Overvåking ekstracellulær pH i Cross-Kingdom Biofilms ved hjelp av Confocal Microscopy

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protokollen beskriver dyrking av cross-kingdom biofilmer bestående av Candida albicans og Streptococcus mutans og presenterer en konfokal mikroskopibasert metode for overvåking av ekstracellulær pH inne i disse biofilmene.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cross-kingdom biofilmer bestående av både sopp og bakterielle celler er involvert i en rekke orale sykdommer, som endodontiske infeksjoner, periodontitt, slimhinneinfeksjoner og, spesielt, tidlig barndom karies. Under alle disse forholdene påvirker pH i biofilmmatrisen mikrobevertinteraksjoner og dermed sykdomsprogresjonen. Den nåværende protokollen beskriver en konfokal mikroskopibasert metode for å overvåke pH-dynamikk i kryssrike biofilmer bestående av Candida albicans og Streptococcus mutans. Det pH-avhengige dual-utslippsspekteret og fargeegenskapene til den metriske sonden C-SNARF-4 utnyttes for å bestemme dråper i pH i ekstracellulære områder av biofilmene. Bruk av pH-ratiometri med sonden krever et omhyggelig valg av bildeparametere, en grundig kalibrering av farsen og forsiktig, terskelbasert etterbehandling av bildedataene. Når den brukes riktig, gjør teknikken for rask vurdering av ekstracellulær pH i forskjellige områder av en biofilm og dermed overvåking av både horisontale og vertikale pH gradienter over tid. Mens bruken av konfokal mikroskopi begrenser Z-profilering til tynne biofilmer på 75 μm eller mindre, er bruken av pH ratiometri ideelt egnet for den ikke-invasive studien av en viktig virulensfaktor i biofilmer på tvers av rike.

Introduction

Cross-kingdom biofilmer bestående av både sopp og bakterielle arter er involvert i flere patologiske forhold i munnhulen. Candida spp. har ofte blitt isolert fra endodontiske infeksjoner1 og fra periodontal lesjoner2,3. I slimhinneinfeksjoner har streptokokkarter fra mitisgruppen vist seg å forbedre soppbiofilmdannelse, vevsinvasjon og formidling i både in vitro- og murinemodeller4,5,6,7. Mest interessant, muntlig transport av Candida spp. har vist seg å være forbundet med utbredelsen av karies hos barn8. Som vist i gnagermodeller, øker et symbiotisk forhold mellom Streptococcus mutans og Candidas albicans produksjonen av ekstracellulære polysakkarider og fører til dannelse av tykkere og mer kariogene biofilmer9,10.

I alle de ovennevnte forholdene, tidlig barndom karies spesielt, biofilm pH er av betydning for sykdomsprogresjon, og den eminente rollen biofilm matrise for utvikling av acidogenic mikromiljøer11 krever metoder som tillater å studere pH endringer i kryss-rike biofilmer. Enkle og nøyaktige konfokale mikroskopibaserte tilnærminger for å overvåke pH ibakterielle 12 og sopp13 biofilmer er utviklet. Med ratiometrisk e-størrelses-dye C-SNARF-4 og terskelbasert bildeetterbehandling, kan ekstracellulær pH bestemmes i sanntid i alle tre dimensjoner av en biofilm14. Sammenlignet med andre publiserte teknikker for mikroskopibasert pH-overvåking i biofilmer, er pH ratiometri med C-SNARF-4 enkel og billig, fordi det ikke krever syntese av partikler eller forbindelser som inkluderer et referansefarge15 eller bruk av tofotær eksitasjon16. Bruk av bare ett farge forhindrer problemer med probe compartmentalization, fluorescerende blødning, og selektiv bleking16,17,18 samtidig som det muliggjør en pålitelig differensiering mellom intra- og ekstracellulær pH. Til slutt utføres inkubasjon med dye etter biofilmvekst, noe som gjør det mulig å studere både laboratorium og in situ-dyrkede biofilmer.

Målet med det nåværende arbeidet er å utvide bruken av pH ratiometri og gi en metode for å studere pH-endringer i kryssrike biofilmer. Som konseptbevis brukes metoden til å overvåke pH i biofilmer med to arter bestående av S. fåredyr og C. albikaner eksponert for glukose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen for spyttsamling ble gjennomgått og godkjent av Etikkkomiteen i Aarhus Fylke (M-20100032).

1. Dyrking av cross-kingdom biofilmer

  1. Vokse S. mutans DSM 20523 og C. albicans NCPF 3179 på blod agar plater ved 37 ° C under aerobe forhold.
  2. Overfør enkeltkolonier av hver organisme for å reagensrør fylt med 5 ml hjernehjerteinfusjon (BHI). Vokse i 18 timer under aerobe forhold ved 37 °C.
  3. Sentrifuge over natten kulturer på 1200 x g i 5 min. Kast supernatanten, resuspender cellene i fysiologisk saltvann og juster OD550 nm til 0,5 for C. albicans (~ 107 celler / ml) og S. fårekjøtt (~ 108 celler / ml). Fortynn S. mutans suspensjon 1:10 med steril fysiologisk saltvann (~ 107 celler / ml).
  4. Pipette 50 μL steril spyttoppløsning, utarbeidet i henhold til metoden for de Jong et al.19,inn i brønnene til en optisk bunn 96-brønnplate for mikroskopi. Inkubat i 30 min ved 37 °C. Vask brønnene 3x med 100 μL steril fysiologisk saltvann. Tøm brønnene.
  5. Tilsett 100 μL C. albikaner suspensjon til hver brønn. Inkuber ved 37 °C i 90 min. Vask 3x med steril fysiologisk saltvann.
    MERK: Ikke tøm brønnene helt under vasking. La et reservoar på 20 μL for å unngå overdreven skjærkrefter.
  6. Tilsett 100 μL varmeinaktivert fosterstorfeserum (inaktivert ved 56 °C i 30 min) til hver brønn. Inkuber ved 37 °C i 2 timer. Vask 3x med steril fysiologisk saltvann. Tøm brønnene, og la et reservoar på 20 μL.
  7. Tilsett 100 μL S. mutans suspensjon (utarbeidet i trinn 1.3) til hver brønn. Tilsett 150 μL BHI som inneholder 5% sukrose. Inkuber ved 37 °C i 24 timer eller lenger. Når du dyrker eldre biofilmer, endre mediet daglig til frisk BHI. På slutten av den tverrrike biofilm vekstfasen, vask 5x med steril fysiologisk saltvann.

2. Ratiometrisk pH-avbildning

MERK: Ratiometrisk pH-avbildning må utføres umiddelbart etter at biofilmveksten er fullført.

  1. For ratiometrisk pH-avbildning, bruk et invertert konfokal laserskannemikroskop med en 63x olje- eller vannnedsenkinglinse, en 543 nm laserlinje og et spektralbildesystem (dvs. META-detektor) for å tillate avbildning av overlappende fluorescerende signaler. Bruk en inkubator til å varme mikroskopstadiet til 35 °C.
  2. Still inn detektoren for å sikre påvisning av grønn fluorescens fra 576-608 nm og samtidig påvisning av rød fluorescens fra 629-661 nm. Velg en passende lasereffekt og gevinst for å unngå over- og undereksponering.
    MERK: Eksponering av bildene er best sett i palettbilder med falsk farging.
  3. Sett pinhole-størrelsen til 1 luftig enhet eller en optisk skive på ~0,8 μm. Sett bildestørrelsen til 512 x 512 piksler og skannehastigheten til 2. Velg et linjegjennomsnitt på 2, ved hjelp av gjennomsnittsalternativet.
    MERK:I begynnelsen av en rekke eksperimenter, sjekk at de valgte mikroskopinnstillingene gir en klar kontrast mellom bakterielle celler, soppcellevegger, biofilmmatrise og soppcytoplasma.
  4. Forbered 100 μL steril fysiologisk saltvann som inneholder 0,4 % (w/v) glukose, titreret til pH 7. Forbered en lagerløsning av C-SNARF-4 (1 mM i dimetylsulfoksid). Tilsett ye til en endelig konsentrasjon på 30 μM.
    FORSIKTIG: Bruk nitrilhansker når du håndterer forholdsforholdetmetrisk eske.
  5. Tøm en av brønnene med en biofilm på tvers av kongedømmene, og la et reservoar på 20 μL. Tilsett den sterile saltvannen som inneholder glukose og det metriske farmetriske hellen. Plasser 96-brønnplaten på mikroskopstadiet og begynn å forestille seg biofilmen.
  6. Få enkeltbilder eller Z-stabler på forskjellige steder i biofilmen. Merk X-Y-posisjonen i mikroskopprogramvaren for å følge pH-endringer i bestemte visningsfelt over tid. Med jevne mellomrom, ta bilder med laseren slått av for å korrigere for detektorforskyvning.
  7. Gjenta trinn 2.4-2.6 for analysen av hver biofilm dyrket i en annen brønn.

3. Kalibrering av ratiometrisk dye

MERK: Kalibrering av farge og montering av en kalibreringskurve kan utføres på en annen dag enn ratiometrisk pH-avbildning.

  1. Forbered en serie på 50 mM 2-morfonoethanesulfonsyre (MES) buffer titreret til pH 4.0−7.8 i trinn på 0,2 pH-enheter ved 35 °C. Pipette 150 μL av hver bufferløsning inn i brønnene til en optisk bunn 96-brønnplate for mikroskopi.
  2. Tilsett ye til de bufferfylte brønnene til 96-brønnplaten til en endelig konsentrasjon på 30 μM. La likevekt i 5 min.
  3. Varm mikroskopstadiet til 35 °C. Velg de samme mikroskopinnstillingene som for metrisk pH-avbildning. Plasser 96-brønnplaten på mikroskopstadiet. Fokuser på bunnen av brønnene. Få to bilder (grønn og rød kanal) for alle bufferløsninger, 5 μm over bunnen av brønnen. Med jevne mellomrom, ta bilder med laseren slått av for å korrigere for detektorforskyvning.
  4. Utfør kalibreringseksperimentet i triplicate.
  5. Eksporter alle bilder som TIF-filer. Importer dem til dedikert bildeanalyseprogramvare (dvs. ImageJ20). Trekk fra bildene som er tatt med laseren slått av fra de respektive bildene av bufferløsningene ved å klikke Prosess | Bilde kalkulator | Trekk fra).
    MERK: Beskjær om nødvendig bildene for å eliminere artefakter ved bildekantlinjene ved å utføre rektangulært valg ved hjelp av Bilde | Beskjær.
  6. Del de grønne kanalbildene gjennom de røde kanalbildene og beregn gjennomsnittlig fluorescensintensiteter i de resulterende bildene ved å klikke analyser | Histogrammet.
  7. Fra triplicate eksperimenter, plotte gjennomsnittlig grønn / rød forhold mot pH. Bruk dedikert programvare for å tilpasse en funksjon til kalibreringsdataene (dvs. MyCurveFit).

4. Digital bildeanalyse

MERK: Digital bildeanalyse kan utføres når som helst etter kalibrering av dye og ratiometric pH-avbildning.

  1. Oppbevar de grønne og røde kanalbiofilmbildene i separate mapper og gi nytt navn til begge filer med sekvensielle tall (f.eks. GREEN_0001). Importer bildene til dedikert bildeanalyseprogramvare (dvs. ImageJ). Klikk på Analyser | Histogrammet for å bestemme den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten i bildene tatt med laseren av og trekke verdien fra biofilmbildene ved å klikke Prosess | Matematikk | Trekk fra.
  2. Importer 2 bildeserien til dedikert bildeanalyseprogramvare (dvs. daime21). Utfør en terskelbasert segmentering av bildene for den røde kanalen (Segment | Automatisk segmentering | Egendefinert terskel). Sett den "lave" terskelen over fluorescensintensiteten til soppcytoplasma og den "høye" terskelen under intensiteten av soppcelleveggene og bakteriene.
    MERK:Når det er valgt passende terskler, gjenkjennes bare ekstracellulære områder som objekter.
  3. Overfør objektlaget for den segmenterte bildeserien til den grønne kanalbildeserien. Hvis du vil gjøre dette, klikker du Segment | Overfør objektlag.
    MERK: Hvis kontrasten mellom ekstracellulære områder og soppcytoplasma er for svak i de enkelte fargekanalene, legger du til den grønne kanalbildeserien i den røde kanalserien før segmentering ved å klikke Rediger | Bilde kalkulator | Tillegg. Utfør segmenteringen som beskrevet under 4.2, og overfør objektlaget for den segmenterte bildeserien til både den grønne og den røde kanalbildeserien.
  4. Bruk objektredigeringsprogrammet til å slette ikke-objektpiksler i den røde og grønne kanalbildeserien (Visualizer | Objekt redaktør | I alle bilder | Slett ikke-objektpiksler). Nå er biofilmbildene ryddet fra både bakterielle og soppceller. Eksporter den behandlede bildeserien som TIF-filer.
  5. Importer begge bildeseriene til ImageJ. ImageJ tilordner en intensitet på 0 til alle ikke-objektpiksler. Fjern disse pikslene ved å dele den røde bildeserien (R1) av seg selv (Prosess | Bilde kalkulator | Bilde 1: R1; Operasjon: Splitt; Bilde 2: R1) og multiplisere den resulterende bildeserien (R2) med den opprinnelige røde bildeserien (Prosess | Bilde kalkulator | Bilde 1: R1; Operasjon: Multipliser; Bilde 2: R2). En tredje bildeserie (R3) er opprettet, identisk med R1, bortsett fra det faktum at NaN er tilordnet til alle piksler med en intensitet på 0 i R1. Fortsett på samme måte med den grønne bildeserien.
  6. Bruk 'Mean'-filteret (Prosess | Filtre | Mener | Radius | 1 piksel) på den røde og grønne kanalbildeserien for å kompensere for detektorstøy. Del den grønne kanalbildeserien etter bildeserien for den røde kanalen (Prosess | Bilde kalkulator | Bilde 1: G3; Operasjon: Splitt; Bilde 2: R3). Den resulterende bildeserien (G3/R3) viser det grønne/røde forholdet for alle objektpiksler.
  7. Beregn gjennomsnittsforholdet for hvert bilde (Analyser | Histogrammet). Bruk falsk fargelegging for bedre visuell representasjon av forholdene i bildene (Bilde | Oppslagstabeller). Konverter de grønne/røde forholdtil pH-verdier som bruker funksjonen som er montert under 3,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter 24 timer og 48 timer utviklet robuste biofilmer på tvers av kongedømmene i brønnplatene. C. albicans viste varierende grad av filamentous vekst, og S. fårekjøtt dannet tette klynger på opptil 35 μm i høyden. Enkeltceller og kjeder av S. fårekjøtt gruppert rundt sopphyphae, og store intercellulære mellomrom indikerte tilstedeværelsen av en voluminøs matrise (Figur S1).

Kalibrering av det ratiometriske farge gir en asymmetrisk sigmoidal kurve13,14. Den ekstracellulære pH i biofilmene falt raskt i de første 5 min etter eksponering for glukose ved forskjellige hastigheter i forskjellige mikroskopiske synsfelt. Deretter bremset forsuringen, vanligvis nådde verdier på 5,5-5,8 etter 15 min (Figur 1). Replikerbiofilmer viste en lignende atferd, med bare små variasjoner i gjennomsnittlig pH (figur S2).

Nøyaktigheten av pH-beregningene er sterkt avhengig av et nøye utvalg av bildeinnstillinger under oppkjøp. For de aktuelle biofilmene viste en optisk skive på 0,8 μm seg å være ideell for å oppnå best mulig kontrast mellom ekstracellulære områder og soppcytoplasma (figur S3). Videre en pikselstørrelse på 0,28 μm (Figur S4),en piksel oppholdstid på 102,4 μs (figur S5)og et linjegjennomsnitt på 2 (Figur S6) ga en god kontrast sammen med en akseptabel bildeanskaffelsestid på ~ 1 min. Under bildeetterbehandling ble alle bakterielle og soppceller fjernet fra bildene, mens de fleste av de omkringliggende ekstracellulære områdene ble inkludert i den påfølgende pH-analysen. Avhengig av lysstyrken på bildene, måtte forskjellige øvre og nedre terskler velges (figur 2).

PH-dataene som vises i figur 1 og figur S2 ble registrert 5 μm fra biofilm-substratum-grensesnittet. Med økende avstand fra substratet, og avhengig av celletettheten i biofilmene, reduseres fluorescensintensiteten, noe som resulterer i en lavere kontrast mellom celler og matrise. Men i de tynne biofilmene (~ 35 μm) dyrket i den nåværende studien, tillot kontrast på toppen av biofilmen pålitelig bildeanalyse(Figur S7A).

Figure 1
Figur 1: Bruk av pH-ratiometri i biofilmer med kryssrike utsatt for glukose. (A) Et synsfelt i en farget biofilm ble avbildet med konfokal mikroskopi og området dekket av bakterielle og soppceller ble fjernet før ratiometrisk analyse. (B) PH i ekstracellulære plass ble beregnet og visualisert ved hjelp av en oppslagstabell (16 farger). Skala barer = 20 μm. (C) PH i 24 h cross-kingdom biofilms falt raskt ved eksponering for glukose på litt forskjellige priser i forskjellige synsfelt. Feilfelt = standardavvik (SD). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Terskelbasert bildesegmentering av fargede biofilmer. På grunn av de lokale pH-endringene endres fluorescensintensiteten i biofilmene over tid. (A) og (B) viser det samme mikroskopiske synsfeltet etter henholdsvis 1 min og 15 min eksponering for glukose. Under bildesegmentering må høye og lave terskler velges tilstrekkelig for å eliminere alle områder som dekkes av bakterielle og soppceller. (C) Blå områder ble eliminert av lavterskel (40), røde områder av høy terskel (115). (D) Bare ekstracellulære områder ble gjenkjent som objekter (omgitt av oransje linjer). (E) Etter eliminering av området som dekkes av mikrobielle celler, kan pH-beregningen utføres i biofilmmatrisen. Skalerstolper = 20 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 1
Figur S1: Typisk 24 h cross-kingdom biofilm farget med ratiometrisk eske. Mange C. albicans celler viste filamentous vekst, mens S. fårekjøtt (gul) celler dannet tette klynger eller lokalisert rundt sopp hyphae som enkeltceller eller kjeder. Store intercellulære rom indikerte tilstedeværelsen av en voluminøs biofilmmatrise. Skalerstolper = 20 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 2
Figur S2: PH-utbyggingen i biofilmer med kryssrike på 24 timer eksponert for glukose. (A), (B), og (C) PH ble bestemt ratiometrisk i tre replikere biofilmer i 15 min etter eksponering for glukose. Etter en rask pH-nedgang i de første 5 min, bremset forsuringen, og nivåene på 5,5−5,8 ble nådd etter 15 min. Litt forskjellige priser ble observert i forskjellige mikroskopiske synsfelt (hver representert med en linje). Kalibrering av ratiometrisk sonde ble bare utført én gang. Feilfelt = SD. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 3
Figur S3: Virkningen av optisk skivetykkelse på bildekontrast. Bilder av fargede biofilmer ble kjøpt med (A) en pinhole størrelse på 2 luftige enheter og en optisk skive tykkelse på 1,6 μm, og (B) 1 Luftig enhet og en optisk skive på 0,8 μm. Ved 1 Airy Unit var det behov for høyere laserkraft/forsterkning for bildeoppkjøp, men kontrasten mellom soppcytoplasma og ekstracellulære områder forbedret seg. Skalerstolper = 20 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 4
Figur S4: Virkningen av oppløsning på bildekontrast. Bilder av fargede biofilmer ble kjøpt med pikselstørrelser på (A) 1,12 μm, (B) 0,56 μm, (C) 0,28 μm, (D) 0,14 μm, og (E) 0,11 μm. Reduksjon av pikselstørrelsen under 0,28 μm forbedret ikke kontrasten mellom ekstracellulære områder og soppcytoplasma. Skalerstolper = 20 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 5
Figur S5: Virkningen av skannehastighet på bildekontrast. Bilder av fargede biofilmer ble kjøpt med pikselbotider på (A) 12,8 μs, (B) 25,6 μs, (C) 51,2 μs, (D) 102 μs, og (E) 164 μs. Øke pikselen botid utover 102 μs forbedret ikke kontrasten mellom ekstracellulære og intracellulære områder. Skalerstolper = 20 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 6
Figur S6: Virkningen av snitt på bildekontrast. Bilder av fargede biofilmer ble kjøpt med linjegjennomsnitt (gjennomsnitt) på (A) 1, (B) 2 og (C) 4. Et linjegjennomsnitt på 2 ga det beste kompromisset mellom kontrast og oppkjøpstid. Skalerstolper = 20 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Supplemental Figure 7
Figur S7: Bildekontrast i rent soppbiofilmer og biofilmer på tvers av rike. (A) Toppen av en farget cross-kingdom biofilm ble avbildet 30 μm fra grensesnittet. Kontrasten mellom ekstracellulære og intracellulære områder var lavere enn ved biofilmbasen, men fortsatt tilstrekkelig for ratiometrisk pH-analyse. (B) A C. albicans monospecies biofilm ble avbildet for pH ratiometri. Laserkraft/forsterkning kan økes for å optimalisere kontrasten mellom soppcellevegger og cytoplasma. (C) I cross-kingdom biofilms, de sterkt fluorescerende bakterier utelukket ytterligere økning av laserkraft / gevinst. Derfor er kontrasten mellom soppcellevegger og cytoplasma mindre uttalt enn i rent soppbiofilmer. Skalerstolper = 20 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ulike protokoller for dyrking av cross-kingdom biofilms som involverer C. albicans og Streptococcus spp. har blitt beskrevet tidligere9,22,23,24,25. Det nåværende oppsettet fokuserer imidlertid på enkle vekstforhold, en tidsplan som er kompatibel med vanlige arbeidsdager, en balansert artssammensetning og utviklingen av en voluminøs biofilmmatrise. Videre ble 96-brønnplater belagt med spyttløsning for å etterligne orale forhold for vedheking til en viss grad.

Bruken av pH ratiometri med C-SNARF-4 er en billig metode for raske målinger av biofilm pH, fordelene og ulempene som har blitt diskutert i detalj andre steder12,26. Kort sagt, teknikken gjør det mulig for vurdering av pH på forskjellige steder inne biofilms og dermed overvåking av horisontale pH gradienter og pH utviklinger over tid27. Vertikale pH-profiler kan også registreres, men penetrasjonsdybden er begrenset av bruk av konfokal mikroskopi. Derfor representerer pH ratiometri et raskere, mer allsidig og mindre invasivt alternativ til pH-mikroelektroder, som for tiden er metoden for valg for Z-profilering av tykke biofilmer28. Sammenlignet med andre mikroskopibaserte metoder for pH-opptak i biofilmer, har pH ratiometri med C-SNARF-4 fordelen av bare å ansette en flekk. Derfor er flere problemer som kan oppstå fra differensialfluorescerende atferd og samspillet mellom forskjellige fargestoffer omgått26.

I biofilmer på tvers av kongedømmene utgjør terskelbasert differensiering mellom mikrobiell biomasse og ekstracellulære områder noen problemer sammenlignet med biofilmer som bare omfatter bakterielle eller soppceller. Bakterielle celler internaliserer det ratiometriske farge og viser et lyst fluorescerende signal sammenlignet med biofilmmatrisen, men også sammenlignet med soppcellevegger. Soppcellevegger vises noe lysere enn biofilmmatrisen, som igjen viser høyere fluorescens enn soppcytoplasma. I biofilmer som bare består av soppceller, kan bilder kjøpes med høy laserkraft/ gevinst, noe som resulterer i tilstrekkelig kontrast mellom biofilmmatrisen og soppcytoplasma (Figur S7B). Når bakterier er til stede, må laserkraft/gevinst reduseres for å unngå overeksponering av bakterielle celler (Figur S7C). Derfor er kontrasten mellom soppcytoplasma og ekstracellulære områder ikke så uttalt, og bildeinnstillinger som pinhole størrelse, pikselstørrelse og piksel-dwell tid må velges med stor forsiktighet for ratiometrisk analyse.

Når det gjelder alle mikroskopibaserte teknikker, er bildekvalitet og oppkjøpstid omvendt korrelert. I dagens cross-kingdom biofilms, en bildetid på ~ 30 s, ideelt 1 min, var nødvendig for å oppnå en passende kvalitet for påfølgende pH analyse. Til sammenligning kan biofilmer som bare har bakterier avbildet med tilstrekkelig kvalitet i 10 s eller mindre29. For mikroskopianalyser av biofilmvekst, struktur eller sammensetning utgjør ikke anskaffelsestider på 1 min et problem, og i mange tilfeller kan dette også gjelde for pH-opptak. Ekstreme pH-endringer, for eksempel den raske forsuringen som observeres umiddelbart etter eksponering for glukose (ΔpH > 1 enhet/min), er vanskelige å overvåke i biofilmer på tvers av rike.

Det nåværende arbeidet viser at ratiometriske pH-opptak med C-SNARF-4 er gjennomførbare i kryssrike biofilmer bestående av S. mutans og C. albicans. Fremtidige studier kan benytte metoden for å analysere pH-endringer i kryssrike biofilmer med større artsmangfold, spesielt i biofilmer dyrket in situ (dvs. hos barn med barnehagekaries)30. I denne studien ble pH i biofilmene overvåket under statiske forhold og i en begrenset observasjonstid på 15 min, rett etter en glukosepuls. Ytterligere fremskritt kan omfatte anvendelse av en væskestrøm for å etterligne in situ forhold nærmere14,31,32. Videre kan pH ratiometri brukes til å studere virkningen av ulike ernæringsmessige forhold på langsiktige pH-endringer i kryssrike biofilmer og bidra til å belyse effekten av biofilm pH på det underliggende vertsvevet. Igjen, demineralisering av dental emalje i tidlig barndom karies kan tjene som et fremtredende eksempel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Anette Aakjær Thomsen og Javier E. Garcia er anerkjent for utmerket teknisk støtte. Forfatterne takker Rubens Spin-Neto for fruktbare diskusjoner om bildeanalyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97, (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14, (1), 0210527 (2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35, (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16, (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214, (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, (11), 7967 (2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80, (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52, (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82, (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13, (6), 1006407 (2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92, (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18, (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75, (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92, (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2, (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47, (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8, (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11, (3), 0150457 (2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51, (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9, (11), 1242 (2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81, (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76, (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6, (9), 25299 (2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28, (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics