbake til 0 mmHg med en 20 sekunders Hold periode. Gjenta dette i 5 sykluser. Trykkdata fra alle tre lengder vil bli brukt i avsnitt 8.
  15. Kraft-lengde testing (nominell trykk): sett trykket til losset trykk og organ til-2% av in vivo lengde. Strekk orgelet til + 2% av in vivo lengde og gå tilbake til-2% i in vivo lengde med hastighet på 10 μm/s. Gjenta for totalt 3 sykluser.
  16. Kraft-lengde testing (1/3 maksimal trykk + opp): sett trykket til 1/3 av maksimal trykk + opp og justere orgelet til-2% i in vivo lengde. Etter å ha trykket Start, strekk orgelet til + 2% i in vivo lengde og tilbake til-2% i in vivo lengde med en hastighet på 10 μm/s. Etter gjentatt for totalt 3 sykluser, trykk Stopp og lagre dataene.
  17. Kraft-lengde testing (2/3 maksimal trykk + opp): sett trykket til 2/3 av maksimal trykk + opp og justere orgelet til-2% i in vivo lengde. Trykk Start og strekk orgelet til + 2% i in vivo lengde og tilbake til-2% i in vivo lengde med en hastighet på 10 μm/s. Etter gjentatt for totalt 3 sykluser, trykk Stopp og lagre dataene.
  18. Kraft-lengde testing (maksimal trykk + opp): sett trykket til maksimal trykk + opp og Juster orgelet til-2% i in vivo lengde. Med en hastighet på 10 μm/s, strekk orgelet til + 2% av in vivo lengde og tilbake til-2% av in vivo lengde. Etter gjentatt for totalt 3 sykluser, lagre dataene. Alle kraftdata vil bli brukt i avsnitt 8.
  19. Fjern KRB testing Media og vask med kalsium-fri KRB. Erstatt Media med kalsium fri KRB løsning supplert med 2 mM EGTA. Ruge vevet i 30 minutter. Fjerne oppløsningen og ombytte mediet med frisk kalsium-ledig KRB.

6. passiv mekanisk testing

Merk: Hvis du starter med passiv testing, starter du på trinn 1. Hvis basal tone testingen ble utført før passiv start på trinn 6. Hvis du starter med frosset vev, la en 30-minutters likevekts periode ved romtemperatur før cannulating orgelet.

  1. Finne losset geometri: strekk orgelet slik at veggen av orgelet er ikke i spenning. Mål det kanylert organ fra Sutur å Sutur og fortegnelse denne idet det losset lengden.
  2. Finne losset trykk: etter å ha trykket Start, øke trykket fra 0 til 10 mmHg i trinn på 1 mmHg. Mens du går gjennom denne prosessen, bestemme trykket der orgelet er ikke i spenning. Ved hjelp av dataprogram Monitor, kan dette bestemmes fra det største hoppet i ytre diameter. Etter nullstilling kraften, ta opp dette trykket så vel som den ytre diameter og Merk dette som det første punktet der orgelet ikke er kollapset.
  3. Beregnet in vivo stretch: Beregn estimert in vivo stretch ved å dele lengden målt i vivo med lengden målt etter explant.
  4. Trykk diameter pre-condition: etter å ha trykket Start, sette trykket satt til 0 mmHg, lengden som anslått i vivo lengde, og gradient til 1,5 mmHg/s. Begynn å kjøre en sekvens som tar trykket fra 0 mmHg til maksimalt trykk og tilbake til 0 mmHg. Gjenta denne prosessen gjennom 5 sykluser med en 30 sekunders hold tid.
  5. Force-lengde preconditioning: Juster organ til in vivo lengde og manuelt angi losset trykk i dataprogrammet for begge trykk. Etter å ha trykket Start, angi gradient til 2 mmHg og trykket til 1/3 av maksimum. Strekk orgelet opp til + 2% og ned igjen til-2% strekk på 10 μm/s. Gjenta denne syklusen for totalt 5 ganger og trykk Stopp.
  6. Finne den eksperimentelle in vivo lengde: Finn og plot kraft verdier på-2% av in vivo lengde, in vivo lengde, og + 2% av in vivo lengde. Ta styrker med jevnt fordelte trykk som strekker seg fra 0 mmHg til maksimalt trykk. Den eksperimentelle in vivo strekningen vil være strekningen verdi som viser en relativt flat linje over en rekke trykk.
  7. Gjenta trykket diameter og aksial pre-condition trinn på den nye in vivo lengde.
  8. Likevekts: med orgelet på den fastsatte in vivo lengde, angi innløp og utløpstrykk til losset trykk. La orgelet re-likevekt i 15 minutter. Etter 15 minutter, sakte bringe innløp og utløp press tilbake ned til 0 mmHg.
  9. Re-evaluere losset konfigurasjon: Bring orgelet til losset lengde og re-anslå losset lengde. Ta opp den losset lengden og den ytre diameteren mens trykket er 0 mmHg, det losset trykket og 1/3 det maksimale trykket. Null styrken ved losset trykk. Diameteren ved losset trykk er in vivo diameter.
    Merk: re-estimering av losset lengde er nødvendig som små plast deformasjoner ble observert tidligere i myke biologiske vev etter preconditioning. Denne konfigurasjonen som ikke er lastet inn, vil være den som brukes i punkt 8.
  10. Ultralyd: Utfør ultralyd B-modus avbildning ved losset lengde og trykk.
  11. Testing av trykk diameter: med orgelet på-2% av eksperimentelt bestemmes i vivo-lengde og trykket ved 0 mmHg, trykk Start. Øk trykket fra 0 mmHg til maksimalt trykk og tilbake til 0 mmHg. Hold 2-0 mmHg-trinnet i 20 sekunder. Etter å ha gjentatt for totalt 5 ganger, trykker du på Stopp -knappen i grensesnittet og lagre filen.
    Merk: Gjenta ved eksperimentell in vivo lengde, + 2% av den eksperimentelle i vivo lengde.
  12. Kraft-lengde testing: sett trykket til nominell trykk og justere organ til-2% av in vivo lengde. Strekk orgelet opp til + 2% av in vivo-lengden og tilbake til-2% av in vivo-lengden med en hastighet på 10 μm/s. Når du har gjentatt for totalt 3 ganger, lagrer du dataene. Gjenta dette for 1/3 maks trykk, 2/3 maks trykk, og ved maks trykk.
  13. Beregn tykkelsen på losset fra ultralydbilder B-modus-bilde. Bruke bildebehandlingsprogramvare, tegne en linje for å betegne penetrasjon dybden. Sett skalaen til lengden av linjen (dvs. 2000 μm som vist i figur 6b og 6D).
  14. Veggtykkelse beregninger: ved hjelp av en datamaskinprogramvare, spore og måle den indre og ytre diameter av orgelet. Deretter tegner og måler du en linje mellom diameteren. Tegn totalt 25 transmuralt linjer. Gjennomsnittlig alle datapunkter og gjenta for totalt 3 ganger.

7. Rydd opp

  1. Kontroller at trykket er 0 mmHg og slått av. Lukk hoved innløpet og uttaket for begge treveis ventilene. Aspirer den resterende væsken fra bassenget på den kanyleringen enheten.
  2. Fjern orgelet fra scenen og fyll beholderen flasken med deionisert vann. Bruk en sprøyte og skyll kanyle med vann. Koble slangen til å omgå kanyle.
  3. Drei trykket og strømmen på, sett innløps trykket til 200 mmHg, utløpstrykket til 0 mmHg, gradient til 10 mmHg/s, og la flyten kjøre i 5 minutter. La systemet kjøre mens beholderen flasken er tom og la luften kjøre i 5 minutter eller til linjene er tørre.

8. data analyse

  1. For Trykk diameter testing, samle inn data fra der trykket begynner å øke fra minimumsverdien til det maksimale. For kraft-lengde testing, samle inn data fra like under den maksimale Peak i kraft inntil kraft stoppet synkende.
  2. Åpne datafilen for hver test av trykk diameter og velg kategorien for gjennomsnittlig trykk. Naviger til innlastings området for den siste kurven, 0 mmHg til maksimums trykket, og slipp dataene inn i et regneark. Velg samme område på den ytre diameter, innløpstrykk, utløpstrykk, kraft, temperatur, pH, og Flow tab plassere hvert element i samme dokument.
  3. Åpne dataene for hver test av kraft lengde. Naviger til lasting regionen av kurven,-2% til + 2%, og dra og slippe dataene inn i et regneark. Velg samme område for de andre målte variablene, og Plasser hvert element i det samme regnearket.
  4. For Trykk diameter og kraft lengde test subtrahere opp fra alle trykk verdier.
  5. Gjennomsnittlig data for Trykk diameter hver 1 mmHg (dvs. 0 +/-0,5, 1 +/-0,5, 2 +/-0,5).
  6. Finn det losset volumet på orgelet (V). Ligning 1 kan benyttes til å finne V, gitt at R02 er losset ytre radius målt ved mikroskopet, L er losset lengde, og H er losset tykkelse som oppdages av ultralyd. Forutsetningen for incompressibility er utnyttes, noe som betyr at orgelet sparer volum mens utsatt for deformasjoner.
    Merk: lengden på losset måles med Sutur til Sutur. Diameteren med losset måles via mikroskopet, kameraet og programvaren, etterfulgt av beregning av radiusen (figur 5) tykkelsen på losset er beregnet fra ultralyd bildene (figur 6).
    Equation 3Ligning 1
  7. Ved hjelp av forutsetningen om incompressibility, bruk losset volum, deformert ytre radius (Equation 4), og lengde (Equation 5) for å bestemme den deformert indre Equation 6 radius.
    Equation 7Ligning 2
  8. Bruk likninger 3, 4 og 5 for å beregne hvert stress, henholdsvis. I ligninger 3-5 er P definert som intraluminal trykk og Ft er kraften målt av svingeren.
    Equation 8Ligning 3
    Equation 9Ligning 4
    Equation 10Formel 5
  9. Plot press-diameter forholdet, makt-press forholdet, circumferential stress-circumferential stretch forhold, og aksial stress og circumferential strekk verdier (figur 7, figur 8). Strekk verdiene kan beregnes ved hjelp av midwall radius. Beregninger av circumferential og aksial påkjenninger kan bli funnet i ligninger 6 og 7, henholdsvis.
    Equation 11Ligning 6
    Equation 12Ligning 7
  10. Beregn samsvar nær det fysiologiske trykk området og ved in vivo stretch. Nedre trykk grense (LPB) er 1 standardavvik under gjennomsnittlig målt trykk. Øvre trykk grense (UPB) er 1 standardavvik over gjennomsnittlig målt trykk9.
    Equation 13
  11. Beregn tangent moduli for å kvantifisere materialets stivhet. Identifiser beregnet circumferential stress som tilsvarer den nedre trykk bundet og øvre bundet trykk. Tilpass en lineær linje til den circumferential circumferential strekk kurven innenfor det identifiserte stress området på in vivo-lengden. Beregn stigningstallet for linje9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket analyse av mekaniske egenskaper av de kvinnelige reproduktive organer er betinget av hensiktsmessig organ disseksjon, kanyleringen, og testing. Det er viktig å explant livmor hornene til skjeden uten defekter (figur 1). Avhengig av organ type, vil kanyle størrelse variere (figur 2). Kanyleringen må gjøres slik at orgelet ikke kan bevege seg under eksperimentet, men heller ikke skade veggen av orgelet under prosedyren (Figur 3). Unnlatelse av enten trinn vil resultere i manglende evne til fartøyet å holde trykket. Testing prosedyre standardisering er avgjørende for suksessen til protokollen for å gi konsistente og repeterbar resultater.

Når orgelet er dissekert og kanylert riktig, makt på trykk myograph systemet. Oppsettet av trykk myograph systemer omfatter en kontroller enhet, strømningsmåler og trinn (Figur 4). Trykk myograph systemet brukes til å overvåke ulike aspekter av orgelet som gjennomgår mekanisk testing (figur 5). Et ultralydsystem, eller tilsvarende, brukes til å måle tykkelsen av organene i losset tilstand med og uten basal tone (figur 6). Etter mekanisk testing, kan tangent moduli beregnes for circumferential og aksial retninger (tabell 2).

Både basal tone testing og passiv testing yield viktige mekaniske egenskaper av reproduktive tarmkanalen, med og uten kontraktile bidrag av glatte muskelceller (figur 7, figur 8). Skalering mellom organene krever noen justeringer av protokollene (tabell 1), som cervix og vagina oppleve forskjellige belastninger i vivo46-48. Slike variasjoner kan overvåkes gjennom teknikker som trykk catherization. Pressure catherization er en metode som brukes tidligere for å overvåke in vivo forhold i skjeden og livmoren49-53. Modeller i tidligere studier spenner fra mus, kaniner, og mennesker. De samme prinsippene ville gjelde på samme måte som livmorhalsen og vaginal trykket som er spesifikk for murine modellen. Selv om, uansett hvilket organ blir testet, de samme materialene er nødvendig for protokollene (tabell 3).

Figure 1
Figur 1: murine disseksjon diagram. Musen disseksjon for reproduktive organer: både livmor horn, cervix, og vagina. I figuren, blæren og urinrøret er fjernet fra fremre av skjeden. Tarmen og magemusklene ble reflektert superiorly. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: størrelses sammenligning av de to kanyle. Størrelses sammenligning av de to kanyler som brukes for kanyleringen av reproduktive organer. De større kanyle (D = 3,75 mm) brukes for vaginal vevet (A). De mindre kanyle (D = 0,75 mm) brukes til cannulating cervical tissue (B). Cervical kanyle er glatt mens vaginal kanyle har to grooves. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kanyleringen metode for vagina og cervix. På grunn av den varierende geometri og tykkelse av reproduktive organer, de er mest effektivt kanylert i distinkte manerer. For skjeden, plasserer to sting i en "X" mote. Når cannulating livmorhalsen, sted 3 horisontale sting på livmor enden og 4 sting på det eksterne operativsystemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Bilde 4: oppsett for Trykk myograph enhet. Oppsettet av DMT enheten benyttes for både basal og passiv testing. DMT er sammensatt av tre viktigste huber: scenen (A), Controller enhet (B), og Flow meter (C). Innenfor kontrolleren enheten, er det en reservoar flaske og en avfalls flaske. Beholderen flasken er i utgangspunktet fylt med væske som tømmer som eksperimentet er utført. Avfallsflasken, som i utgangspunktet er tom, samler væsken som går gjennom eksperimentet. Kontrolleren enhet grensesnitt med DMT programvare på datamaskinen og styrer trykk, temperatur og flyt. Kontrolleren enheten leser utganger fra kraft og trykk transdusere i scenen gjennom en VGA-grensesnittkabel. Scenen komponenten av systemet inneholder en innløp og utløp flyt av systemet. Inntaks-og utløps flyten har tilsvarende innløps-og utløpstrykk målt av systemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: fil oppsett på trykk myograph programmet. Visning av oppsett av datamaskinprogramvare. En boks er trukket rundt regionen av interesse og ytre diameter av vevet er optisk spores i sanntid (A). Data innhentet under mekanisk testing registreres og vises i sanntid i ytre diameter, inntakstrykk, utløpstrykk, gjennomsnittlig trykk, kraft, temperatur, pH, og Flow Tab (B). Innenfor trykk grensesnittet trykk (mmHg), gradient (mmHg/s), og flyt er kontrollert. Videre vises aksial styrken (mN) målt av in-line Force svingeren. Strømningshastighet (μL/min) rapporteres i fliken for strømningsmåleren (C). Trykk sekvensering vises og styres i Sequencer kategorien (D). Data som registreres under mekanisk testing registreres og vises i sanntid i ytre diameter, inntakstrykk, utløpstrykk, gjennomsnittlig trykk, kraft, temperatur, pH og strømnings fane (E). En representant trykk diameter test av skjeden vises viser ytre diameter som en funksjon av tid på den ytre diameter kategorien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: ultralyd bildebehandling. Ultralyd avbildning av murine reproduktive organer. Alle bilder ble tatt ved hjelp av ultralydsystemet på kort-akse-B-modus. En representativ bilde av skjeden ved losset lengde og trykk (A). Vaginal veggtykkelse ble beregnet i ImageJ. En vertikal linje ble tegnet langs dybde skalaen (mm) for å kalibrere antall piksler per μm. Polygonverktøyet ble brukt til å spore den indre og ytre diameter. Deretter ble transmuralt linjer trukket for å beregne tykkelsen og gjennomsnittet (B). Dette ble utført 3 ganger. En representativ bilde av livmorhalsen ved losset lengde og trykk (C). Veggtykkelse ble deretter beregnet ved hjelp av bilde J og polygonverktøyet på en lignende måte som i skjeden (D). Innenfor reproduksjons komplekset spores den ytre diameteren på to forskjellige steder (E). Gjennom hele bilde prosessen stabiliseres svingeren med en 3-D trykt holder (F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: representative resultater for vaginal testing. Den representative mekaniske testresultater av vaginal basal og passive protokoller. Med data innhentet av DMT-systemet, kan flere mekaniske forbindelser utledes. A) basal trykk diameter, B) passiv trykk diameter, C) basal kraft trykk, D) passiv kraft trykk, E) basal circumferential circumferential strekk, F) passiv circumferential stress-circumferential Stretch, G) basal aksial stress-circumferential Stretch, H) passiv aksial stress-circumferential strekk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: representative resultater for livmorhals testing. Den representative mekaniske testresultater av cervical basal og passive protokoller. Med data innhentet av DMT-systemet, kan flere mekaniske forbindelser utledes. A) basal trykk diameter, B) passiv trykk diameter, C) basal kraft trykk, D) passiv kraft trykk, E) basal circumferential circumferential strekk, F) passiv circumferential stress-circumferential Stretch, G) basal aksial stress-circumferential Stretch, H) passiv aksial stress-circumferential strekk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I vivo-trykk Maksimalt trykk 1/3 maks trykk 2/3 maks trykk Aksial strekk Kanyle størrelse Anbefalt nummer
av sting
Vagina 7 mmHg 15 mmHg 5 mmHg 10 mmHg -2%, in vivo, + 2% 3,75 mm 2--i en "X" mote
Livmorhalsen 10 mmHg 200 mmHg 66 mmHg 133 mmHg -2%, in vivo, + 2% 0,75 mm for livmor ende
3,75 mm til vaginal ende
3 horisontale sting på
livmor enden
4 sting på
vaginal eksterne OS

Tabell 1: oppsummering av informasjon for skalering av mekaniske testmetoder for hvert organ. De losset trykkverdiene ble målt ved hjelp av catherization teknikker under anestesi (4% isoflurane i 100% oksygen). En ballong kateter ble benyttet for vaginal målinger og en 2F kateter for livmorhalsen.

Vagina Livmorhalsen
Basal
Circumferential (kPa)
127,94 188
Basal
Aksial (kPa)
56,8 75,44
Passiv
Circumferential (kPa)
246,03 61,26
Passiv
Aksial (kPa)
112,74 19,26

Tabell 2: representative resultater for tangent moduli i skjeden og cervix. Tangent moduli ble beregnet for både basale og passive forhold, samt for både circumferential og aksial retninger. Alle målinger som er angitt, er i enheter av kPa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som tilbys i denne artikkelen presenterer en metode for å bestemme de mekaniske egenskapene til murine vagina og cervix. De mekaniske egenskapene analysert i denne protokollen omfatter både passiv og basal tone forholdene i organene. Passive og basale tone forhold er indusert ved å endre det biokjemiske miljøet som orgelet er neddykket. For denne protokollen inneholder Media som er involvert i basal testing kalsium. Testing av basal tone tilstand tillater isolering av glatt muskel celle mekanisk bidrag innenfor kvinnelige reproduktive organer54,55. Når du utfører passiv mekanisk testing, inneholder ikke mediet kalsium. Mangelen på kalsium hemmer den glatte muskelceller fra kontraktørselskaper. Dette tillater elucidation av andre ECM-komponenter, slik som kollagen og elastiske fibre, som i stor grad dikterer de passive mekaniske egenskaper. Kombinert med biokjemiske og histologiske analyse, disse resultatene tillater elucidation av relasjoner mellom ECM mikrostrukturelle sammensetning og mekanisk funksjon. Dette gjør det mulig for avgrensning av strukturelle og mekaniske mekanismer av patologi som er relevante for kvinners reproduktive helse.

Tidligere, vagina og cervix ble testet uniaxially27,28. Skjeden og cervix, men demonstrere Anisotrop egenskaper og erfaring multiaxial lasting i vivo29,30 . Derfor, trykk myograph systemer som brukes her gir kvantitativ informasjon om multiaxial lasting som kan hjelpe til å forstå årsaker av reproduktive patologi, samt den påfølgende utformingen av potensielle behandlinger. Videre, trykk myography tillater vurdering av multiaxial egenskaper samtidig bevare in vivo orgel geometri og den innfødte celle-matrise interaksjon56 . In vivo, cellene aktivt renovere den omliggende ECM som svar på endringer i biomekaniske og biokjemiske stikkordene57,58,59. Protokollen som brukes her er fordelaktig som det tillater overvåking av påfølgende endringer i bulk orgel egenskaper under fysiologisk relevante forhold. Dette hjelpemidler i å tilby en plattform for å generere systematiske datasett av multiaxial aktive og passive mekaniske egenskaper. Videre kan de innsamlede dataene i disse eksperimentene utnyttes til å formulere og validere microstructurally ikke-lineære konstituerende modeller for å beskrive og forutsi den mekaniske reaksjonen til de kvinnelige reproduktive organene i friske og patologiske tilstander16,60.

En ekstra systemkomponent som var en fordel for protokollen var bruken av ultralyd avbildning for å måle tykkelsen på orgel veggene. Tykkelsen er viktig informasjon for å beregne stress oppleves mens gjennomgår testing.

Med noen eksperimentelle satt opp, er det noen begrensninger på denne prosedyren. Denne protokollen for tiden bare vurderer elastisk respons av vagina og cervix og ikke viskoelastiske respons. En potensiell metode for å redusere denne begrensningen i fremtiden er å endre den eksisterende protokollen til å omfatte krype og stress avslapping analyser61. En annen begrensning er forutsatt at organene er incompressible. Innenfor denne studien, tykkelse ble utelukkende målt ved losset konfigurasjonen, som motivert av tidligere studier som viser nonpregnant murine vev utstillinger minimale endringer i volum under osmotisk lasting62. Videre har ytterligere studier operert under samme forutsetning av incompressibility44,60,63. Ideelt sett vil en ultralyd utføres for helheten av eksperimentet for å fjerne behovet for incompressibility forutsetning og for å bedre informere endelig element modeller. En endelig begrensning er mangelen på kvantifisert in vivo cervical press for å informere lasting protokollene. Litteraturen tyder på at cervical press i menneskelige kvinner er 37 mmHg53. Mus, men kan vise forskjellige cervical press fra det av mennesker. En forskjell i vaginal rykket ble demonstrert mellom gnagere modeller og menneskelige prøver64,65. Videre studier er nødvendig for å kvantifisere trykket i ikke-gravide murine cervix. Mot dette formål, intra-livmor Press ble nylig rapportert gjennom graviditet49.

Det kommersielt tilgjengelige trykk myograph systemet som benyttes i denne prosedyren måler kraft egenskapene til elastiske, hule organer. Denne protokollen er lett tilpasses til andre ulike organer og vev ved å endre den kjemiske tilsetningsstoffer i badekaret, kanyle størrelse, og Sutur tykkelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Arbeidet var finansiert av NSF CAREER Award Grant #1751050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
  2. Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53, (4), 541-560 (1947).
  3. Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
  4. Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75, (2), 240-243 (1990).
  5. Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215, (4), e471-e478 (2016).
  6. Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23, (23), 907-912 (2014).
  7. Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43, (43), 433-439 (2000).
  8. Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
  9. Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140, (5), (2018).
  10. Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. The McGraw-Hill Companies. (2006).
  11. Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
  12. Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143, (4), 429-438 (2012).
  13. Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193, (3), 1149-1155 (2005).
  14. Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24, (7), 838-849 (2017).
  15. Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27, (2), 327-339 (1982).
  16. Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92, (2), 287-295 (2011).
  17. Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224, (1), 33-44 (2011).
  18. Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198, (5), (2009).
  19. Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12, (108), 20150280 (2015).
  20. Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
  21. Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49, (8), 867-879 (2011).
  22. Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44, (10), 1941-1947 (2011).
  23. Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11, (9), 1419-1428 (2003).
  24. Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
  25. Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9, (12), 9379-9391 (2013).
  26. Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32, (12), 1969-1982 (2011).
  27. Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13, (3), 317-337 (2010).
  28. Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120, (2), 224-232 (2012).
  29. Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
  30. Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. 689-690 (2010).
  31. Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39, (1), 549-558 (2010).
  32. Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46, (12), 2036-2047 (2018).
  33. Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8, (4), 491-494 (1973).
  34. Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7, (4), e35538 (2012).
  35. McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
  36. Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36, (2), 133-140 (2006).
  37. Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
  38. Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103, (2), 443-447 (2006).
  39. de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 6364821 (2018).
  40. Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
  41. Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110, (1), 251-257 (1996).
  42. Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
  43. Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
  44. Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139, (10), 104504 (2017).
  45. Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14, (4), 181-201 (1977).
  46. Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19, (4), 404-417 (2015).
  47. House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28, (6), 745-749 (2006).
  48. Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
  49. Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
  50. Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64, (2), 183-186 (1985).
  51. Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67, (8), 711-716 (1988).
  52. Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9, (1), 27-37 (1997).
  53. Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
  54. Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
  55. Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
  56. Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126, (6), 787-795 (2005).
  57. Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (11), 6180-6185 (2001).
  58. Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
  59. Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36, (8), 1322-1334 (2008).
  60. Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141, (2), 021011 (2018).
  61. Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  62. Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132, (2), 021003 (2010).
  63. Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138, (5), 051008 (2016).
  64. Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
  65. van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25, (6), 799-805 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics