Fabrikation og implementering af en reference-fri trækkraft mikroskopi platform

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol indeholder instruktioner til implementering af multiphoton litografi til at fabrikere tredimensionelle arrays af fluorescerende fiducial markører indlejret i poly (ethylenglycol)-baserede silicagelrogeler til brug som reference-fri, trækkraft mikroskopi Platforme. Ved hjælp af disse instruktioner forenkles måling af 3D-materiale stamme og beregning af cellulære distraktionerne for at fremme målinger af trækkraft med høj gennemløb.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banda, O. A., Slater, J. H. Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform. J. Vis. Exp. (152), e60383, doi:10.3791/60383 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kvantificering af celle induceret materiale deformation giver nyttige oplysninger om, hvordan cellerne fornemmer og reagerer på de fysiske egenskaber i deres mikromiljø. Mens mange tilgange findes til måling af celle-induceret materiale stamme, her giver vi en metode til overvågning af stamme med sub-micron opløsning på en reference-fri måde. Ved hjælp af en to-foton aktiveret photolithographic mønster proces, viser vi, hvordan man genererer mekanisk og bio-aktivt tunable syntetiske substrater, der indeholder indlejrede arrays af fluorescerende fiducial markører til nemt at måle tredimensionelle ( 3D) materiale deformation profiler som reaktion på overflade tractions. Ved hjælp af disse substrater kan celle spændings profiler tilknyttes ved hjælp af en enkelt 3D-billedstak af en celle af interesse. Vores mål med denne metode er at gøre Traction Force mikroskopi en mere tilgængelig og lettere at implementere værktøj til forskere, der studerer cellulære mekanisotransduktionsprocesser, især nytilkomne til marken.

Introduction

Trækkraft mikroskopi (TFM) er processen med at tilnærme cellulære distraktionerne ved hjælp interpoleret forskydning felter af fiducial markører genereret af en vedhængende og kontraktile celle. Ved hjælp af TFM kan indflydelsen fra mekaniske signaler i det ekstracellulære miljø på vigtige cellulære processer såsom spredning, differentiering og migration undersøges1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Desværre kan mange eksisterende tilgange være vanskelige at gennemføre eller kræve kendskab til højt specialiserede analytiske og beregningsmæssige værktøjer gør TFM vanskeligt for uerfarne forskere til at bruge. Vi beskriver en metode til at generere en TFM platform, der eliminerer nogle af de vanskeligheder i analysen, samtidig med at høj gennemløb dataindsamling.

Af de eksisterende TFM-tilgange omfatter de hyppigst anvendte til kvantificering af materiale stammen inkorporering af små fluorescerende markører (typisk fluorescerende perler i nano-eller mikrometer størrelse) i en deformerbar hydrogel, såsom polyacrylamid (PAA) eller poly (ethylenglycol) diacrylat (pegda)13,14,15. Disse perle baserede tilgange giver mulighed for tæt klynge fiducial markører omkring en celle af interesse for at maksimere forskydning prøveudtagning. Desværre kan fordelingen af perlerne i hele hydrogel ikke styres direkte, så den rumlige organisation er tilfældig. Denne tilfældige placering fører til problemer såsom perler, der er for tæt på hinanden til præcist at løse, eller så sprede, at patches af substrat udbytte lav kvalitet data. Den manglende evne til at forudsige, hvor fiducial markører ligger i fravær af celler også skaber en begrænsning, at for hver indsamlede sæt af celle trækkraft data, en yderligere referencebillede af de underliggende markører i en afslappet tilstand skal også tages til fange. Referencebilledet er påkrævet, så forskydningen i det stressede billede kan tilnærses som forskellen mellem de stressede og ustressede billeder. For at opnå en afslappet tilstand, de celler, der måles, er enten kemisk afslappet eller helt fjernet. Denne proces forhindrer ofte erhvervelse af yderligere eksperimentelle målinger, hæmmer langsigtede celle undersøgelser, og begrænser gennemløb. En referencebillede kræver også billedregistrering teknikker til at rumme for drift, som kan have fundet sted under eksperimenter, ofte fører til besværlig manuel matchning af stress tilstand billeder til reference billeder.

Andre TFM-metoder, som anses for reference frie, gennemfører en eller anden form for kontrol over fordelingen af fiducial markører, enten ved højopløsnings litografi, mikrokontakttrykning eller mikromolding16,17,18 ,19,20. Den reference frie TFM opnås ved at antage, at den afslappede tilstand for hver fiducial markør kan forudsiges ud fra, hvordan markør positioner blev ordineret under fremstillingsprocessen. Disse metoder giver mulighed for fuldstændig opsamling af en celles spændingstilstand inden for et enkelt billede, hvor fiducial markør forskydninger måles i forhold til en implicit reference, end der kan udledes af den fiducial markør geometri. Selv om konsistens i markørplacering typisk opnås ved hjælp af disse platforme, lider de generelt af deres egne mangler i forhold til de udbredte perle baserede tilgange, herunder: 1) nedsat trækkraft opløsning; 2) nedsat nøjagtighed af out-of-plane forskydninger (i nogle tilfælde en fuldstændig manglende evne til at måle); og 3) nedsat customizability af platform substrater og materialer (f. eks. ligand præsentation, mekaniske egenskaber).

For at afhjælpe disse mangler designede vi en ny reference-fri TFM-platform. Platformen udnytter multiphoton aktiveret kemi til at link en lille volumen af en fluoroforet i specifikke 3D steder inden for hydrogel, der tjener som fiducial markører til at måle materiale stamme. På denne måde har vi designet en platform, der fungerer på samme måde som Bead-baserede tilgange, men med den betydelige fordel, at fiducial markører er organiseret i gridded arrays giver mulighed for reference-fri materiale stamme tracking. Denne reference-fri ejendom giver mange fordele. Først og fremmest, det giver mulighed for ikke-påtrængende overvågning af cellulære trækkraft stater (dvs., omgår behovet for at slappe af eller fjerne celler til at erhverve referencepositioner af fordrevne fiducial markører). Dette var vores primære mål i udformningen af dette system, da vi havde til hensigt at indarbejde andre downstream analytiske metoder i tandem med TFM, som kan være vanskeligt med destruktive end-punkt TFM tilgange. For det andet, ved hjælp af en implicit reference baseret på gridded arrays giver mulighed for nær-komplet automatisering af fortrængnings analyse. Den formelle rigtighed af arrays skaber en forudsigelig arbejdsgang, hvor forekomsten af ekstraordinære tilfælde (dvs. prøve celledata, der indeholder uventede artefakter såsom suboptimal markør afstand eller registrering mismatch) kan opretholdes på et minimum. For det tredje giver afkald på behovet for at erhverve et referencebillede frihed til at overvåge mange celler på en enkelt prøve over længere tidsperioder. Dette står i kontrast til traditionelle perle baserede tilgange, hvor fejl i positionering kan akkumulere og øge vanskeligheden ved korrekt registrering af reference billeder til celle spændinger, afhængigt af hvordan mikroskopet er i automatiseret fase bevægelser. Billeder. Samlet set, denne platform letter højere gennemløb i indsamling cellulære spænding data.

Med denne protokol, vi håber at gøre læserne med de to-foton, Laserscanning litografi teknik, som vi implementeret for at generere denne reference-fri TFM platform til at måle in-plane og out-of-plane trækkraft komponenter genereret af celler seedet på overfladen. Ikke omfattet af denne protokol er syntesen af nogle af de monomeriske komponenter. Generelt omfatter disse reaktioner næsten identiske "One-pot"-syntese reaktions ordninger, der er beskrevet tidligere21, og alternativer til disse produkter kan også købes. Vi sigter også mod at gøre læserne bekendt med de softwarebaserede værktøjer, vi har genereret for at fremme brugen af kommercielt tilgængelige laser scannings mikroskoper som 3D-udskrivnings værktøjer og for at lette analysen af de fiducial markør forskydninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. photopolymerizing en PEGDA base hydrogel

  1. Indsamling af reagenser
    1. Indsamle lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylfosforat (LAP), 3,4 kDa poly (ethylen) glykol diacrylat (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 mærket PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 mærket PEGDA (PEG-633) og pegyleret RGDS peptid ( Eller PEG-RGD'ER) fra deres respektive frysere og Bring hver til stuetemperatur.
    2. I separate rav-mikrocentrifuge glas måles 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633 og 6 mg RGDS peptid.
  2. Klargøring af præ-polymer opløsningen
    1. OMGANGEN opløses i 1 mL fosfat bufferet saltvand (PBS, pH 7,4). Brug 200 μL af opløsningen til opløst LAP til at opløse PEGDA. Brug derefter 200 μL af PEGDA-opløsningen til at opløse PEG-RGD'ER.
      Bemærk: Hvis kontrol af celle form ønskes, udelades opløsning af PEG-RGD'ER i basen hydrogel præ-polymeropløsning, da det vil blive tilføjet via to-photon, Laserscanning litografi senere i protokollen.
    2. Brug 80 μL PBS til at opløse PIND-488. Tilsæt 2,5 μL af denne opløsning til præ-polymer opløsningen.
      Bemærk: PIND-488 vil give den endelige hydrogel et fluorescerende signal, som kan bruges til at navigere under mønstret, og koncentrationen kan ændres for at ændre signal intensiteten.
    3. Den komplette præ-polymeropløsning filtreres gennem et 0,2 μm polytetrafluorethylen (PTFE) filter for at fjerne partikler, der kan være til stede i opløsningen. Hvis reactanter er korrekt syntetiseres, bør filteret ikke blive tilstoppet.
  3. Photopolymerizing basen hydrogel
    1. 3 μL af præ-polymer opløsningen placeres på et tyndt fladt ark perflud alkoxy alkaner (PFA). Placer flad 150 μm tyk Polydimethylsiloxan (PDMS) strimler omgivende, men ikke i kontakt med, drop af præ-polymeropløsning. Læg en acrylatsilanized Cover seddel21,22,23,24 på PDMS — med den præ-polymer dråbe centreret under dæksedlen — for at udglatte præ-polymer-dråben til tykkelsen af PDMS Spacers.
    2. Udsætte den klemt præ-polymeropløsning til UV-lys, indtil en hydrogel er fuldt dannet (ca. 1 min ved 14 mW/cm2 af 370-400nm lys).
    3. Adskil dæksedlen forsigtigt fra PDMS Spacers, og fastgør den til en Petri skål med høj ydeevne, dobbeltsidet akryl klæbemiddel. Påfør Tryk på den klæbende kontaktflade for at skabe en komplet forsegling mellem coverslip, klæbemiddel og Petri skål – med omhu for ikke at knække glasset.
    4. Skyl hydrogel i Petri skålen ved hjælp af sterilfiltreret PBS for at minimere biologiske og forurenende partikler.
    5. Gentag trin 1.3.1-1.3.4 efter behov for at oprette det ønskede antal hydrogels.
    6. Tilsæt 8 μL NVP til de resterende 800 μL LAP-opløsning, og opbevar denne løsning samt uopløst PEG-633, indtil den er klar til at mønstre.
      Bemærk: LAP-løsningen med NVP er meget følsom over for lys og vil polymerisere, hvis den ikke holdes i mørket. Indpakning røret i aluminiumsfolie kan bidrage til at forbedre sin holdbarhed.

2. oprettelse af mønster instruktioner

  1. Designe et binært billede
    1. Hvis du vil oprette en virtuel maske til ordination af fiducial markør matricer, skal du bruge billedbehandlings-eller tegnings software til at oprette et billede med et billedformat på 100:1 (f. eks. 2000 pixels lang x 20 pixels i bredden).
    2. Opret en række med 100 jævnt fordelte hvide pixels på en sort baggrund centreret langs billedets lange akse.
    3. Gem dette billede som en *. tif-filtype.
      Bemærk: Hvis kontrol af celle form ønskes21,25,26,27,28, oprette en ekstra virtuel maske. Brug et firkantet formet billedlærred, og Opret positive hvide funktioner på en sort baggrund. For at tilnærme en passende størrelse til de hvide funktioner (som i sidste ende vil støtte celle vedhæftning) antage, at den samlede størrelse af billedet svarer til størrelsen af mikroskopet viewfield bruges til Laserscanning litografi.
  2. Konvertering af et binært billede til en digital maske
    1. Download LSM-ROI-generator-funktionerne, der er tilgængelige gratis på software lageret29.
    2. Åbn MATLAB, og Find mappen med de hentede funktions filer. Når du er i mappen, skal du åbne run_script. m MATLAB-scriptet og køre scriptet.
    3. Vælg den binære *. tif-fil til konvertering. Vælg derefter en mappe for at gemme regions filer.
    4. Indtast den ønskede endelige størrelse, i mikron, af det valgte billede. Input billedet skaleres og dimensioneret, så det svarer til disse parametre. Hvis hele billedet skal være i visningsfeltet for mikroskopet, skal billedets samlede størrelse være mindre end eller lig med størrelsen på mikroskopet viewfield.
    5. Hvis du opretter en enkelt pixel array, i ROI-generator muligheder, Sørg for at fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet Fjern afkrydsningsfeltet under små regioner/enkelte pixels, for at kontrollere afkrydsningsfeltet kvadrater, og for at fjerne markeringen Brug under Vandrette pause linjer. Klik derefter på OK.
      Bemærk: Hvis du opretter en regions fil for at oprette enkelt celle mønstre, er standardindstillingerne passende.
    6. Find den resulterende *. ovl-fil i den tidligere angivne mappe. Denne fil skal bringes til mikroskopet for at indlæse de ønskede områder, der styrer laser lukkeren under to-photon Laserscanning litografi.

3. opdigte fiducial markør arrays

  1. Neddypning af base hydrogel
    1. Under svagt lysforhold tilsættes 200 μL af LAP/NVP-opløsningen til AF633 (begge forberedt i trin 1). Bland grundigt, mens du beskytter mod lys.
    2. Fjern alle PBS-opløsningen fra Petri skålen indeholdende en PEGDA-hydrogel fra trin 1.
    3. Tilsæt den opløste PIND-633 til hydrogel for at danne en dråbe, der fuldstændigt omfatter base hydrogel.
      Bemærk: Hvis hullet i Petri skålen kun er lidt større end hydrogel, kan det fungere som en brønd til at holde mønster opløsningen. Ellers skal du sørge for, at dæksedlen er helt tør, før du tilføjer mønster opløsningen, eller den kan løbe ud af den hydrogel, der forårsager hydrogel, til at dehydrere under mønstret.
    4. Læg Petri skålen på prøveholderen på mikroskop stadiet, og Anbring låget på Petri skålen. Lad møntens opløsning blive blød i hydrogel i mindst 30 minutter i mørket.
      Bemærk: mikroskop kan tændes og konfigureres under denne opsætningstid. Ved hjælp af 488 nm laser til billede af hydrogel under iblødsætning er fint.
  2. Konfigurering af mikroskopet
    1. Ved hjælp af en 488 nm laser linje og filtre passende til billede AlexaFluor 488, lokalisere hydrogel ved hjælp af PEG-488 signal. Blok indsamling af længere emission bølgelængder fra detektoren, da disse vil blive mættet med signal fra PIND-633.
    2. Find midten af hydrogel i XY-flyet ved hjælp af lodrette og vandrette flise scanninger og nul scenen position her.
    3. Find overfladen af hydrogel ved hjælp af linjescanninger og z-Stack-funktionen. Nul fokus position her. Niveau hydrogel ved at gentage disse linjescanninger væk fra XY Center for at identificere overfladen position og justere de indstillede skruer til mikroskopet fase.
    4. I mikroskop-softwarens arbejdsområde opretter du en separat eksperimentfil til photopatterning. Multiphoton-effekten indstilles til 1,8% (15,5 mW ved 740 nm målt ved bagåbningen af målet) og scanningshastigheden til 6 (0,1 μm/μs). Juster billed rammens størrelse i pixel for at opnå en pixelstørrelse på 0,1 μm pr. pixel og et størrelsesforhold på 100:1.
    5. Indlæs den regions fil (*. ovl), der blev oprettet i trin 2,2, i fanen regioner. Brug en makro til at angive alle områder til anskaffelse.
    6. Aktiver z-Stack-funktionen, og Indstil afstanden til 3,5 μm for en total dybde på 28 μm og det samlede antal z-skiver på 9.
    7. Brug positions funktionen til at indstille specifikke placeringer på hydrogel, hvor de fiducial markør matricer vil være photopatterned.
      Bemærk: z-placeringen af disse positioner vil diktere midterpositionen af hver z-stak; Når du placerer positioner, skal du sikre, at hver position vil garantere, at den mønstrede volumen vil overlappe med hydrogel på alle overflade steder.
    8. Brug funktionen flise til at angive yderligere rækker og kolonner på hver position. Vær omhyggelig med at undgå overlappende mønstrede områder. Ideelt set skal du sørge for, at mønstrede områder er tæt nok til at fjerne tomme og ubrugelige steder mellem positioner.
  3. Fotopatterning af de fiducial markør matricer
    1. Som Soak tid nærmer sig 30 min mærke, tage efterfølgende z-stak linjescanninger af overfladen af hydrogel hver 5 min at kontrollere for hævelse baseret på ændringer i placeringen af overfladen i forhold til nulstillet fokus position.
    2. Hvis der ikke sker ændringer i overflade positionen over et interval på 5 minutter, skal du indlæse og køre de mønster indstillinger, der er oprettet i trin 3.2.4
    3. Når mønstret eksperimentet er færdigt med at køre, skal du bruge 488 nm-laseren til at kontrollere, at overfladen af hydrogel ikke bevæges under mønstret.
      Bemærk: Hvis det overfladen af hydrogel ikke er i samme position som før mønstret, findes der flere scenarier. Hydrogel ikke havde opnået hævelse ligevægt før mønstning, hydrogel begyndte at tørre ud under mønstret, eller mikroskopet oplevede z-drift. Kilden til denne overflade oversættelse bør identificeres og korrigeres i efterfølgende mønterløb.
    4. Fjern hydrogel fra mikroskopet og Aspirer PIND-633 opløsningen fra Petri skålen.
      Bemærk: hydrogel er stadig meget følsom over for lys. At holde hydrogel i mørket er meget vigtigt, indtil al skylning er færdig.
    5. Skyl hydrogel 3 gange med steril-filtreret PBS, og sørg for helt at fjerne rinsat mellem hver efterfølgende skylning. Gentag denne tredobbelt skylning hver 15 min for 1 h.
    6. Lad hydrogel skylle i PBS natten.
      Bemærk: protokollen kan sættes på pause her.
    7. Tredobbelt skyl hydrogel med PBS. Derefter hurtigt tredobbelt skylle hydrogel med en 200-Proof ethanol opløsning, efterfulgt af en anden tredobbelt Skyl med PBS. Lad ikke hydrogel sidde i 200 Proof ethanol i længere perioder.
      Bemærk: nogle af komponenterne i mønstring-opløsningen kan gå ned ud af opløsningen og indskyde på overfladen af hydrogel og fremstå som et solidt lag af fluorescens (~ 1-5 mikroner tyk) under 633 nm-belysning. Skylning med 200 Proof ethanol bør fjerne disse uønskede komponenter.
  4. Brug af efterfølgende photopatterning til at generere enkelt celle mønstre (valgfrit)
    Bemærk: Hvis kontrol over celle spredningsområde og form ønskes, kan der udføres flere runder af mønstret. Basis gelen skal have PEG-RGD'ER udeladt fra den oprindelige formulering. Det anbefales, at mønstret for de fiduelle markør systemer udføres sidst for at undgå blegning af de fluorescerende fiducial markører.
    1. 20 mg PEG-RGD'ER opløses i LAP/NVP-opløsningen, som er forberedt i trin 1.
    2. Gentag trin 3,1 – 3,3 ved hjælp af PEG-RGDS-løsningen i stedet for PEG-633-opløsningen. Brug den relevante regions-fil, der definerer de enkelte celle mønstre (Se trin 2 for instruktioner).
      Bemærk: for at visualisere arrays af PEG-RGDS mønstre, er der flere muligheder. En fluorescerende variant af peg-rgd'er kan anvendes21,30 eller peg-rgd'er kan doseret med fluorescerende pind. Anbefalet: Alternativt kan 488 nm laser linje køres i tandem med multiphoton mønstret laser til blege PIND-488 signal i basen hydrogel, hvilket skaber ikke-fluorescerende regioner, der falder sammen med RGDS inkorporering.

4. visualisering af fiducial markør systemer

  1. Erhvervelse af en z-stak billede af den fabrikerede array
    1. Udskift PBS i Petri skålen med de celle medier, der bruges til cellekultur.
      Bemærk: phenol røde frie medier anbefales til brug under billed erhvervelse for at forhindre fototoksicitet.
    2. Efter 1 time af opsuge tid, brug en widefield fluorescens mikroskop udstyret med en struktureret belysning modul og en høj forstørrelse vand nedsænkning objektiv linse til at visualisere silicagelrogeler ved hjælp af et filter, der passer til de fluorescerende fiducial markører.
    3. Saml en z-stak billeder i høj opløsning (med en afstand på 0,4 μm i Z), der omfatter mindst 20 μm dybde fra hydrogelens overflade til hydrogel i det mønstrede område, og sørg for, at den øvre grænse for z-stakken indeholder mindst 1-2 billeder fysisk over mønstrede område (dvs. hvor de fluorescerende fiducial markører ikke længere er synlige og kun støj er til stede).
      Bemærk: anskaffelse af denne billedstak er nødvendig for at kontrollere, at alle mønster parametre er korrekte og kan analyseres sammen med celledata i trin 5,3.

5. udførelse af TFM ved hjælp af photopatterned silicagelrogeler

  1. Såning celler
    Bemærk: for at opretholde steriliteten, Følg alle standard vævskultur praksis.
    1. Før celle såning, Følg standardprotokoller for den respektive cellelinje for cellekultur og vedligeholdelse.
    2. Valgfri Hvis hydrogelens sterilitet er problematisk, Inkuber hydrogel i 24 timer i medier, der indeholder antibiotika, efterfulgt af skylning med normale medier.
    3. Til frøceller, først re-suspendere trypsinized celler i den endelige volumen af medier, der skal anvendes i hydrogel Petri skålen.
    4. Fjern alle opløsningen fra hydrogel skålen, og Udskift med de celle belastede medier.
    5. Lad hydrogel sidde uforstyrret i celle belastede medier i 10 min.
    6. Flyt forsigtigt Petri skålen til en inkubator. Vedligehold cellerne i inkubator i 4 timer, eller indtil cellerne er synligt overholdt.
    7. Udskift de celle belastede medier med celle frie medier for at fjerne ikke-klæbet celler.
  2. Erhvervelse af billeder af celler og de fiducial markører
    1. Indstil temperaturen for inkubations kammeret på mikroskop til 37 °C og CO2 til 5%, og lad kammeret nå de indstillede punkter.
    2. Placer Petri skålen på prøveholderen, og Find de mønstrede områder.
    3. Find en celle af interesse (COI) og erhverve en overført eller fluorescerende billede af COI.
      Bemærk: dette billede vil blive brugt til at segmentere celle grænsen under analyse, så billedet skal tydeligt visualisere celle boarders.
    4. Få en z-stak af det mønstrede array under COI som i trin 4.1.4.
    5. Erhverve et andet sæt af overførte eller fluorescerende billeder af cellen.
      Bemærk: Sammenlign det andet billede indstillet til den første for at afgøre, om celleskader på grund af fototoksicitet er observeret, og om billedet erhvervelse indstillinger skal justeres. Celler, der krymper efter eksponering har sandsynligvis lidt betydelige fototoksiske virkninger, som kan påvirke resultaterne.
    6. Gentag trin 5.2.3-5.2.5 for hver COI.

6. analyse af billederne

  1. Udarbejdelse af billedfiler til analyse
    1. Brug data indsamlet i trin 5,2, forberede en beskåret billede stak af området omkring en COI sådan, at det nederste billede (første billede) af stakken repræsenterer den første ramme, hvor: (1) > 80% af de mønstrede markør kolonner er synlige, (2) det øverste billede (sidste billede) i stakken indeholder ikke længere nogen synlige fiducial markører (dvs. over hydrogel overfladen), og (3) der er mindst 20 μm af ikke-stressede fiducial markører omkring COI.
      Bemærk: beskæring af billederne reducerer i høj grad beregningsmæssige tid under analysen. Analyse koden i senere trin kan køres uden beskæring af billederne, men det anbefales ikke.
    2. Opret et beskåret billede af det overførte og/eller fluorescerende billede, så det svarer til XY-beskæringen af stakken i det foregående trin.
    3. Brug enten det beskårne overførte eller fluorescerende billede – alt efter hvad der er mere repræsentativt for celle figuren – til at segmentere billedet manuelt (spore cellekanten) eller via billedbehandlings værktøjer.
    4. Konverter dette billede til et binært billede, hvor cellens indre er sort (dvs. intensitet = 0), og området omkring cellen er hvidt (dvs. intensitet ≠ 0). Gem dette billede som binær maske. tif.
    5. For hver COI skal du indsamle billedstak filen, den overførte billedfil og den binære maskefil i en enkelt mappe.
  2. Kørsel af analyse scripts på billederne
    1. Klon eller download TFM-analysefunktionerne, der er tilgængelige gratis på software lageret29. Hele lageret skal downloades, da der er et betydeligt antal afhængigheder i undermapperne.
    2. Åbn MATLAB, og Føj mappen og alle undermapper til den lokale klon af kode lageret til stien.
    3. Indstil mappen i MATLAB-arbejdsområdet til den mappeplacering, hvor de forberedte billeder i trin 6,1 blev gemt.
    4. Åbn og Kør tracking. m -scriptet. Når du bliver bedt om det, skal du følge instruktionerne for at indlæse de relevante billeder, udføre indledende forbehandlings trin og fejl kontrollere objekt sporings algoritmen.
    5. Når scriptet er færdigt, skal du åbne og køre funktionen Dispshear. m . Dette script bør ikke kræve input fra brugeren.
    6. Når Dispshear. m -scriptet er færdigt, skal du åbne og køre disp3D. m. Hvis du bliver bedt om at åbne billeder, skal du følge instruktionerne.
      Bemærk: under kørslen kan scriptet bede brugeren om at tegne en linje på et billede af det mønstrede array. Denne linje skal repræsentere den primære bevægelses akse i scannings laseren under mønstret og skal line-up med en række mønstrede fiducial markører. Denne proces instruerer koden om, hvilken retning (dvs. rækker eller kolonner af fiducial markører), der sandsynligvis giver de mest justerede rækker af fiducial markører.
    7. Når koden Dispshear. m er fuldført, skal du køre koden dispsurface. m efterfulgt af koden interpFinal3D_2. m . Disse scripts bør ikke kræve input fra brugeren.
      Bemærk: interpFinal3D_2. m -scriptet konverterer forskydnings data til Surface-distraktionerne ved hjælp af software, der er opnået eksternt, hvilket tidligere er beskrevet31. For at anvende disse eksterne funktioner interpolerer interpFinal3D_2. m forskydnings data i ensartede gitre for at fungere som input til konverteringsfunktionerne. Hvis du bruger en anden konverteringsmetode, eller hvis der ikke er brug for spor, kan dette trin springes over.
    8. Når alle scripts er blevet kørt, sikre alle data og udgange kan findes i den oprindelige mappe.
    9. Gentag trin 6.2.3 – 6.2.8 for hver COI.
      Bemærk: inden for kode lageret, der er en mappe, der indeholder scripts, der tillader automatisk batchkørsel af hver af de scripts på en liste over mapper. Se selve automatiserings scriptene (dvs. kommentarer i koden) for at få vejledning i, hvordan du bruger dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I hele protokollen er der en række kontrolpunkter, som giver feedback til at vurdere kvaliteten af mønstret procedure. For at give en vis indsigt i, hvordan man vurderer fremskridtene på hvert af disse checkpoints, giver vi repræsentative resultater af et egentligt eksperiment. Resultaterne fremhæver anvendelsen af denne protokol udført på en photopatterhydrogel, der er forberedt til TFM-analyse af humane navle vene endotheliale celler (Huvec'er). Resultaterne omfatter rå billeddata samt forarbejdede data udgange på hvert kritisk trin.

Det første checkpunkt sker på trin 4, når den fiducial markør array har været photopatterned i hydrogel. Når du indsamler en billedstak, skal de resulterende billeder vise en regelmæssig matrix af mønstrede funktioner (figur 1a-C), der svinger i intensitet som en funktion af z-position i billed stakken. Hvis den mønstrede overflade ikke var perfekt niveau, kan forskellige regioner i hver billed skive synes ude af fase med hinanden med hensyn til disse svingninger; Dette forventes og bør ikke påvirke analysen undtagen i ekstreme tilfælde.

De resterende kontrolpunkter udnytter output fra hver af de scripts, der køres under analyse af en given COI. The tracking. m script giver flere diagnostiske billeder, herunder en z-projektion af fluorescerende fiducial markører (figur 2a) til at vurdere forbehandlings kvalitet, en afbildning af detekterede centroids farvekodet som en funktion af z-position ( Figur 2B) til vurdering af objekternes detekterings kvalitet og et plot af spor, der repræsenterer detekterede markør-centroider, som er blevet kædet sammen i kolonner i z-retningen (figur 2c) for at vurdere objekt sporings kvaliteten.

For nøjagtig 3D barycentrum afsløring nødvendig for at beregne reference koordinater og forskydninger, fluorescerende fiducial markører skal ligne ellipsoide figurer med intensitet faldende radialt fra midten. Scriptet disp3D. m giver et plot af intensitet som en funktion af z-position for hver kolonne af detekterede funktioner i en given billedstak (figur 3a, B) for at vurdere kvaliteten af de fiducial markør intensitets profiler. Både disp3D. m og dispshear. m sammen giver histogrammer af målt forskydnings støj i hver af de kartesiske koordinat dimensioner (figur 4A-C) samt interpolerede varmekort over forskydning (figur 4 E, F). Endelig giver interpFinal3D_2. m varmekort over overflade sporinger beregnet ved hjælp af outsourcet kode (figur 5)31.

Figure 1
Figur 1: typiske mønster resultater.
A) fluorescerende billeder af fiducial markører, der viser intensitets udsving gennem Z-dimensionen fra hydrogel overfladen til 12,4 μm inden for hydrogel. B) en forarbejdet volumetrisk gengivelse afslører den ellipsoide form af de fiduelle markører. C) opdelte profilvisninger af den volumetriske gengivelse viser rå markør data. A, C: skala bar = 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: diagnostiske udgange fra partikel sporings algoritmen.
Objektet afsløring og tracking software udsender flere diagnostiske billeder, herunder (a) en Z-vægtet projektion af de fluorescerende fiducial markører og (B) en scatter plot af markør positioner med farvekodede z-position. (C) en ekstra udgang viser en z-vægtet projektion, som i (a), med 2D-registreringer fra hver ramme, der er sammenkædet i kolonner. (D) et nærmere kig på (B) tydeligere viser individuelle 2D detektioner farvekodet af z-position. A: skala bjælke = 20 μm. C: skala stang = 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: diagnostiske udgange fra algoritmen 3D-fortrængning.
(A, B) Linje plot af markør intensitet som en funktion af frame position display svingninger mellem markører grupperet i den lodrette retning. Disse linje parceller giver mulighed for kvalitativ vurdering af gitter tilpasningen med billedplanet, samt den overordnede kvalitet af de mønstrede fiducial markører. A) overlappende svingninger i markør intensiteten bekræfter den acceptable justering af billedplanet med de mønstrede fiduelle markør matricer. Hvis du medtager tomme rammer øverst i en Z-stak, kan du automatisk beregne en støjtærskel i behandlingssoftwaren. (B) dårlig overlapning mellem svingningerne er ofte tegn på dårlig tilpasning af de mønstrede gitre med billedplanet, men kan også antyde, at gitteret selv er forkert justeret og kan give dårlige resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: diagnostiske udgange fra 2D-og 3D-forskydnings algoritmerne.
(A-C) Histogrammer af målte forskydninger i regioner, der betragtes som "ikke-deformeret" (dvs. forskydnings støj), giver en kvantitativ vurdering af nøjagtigheden af beregnede referencelinjer for tilnærmelsessteds referencepositioner. Forskydnings felter giver en visuel gengivelse af både (D) i-plane (forskydning) og (E) out-of-plane (normal) målte forskydninger. D: Scale bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: diagnostiske udgange fra trækkraft konverterings algoritmen.
(A-C) Trækkraft belastninger kan beregnes ud fra interpolerede forskydnings felter for at bestemme (B) samlet trækkraft, (C) forskydning trækkraft, og (D) normal trækkraft. A: Scale bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med denne protokol er at tilvejebringe en arbejdsgang, der letter en stor mængde af vanskelighederne i forbindelse med generering og analyse af TFM-data. Når de er tilberedt, er de photopatterned silicagelrogeler enkle at bruge, kræver kun viden om standard vævskultur praksis og Fluorescens mikroskopi. Det referencefri aspekt muliggør ubekymret navigation på celle belastede silicagelrogeler og eliminerer besværlige billedbehandlings trin såsom billedregistrering mellem reference og deformerede billeder. Den resulterende analyse er næsten helt automatiseret og data fra individuelle COIs kan analyseres fra start til på mindre end 10 min.

De primære udfordringer i denne protokol stammer fra fabrikation af den photopatterned hydrogel. Fordi de fleste af de reagenser, der anvendes i protokollen er syntetiseret in-House, vi forventer, at brugere med lidt erfaring ved hjælp af syntetiske hydrogel materialer kan være noget afskrækket fra at forsøge denne protokol. Når det er sagt, alle de Pegylerede komponenter, der anvendes i denne protokol er syntetiseret fra næsten identiske protokoller ved hjælp af en-pot reaktioner og mange af komponenterne kan købes fra kommercielle leverandører.

Denne protokol kræver også nogle beherskelse over brugen af laser-scanning mikroskoper. Laser scannings parametrene skal optimeres for hvert forskelligt mikroskop, da laser intensiteter, objektiv linser og andre mikroskop komponenter vil variere, selv mellem mikroskoper af samme model. En simpel fremgangsmåde til at bestemme de bedste mikroskop indstillinger for foto-mønster er at udføre et panel af scanninger med varierede indstillinger. Enhver indstilling, der påvirker den totale laser eksponering, som prøven modtager, vil påvirke størrelsen og kvaliteten af de mønstrede markører. Dette omfatter: scanningshastighed, pixelstørrelse, gennemsnits nummer, laser effekt/intensitet/Fluence, forstørrelse og numerisk blænde32,33. Det er ofte lettest at justere laser effekt og scanningshastighed, og derfor anbefales det at starte med disse to parametre. Det skal også bemærkes, at den software, der anvendes til at generere regioner filer blev designet specielt til mærke af mikroskoper vi bruger og kan være nødvendigt at blive forstærket for at imødekomme andre mikroskop mærker og modeller. Med de indstillinger, der er angivet i protokollen, skal brugeren forvente at generere ellipsoide markører med 3D Gaussian-lignende intensitets profiler af fuld bredde halvt Max dimensioner på 0,84 ± 0,11 μm i XY og 3,73 ± 0,30 μm i Z. Algoritmen til registrering af objekter bruger en Center-of-Mass af intensitet til at identificere markør centroids og vil udføre bedst, når markører præsenterer en bestemt gradient af intensitet.

Korrekt skylning af hydrogel og beskytte det mod lys og fra forurenende stoffer er afgørende vigtigt for cellekultur. Som nævnt i protokollen, nogle af de mønster komponenter kan gå ned ud af opløsning og deponering på overfladen af hydrogel. Hvis disse komponenter ikke er helt skyllet ud af overfladen, kan celle vedhæftningen være forudsigeligt påvirket. Hvis det udsættes for UV-spektrum lys, selv i små doser, mens hydrogel er iblødsætning i mønstret opløsning, vil mønstret opløsning begynde at polymerisere og vil give dårlige resultater. Endelig vil luftbårne partikler eller ufiltrerede partikler komplicere analysen, især hvis de er fluorescerende. Der bør udvises særlig omhu for at forhindre, at disse forurenende stoffer kommer ind i prøven på alle trin i protokollen.

Analyse koden forudsiger reference placeringer for deformerede fiducial markører ved at forudsige den oprindelige matrix fra ikke-deformerede markører i samme række eller kolonne som det deformerede mærke. Selv om dette i høj grad forenkler analyse, det også pålægger nogle begrænsninger på, hvad der kan eller ikke kan analyseres. Som minimum skal hver deformeret markør, der analyseres, have 2 eller flere medlemmer af både kolonnen og rækken af markører, som ikke deformeres, så der kan foretages en nøjagtig forudsigelse. En række defineres af den gruppe af prikker, der udskrives i en enkelt linje scanning på mikroskopet, og en kolonne defineres af markører, der er mønstret på en enkelt lodret akse ved hjælp af en z-stack-funktion. Dette begrænser analysen til enkeltceller eller små celle klynger baseret på længden og dybden af hvert mønstrede område. Det er vigtigt at bemærke, at dette ikke afhjælpes ved at placere to mønstrede regioner perfekt ved siden af hinanden. Dette skyldes, at selv om XY-komponenterne kan line op, er det ikke muligt at perfekt linje op Z positionelle komponenter i arrays, medmindre prøveoverfladen er helt niveau med både brændplanet og scenen. Den bedste måde at undgå denne begrænsning er at ansætte yderligere runder af mønstret, der specifikt dikterer adhæsion ligand placering. Hvis den justeres korrekt, kan celle vedhæftningen begrænses til brugbare områder på mønstrene.

Analyse koden er optimeret til kvadratiske arrays, hvor markører er fordelt ca. 3,5 μm fra hinanden i Z og 2,1 μm i X og Y. Den endelige afstand vil variere baseret på mønster nøjagtighed og hævelse, men dette bør ikke i høj grad påvirke ydeevnen, hvis i-rækkeafstanden er konsistent (inter-Row mellemrum variation vil ikke påvirke sporing). Mens koden kan køre til færdiggørelse på forskelligt foreskrevne arrays, dens nuværende tilstand kan give dårlige resultater, hvis arrays ikke svarer til de parametre, der er anført her. Vores nuværende mål for analyse koden er at inkludere støtte til variabel afstand samt trekantede arrays, som kan forbedre trækkraft genopbygning nøjagtighed og reducere regionale bias i forhold til firkantede arrays.

Afslutningsvis, vi giver en tilgang til TFM, der giver mulighed for facile indsamling og analyse af TFM data uden køretøjet står cellulære funktion. Vores mål med denne tilgang er at give en mere tilgængelig og ikke-påtrængende TFM-tilgang uden at gå på kompromis med resolutionen og kvaliteten af TFM-data. Vi forventer, at denne metode vil fremme konvergensen af biokemisk viden om cellulære fænotyper med de observerede fysiske egenskaber af celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

O. A. Banda blev støttet af midler fra en NSF IGERT SBE2 Fellowship (1144726), Startup midler fra University of Delaware, og National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299). JHS understøttes af midler fra National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299) og National Science Foundation CAREER Award program (1751797). Mikroskopi adgang blev støttet af tilskud fra NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) og staten Delaware. Den strukturerede belysning mikroskop blev erhvervet med midler fra staten Delaware Federal Research and Development Grant program (16A00471). Den LSM880 confokale mikroskop anvendes til to-photon Laserscanning litografi blev erhvervet med en delt instrumentering Grant (S10 OD016361).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc Syringe Filter, 0.2 μm Supor Membrane, Low Protein Binding Pall PN 4602 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips in-house in-house Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24
Axio-Observer Z1 w/Apotome Zeiss Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.
Chameleon Vision ii Coherent Inc. Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.
Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil 3M Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.
Flexmark90 PFW Liner FLEXcon FLX000620 Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.
LSM-880 Zeiss Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.
MATLAB Mathworks R2018a Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.
Model SC Plotter USCutter SC631E Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.
Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27 Zeiss Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.
PEG-AF633 in-house in-house Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21
PEG-DA in-house in-house Base material for hydrogels. See reference: 21
PEG-RGDS in-house in-house RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21
Petri Dishes CELLTREAT 229638 8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).
Syringe, Leur-Lok, 1 mL BD 309628 Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.
UV Lamp UVP Blak-Ray® B-100AP Polymerizes base hydrogel.
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) Sigma-Aldrich V3409-5G Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex. Cell. 158, (1), 143-156 (2014).
  2. Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension. Molecular Biology of the Cell. 9, (11), 3179-3193 (1998).
  3. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration. Cell. 151, (7), 1513-1527 (2012).
  4. Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration. Biophysical Journal. 108, (4), 821-832 (2015).
  5. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124, (8), 1195-1205 (2011).
  6. Reilly, G. C., Engler, A. J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. Journal of Biomechanics. 43, (1), 55-62 (2010).
  7. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nature Materials. 13, (10), 979-987 (2014).
  8. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  9. Steward, A. J., Kelly, D. J. Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Anatomy. 227, (6), 717-731 (2015).
  10. Lv, H., et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. Stem Cell Research & Therapy. 6, (1), 103 (2015).
  11. Tijore, A., et al. Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell. Advanced Healthcare Materials. 4, (9), 1399-1407 (2015).
  12. Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement. Journal of Cell Science. 120, (9), 1624-1634 (2007).
  13. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, (3), 881-886 (2013).
  14. Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances. Biophysical Journal. 94, (1), 207-220 (2008).
  15. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts. Biophysical Journal. 80, (4), 1744-1757 (2001).
  16. Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2, (2), 124-137 (2018).
  17. Bergert, M., et al. Confocal reference free traction force microscopy. Nature Communications. 7, (2016).
  18. Schwarz, U. S., et al. Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates. Materials Science and Engineering: C. 23, (3), 387-394 (2003).
  19. Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, (4), 1484-1489 (2003).
  20. Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).
  21. Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, (20), 18233-18241 (2019).
  22. Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow. Analytical Methods. 11, (1), 8-16 (2019).
  23. Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).
  24. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 5, (17), 2153-2160 (2016).
  25. Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography. Advanced Functional Materials. 21, (15), 2876-2888 (2011).
  26. Slater, J. H., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9, (6), 6128-6138 (2015).
  27. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8, (34), 21883-21892 (2016).
  28. Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. Biomimetic Surfaces for Cell Engineering. Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. 543-569 (2016).
  29. Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. Available from: https://github.com/SlaterLab (2019).
  30. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization. Advanced Materials. 24, (17), 2344-2348 (2012).
  31. Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. High resolution, large deformation 3D traction force microscopy. PLoS ONE. 9, (4), 1-12 (2014).
  32. Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering. Advanced Healthcare Materials. 6, (24), 1-28 (2017).
  33. Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels. Multiphoton Lithography. 183-220 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics