Biaksiyel Bazal Tonu ve Basınç Miyografkullanarak Mürin üreme sisteminin pasif testi

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol, minür vajina ve serviks üzerinde basınç miyograf testi yapmak için ticari olarak mevcut basınçlı miyograf sistemi kullanılmıştır. Kalsiyumlu ve kalsiyumsuz ortamkullanımı, düz kas hücrelerinin katkıları (SMC) bazal tonu ve pasif ekstrasellüler matriks (ECM) tahmini fizyolojik koşullar altında organlar için izole edildi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kadın üreme organları, özellikle vajina ve serviks, çeşitli hücresel bileşenler vebenzersiz bir hücre dışı matris oluşur (ECM). Düz kas hücreleri vajinal ve servikal duvarlar içinde bir kontraktil fonksiyon sergiler. Biyokimyasal ortama ve organ duvarlarının mekanik distansiyonuna bağlı olarak, düz kas hücreleri kontraktil koşulları değiştirir. Temel fizyolojik koşullar altında düz kas hücrelerinin katkısı bazal tonu olarak sınıflandırılır. Daha spesifik olarak, bazal bir ton hormonal ve nöral stimülasyon yokluğunda düz kas hücrelerinin temel kısmi daralması olduğunu. Ayrıca, ECM organ duvarları ve biyokimyasal ipuçları için bir rezervuar olarak fonksiyonları için yapısal destek sağlar. Bu biyokimyasal ipuçları çeşitli organ fonksiyonları için hayati önem taşımaktadır, bu tür büyümeyi teşvik ve homeostaz bakımı gibi. Her organın ECM öncelikle kollajen lifleri oluşur (çoğunlukla kollajen türleri I, III, ve V), elastik lifler, ve glikozaminoglikanlar / proteoglikanlar. ECM'nin bileşimi ve organizasyonu her organın mekanik özelliklerini belirler. ECM bileşimindeki bir değişiklik, pelvik organ prolapsusu veya erken servikal remodeling gibi üreme patolojilerinin gelişmesine yol açabilir. Ayrıca, ECM mikroyapısı ve sertlik değişiklikleri düz kas hücre aktivitesi ve fenotip değiştirebilir, böylece kontraktil kuvvet kaybına neden.

Bu çalışmada, rapor edilen protokoller, estrus'ta 4-6 aylıkken gebe olmayan vajina ve serviksin bazal tonu ve pasif mekanik özelliklerini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Organlar ticari olarak kullanılabilen basınç miyografına monte edildi ve hem basınç çapı hem de kuvvet boyu testleri yapıldı. Üreme organlarının mekanik karakterizasyonu için örnek veriler ve veri analizi teknikleri dahildir. Bu tür bilgiler matematiksel modeller oluşturmak ve rasyonel kadın sağlığı patolojileri için terapötik müdahaleler tasarımı için yararlı olabilir.

Introduction

Vajinal duvar dört tabakadan oluşur, epitel, lamina propria, muscularis, ve adventiti. Epitel öncelikle epitel hücrelerinden oluşur. Lamina propria elastik ve fibrillar kollajen lifleri büyük miktarda vardır. Kas da elastin ve kollajen lifleri oluşur ama düz kas hücrelerinin artan miktarda vardır. Adventiti elastin oluşur, kollajen, ve fibroblastlar, önceki katmanlara göre azaltılmış konsantrasyonlarda da olsa. Onlar organların kontraktil doğada bir rol oynamak gibi düz kas hücreleri biyomekanik motive araştırma grupları için ilgi vardır. Bu nedenle, düz kas hücre alanı fraksiyonu ve organizasyon sayısal mekanik fonksiyonu anlamak için anahtardır. Önceki araştırmalar vajinal duvar içinde düz kas içeriği öncelikle çevresel ve uzunlamasına eksende organize olduğunu göstermektedir. Histolojik analiz, düz kas alanı fraksiyonunun duvarın proksimal ve distal kesitleriiçin yaklaşık %35 olduğunu göstermektedir 1.

Serviks son derece kolajnöz bir yapıdır, yakın zamana kadar, minimal düz kas hücre içeriği olduğu düşünüldü2,3. Son çalışmalar, ancak, düz kas hücreleri serviks daha büyük bir bolluk ve rol olabileceğini ileri sürmüşlerdir4,5. Serviks düz kas hücrelerinin bir gradyan sergiler. Internal os dış işletim sistemi sadece% 10 içeren% 50-60 düz kas hücreleri içerir. Fare çalışmaları, ancak, serviks rapor oluşur 10-15% düz kas hücreleri ve 85-90% fibröz bağ dokusu bölgesel farklılıklar hiçbir söz ile6,7,8. Fare modelinin sık bildirilen insan modelinden farklı olduğu göz önüne alındığında, fare serviksi ile ilgili daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir.

Bu protokolün amacı, murine vajina ve serviksin mekanik özelliklerini açıklamaktı. Bu, doğal hücre-matris etkileşimlerini ve organ geometrisini korurken aynı anda çevresel ve eksenel yönlerdemekanik özelliklerin değerlendirilmesini sağlayan bir basınçlı miyograf cihazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Organlar iki özel kanülüzerine monte edildi ve ipek 6-0 dikişile güvence altına alındı. Basınç çapı testleri uyum ve teğet modüler9belirlemek için tahmini fizyolojik eksenel streç etrafında yapılmıştır. Kuvvet uzunluğu testleri tahmini eksenel streç onaylamak ve mekanik özellikleri fizyolojik aralığında ölçüldü sağlamak için yapılmıştır. Deneysel protokol 4-6 aylık estrus'ta gebe olmayan murine vajina ve serviks üzerinde uygulandı.

Protokol iki ana mekanik test bölümüne ayrılmıştır: bazal ton ve pasif test. Bazal tonu düz kas hücrelerinin temel kısmi daralması olarak tanımlanır, dış lokal yokluklarda bile, hormonal, ve nöral stimülasyon10. Vajina ve serviksin bu temel kontraktil yapısı, daha sonra basınç miyograf sistemi ile ölçülen karakteristik mekanik davranışlar verir. Pasif özellikleri daralma temel durumunu koruyan hücreler arası kalsiyum kaldırarak değerlendirilir, düz kas hücrelerinin gevşemesi ile sonuçlanan. Pasif durumda, kollajen ve elastin lifleri organların mekanik özellikleri için baskın katkılar sağlar.

Murine modeli kadınların üreme sağlığıpatolojileri üzerinde yoğun olarak kullanılmaktadır. Fare üreme sistemi11,12,13,14içinde ECM ve mekanik özellikleri arasında gelişen ilişkileri ölçmek için çeşitli avantajlar sunuyor. Bu avantajlar kısa ve iyi karakterize ester döngüleri, nispeten düşük maliyet, kullanım kolaylığı ve nispeten kısa gebelik süresi15içerir. Ayrıca, laboratuvar farelerin genomu iyi eşlenmiş ve genetiği değiştirilmiş fareler mekanistik hipotezler16,17,18test etmek için değerli araçlardır.

Ticari olarak mevcut basınçlı miyograf sistemleri çeşitli doku ve organların mekanik tepkilerini ölçmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Basınç miyograf sistemi üzerinde analiz bazı önemli yapılar elastik arterler dahil19,20,21,22, damarlar ve doku mühendislik vasküler greftler23,24, yemek borusu25, ve kalın bağırsak26. Basınç miyograf teknolojisi eksenel ve çevresel yönlerdeki özelliklerin eşzamanlı olarak değerlendirilmesini sağlarken, yerli hücre-ECM etkileşimlerini ve in vivo geometrisini korur. Yumuşak doku ve organ mekaniğinde miyograf sistemlerinin yaygın kullanımına rağmen, basınç miyografsı teknolojisini kullanan bir protokol daha önce vajina ve serviks için geliştirilmemiştir. Vajina ve serviksmekanik özellikleri önceki araştırmalar uniaksiyel27,28değerlendirildi . Bu organlar, ancak, vücut içinde multiaksiyel yükleme deneyimi29,30, böylece biaksiyel mekanik tepki niceliksel önemlidir.

Ayrıca, son çalışmalar düz kas hücreleri yumuşak doku patolojileripotansiyelbir rol oynayabilir düşündürmektedir 5,28,31,32. Bu, doğal hücre-matris etkileşimlerini koruduğu için basınç miyograf teknolojisini kullanmanın başka bir çekiciliği sağlar, böylece düz kas hücrelerinin fizyolojik ve patofizyolojik olarak oynadığı katkının belirtilmesine izin verir. Koşul -ları. Burada, vajina ve serviksin çok eksenli mekanik özelliklerini hem bazal ton hem de pasif koşullar altında ölçmek için bir protokol öneriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada estrus'ta 4-6 aylık dişi C57BL6J (29.4 ± 6.8 gram) kullanılır. Tüm prosedürler Tulane Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Doğumdan sonra, fareler ötanaziden önce bir hafta boyunca uyum sağlar ve standart koşullar altında (12 saatlik ışık/karanlık döngüler) barındırılabildiler.

1. Estrus fare kurban

  1. Estrous döngüsünü belirleyin: Ester döngüsü önceki çalışmalara göre görsel değerlendirme ile izlendi15,33,34. Estrous döngüsü dört aşamadan oluşur: proestrus, estrus, metestrus, ve diestrus. Proestrus faz ı sırasında genital organlar şişmiş, pembe, nemli ve kırışık. Estrus faz buruşuk ama daha az şişmiş, pembe ve nemli. Metestrus ve diestrus hem hiçbir şişme ve kırışıklık sergileyen olarak bildirilmiştir, pembe bir renk yoksun, ve kuru34,35.
  2. Estrus'ta deney yapın: Tüm mekanik testler fareler estrus'tayken yapıldı, çünkü bu görselleştirmesi en kolay ve tutarlı ve tekrarlanabilir bir zaman noktası sağlar.
  3. Bazal ton testinden geçen fareler için giyotin yoluyla ötenazi. Sadece pasif koşullarda test edilen fareler için karbondioksit (CO2)inhalasyonu kullanılarak ötenazi yapılır. Co2 gaz düz kas hücrelerinin kontraktil özelliklerini değiştirir gibi giyotin, üreme yolu düz kas hücrelerinin işlevini korumak için hizmet vermektedir36,37,38, 39,40,41,42. Hücre apoptoz şansını en aza indirmek için 30 dakika içinde diseksiyonu yapmak zorunludur.

2. Üreme sistemi diseksiyonu

  1. Set up: İş istasyonuna bir emici ped yerleştirin ve bir Petri kabı nı ve şırıngayı 4 °C Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) çözeltisi ile doldurun. Yağ dokusu bertaraf için bir mendil kullanın. Fare ventral tarafı yukarı yerleştirin ve pençeleri ve kuyruk bant. Mikroskop ışıklarını açın ve mikro makas, makas, iki çift düz cımbız ve iki çift kavisli cımbız yola.
  2. Açılı cımbız ve makas kullanarak, karın çevresindeki deriyi kaldırın ve karın tabanında bir kesi yapmak, kasık kemiği üzerinde. Kesi karın kas duvarını delmeyecek kadar sığ olmalıdır. Göğüs kafesi doğru üstün kesmek için makas kullanmaya devam edin ve karın kasları ile derin.
  3. Kavisli cımbız ve mikro makas ile yağ hafifçe çekerek yüzeysel yağ çıkarın. Yağ dokusu ışığı parıltı benzeri bir görünümle heterojen olarak yansıtır. Kaldırılan tüm yağ ve dokuyu mendilin üzerine yerleştirin. Hem rahim boynuzları ve kasık kemiği tanımlayın.
  4. Vajinal duvar ve kasık kemiği arasında kapalı makas yerleştirin. Dikkatle kasık kemiğinin ortasını kesti (kasık symphysis). Kesilmiş kasık kemiğinin her iki ucuna da kavisli cımbız yerleştirin. Üreme organlarına daha iyi erişim sağlamak için her iki kesik uçları yanal olarak çekin.
  5. Mesane ve üretrayı vajinal duvardan çıkarın. Bu düz cımbız ve mikro makas kullanılarak yapılabilir. Gerginlik oluşturmak ve vajinadan çevredoku ayırmak için künt diseksiyon teknikleri kullanmak için düz cımbız ile mesane tutun. Mesane ve üretra kesildikten sonra, tabanı kesip vücut boşluğundan çıkarın.
  6. Üreme sistemini tanımlayın: Rahim boynuzları rahim ağzından ikiye katlar. Serviks geometri ve sertlik farklılıkları nedeniyle vajinadan tespit edilebilir. Serviksin dış çapı vajinadan daha küçüktür. Serviks vajinadan daha serttir ve boncuk gibi hisseder (Şekil 1).
  7. Organlar boyunca 3 mm nokta işaretlemek için mürekkep ve kaliperler kullanın. Rahim tüpleri üzerinde yumurtalıklar aşağıda başlayın ve serviks ulaşmak için aşağı nokta işareti. Vajina introitus aşağı bir nokta yolu başlatmak için merkezi serviks nokta kullanın.
  8. Mürekbin kurumasını ve üreme organlarını çevreleyen yağ dokusundan, bağ dokusundan ve kolondan ayırmasına izin verin. Mümkün olduğunca vajinal introitus yakın vajina temizleyin. Makas kullanarak, vajinal introitus etrafında kesti.
    NOT: Bu işlem sırasında organların kuruması mümkündür. Bu bir sorunsa, organlara nem eklemek için 4 °C HBSS ile dolu bir şırınga kullanılabilir.
  9. Rahim boynuzlarını yumurtalıklardan hemen aşağı kesin. Bağ dokusu çıkarılır ve organ geri teptiği gibi organların post ekstrektifi uzunluğu geri çekeceğini unutmayın. Parçalanmış üreme organlarını 4 °C HBSS ile dolu bir Petri kabına yerleştirin. Bu uzunluk değişikliği, tahmini in vivo uzunluğunun hesaplanmasında kullanılabilir (bölüm 5).
    NOT: Diseksiyon ve kanülasyon sırasında bu sıcaklıkta HBSS kullanılmasının düz kas hücresi nin canlılığını etkilemediğini tespit ettik. 7.4 bir pH bakımı, ancak, düz kas hücrelerinin canlılığını korumak için zorunludur. Bu sıcaklıkta HBSS'nin pH seviyesi 7.4'tür.
  10. 4 °C HBSS'de 15 dakikalık bir denge süresinden sonra kaliperler kullanarak nokta arasındaki boşluğu ölçün. Her mesafe için ölçümleri bir elektronik tabloya kaydedin. Bu değerler in vivo streç oranını (orijinal uzunluk/ekstrektib uzunluğu) hesaplamak için kullanılacaktır.
  11. Farenin içine bakan fazla doku ile karın bölgesinde atılan doku içeren silme ayarlayın ve 4 ° C HBSS içinde silme. Fareyi ve fazla dokuyu folyoya sarın ve -20 °C'de saklanacak bir dondurucu güvenli torbaya yerleştirin. Vajinadaki pasif mekanik davranış, bir donma-çözülme döngüsü43'tensonra önemli ölçüde farklı bulunamaz. Test edilen tüm organlar ötenaziden hemen sonra veya bir donma-çözülme döngüsünden sonra kullanıldı.

3. Kannasyon

  1. Organ tipi için uygun kanül boyutunu belirleyin. Tipik bir C57BL6J farede, vajina çapı 3.75 mm ve perçinlenmiş kanüller kullanır. Serviks, vajinal uç için 3,75 mm, rahim ucu için 0,75 mm çapında bir kanül kullanır (Şekil2) 0,75 mm kanül pürüzsüzdür.
    NOT: Yukarıda belirtilen çap boyutları tipik nulliparous 4-6 ay C57BL6 fareler, C57BL6 x 129SvEv ve 7-9 aylık olmayan fareler için kullanılır. Ancak, prolapsus veya gebelik gibi bazı durumlar, daha büyük boyutlu bir kanül gerektirebilir.
  2. Her organile, cannulation cihazın kuvvet transdüser kısmına servikal tarafı monte. Cihazın mikrometre kısmına organın (vajinal veya rahim) karşı ucunu monte edin. Dikişlerle her iki ucunu da sıkın.
  3. Vajina ve serviks arasındaki kasisite kalınlığı ve derecesi arasındaki fark nedeniyle, en etkili kanülasyonu gerçekleştirmek için çeşitli tekniklerden yararlanılabilir. Vajina için kanülün2 ve3 perçininin arasına "X" şeklinde 2 dikiş yerleştirin. Ne zaman serviks cannulating, kanül en iyi rahim ucunda 3 yatay dikişler ve dış os üzerinde 4 dikişleri ile kanül arkasına yerleştirilir böylece pernüs değildir. Her iki organ için de dikişler arasında maksimum uzunluk7 mm'den fazla olmamalıdır (Şekil 3).

4. Basınç miyograf kurulumu

  1. Basınç miyograf sistemini kurmak için, test sistemi üzerindeki güç ve rezervuar şişesini 200 mL HBSS ile doldurun (Şekil4). Isıyı "açıktı" ve rezervuar şişesindeki HBSS'nin ısınmasına izin verin. Sonra, mikroskobu açın ve bilgisayar programını açın. Kantinlenmiş organın görüntüsünün, basınç arabiriminin, akış ölçer okumalarının ve sıralayıcı işlev aracının tümünün görünür olduğundan emin olun (Şekil5).

5. Bazal ton mekanik test

NOT: Serviks testin başlangıç aşamalarında phasik bir doğa sergiledi. Ancak, bu ön koşullandırma sonra azaldı. Bazal ton testi DMT cihazının havzasında Krebs Ringer Tampon (KRB) kullanılarak yapılır. Tampon % 95 O2 ve% 5 CO2ile aklanır. Bazal ton kısmı tamamlandıktan sonra kalsiyumsuz KRB kullanılır.

  1. Boşaltılmış geometriyi bulma: Duvarı gerilimde olmayacak şekilde organı uzatın. Vajina için, vajinal duvarda oluklar gözlemlemek. Serviks için, merkezi serviks işaretinin üstünde ve altında bulunan mürekkep noktalarının hemen altından kesin. Bu, 6 mm 44'lük yerinde servikal içintekrarlanabilir bir yöntem tasarlar. Kaliperlerle sütürden dikişe kadar olan uzunluğu ölçün
  2. Boşaltılmış basıncıbulma (UP): Basıncı 1 mmHg'lik artışlarla 0 mmHg'den 10 mmHg'ye yükseltin. Organın artık çökmediği basıncı belirleyin. Bu, program monitöründe sergilendiği gibi, belirli bir basınçta dış çaptaki en büyük sıçrama olarak belirlenebilir. Basınç ve dış çapı kaydettikten sonra, bu organın çökmediği ilk nokta olarak not edin ve kuvveti sıfır.
  3. Tahmini in vivo streç: In vivo cinsinden ölçülen uzunluğu ekstrektif ekstreğe göre ölçülen uzunluğa bölerek tahmini in vivo streç hesaplayın:
    Equation 1
  4. Basınç çapı ön koşullandırma: Basıncı 0 mmHg'ye, uzunluğu tahmini inEquation 2vivo uzunluğa ve degradeyi 1,5 mmHg/s'ye ayarlayın. Basıncı 0 mmHg'dan in vivo basınca + boşaltılmış alete götüren bir dizi çalıştırın (Tablo 1), 30 saniye ve 30 saniyelik bekleme süresi ile 0 mmHg basınç almak. Toplam 5 döngü boyunca tekrarladıktan sonra, bilgisayar programında Durdur'a basın ve dosyayı kaydedin.
  5. Deneysel in vivo streç bulma: Boşaltılmış basınç ve starttuşuna basarken tahmini in vivo uzunlukta olması için organ ayarlayın. Boşaltılmış basınçtan maksimum basınca kadar değişen basınç değerleri içinbasınç ve kuvvet değerlerini değerlendirin (Tablo 1). Bilgisayar programında durdur düğmesine basın ve dosyayı kaydedin.
    NOT: Ölçülen streç değeri yerinde hesaplanır. Bu sadece kasık symphysis disarticulating sonra ölçülebilir sınırlama eşlik ediyor. Sonuç olarak, doğal tethering, uzunluğu değiştirebilirsiniz kaybolur. Teorik streç, ancak, daha önce tanıtılan teoriye dayanmaktadır, organ enerji tasarrufu için fizyolojik baskılara maruz kaldığında kuvvet minimal değişiklikler yaşayacaktır45. Protokolde, in vivo streç cinsinden ölçülen streç değeri, fizyolojik basınç aralığına maruz kaldığında kuvvette minimum değişiklik olduğu deneysel olarak tanımlanan uzunluk kullanılarak hesaplanan streç değeri olacaktır.
  6. Basınç çapı ön koşullandırma: Basıncı 0 mmHg'ye, deney in vivo uzunluğa ve 1,5 mmHg/s'lik degradeye ayarlayın. 0 mmHg'den maksimum basınca + UP'a kadar olan basıncı alan bir dizi çalıştırın, 30 saniye tutun ve bir reklamla 0 mmHg'ye geri ditional 30 saniye bekleme süresi. Bunu toplam 5 döngü boyunca tekrarladıktan sonra, program arabirimindeki Durdur düğmesine basın ve dosyayı kaydedin.
    NOT: 5.4 artan basınç ile daha tutarlı bir eksenel kuvvet okuma elde etmek için zorunludur. Bu adım, genellikle görsel ipuçlarına göre küçümsenen in vivo streç, doğru bulma yardımcı olur. 5.6 histerizi en aza indirmek ve organın tutarlı, tekrarlanabilir, matematiksel olarak yorumlanabilir bir tepki elde etmek için ihtiyati bir adım olarak hizmet vermektedir.
  7. Kuvvet uzunluğu ön koşullandırma: Giriş ve çıkış basıncı için 1/3 max basınç + UP girin. Organı in vivo uzunluğunun %-2'sine ayarlayın ve Başlattuşuna basın. Uzunluğu vivo uzunlukta +2'ye ayarlayın ve 10 μm/s'de %-2'ye geri döndü. Eksenel uzatmayı toplam 5 döngü boyunca tekrarlayın. Bilgisayar programında Durdur'a basın ve dosyayı kaydedin.
  8. Denge: Organ ın in vivo uzunlukta olduğu anda, hem giriş hem de çıkış basıncını maksimum basıncın + UP'ın 1/3'üne ayarlayın. Organı 10 dakika lığına dengeleyin. Her iki basıncı da yavaş yavaş 0 mmHg'ye düşürün ve degrade 1,5 mmHg/s olarak ayarlayın.
  9. Boşaltılmış geometriyi yeniden değerlendirin: Organı in vivo uzunluğa ve boşaltılmış basınca basıncına ayarlayın. Eksenel uzunluğunu, kuvvette minimum değişiklik olana kadar tahmini boşaltılmış uzunluğa doğru 10 μm/s'lik bir hızda azaltın. Bu karşılık gelen uzunluk boşaltılmış uzunluk olarak bilinir, ya da nerede organ gerginlik veya sıkıştırma değildir. Kuvveti sıfırlamadan önce, boşaltılan uzunluğu, dış çapı ve kuvvet değerini kaydedin.
    NOT: Önceki boşaltılmış geometri tamamen nitel görsel ipuçları ile belirlenmiştir. Bir yeniden değerlendirme nicel bir yöntem için ve ön koşullandırma sırasında oluşabilecek uzunluk olası değişiklikleri hesaba katmak için gereklidir. Bu geometri bölüm 8'de kullanılacaktır.
  10. Ultrason Kurulumu: Test cihazındaki organları görselleştirmek için genel görüntüleme karın paketini kullanın. (Şekil 6). Test etmeden önce, basınçlı miyograf metal havzasının altından yapıları en aza indirin. Kanül, doku hala test çözeltisine tamamen batırılmış durumdayken alttan maksimum mesafe olan yüksekliğe ayarlayın. Özel tutucu, görüntüleme sırasında dönüştürücünün dikey bir pozisyonda sabitlenmesi için 3D yazdırılır.
  11. Ultrason Görüntüleme: Kuvvet dönüştürücü yakınında kanül belirlemek ve doku uzunluğu boyunca görüntü mikroskop aşamasını ayarlayın. Test işlemi boyunca, uzunluk boyunca orta bölge izlenir (Şekil 6A,C). Görüntülemeden sonra, bir dizi B modu çerçeveden oluşan görüntü "Cine store" döngüsini gözden geçirin ve en büyük dış çapa sahip çerçeveyi tanımlayın. Yapılan kalınlık hesaplamaları bölüm 8'de kullanılacaktır.
  12. Basınç çapı testi (-vivo uzunlukta %-2): Başlat'a basın ve organı in vivo uzunluğunun %-2'si olacak şekilde ayarlayın, basıncı 0 mmHg'ye ve degradeyi 1,5 mmHg/s'ye ayarlayın. Basıncı 0 mmHg'den maksimum basınca yükseltin. Basıncı 20 saniyelik bekleme süresiyle 0 mmHg'ye indirin. Bunu 5 döngü boyunca tekrarlayın.
  13. Basınç çapı testi (in vivo length): Başlat tuşuna basın ve organı vivo uzunlukta olacak şekilde ayarlayın, basıncı 0 mmHg'ye ayarlayın ve degradeyi 1,5 mmHg/s'ye ayarlayın. Basıncı 0 mmHg'den maksimum basınca yükseltin. Basıncı 20 saniyelik bekleme süresiyle 0 mmHg'ye indirin. Bunu 5 döngü boyunca tekrarlayın.
  14. Basınç çapı testi (+2% in vivo length): Organı vivo uzunlukta +%2 olacak şekilde ayarlayın, basıncı 0 mmHg'ye ayarlayın ve degradeyi 1,5 mmHg/s'ye ayarlayın. Basıncı 0 mmHg'dan maksimum basınca yükseltin ve 20 saniyelik bekleme süresiyle 0 mmHg'ye geri getirin. Bunu 5 döngü boyunca tekrarlayın. Her üç uzunluktaki basınç verileri bölüm 8'de kullanılacaktır.
  15. Kuvvet uzunluğu testi (Nominal basınç): Basıncı boşaltılmış basınca ve organa in vivo uzunluğunun %-2'sine ayarlayın. Organı in vivo uzunluğunun +%2'sine kadar uzatın ve in vivo uzunluğuna 10 μm/s hızla -%2'ye geri dönün.
  16. Kuvvet uzunluğu testi (1/3 maksimum basınç + UP): Basıncı maksimum basıncın 1/3'üne + UP'ye ayarlayın ve organı in vivo uzunluğunun %-2'sine ayarlayın. Start tuşunabastıktan sonra organı in vivo uzunluğa +%2'ye kadar uzatın ve 10 μm/s'lik bir hızda in vivo uzunluğa %-2 geri getirin. Toplam 3 döngü boyunca tekrarladıktan sonra Durdur'a basın ve verileri kaydedin.
  17. Kuvvet uzunluğu testi (2/3 maksimum basınç + UP): Basıncı maksimum basıncın + UP'ın 2/3'üne ayarlayın ve organı in vivo uzunluğunun %-2'sine ayarlayın. Başlat tuşuna basın ve organı in vivo uzunlukta +%2'ye ve 10 μm/s'lik bir hızda in vivo uzunluğa %-2'ye geri gerin. Toplam 3 döngü boyunca tekrarladıktan sonra Durdur'a basın ve verileri kaydedin.
  18. Kuvvet uzunluğu testi (maksimum basınç + UP): Basıncı maksimum basınca + UP'a ayarlayın ve organı in vivo uzunluğunun %-2'sine ayarlayın. 10 μm/s'lik bir hızda, organı in vivo uzunluğunun +%2'sine kadar uzatın ve in vivo uzunluğunun %-2'sine geri getirin. Toplam 3 döngü için tekrarladıktan sonra, verileri kaydedin. Tüm kuvvet verileri bölüm 8'de kullanılacaktır.
  19. KRB test ortamını çıkarın ve kalsiyumsuz KRB ile yıkayın. Ortamı 2 mM EGTA ile takviye edilmiş kalsiyumsuz KRB çözeltisi ile değiştirin. 30 dakika boyunca dokuyu kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi çıkarın ve ortamı taze kalsiyumsuz KRB ile değiştirin.

6. Pasif mekanik test

NOT: Pasif test ile başlamak için 1. Bazal ton testi 6. Dondurulmuş doku ile başlıyorsanız, organ kannasyon önce oda sıcaklığında 30 dakikalık bir denge süresi bekleyin.

  1. Boşaltılmış geometriyi bulma: Organı gererek organın duvarının gerilimiçinde olmamasını sağlar. Kantinli organı dikişe kadar ölçün ve bunu boşuzunlukta olarak kaydedin.
  2. Boşaltılmış basıncı bulma: Starttuşuna bastıktan sonra, basıncı 0 mmHg'lık artışlarla 0'dan 10 mmHg'ye yükseltin. Bu süreçten geçerken, organın gerginlik içinde olmadığı basıncı belirleyin. Bilgisayar programı monitörü kullanılarak, bu dış çaptaki en büyük sıçramadan belirlenebilir. Kuvveti sıfırladıktan sonra, bu basıncı ve dış çapı kaydedin ve bunu organın çökmediği ilk nokta olarak not edin.
  3. Tahmini in vivo streç: In vivo cinsinden ölçülen uzunluğu ekstrektif sonra ölçülen uzunluğa bölerek tahmini in vivo streç hesaplayın.
  4. Basınç çapı ön koşullandırma: Starttuşuna bastıktan sonra, basıncı 0 mmHg,tahmin edilen in vivo uzunlukta uzunluk ve 1,5 mmHg/s'ye kadar degrade olarak ayarlayın. Basıncı 0 mmHg'den maksimum basınca ve 0'a geri götüren bir dizi çalıştırmaya başlayın Mmhg. Bu işlemi 30 saniyelik bekleme süresiyle 5 döngü boyunca tekrarlayın.
  5. Kuvvet uzunluğu ön koşullandırma: Her iki basınç için de bilgisayarı boşaltılan basıncı in vivo uzunluğa ayarlayın ve boşaltılan basıncı el ile girin. Start tuşuna bastıktan sonra degradeyi 2 mmHg'ye, basıncı maksimumun 1/3'üne ayarlayın. Organı +%2'ye kadar uzatın ve 10 μm/s'de %-2'ye geri geri leyin. Bu döngüyü toplam 5 kez tekrarlayın ve Durdur'abasın.
  6. Deneysel in vivo uzunluğu bulma: In vivo uzunluğunun %-2'si, in vivo uzunluğunun %2'si ve in vivo uzunluğunun +%2'si kadar kuvvet değerlerini bulun ve çizin. 0 mmHg'den maksimum basınca kadar eşit aralıklı basınçlarda kuvvet alın. Deneysel in vivo streç basınç bir dizi üzerinde nispeten düz bir çizgi sergileyen streç değeri olacaktır.
  7. Yeni in vivo uzunlukta basınç çapını ve eksenel ön koşullandırma adımlarını tekrarlayın.
  8. Denge: Organ ın in vivo uzunlukta olması ile giriş ve çıkış basıncını boşaltılmış basınca ayarlayın. Organ 15 dakika lığına tekrar dengelesin. 15 dakika sonra, giriş ve çıkış basıncını yavaşça 0 mmHg'ye geri getirin.
  9. Boşaltılmış yapılandırmayı yeniden değerlendirin: Organı boşaltılan uzunluğa getirin ve boşaltılmış uzunluğu yeniden tahmin edin. Basınç 0 mmHg, boşaltılmış basınç ve 1/3 maksimum basınç iken boşaltılmış uzunluğu ve dış çapı kaydedin. Boş basınçtaki kuvveti sıfırla. Boşaltılmış basınçtaki çap in vivo çapıdır.
    NOT: Boşaltılmış uzunluğun yeniden tahmin edilmesi gereklidir, çünkü daha önce yumuşak biyolojik dokularda ön koşullanma sonrası küçük plastik deformasyonlar gözlenmiştir. Bu boşaltılmış yapılandırma bölüm 8'de kullanılan konfigürasyon olacaktır.
  10. Ultrason: Boşaltılan uzunluk ve basınçta ultrason B-modu görüntüleme gerçekleştirin.
  11. Basınç çapı testi: Organın -2% in vivo uzunlukta ve basınç 0 mmHg olarak belirlenen ile Başlattuşuna basın. Basıncı 0 mmHg'den maksimum basınca ve 0 mmHg'ye yükseltin. 2-0 mmHg adımını 20 saniye basılı tutun. Toplam 5 kez tekrarladıktan sonra arabirimdeki Durdur düğmesine basın ve dosyayı kaydedin.
    NOT: Deneysel in vivo uzunlukta tekrarlayın, deneysel in vivo uzunluğunun +%2'si.
  12. Kuvvet uzunluğu testi: Basıncı nominal basınca ayarlayın ve organı in vivo uzunluğunun %-2'sine ayarlayın. Organı in vivo uzunluğunun +%2'sine kadar uzatın ve in vivo uzunluğunun %-2'sine 10 μm/s'lik bir hızda geri getirin. Toplam 3 kez tekrarladıktan sonra verileri kaydedin. Bunu 1/3 maksimum basınç, 2/3 max basınç ve maksimum basınçta tekrarlayın.
  13. Ultrason görüntüleri B-modu görüntüden boşaltılan kalınlığı hesaplayın. Görüntüleme yazılımı kullanarak, penetrasyon derinliğini belirtmek için bir çizgi çizin. Ölçeği çizginin uzunluğuna ayarlayın (şekil 6B ve 6D'degösterildiği gibi 2000 μm).
  14. Duvar kalınlığı hesaplamaları: Bir bilgisayar yazılımı kullanarak, organın iç ve dış çapını takip eder ve ölçer. Daha sonra, çizmek ve çapları arasında bir çizgi ölçmek. Toplam 25 transmural çizgi çizin. Tüm veri noktalarının ortalamave 3 kez toplam tekrarlayın.

7. Temizlik

  1. Basıncın 0 mmHg olduğundan ve kapalı olduğundan emin olun. Her iki üç yönlü vanalar için ana girişi ve çıkışı kapatın. Kanülasyon cihazının havzasından kalan sıvıyı aspire edin.
  2. Sahneden organ çıkarın ve deiyonize su ile rezervuar şişe doldurun. Bir şırınga kullanarak, kanülsuyu suyla durulayın. Kanül atlamak için boru bağlayın.
  3. Basıncı ve akışı açın, giriş basıncını 200 mmHg'ye, çıkış basıncını 0 mmHg'ye, degradeyi 10 mmHg/s'ye ayarlayın ve akışın 5 dakika boyunca çalışmasını bekleyin. Rezervuar şişesi boşken sistemin çalışmasına izin verin ve havanın 5 dakika veya hatlar kuruyana kadar çalışmasına izin verin.

8. Veri analizi

  1. Basınç çapı testi için, basıncın minimum değerden maksimum değere kadar artmaya başladığı yerden veri toplayın. Kuvvet uzunluğu testi için, kuvvet azalan akadar yürürlükteki maksimum tepenin hemen altından veri toplayın.
  2. Her basınç çapı testi için veri dosyasını açın ve ortalama basınç sekmesini seçin. Son eğrinin yükleme bölgesine gidin, maksimum basınca 0 mmHg gidin ve verileri elektronik tabloya bırakın. Dış çapta, giriş basıncında, çıkış basıncında, kuvvette, sıcaklıkta, pH'da ve akış sekmesinde her öğeyi aynı belgeye yerleştirerek aynı bölgeyi seçin.
  3. Her Kuvvet uzunluğu testi için verileri açın. Eğrinin yükleme bölgesine gidin, -%2 ila +2 arasında, ve verileri sürükleyip elektronik tabloya bırakın. Diğer ölçülen değişkenler için aynı bölgeyi seçin ve her öğeyi aynı elektronik tabloya yerleştirin.
  4. Basınç çapı ve kuvvet uzunluğu testi için UP tüm basınç değerlerinden çıkarılır.
  5. Her 1 mmHg'de bir basınç çapı verisinin ortalaması (yani, 0+/- 0,5, 1+/-0,5, 2+/- 0,5).
  6. Organın boşaltılmış hacmini bulun (V). Denklem 1 Vbulmak için kullanılabilir , R 02 mikroskop ile ölçülen boşaltılmış dış yarıçapı olduğu göz önüne alındığında, L boşaltılmış uzunluğu, ve H ultrason tarafından algılanan boşaltılmış kalınlığıdır. Basınçsyama varsayımı, organın deformasyonlara maruz kalırken hacmi ni muhafaza ettiği anlamına gelir.
    NOT: Boşaltılmış uzunluk, dikişten dikişe kadar kaliperlerle ölçülür. Boşaltılmış çap mikroskop, kamera ve yarıçapın hesaplanması ile takip edilen yazılım ile ölçülür (Şekil 5) Boşaltılan kalınlık ultrason görüntülerinden hesaplanır (Şekil 6).
    Equation 3Denklem 1
  7. Sıkıştırılmazlık varsayımını kullanarak, deforme olmuş iç yarıçapıEquation 4Equation 5 Equation 6 belirlemek için boşaltılmış hacmi, deforme olmuş dış yarıçapı (), ve uzunluğu () kullanın.
    Equation 7Denklem 2
  8. Her gerilimi sırasıyla hesaplamak için 3, 4 ve 5 denklemlerini kullanın. 3-5 denklemlerinde P intraluminal basınç olarak tanımlanır ve Ft transdüser tarafından ölçülen kuvvettir.
    Equation 8Denklem 3
    Equation 9Denklem 4
    Equation 10Denklem 5
  9. Baskı çapı ilişkisini, kuvvet-basınç ilişkisini, çevresel stres-çevresel streç ilişkisini ve eksenel gerilim ve çevresel germe değerlerini çizin (Şekil7, Şekil8). Germe değerleri orta duvar yarıçapı kullanılarak hesaplanabilir. Çevresel ve eksenel gerilmelerin hesaplamaları sırasıyla Denklem 6 ve 7'de bulunabilir.
    Equation 11Denklem 6
    Equation 12Denklem 7
  10. Fizyolojik basınç aralığına yakın ve in vivo streç te uyumluluğu hesaplayın. Alt basınç sınırı (LPB) ortalama ölçülen basıncın altında 1 standart sapmadır. Üst basınç sınırı (UPB) ortalama ölçülen basınç9üzerinde 1 standart sapma olduğunu.
    Equation 13
  11. Malzeme sertliğini ölçmek için teğet moduli hesaplayın. Alt basınç sınır ve üst sınır basıncına karşılık gelen hesaplanan çevresel gerilimi belirleyin. Lineer bir çizgiyi çevresel gerilime uygun olarak, in vivo uzunlukta tanımlanan gerilim aralığına sığdırın. 9.çizginin eğimini hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kadın üreme organlarının mekanik özelliklerinin başarılı analizi uygun organ diseksiyonu, kanülasyon ve teste bağlıdır. Rahim boynuzlarının herhangi bir kusur olmadan vajinaya ekstrüzyonu zorunludur (Şekil 1). Organ tipine bağlı olarak kanül boyutu değişir (Şekil 2). Kanülasyon, organın deney sırasında hareket edememesi ve aynı zamanda işlem sırasında organın duvarına zarar vermemesi için yapılmalıdır (Şekil3). Her iki adımın da başarısız olması geminin basınç tutamamasına neden olacaktır. Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için protokolün başarısı için test prosedürü standardizasyonu hayati önem taşımaktadır.

Bir kez organ kesilir ve düzgün cannulated, basınç miyograf sistemi üzerinde güç. Basınç miyograf sistemlerinin kurulumu bir denetleyici ünitesi, akış ölçer ve aşamaiçerir (Şekil4). Basınç miyograf sistemi, mekanik testlerden geçtiği için organın çeşitliyönlerini izlemek için kullanılır (Şekil 5). Ultrason sistemi veya eşdeğeri, bazal tonlu ve bazal tonsuz boş durumdakiorganların kalınlığını ölçmek için kullanılır (Şekil 6). Mekanik testten sonra çevresel ve eksenel yönlerde teğet modüler hesaplanabilir(Tablo 2).

Hem bazal ton testi hem de pasif testler, düz kas hücrelerinin kontraktil katkısı olan ve olmayan üreme yollarının önemli mekanik özelliklerini verir (Şekil7, Şekil8). Organlar arasında ölçekleme protokolleri için birkaç ayarlama gerektirir (Tablo 1), serviks ve vajina vivo46-48farklı yükler deneyim gibi . Bu tür varyasyonlar basınçlı katherizasyon gibi tekniklerle izlenebilir. Basınç katherizasyonu vajina ve rahim içinde in vivo koşulları izlemek için daha önce kullanılan bir yöntemdir49-53. Önceki çalışmalarda modeller fareler, tavşanlar ve insanlar arasında değişmektedir. Aynı ilkeler, mürin modeline özgü servikal ve vajinal basınç için de benzer şekilde geçerli olacaktır. Ancak, hangi organ test edilirse test edilir, protokoller için aynı malzemeler gereklidir (Tablo3).

Figure 1
Şekil 1: İdrar diseksiyonu diyagramı. Üreme organları için fare diseksiyonu: hem rahim boynuzları, serviks, ve vajina. Şekilde, mesane ve üretra vajinanın ön kaldırılır. Bağırsaklar ve karın kasları üstün bir şekilde yansıtıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: İki kanülün boyut karşılaştırması. Üreme organlarının kanülasyonunda kullanılan iki kanülün boyut karşılaştırması. Büyük kanül (D = 3.75 mm) vajinal doku için kullanılır (A). Daha küçük kanül (D = 0.75 mm) servikal doku(B) kanültasyonu için kullanılır. Vajinal kanül iki oluklar varken servikal kanül pürüzsüz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Vajina ve serviks için kanülasyon yöntemi. Üreme organlarının değişen geometrisi ve kalınlığı nedeniyle, en etkili şekilde farklı şekillerde kannulated vardır. Vajina için, bir "X" moda iki dikiş yerleştirin. Serviks kannasyonu yaparken, rahim ucuna 3 yatay dikiş ve dış os üzerine 4 dikiş yerleştirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Basınçlı miyograf cihazı için kurulum. Hem bazal hem de pasif test için kullanılan DMT cihazının kurulumu. DMT üç ana merkezden oluşur: sahne (A), denetleyici ünitesi (B), ve akış ölçer (C). Denetleyici ünitesinde bir rezervuar şişesi ve bir atık şişesi bulunmaktadır. Rezervuar şişesi başlangıçta deney icra edilirken boşalan sıvı ile doldurulur. Başlangıçta boş olan atık şişesi, deney boyunca çalışan sıvıyı toplar. Denetleyici ünitesi bilgisayardaki DMT yazılımıyla aralar ve basıncı, sıcaklığı ve akışı kontrol eder. Denetleyici ünitesi, kademe içindeki kuvvet ve basınç dönüştürücülerinden çıkan çıkışları VGA arabirim kablosu aracılığıyla okur. Sistemin aşama bileşeni, sistemin giriş ve çıkış akışını içerir. Giriş ve çıkış akışı, sistem tarafından ölçülen giriş ve çıkış basınçlarına sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Basınç miyograf programı üzerinde dosya kurulumu. Bilgisayar yazılımı kurulumunun görüntülenmesi. Bir kutu ilgi bölgesi etrafında çizilir ve doku dış çapı optik gerçekzamanlı olarak izlenir (A). Mekanik test sırasında elde edilen veriler dış çap, giriş basıncı, çıkış basıncı, ortalama basınç, kuvvet, sıcaklık, pH ve akış sekmesinde gerçek zamanlı olarak kaydedilir ve görüntülenir (B). Basınç arabirimi basıncı (mmHg), degrade (mmHg/s) içinde ve akış kontrol edilir. Ayrıca, eksenel kuvvet (mN) satır içi kuvvet transdüser tarafından ölçülen görüntülenir. Akış hızı (μL/dk) akış ölçer sekmesinde(C) raporlanır. Basınç sıralaması sıralayıcı sekmesinde (D) gösterilirve denetlenir. Mekanik test sırasında kaydedilen veriler kaydedilir ve dış çap, giriş basıncı, çıkış basıncı, ortalama basınç, kuvvet, sıcaklık,pH ve akış sekmesi (E) gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Vajinanın temsili Basınç Çapı testi, dış çap sekmesinde zamanın bir fonksiyonu olarak dış çapı gösterir.

Figure 6
Şekil 6: Ultrason Görüntüleme. Murine üreme organlarının ultrason görüntülemesi. Tüm görüntüler kısa eksen-B modunda ultrason sistemi kullanılarak alınmıştır. Boşaltılan uzunluk ve basınçta vajinanıntemsili bir görüntüsü (A). Vajinal duvar kalınlığı ImageJ'de hesaplanmıştır. Derinlik ölçeği (mm) boyunca, her μm piksel başına piksel sayısını kalibre etmek için dikey bir çizgi çizildi. Poligon aracı iç ve dış çapı izlemek için kullanılmıştır. Daha sonra kalınlığı hesaplamak için transmuralçizgiler çizildi ve ortalama (B). Bu 3 kez yapıldı. Yüksüz uzunluk ve basınçta serviksin temsili bir görüntüsü(C). Duvar kalınlığı daha sonra Vajina benzer bir şekilde Resim J ve çokgenaracı kullanılarak hesaplandı (D). Üreme kompleksi içinde, dış çapı iki farklı yerlerde izlenir (E). Görüntüleme işlemi boyunca transdüser 3 boyutlu baskılı tutucu (F)tarafından stabilize edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Vajinal test için temsili sonuçlar. Vajinal bazal ve pasif protokollerin temsili mekanik test sonuçları. DMT sistemi tarafından elde edilen verilerle, çeşitli mekanik ilişkiler elde edilebilir. A) Bazal Basınç Çapı, B) Pasif Basınç-Çap, C) Bazal Kuvvet-Basınç, D) Pasif Kuvvet-Basınç, E) Bazal çevresel gerilim-çevre germe, F) Pasif çevresel stres-çevresel streç, G) Bazal eksenel stres-çevresel streç, H) Pasif eksenel stres-çevresel streç. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Servikal test için temsili sonuçlar. Servikal bazal ve pasif protokollerin temsili mekanik test sonuçları. DMT sistemi tarafından elde edilen verilerle, çeşitli mekanik ilişkiler elde edilebilir. A) Bazal Basınç Çapı, B) Pasif Basınç-Çap, C) Bazal Kuvvet-Basınç, D) Pasif Kuvvet-Basınç, E) Bazal çevresel gerilim-çevre germe, F) Pasif çevresel stres-çevresel streç, G) Bazal eksenel stres-çevresel streç, H) Pasif eksenel stres-çevresel streç. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

In Vivo Basınç Maksimum Basınç 1/3 Maksimum Basınç 2/3 Max Basınç Eksenel Streç Kanül Boyutu Önerilen sayı
dikişlerin
Vajina 7 mmHg 15 mmHg 5 mmHg 10 mmHg -%2, in vivo, +2% 3,75 mm 2- bir "X" moda
Serviks 10 mmHg 200 mmHg 66 mmHg 133 mmHg -%2, in vivo, +2% Rahim ucu için 0,75 mm
Vajinal uç için 3,75 mm
3 yatay dikiş
rahim sonu
Üzerinde 4 dikiş
vajinal dış işletim sistemi

Tablo 1: Her organ için mekanik test yöntemleriölçekleme için bilgi özeti. Boşaltılmış basınç değerleri anestezi altında katherizasyon teknikleri kullanılarak ölçüldü (%4 isofluran% 100 oksijen). Vajinal ölçümlerde balon kateter, serviks için 2F kateter kullanıldı.

Vajina Serviks
Bazal
Çevresel (kPa)
127.94 188
Bazal
Eksenel (kPa)
56.8 75.44
Pasif
Çevresel (kPa)
246.03 61.26
Pasif
Eksenel (kPa)
112.74 19.26

Tablo 2: Vajina ve serviksin teğet modüllü sehpasının temsili sonuçları. Teğet modüllü hem bazal hem de pasif koşullar için olduğu kadar hem çevresel hem de eksenel yönlerde hesaplanmıştır. Sağlanan tüm ölçümler kPa birimlerindedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede verilen protokol, murine vajina ve serviksin mekanik özelliklerini belirlemek için bir yöntem sunmaktadır. Bu protokolde analiz edilen mekanik özellikler, organların hem pasif hem de bazal ton koşullarını içerir. Pasif ve bazal ton koşulları, organın sular altında kaldığı biyokimyasal ortamın değiştirilmesiyle indüklenir. Bu protokol için bazal testlerde yer alan ortam kalsiyum içerir. Bazal ton durumunutest kadın üreme organları içinde düz kas hücresi mekanik katkı izolasyon sağlar54,55. Pasif mekanik test yaparken ortam kalsiyum içermez. Kalsiyum eksikliği, düz kas hücrelerinin kassızlığı engeller. Bu, büyük ölçüde pasif mekanik özellikleri dikte kollajen ve elastik lifler gibi diğer ECM bileşenleri, açıklanma izin verir. Biyokimyasal ve histolojik analiz ile birleştirildiğinde, bu sonuçlar ECM mikroyapısal bileşimi ve mekanik fonksiyon arasındaki ilişkilerin açıklanmasına izin verir. Bu daha sonra kadınların üreme sağlığı ile ilgili patolojilerin yapısal ve mekanik mekanizmalarının çizgisini sağlar.

Daha önce, vajina ve serviks uniaksiyal test edildi27,28. Vajina ve serviks, ancak, anizotropik özellikleri göstermek ve deneyim multiaksiyel yükleme in vivo29,30 . Bu nedenle, burada kullanılan basınçlı miyograf sistemleri, üreme patolojilerinin etyolojilerinin anlaşılmasına ve potansiyel tedavilerin sonraki tasarımına yardımcı olabilecek çok eksenli yükleme hakkında nicel bilgiler sağlamaktadır. Ayrıca, basınç miyografiinde in vivo organ geometrisi ve yerli hücre-matris etkileşimi korurken çok eksenli özelliklerin değerlendirilmesi izin verir56 . In vivo, hücreler aktif biyomekanik ve biyokimyasal ipuçları57,58,59değişikliklere yanıt olarak çevreleyen ECM remodel . Burada kullanılan protokol, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında toplu organ mülklerinde sonraki değişikliklerin izlenmesine izin verdiği için avantajlıdır. Bu, çok eksenli aktif ve pasif mekanik özelliklerin sistematik veri kümelerini oluşturmak için bir platform sağlanmasına yardımcı olur. Ayrıca, bu deneylerde toplanan veriler, kadın üreme organlarının sağlıklı ve sağlıklı ve mekanik tepkilerini tanımlamak ve tahmin etmek için mikroyapısal güdümlü doğrusal olmayan kurucu modelleri formüle etmek ve doğrulamak için kullanılabilir patolojik durumlar16,60.

Protokoliçin avantajlı olan bir diğer sistem bileşeni de organ duvarlarının kalınlığını ölçmek için ultrason görüntüleme kullanımıydı. Kalınlığı test sırasında yaşanan stres hesaplamak için çok önemli bilgilerdir.

Herhangi bir deneysel kurulum ile, bu yordamın bazı sınırlamalar vardır. Bu protokol şu anda sadece vajina ve serviks in elastik yanıtı değil, viskoelastik yanıt dikkate alır. Gelecekte bu sınırlamayı azaltmak için potansiyel bir yöntem sürünme ve stres gevşeme tahlilleri61içerecek şekilde mevcut protokolü değiştirmektir. İkinci bir sınırlama da organların sıkıştırılamaz olduğunu varsaymasıdır. Bu çalışmada, kalınlık sadece boş konfigürasyonda ölçüldü, gebe olmayan murine dokusunun ozmotik yükleme sırasında hacimde minimal değişiklikler gösterdiğini gösteren önceki çalışmalarla motive edildi62. Ayrıca, ek çalışmalar sıkıştırılamazlık44,60,63aynı varsayım altında faaliyet var. İdeal olarak, bir ultrason yetersizlik varsayımı ihtiyacını ortadan kaldırmak ve sonlu elemanmodelleri daha iyi bilgilendirmek için denemenin tamamı için yapılacak. Son bir sınırlama yükleme protokolleri bilgilendirmek için in vivo servikal basınç sayısaleksikliğidir. Literatür, insan kadınlarda servikal basınç olduğunu göstermektedir 37 mmHg53. Fareler, ancak, insanların farklı servikal basınç gösterebilir. Kemirgen modelleri ile insan örnekleri arasında vajinal basınç farkı gösterilmiştir64,65. Daha fazla çalışma olmayan hamile murine serviks basıncı ölçmek için gereklidir. Bu amaçla, rahim içi basınç son gebelik boyunca bildirilmiştir49.

Bu prosedürde kullanılan ticari olarak kullanılabilen basınçlı miyograf sistemi elastik, içi boş organların kuvvet özelliklerini ölçer. Bu protokol banyodaki kimyasal katkı maddelerini, kanül ölçüsünü ve dikiş kalınlığını değiştirerek diğer çeşitli organ ve dokulara kolayca uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbiri.

Acknowledgments

Çalışma NSF CAREER ödül hibe #1751050 tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
  2. Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53, (4), 541-560 (1947).
  3. Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
  4. Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75, (2), 240-243 (1990).
  5. Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215, (4), e471-e478 (2016).
  6. Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23, (23), 907-912 (2014).
  7. Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43, (43), 433-439 (2000).
  8. Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
  9. Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140, (5), (2018).
  10. Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. The McGraw-Hill Companies. (2006).
  11. Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
  12. Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143, (4), 429-438 (2012).
  13. Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193, (3), 1149-1155 (2005).
  14. Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24, (7), 838-849 (2017).
  15. Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27, (2), 327-339 (1982).
  16. Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92, (2), 287-295 (2011).
  17. Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224, (1), 33-44 (2011).
  18. Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198, (5), (2009).
  19. Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12, (108), 20150280 (2015).
  20. Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
  21. Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49, (8), 867-879 (2011).
  22. Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44, (10), 1941-1947 (2011).
  23. Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11, (9), 1419-1428 (2003).
  24. Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
  25. Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9, (12), 9379-9391 (2013).
  26. Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32, (12), 1969-1982 (2011).
  27. Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13, (3), 317-337 (2010).
  28. Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120, (2), 224-232 (2012).
  29. Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
  30. Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. 689-690 (2010).
  31. Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39, (1), 549-558 (2010).
  32. Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46, (12), 2036-2047 (2018).
  33. Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8, (4), 491-494 (1973).
  34. Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7, (4), e35538 (2012).
  35. McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
  36. Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36, (2), 133-140 (2006).
  37. Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
  38. Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103, (2), 443-447 (2006).
  39. de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 6364821 (2018).
  40. Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
  41. Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110, (1), 251-257 (1996).
  42. Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
  43. Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
  44. Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139, (10), 104504 (2017).
  45. Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14, (4), 181-201 (1977).
  46. Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19, (4), 404-417 (2015).
  47. House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28, (6), 745-749 (2006).
  48. Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
  49. Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
  50. Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64, (2), 183-186 (1985).
  51. Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67, (8), 711-716 (1988).
  52. Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9, (1), 27-37 (1997).
  53. Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
  54. Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
  55. Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
  56. Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126, (6), 787-795 (2005).
  57. Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (11), 6180-6185 (2001).
  58. Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
  59. Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36, (8), 1322-1334 (2008).
  60. Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141, (2), 021011 (2018).
  61. Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  62. Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132, (2), 021003 (2010).
  63. Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138, (5), 051008 (2016).
  64. Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
  65. van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25, (6), 799-805 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics