Migrasjon, kjemo-attraksjon og co-kultur analyser for menneskelige stamcelle-avledet endotelceller og GABAergic Nevroner

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi presenterer tre enkle in vitro analyser-langdistanse migrasjon analyse, co-kultur migrasjon analyse, og kjemo-attraksjon analyse-som kollektivt vurdere funksjonene til menneskelige stamcelle avledet periventtrikulær endotelceller og deres interaksjon med GABAerge interneuroner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Datta, D., Vasudevan, A. Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons. J. Vis. Exp. (155), e60295, doi:10.3791/60295 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rollen til hjernens vaskulatur i nervesystemet utvikling og etiologi av hjernesykdommer blir stadig mer oppmerksomhet. Våre nyere studier har identifisert en spesiell populasjon av vaskulære celler, periventtrikulære endotelceller, som spiller en kritisk rolle i migrering og distribusjon av forebrain GABAergic interneurons under embryonisk utvikling. Dette, kombinert med deres celle-autonome funksjoner, hentydder til nye roller av periventtrikulære endotelceller i patologien til nevropsykiatriske lidelser som schizofreni, epilepsi og autisme. Her har vi beskrevet tre forskjellige in vitro analyser som kollektivt evaluerefunksjonene til periventtrikulære endotelceller og deres interaksjon med GABAergic interneurons. Bruk av disse analysene, spesielt i menneskelig sammenheng, vil tillate oss å identifisere sammenhengen mellom periventtrikulære endotelceller og hjernesykdommer. Disse analysene er enkle, lave kostnader og reproduserbare, og kan enkelt tilpasses enhver tilhengercelletype.

Introduction

Endotelceller danner foring av blodkar og megle viktige funksjoner som inkluderer vedlikehold av fartøyets veggpermeabilitet, regulering av blodstrøm, blodplateaggregasjon og dannelse av nye blodkar. I hjernen er endotelceller en del av en kritisk blod-hjernebarriere som kontrollerer utveksling av materialer mellom hjernen og blodet1. Våre studier i det siste tiåret har identifisert nye nevrogene roller i hjernen endotelceller som har betydelige implikasjoner for hjernens utvikling og atferd2,3,4,5. Vi har vist at musen embryonale forebrain er vaskalisert av to forskjellige undertyper av fartøy, pial fartøy og periventrikulære fartøy, som varierer i anatomi, opprinnelse, og utviklingsprofil2. Endotelceller som fôrer disse to fartøyundertypene viser tydelige forskjeller i genuttrykksprofilene sine. Mens pial endotelceller for det meste uttrykker gener relatert til betennelse og immunrespons, er periventrikulære endotelceller unikt beriket i uttrykk for gener som vanligvis er forbundet med nevrogenese, nevronal migrasjon, chemotaxis og axon veiledning3. Periventtrikulære endotelceller huser også en ny GABA-signalvei som er forskjellig fra den tradisjonelle nevronale GABA-signalveien5. Samtidig med genuttrykket ble periventrikulære endotelceller funnet å regulere migrasjon og distribusjon av GABAerge interneuroner i den utviklende neocortex. Under embryonisk utvikling gjennomgår periventrikulære endotelceller langdistansemigrasjon langs en ventral-dorsal gradient for å etablere det periventrikulære vaskulære nettverket2,3. Denne trekkruten speiles en dag senere av interneuroner. Migrerende interneuroner samhandler fysisk med det forhåndsdannede periventrikulære vaskulære nettverket og bruker det som et styreskinne for å nå sitt endelige mål i neocortex. I tillegg til å fungere som et fysisk substrat, tjener periventulære endotelceller som kilden til navigasjonssignaler for migrerende nevroner. Periventtrikulær endotelcelleutskilles GABA guider interneuron migrasjon og regulerer deres endelige distribusjonsmønstre4. Defekter i interneuron migrasjon og distribusjon er forbundet med nevropsykiatriske lidelser som autisme, epilepsi, schizofreni og depresjon6,7,8,9,10. Derfor blir studie av periventrikulære endotelcellefunksjoner og deres innflytelse på interneuronmigrasjon i menneskelig sammenheng avgjørende for å håndtere patogenesen av disse lidelsene.

Vi har generert humane periventrikulære-lignende endotelceller fra humane embryonale stamceller i vårt laboratorium11, ved hjelp av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi12,13. For å validere om menneskelige periventrikulære endotelceller trofast etterligner mus periventtrikulær endotelceller, og for å kvantitativt vurdere deres innflytelse på interneuron migrasjon, utviklet vi tre in vitro analyser: en langdistanse migrasjon analyse, en co-kultur migrasjon analyse, og en kjemo-attraksjon analyse. Her beskriver vi protokoller for disse analysene i detalj. Alle tre analysene er basert på bruk av silikonkulturinnsatser for å skape en liten rektangulær cellelapp (av faste dimensjoner) omgitt av cellefri plass. Overføringsavstanden evalueres ved å måle avstanden mellom de endelige plasseringene til cellene fra kanten av det rektangulære plasteret som er skissert på dag 0. I langdistanse migrasjonsanalysen seedes humane periventrikulære endotelceller som en i midten av en 35 mm tallerken, og avstandene som kjøres av cellene over lang tid beregnes. I co-kultur migrasjon analysen, menneskelige periventrikulære endotelceller er co-seeded med menneskelige interneurons som en i en 35 mm tallerken. Dette oppsettet tillater undersøkelse av effekten av direkte fysiske interaksjoner av disse to celletypene på frekvensen av migrering av interneuroner. Den kjemo-attraksjon analysen måler migrasjon av interneurons som svar på kjemo-attraktive signaler utskilt av menneskelige periventtrikulære endotelceller. Interneurons er seeded som en rektangulær patch, med menneskelige periventtrikulære endotelceller og kontroll ikke-periventtrikulær endotelceller sådd som lignende størrelse flekker på hver side. Hver av cellepatchene er adskilt av et cellefritt gap på 500 μm. Respons av interneuroner vurderes ved å kvantifisere antall celler som har migrert mot periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontroll av ikke-periventtrikulære endotelceller.

Disse analyser gir robust vurdering av menneskelige periventrikulære endotelcellefunksjoner og deres innflytelse på interneuronmigrasjon. Det nye oppsettet av langdistanseanalyse og co-kultur migrasjon analyse gir cellefri plass i området centimeter (~ 1-1,5 cm) for å tillate påvisning av langdistanse migrasjon. Et sammendrag av funksjonene i våre analyser sammenlignet med andre populære analyser presenteres i tabell 1. Samlet vil analysene som er beskrevet her tjene som en plattform for å vurdere "syke" periventrikulære endotelceller og interneuroner generert fra iPSCer av hjernesykdommer som schizofreni, autisme eller epilepsi. Disse analysene kan også brukes til å avgjøre hvordan ulike forhold (f.eks. hemmere, ligander, RNAi) påvirker cellemigrasjon. Til slutt kan disse analysene optimaliseres for andre celletyper for å måle langdistanseoverføring, kjemo-tiltrekning eller cellecellemediert migrering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kultur og lagring av humane periventtrikulære endotelceller

  1. Vedlikehold humant periventtrikulær endotelceller på kjellermembranmatrisebelagt (se Materialtabell) 6-brønnplater i periventtrikulær endotelcellemedium (E6 medium som inneholder 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 og 5 μM GABA) ved 37 °C og 5 % CO2. Bytt medium hver eneste dag.
  2. Tin kjellermembranmatrisen i 4 °C, og lag en 1:100-løsning ved å fortynne den i kaldt DMEM/F12 medium. Coat hver brønn av en 6-brønn plate med 1 ml matriseløsning. Inkubatplater ved 37 °C i minst 1 time før bruk.
  3. Tillat menneskelige periventrikulære endotelceller å nå en samtidighet på 80%-90%. Aspirate medium fra brønnen. Vask brønnene én gang med 1 ml steril 1x PBS per brønn.
  4. Løsne celler ved å legge til 1 ml celledissosiasjonsoppløsning (se Materialtabell) per brønn. Inkubat ved 37 °C i 5 min. Etter 5 min, tilsett 1 ml periventrikulær endotelcellemedium. Overfør celleoppløsningen til et 15 ml konisk rør.
    MERK: Vi bruker Accutase for celledissosiasjon her, i motsetning til TrypLE i avsnitt 3 og 4.
  5. Sentrifugeceller ved 500 x g i 5 min ved romtemperatur, aspirere supernatanten og resuspendere cellepellet en ml periventrikulær endotelcellemedium.
  6. Telle levende celler ved hjelp av trypan blå ekskluderingsmetode. Frøceller i ferske matrisebelagte plater med en tetthet på 1,2 x 105 celler/cm2. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2.
  7. Oppbevar humane periventrikulære endotelceller ved å kryobevare i frysemedium (90 % periventrikulær endotelcellemedium og 10 % DMSO).
    1. Dissosiere og samle celler etter trinn 1.3 og 1.4 ovenfor. Telle celler i løsningen ved hjelp av trypan blå ekskluderingsmetode.
    2. Sentrifugeceller ved 500 x g i 5 min ved romtemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender cellepellet en 5 x 106 celler / ml frysemiddel.
    3. Dispenser 1 ml frysing medium pluss celler per kryovial. Plasser hetteglassene i isopropanolfylt kammer og avkjøl over natten i -80 °C ved 1 °C/min. Overfør hetteglassene til en flytende nitrogentank neste dag for langtidslagring.

2. Utarbeidelse av humane periventtrikulære endotelceller for analyse

  1. Tillat menneskelige periventrikulære endotelceller å nå 70%-80% samløp.
  2. Dissosiere celler etter trinn 1,3 til 1,5 som beskrevet ovenfor. Telle celler ved hjelp av trypan blå ekskluderingsmetode.

3. Utarbeidelse av humane GABAerge interneuroner for analyse

MERK: Humanindusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledet GABAergic interneurons og nevronale medium ble kommersielt kjøpt (se Tabell av materialer). Nevronene genereres ved å differensiere en menneskelig fibroblast-avledet iPSC-linje etter en protokoll utviklet av produsenten. Cellene ble tint og dyrket i henhold til produsentens protokoll.

  1. Tin menneskelige GABAergic interneurons og kultur dem i 12-brønn plate i to uker til en samløpet på 70%-80%.
  2. På analysedagen, varm celle dissosiasjon smiddel (se Tabell av materialer)og en aliquot av nevronal medium ved 37 ° C i 10 min før bruk.
  3. Aspirer medium fra hver brønn som inneholder cellene. Vask celler med 1 ml steril 1x PBS per brønn.
  4. Løsne celler ved å legge til 0,5 ml pre-oppvarmet dissosiasjonsløsning per brønn og inkuber ved 37 °C i 5 min. Tilsett 1 ml nevronalt medium per brønn. Overfør celleoppløsningen til et 15 ml konisk rør. Triturate forsiktig for å dissosiere celleklumper.
  5. Sentrifugeceller ved 380 x g i 5 min ved romtemperatur, aspirer supernatanten og resuspendere cellepelleten i 1 ml nevronalt medium. Telle levende celler ved hjelp av trypan blå ekskluderingsmetode.

4. Utarbeidelse av kontroll humane endotelceller for analyse

MERK: Kontroll av humane iPSC-avledede endotelceller og endotelcellemedium ble kommersielt kjøpt (Materialtabell). Disse endotelcellene genereres ved å differensiere en menneskelig fibroblast-avledet iPSC-linje for å endotelskjebnen etter en protokoll utviklet av produsenten. Cellene ble tint og dyrket på Fibronectin substrat i henhold til produsentens protokoll. Fibronectin-belagte plater ble utarbeidet etter produsentens protokoll.

  1. Tine kontroll menneskelige endotelceller og kultur dem i 6-brønnplate til en samløpet på 80%-90%.
  2. På analysedagen, varm celle dissosiasjonsløsning (se Tabell over materialer)og en aliquot av endotelmedium ved 37 °C i 10 min før bruk.
  3. Aspirer mediet fra hver brønn som inneholder cellene. Vask celler med 1 ml steril 1x PBS per brønn.
  4. Løsne celler ved å legge til 0,5 ml av pre-oppvarmet dissosiasjonsløsning per brønn. Inkuber ved romtemperatur i 5 min. Tilsett 1 ml endotelcellemedium per brønn for å nøytralisere dissosiasjonsløsningen. Overfør celleoppløsningen til et 15 ml konisk rør.
  5. Sentrifugeceller ved 200 x g i 5 min ved romtemperatur. Aspirer supernatant og resuspendere cellepellet i 1 ml endotelcellemedium. Telle levende celler ved hjelp av trypan blå ekskluderingsmetode.

5. Utarbeidelse av en-brønnkultur innsatser

  1. Tin 1 mg/ml lamininoppløsning ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
  2. Coat et passende antall 35 mm retter med 0,01% poly-L-ornithine løsning (1 ml per tallerken). Inkuber opp vaskene i romtemperatur i minst 1 timer.
  3. Fortynn 1 mg/ml lamininoppløsning 1:300 i sterilt vann til en endelig konsentrasjon på 3,3 μg/ml umiddelbart før bruk.
  4. Fullstendig aspirer poly-L-orniditt fra hver tallerken. Skyll hver tallerken grundig 3x med sterilt vann og aspirer helt for å unngå poly-L-ornithine-indusert celletoksisitet.
  5. Tilsett 1 ml 3,3 μg/ml lamininoppløsning til hver tallerken og inkubator ved 37 °C over natten eller minst 1 t. Fjern lamininoppløsningen fra fatet umiddelbart før bruk.
    MERK: Du kan også oppbevare lamininholdige retter i 4 °C. Equilibrate oppvasken i en 37 ° C celle kultur inkubator før bruk.
  6. Klipp tre sider av en brønn av en to-brønn silikon kultur innsats (Figur 1A) ved hjelp av et sterilt blad for å generere en en-brønn innsats (Figur 1B).
    MERK: Hold tobrønnsinnsatsen godt festet til overflaten av originalemballasjen mens du kutter for å sikre et jevnt kutt og beskytt limet på innsatsen.
  7. Aspirate laminin løsning fra rettene.
    MERK: Vask ikke oppvasken med steril PBS eller vann etter lamininininkubasjon. Våte overflater vil forhindre stram vedhet av kulturinnsatsen.
  8. Fjern en brønninnsats med sterile pinsett og legg den i midten av poly-L-ornithine/lamininbelagt parabolen. Trykk langs kantene på innsatsen for å feste den til overflaten av parabolen.
  9. Snu parabolen forsiktig opp ned for å kontrollere at innsatsen er godt festet.
  10. Hold parabolen opp ned og merk grensen til innsettingsrommet ved hjelp av en permanent svart markør med en ultrafin spiss (figur 1C).

6. Langdistanse migrasjonsanalyse

  1. Suspendere menneskelige GABAergiske interneuroner ved en konsentrasjon på 3 x 104 celler/ 70 μL nevronalt medium. Frø 70 μL celleoppløsning inne i hver en-brønnkulturinnsats.
    MERK: Frøtettheten av interneuroner er i henhold til produsentens anbefaling.
  2. Suspendere humane periventrikulære endotelceller ved en konsentrasjon på 3 x 104 celler/70 μL periventrikulær endotelcellemedium. Frø 70 μL celleoppløsning inne i hver en-brønnkulturinnsats.
    MERK: Antall humane periventrikulære endotelceller seeded på et 1:1-forhold med antall seedede nevroner.
  3. Tilsett 1 ml nevronalt medium i nevronfat for å fylle området rundt innsatsen og forhindre at belegget tørker. På samme måte legger du til 1 ml periventrikulær endotelcellemedium i periventtrikulær endotelcellerett.
    MERK: Tilsett middels sakte langs kanten av parabolen slik at innsatsen ikke forstyrres.
  4. Kontroller under et mikroskop for å kontrollere at cellene ikke lekker fra innsettingsrommet.
  5. Inkubatceller i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Etter 24 timer inkubasjon, sjekk under mikroskop for å kontrollere at cellene har festet riktig, og det er ingen overnattinglekkasje.
  6. Etter 48 timer med såing, fjern forsiktig innsatsen ved hjelp av en steril pinsett. Kontroller under mikroskopet for å kontrollere at cellelaget forblir uforstyrret (dag 0).
  7. Fjern medium fra nevronparabolen og tilsett 1 ml friskt nevronalt medium. På samme måte fjerner du medium fra den periventulære endotelcelleretten og tilsett 1 ml ferskt periventrikulær endotelcellemedium.
    MERK: Sett til side et nødvendig antall retter og fest med 4 % PFA for dag 0-bilder.
  8. Inkuber celler i 5 dager ved 37 °C og 5 % CO2. Etter 5 dager, fjern medium, fiks celler med 4% PFA i 10 min, og vask 3x med 1x PBS.
  9. Flekknevroner med anti-humant β-tubulin eller antihumant MAP2 antistoff, og endotelceller med anti-humant CD31 antistoff. På slutten av immunstaining, tilsett 1 ml antifade monteringsmedium til hver tallerken.

7. Co-kultur Migrasjon Analyse

  1. Samtidig suspendere 3 x 104 GABAergic interneurons og 3 x 104 humane periventtrikulære endotelceller i 70 μL co-kultur medium (50% periventtrikulær vedlikeholdsmedium uten GABA og 50% nevronalt medium). Frø denne celleløsningen inne i enbrønns innsettingsrommet. Forbered et passende antall slike analyseretter.
    MERK: GABA ble ikke lagt til i co-kultur-mediet for å utelukke effekten av eksogene GABA på migrasjon.
  2. Kontroller under et mikroskop for å kontrollere at cellene ikke lekker fra innsettingsrommet.
  3. Tilsett langsomt 1 ml co-kulturmedium langs siden av fatet for å hindre at belegget tørker.
    MERK: Tilsett middels sakte langs kanten av parabolen slik at innsatsen ikke forstyrres.
  4. Som en første kontroll, frø 3 x 104 menneskelige GABAergic interneurons bare i 70 μL av co-kultur medium per en-brønn innsats. Forbered et passende antall slike retter.
  5. Som en annen kontroll, co-seed 3 x 104 GABAergic menneskelige interneurons med 3 x 104 kontroll menneskelige endotelceller i 70 μL co-kultur medium per en-brønn innsats. Forbered et passende antall retter.
  6. Inkuber opp vaskene i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Etter 24 timer inkubasjon, sjekk under et mikroskop for å kontrollere at cellene har festet riktig, og det er ingen lekkasje.
  7. Etter 48 timer med såing, fjern forsiktig innsatsen ved hjelp av en steril pinsett. Kontroller under mikroskopet for å kontrollere at cellelaget ikke forstyrres (dag 0).
  8. Fjern medium og legg til 1 ml friskt co-kulturmedium.
    MERK: Sett til side et passende antall retter for å anskaffe dag 0-bilder.
  9. Inkuber celler i 5 dager ved 37 °C og 5 % CO2.
  10. Etter 5 dager, fjern medium, fiks celler med 4% PFA i 10 min, og vask 3x med 1x PBS.
  11. Flekk med anti-menneskelig β-Tubulin eller anti-humant MAP2 antistoff for å merke nevronene. På slutten av immunstaining, tilsett 1 ml antifade monteringsmedium til hver tallerken.

8. Chemo-attraksjon Analyse

  1. Legg en tre-brønns kulturinnsats i midten av en poly-L-ornithine/lamininbelagt 35 mm tallerken ved hjelp av sterile pinsett.
  2. Snu parabolen opp ned. Merk grensen rundt det midterste rommet på innsatsen ved hjelp av en permanent svart markør med ultrafin spiss.
  3. Frø 3 x 104 humane GABAerge interneuroner i midtrommet i 70 μL nevronalt medium(figur 3A).
  4. Frø 104 humane periventrikulære endotelceller i 70 μL periventtrikulær endotelcellemedium og 104 kontroll endotelceller i 70 μL kontroll endotelcellemedium i henholdsvis to ytre rom (figur 3A).
  5. Tilsett 1 ml co-kultur medium (50% periventrikulær vedlikeholdsmedium uten GABA og 50% nevronalt medium) langs siden av parabolen for å hindre at belegget på parabolen tørker.
  6. Kontroller under mikroskopet for å kontrollere at cellene ikke lekker fra innsettingsrommet.
  7. Inkubatceller i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Etter 24 timer inkubasjon, sjekk under et mikroskop for å kontrollere at cellene har festet riktig, og det er ingen lekkasje.
  8. Etter 48 timer med såing, fjern forsiktig innsatsen ved hjelp av en steril pinsett. Kontroller under mikroskopet for å kontrollere at cellelaget ikke forstyrres (dag 0).
  9. Fjern medium og legg til 1 ml friskt co-kulturmedium.
    MERK: Sett til side nødvendig antall retter for dag 0-bilder.
  10. Inkubatceller i 36 timer ved 37 °C og 5 % CO2. Etter 36 timer, aspirer medium, fiks celler med 4% PFA i 10 min, og vask 3x med 1x PBS.
  11. Flekk humane GABAergiske interneuroner med anti-humant β-tubulin eller anti-humant MAP2 antistoff. På slutten av fargingsprosedyren, tilsett 1 ml antifade monteringsmedium i hver tallerken.

9. Bilde- og dataanalyse

  1. Plasser immunfarget analysefat under et mikroskop ved 4X forstørrelse.
  2. Hold en langkant av den rektangulære grensen (gjort i trinn 5.10 ovenfor) i synsfeltet. Ta bilder av celler i det cellefrie rommet ved siden av den grensen. Innhente bilder langs høyre langkant og venstre langkant av den rektangulære grensen (Figur 2B).
    MERK: Celler plassert diagonalt med hensyn til rektangelet vurderes ikke på grunn av tvetydighet ved valg av kort- eller langkant som startmerke. Også antall celler som migrerer over kortkanten er ofte betydelig færre (muligens på grunn av mindre antall startceller langs kortkanten) og vurderes ikke.
  3. Åpne bildene i ImageJ. Beregn avstanden mellom hver celle og grensemerket (figur 2D) ved hjelp av ImageJ.
  4. Hvis du vil vurdere migrering når det gjelder cellenumre, angir du en bestemt avstand fra grensen i det oppkjøpte bildet i ImageJ. Telle antall celler som finnes innenfor denne avstanden. Beregn gjennomsnittsnummer, standardavvik og statistisk signifikans ved hjelp av riktig programvare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Trinnene for å sette opp en en-brønns kulturinnsats inne i en 35 mm tallerken vises i figur 1. Langdistanse migrasjonsanalyse og co-kultur migrasjon analyse brukt en one-well innsats for å så ønsket antall celler i midten av en poly-L-ornithine / laminin belagt 35 mm parabolen. På dag 0 var cellene til stede som en rektangulær patch (Figur 2A,C). I dag 0 bilder, dagen 0 linjen kan lett identifiseres av den skarpe kanten av cellelaget (hvit stiplet linje i figur 2C). Ved 48 timer hadde cellene migrert ut i det cellefrie rommet (figur 2B,D). I post-day 0 bilder, den svarte kanten trukket rundt innsatsen (på baksiden av parabolen) kan være tydelig observert som et svart gap. Kanten av gapet ble tildelt som dag 0 linje (hvit stiplet linje i figur 2D). Som nevnt i trinn 9.2 ble bare de cellene som falt i området ved siden av høyre og venstre langkant av cellelaget (gult område i figur 2B)vurdert for dataanalyse. Avstanden som ble reist av en celle ble målt ved å beregne avstanden mellom cellen (hvit pil i figur 2D) og dag 0-linjen. Immunocytokjemisk farging med anti-aktiv Caspase 3 antistoff, en markør for apoptose, viste ingen apoptotisk signal i de seedede cellene (Figur 2E). I co-kultur migrasjon analyse, når interneurons ble co-seeded med menneskelige periventtrikulære endotelceller, nevroner reiste lengre avstander sammenlignet med når interneurons ble seeded alene eller når co-seeded med kontroll endotelceller (Figur 2F). Også for samme avstandsområde migrerte et høyere antall interneuroner ut når de ble co-seeded med periventrikulære endotelceller i forhold til interneuroner i de to andre gruppene. Dette viser at, som mus periventrikulære endotelceller, fremmer humane periventtrikulære endotelceller menneskelig interneuronmigrasjon.

I kjemo-attraksjonanalysen, ved hjelp av tre-brønns kulturinnsatser, ble menneskelige interneuroner sådd som en liten rektangulær patch i en 35 mm poly-L-ornithine/lamininbelagt kulturrett. Periventrikulære endotelceller og kontroll ikke-periventrikulære endotelceller ble seedet som flekker på hver side av nevronal patch, med gapet mellom hver er 500 μm (Figur 3A). Antall interneuroner som migrerte mot periventrikulære endotelceller versus kontrollendotelceller ble kvantifisert etter 36 timer. Et betydelig høyere antall interneuroner migrerte mot periventtrikulære endotelceller sammenlignet med kontroll endotelceller (Figur 3B,C),som bekrefter at GABAergic interneurons reagerer selektivt på kjemoattraktive signaler utskilt av humane periventtrikulære endotelceller.

Figure 1
Figur 1: Utarbeidelse av kulturinnsatsen. (A) En to-brønn kultur innsats. (B) En en-brønninnsats festet i midten av en 35 mm tallerken. (C) Omrisset av det rektangulære plasteret som observert etter at innsatsen er fjernet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjema og representativt resultat av migrasjonsanalyse. (A) Skjema for cellelag (rødt rektangel) på dag 0. (B) Skjema av celler som migrerer ut i det cellefrie rommet. Røde prikker indikerer migrerende celler. Den gule regionen markerer området som er avbildet for datainnsamling. Den stiplede boksen i A og B tilsvarer området som vises i panel C og D. -Jeg har ikkenoeå si. Representative fluorescerende bilder av anti-β-Tubulin antistoff merket interneurons på dag 0 (C) og dag 2 (D) av migrasjon analysen. Den hvite stiplede linjen markerer dag 0. Den gule linjen i D indikerer avstanden som reises av en celle (merket med hvit pil) i 48 h. (E) Nevroner (på dag 0) er co-merket med anti-β-Tubulin antistoffer (rød) og anti-aktiv Caspase 3 antistoffer (grønn), som markerer apoptotiske celler. Nuclei er farget med DAPI (blå). Apoptotiske celler ble ikke oppdaget i seedeceller. (F) Graf fra dag 5 av co-kultur analysen, hvor antall interneurons som har migrert er plottet mot avstand reist. I forhold til interneuroner som ble seeded alene eller co-seeded med kontroll endotelceller, interneurons co-seeded med periventtrikulære endotelceller migrert ut i høyere tall, og også reiste lenger avstand. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 5; **p<0,01, ***p< 0,001, Student's t test). Skala stenger = 100 μm. IN = interneurons; PV EC = periventrikulære endotelceller. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Chemo-attraksjon analyse. (A) Skjema for kjemo-attraksjon analysen. Ved hjelp av en tre-brønns kulturinnsats ble interneuroner (IN) seeded i midten (grønt stiplet rektangel), mens periventrikulære endotelceller (PV-ECer; oransje stiplede rektangel) og kontrollendotelceller (ECer; gult stiplet rektangel) ble sådd på hver side. (B) Bilder av β-Tubulin merket interneurons som viser robust migrasjon mot periventtrikulære endotelceller, men ikke mot kontroll endotelceller. (C) Kvantifisering av kjemo-attraktiv respons av interneurons. Et betydelig høyere antall nevroner migrerte mot periventtrikulære endotelceller enn mot kontroll endotelceller. Data representerer gjennomsnitt ± SD (n = 5; *p < 0,05, Student's t test). Skaler stenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

A Fordeler Begrensninger
Boyden kammer analyse16,17 · Teknisk ikke-krevende
· Egnet for tilhenger- og ikke-tilhengerceller
· Kan endres for å studere effekten av paracrine signalering eller kjemo-attractants på cellemigrasjon
· Endepunktsanalyse. Ikke egnet for sanntidsbildebehandling.
· Ikke egnet for studier av effekt av direkte celle-celle interaksjon på migrasjon
Scratch analyse18 · Endepunkt eller kinetisk
· Teknisk ikke-krevende
· Analyser migrasjon lengde på noen få hundre mikrometer. Ikke egnet for studier av langdistansemigrasjon i området 1-2 cm.
· Ikke egnet for suspensjonceller
· Variasjoner i skrapeareal
Langdistanse migrasjonsanalyse · Sluttpunkt eller kinetisk
· Tillater studie av langdistansemigrasjon mellom 1,5 og 2 cm
· Teknisk ikke-krevende
· Ikke egnet for suspensjonceller
Koordineringsanalyse for kultur · Sluttpunkt eller kinetisk
· Tillater studie av effekten av direkte celle-celle kontakt på migrasjon
· Tillater overføringslengde på opptil 1,5 til 2 cm
· Teknisk ikke-krevende
· Ikke egnet for suspensjonceller
B Fordeler Begrensninger
Boyden kammer analyse · Teknisk ikke-krevende
· Egnet for tilhenger- og ikke-tilhengerceller
· Endepunktsanalyse. Ikke egnet for levende bildebehandling.
· Bratt konsentrasjonsgradient
Under-agarose analyse19 · Teknisk ikke-krevende
· To eller flere kjemoattraktive signaler kan assayed i ett oppsett
· Ikke egnet for tilhengerceller. Begrenset hovedsakelig til blodceller.
· Vanskelig visualisering av celler i agarose
Kapillær kammer migrasjon analyse20,21 · Endepunkt eller kinetisk
· Egnet for tilhenger- eller suspensjonsceller
· Trenger spesielle kamre
Mikrofluidisk enhet22 · Genererer kontrollerbar og stabil konsentrasjonsgradient
· Tillater oppløsning på én cellenivå
· Trenger avanserte enheter og verktøy
· Teknisk krevende og bratt læringskurve
· Kompleks bildebehandling og dataanalyse
Chemo-attraksjon analyse · Sluttpunkt eller kinetisk
· Gradvis konsentrasjonsgradient
· Egnet for sanntids- eller fluorescerende bildebehandling
· Teknisk ikke-krevende
· Ikke egnet for suspensjonceller

Tabell 1: Sammenligning av analysemetoder. (A) Sammenligning av felles in vitro migrasjon analyser med langdistanse migrasjon analyse og co-kultur analyse. (B) Sammenligning av vanlige chemotaxis analyser med kjemo-attraksjon analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrev vi tre in vitro-analyser som sammen gir kvantitativ vurdering av humane periventtrikulære endotelcellespesifikke egenskaper. Disse analyser vil være verdifulle i å få mekanistisk innsikt i samspillet mellom menneskelige periventtrikulære endotelceller med menneskelige interneuroner. Eksperimenter ved hjelp av ligander, inhibitorer eller celler med genspesifikk knockdown eller overexpression vil identifisere eller validere molekylære spillere som megler endothelial cellestyrt interneuron migrasjon eller langdistanse trekkegenskaper av periventtrikulære endotelceller. Disse analysene kan også endres for å utføre live-celle time-lapse migrasjon studier. Videre er det bevis for interaksjon av endotelceller med andre celler enn interneuroner. Studier fra vår gruppe og andre har henvist til påvirkning av periventtrikulære endotelceller på mønster av projeksjonnevroner og spredning av nevrale forløperceller5,14,15. Det ville være av interesse å teste disse mulige interaksjonene ved hjelp av våre analyseinnstillinger. Til slutt vil disse assene tjene som en plattform for vurdering av syke periventtrikulære endotelceller. Vårt arbeid har etablert nye autonome forbindelser mellom det periventrikulære vaskulære nettverket og opprinnelsen til nevropsykiatriske lidelser som schizofreni, epilepsi, autisme og alvorlig depresjon3,5. Disse analyser vil være uvurderlig i å identifisere potensielle defekter i langdistanse migrasjon, kjemo-tiltrekning, eller sidextracrine signalering av syke-periventrikulære endotelceller i disse nevropsykiatriske lidelsesforhold.

Disse analysene er enkle, reproduserbare og lave kostnader, og de kan endres for å måle cellemigrasjon og effekter av co-kultur eller kjemo-attraktive signaler om migrasjon i ulike celletyper, med unntak av ikke-tilhengerceller. Det er noen kritiske trinn som må følges for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. For det første er det viktig å optimalisere seeding cellenummer for hver analyse. Antall celler som skal sås i et enkelt rom bør avhenge av celletype, ønsket grad av samflyt og analysespesifikke faktorer som co-kulturforhold. For det andre er det nødvendig å optimalisere cellekulturmediet for hver analyse. I co-kultur migrasjon analyse og kjemo-attraksjon analyse, hvor mer enn én celle type er seeded i en enkelt tallerken, analysemediet bør være bidrar til alle celletyper. I piloteksperimenter undersøkte vi effekten av co-kultur medium på levedyktighet (ved hjelp av trypan blå eksklusjonsmetode) og morfologi (ved hjelp av immuncytokjemi) av hver celletype. Vi dyrket menneskelige GABAergic nevroner med co-kultur medium for en uke og observerte ingen signifikant forskjell i levedyktighet og morfologi av nevroner i co-kultur medium sammenlignet med nevroner dyrket i nevronal medium. På samme måte viste periventrikulær endotelceller og kontroll endotelceller, dyrket i co-kulturmedium for to passasjer, ingen signifikant variasjon i celleoverlevelse og morfologi. For det tredje, siden overføringshastigheten varierer mellom ulike celletyper, er det viktig å bestemme tidsrammen for hver analyse for celletypen(e) som studeres. For det fjerde er det avgjørende å håndtere kulturinnsatsene nøye. Innleggene skal festes godt på fatet ved å trykke forsiktig med fingertuppen. Parabolen skal dreies opp ned for å bekrefte at innsatsen ikke beveger seg. Forsiktighet bør også tas mens du fjerner innsatsen for ikke å forstyrre cellelaget. Til slutt anbefales det å øke prøvestørrelsen for å redusere eksperimentell variasjon.

Til slutt vil disse assene betydelig utvide vår forståelse av menneskelig periventtrikulær endotelcellebiologi og dens rolle i hjernens utvikling i normale og syke forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av priser fra National Institute of Mental Health (R01MH110438) og National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) til AV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase dissociation solution Millipore Sigma SCR005 Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody Biolegend 802001
Anti-human CD31 antibody Millipore Sigma CBL468
Anti- MAP2 antibody Neuromics CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody Millipore Sigma AB3623
Control human endothelial cells Cellular Dynamics R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement Cellular Dynamics M1019
Cryogenic vials Fisher Scientific 03-337-7Y
DMEMF/12 medium Thermofisher Scientific 11320033
DMSO Sigma-Aldrich D2650
E6 medium Thermofisher Scientific A1516401
FGF2 Thermofisher Scientific PHG0261
Fibronectin Thermofisher Scientific 33016-015
Freezing Container Thermofisher Scientific 5100
GABA Sigma-Aldrich A2129
Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629
Human GABAergic neurons Cellular Dynamics R1013
Human GABAergic neurons base medium Cellular Dynamics M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement Cellular Dynamics M1032
Laminin Sigma L2020
Matrigel Corning 356230 Basement membrane matrix
Mounting Medium Vector laboratories H-1200
poly-L-ornithin Sigma p4957
PBS Thermofisher Scientific 14190
Trypan blue Thermofisher Scientific 15250061
TrypLE Thermofisher Scientific 12563011 Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A Peprotech 100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit Lifeline Cell Technologies LL-0003 Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert ibidi 80209
3-well silicone culture-Insert ibidi 80369
35 mm dish Corning 430165
15-ml conical tube Fisher Scientific 07-200-886
4% PFA solution Fisher Scientific AAJ19943K2
6-well tissue culture plate Fisher Scientific 14-832-11
Inverted phase contrast microscope Zeiss Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope Olympus FSX-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, (1), 21-78 (2019).
  2. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11, (4), 429-439 (2008).
  3. Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
  4. Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33, (37), 14809-14815 (2013).
  5. Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28, (2), 221-248 (2018).
  6. Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
  7. Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6, (4), 312-324 (2005).
  8. Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13, (2), 107-120 (2012).
  9. Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27, (7), 400-406 (2004).
  10. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, (3), 8-12 (2001).
  11. Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. Nara, Japan. (2018).
  12. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, (11), 713-726 (2012).
  13. Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13, (5), 265-278 (2017).
  14. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19, (1), 32-41 (2009).
  15. Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
  16. JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  17. Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
  18. Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2, (2), 329-333 (2007).
  19. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115, (6), 1650-1656 (1975).
  20. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75, (2), 606-616 (1977).
  21. Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
  22. Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40, (6), 1316-1327 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics